EEN VERSNELDE DIAGNOSTIEK VAN FISH OP BEENMERGSMEARS
Naam: Kristiaan Huijbers
Datum: 8 oktober 2013
Stagecoordinator: Dr. Eva van der Berg
Inhoud
• Inleiding
• Doelstelling
• Materiaal & Methode
• Resultaten
• Casus
• En verder?
Inleiding• Wat is Fluorescentie In Situ Hybridisatie?
• Techniek voor chromosomenonderzoek (sinds 1990)• (delen van) chromosomen voorzien van fluorescerende labels • Analyse d.m.v. de fluorescentiemicroscoop• Interfase FISH of metafase FISH?
• Principe• Enkelstrengs fluorescerend gelabeld DNA (probe)• Complementair aan het te onderzoeken stuk DNA• Door binding van waterstofbruggen, hybridiseert de probe aan het stukje DNA van
interesse• Door verschillende kleuren van markers, onderzoek naar meerdere verschillende
stukken DNA mogelijk
Interfase Metafase
Gebruikte probes: CEP1, CEP16 en CEP17
Doelstelling
• Doelstelling:• Verbetering van diagnostiek op spoedbepalingen d.m.v. FISH op beenmerg• Sneller uit kunnen geven van een uitslag
• Met probes:• Vysis PML-RARA t(15;17) bij promyelocytenleukemie• Vysis IGH t(11;14) bij mantelcellymfomen• Vysis BCR-ABL t(9;22) bij CML• Vysis LSI RB1 bij CLL• Vysis ATM bij CLL• Vysis TP53 bij CLL• Vysis LSI IGH/CCND1 bij CLL
Inleiding• Huidig protocol FISH op
beenmerg:• Kweken en oogsten van
beenmergmateriaal• Spatten• Voorbehandeling• Inzetten FISH preparaten• Wassen• Analyseren
• Te onderzoeken protocol:• Beenmergsmear maken• Inzetten FISH preparaten• Wassen• Analyseren
Materiaal & Methode• Beenmerguitstrijk maken
• Per objectglas 2 à 3 druppels bloed m.b.v. een naald• Strijk maken: egaal verdelen van bloed op het objectglas• Laten drogen en fixeren in methanol/azijnzuur, 10 minuten• Laten drogen en controleren op genoeg kernen met een fasecontrastmicroscoop
Materiaal & Methode• Denaturatie en Hybridisatie
• Probe opbrengen (5 microliter per spot)• Denatureren: 3 minuten bij 76°C• Hybridiseren: 120 minuten bij 37°C
Materiaal & Methode• Wassen
• 0,4× SSC bij 76°C, 2 minuten• 2,0× SSC+Tween(0.1%), 1 minuut• Dehydreren in 70%, 90% en 100% ethanol• Afdekken met DAPI- vectashield, 1:1
Materiaal & Methode• Verschillen met het huidige protocol
• Overslaan van enkele stappen: • Kweken en oogsten van cellen• Spatten van cellen op objectglas• Voorbehandeling
Materiaal & Methode • Overslaan van voorbehandeling
• RNase behandeling• Ribonuclease A, dat enkelstrengs RNA in stukjes knipt. Beter signaal en
minder achtergrond• Pepsine behandeling
• Afbraak van eiwitten rond de nucleïnezuren en kerneiwitten, betere toegang target DNA
• Formaldehyde
• Herstellen van eventuele verstoring van morfologie van de chromosomen en kernen
Resultaten• Gebruikte probes (tot nu toe)
• Vysis: BCR-ABL Dual Color Fusion (9q34/22q11) • Vysis: MLL Dual Color Break (11q23)
Resultaten
BCR-ABL probe: 2×BCR, 2×ABL MLL probe, 2 fusiegenen
MLL probe, 1 fusiegen en splitBCR-ABL probe: 3×BCR, 2×ABL
Casus Vrijdag 27 september ‘13
• FISH op beenmergmateriaal van een patiënt met de indicatie AML
• Gevonden afwijking met de BCR-ABL probe• 3 BCR signalen (groen)
→ trisomie 22?
Casus Vrijdag 27 september ‘13
• FISH op beenmergmateriaal van een patiënt met de indicatie AML
• Vervolg: CBFB (inv(16)) probe
• Inversie op chromosoom 16• Komt voor in ± 20% bij AML patiënten• Trisomie 22 komt vaker voor bij dit type AML
Casus Woensdag 2 oktober ‘13
• Definitieve uitslag:
• Na chromosomenonderzoek• 48,XY,+8,inv(16)(p13.1q22.1),+22[13]/46,XY[2]
• PCR
• FISH nomenclatuur• nuc ish(CBFB×2)(3’CBFB sep5’CBFB×1)
Hoe verder?• Testen van probes voor verschillende indicaties:
Probe: Indicatie:
Vysis LSI PML/RARA Dual Color, Dual Fusion Promyelocytenleukemie
Vysis LSI IGH Dual Color, Break Apart Mantelcellymfoom
Vysis LSI RB1 CLL
Vysis LSI IGH/CCND1 Dual Color, Dual Fusion CLL
Vysis LSI PML/RARA CLL
Bedankt!