EEN VERSNELDE DIAGNOSTIEK VAN FISH OP BEENMERGSMEARS

Naam: Kristiaan Huijbers

Datum: 8 oktober 2013

Stagecoordinator: Dr. Eva van der Berg

Inhoud

• Inleiding

• Doelstelling

• Materiaal & Methode

• Resultaten

• Casus

• En verder?

Inleiding• Wat is Fluorescentie In Situ Hybridisatie?

• Techniek voor chromosomenonderzoek (sinds 1990)• (delen van) chromosomen voorzien van fluorescerende labels • Analyse d.m.v. de fluorescentiemicroscoop• Interfase FISH of metafase FISH?

• Principe• Enkelstrengs fluorescerend gelabeld DNA (probe)• Complementair aan het te onderzoeken stuk DNA• Door binding van waterstofbruggen, hybridiseert de probe aan het stukje DNA van

interesse• Door verschillende kleuren van markers, onderzoek naar meerdere verschillende

stukken DNA mogelijk

Interfase Metafase

Gebruikte probes: CEP1, CEP16 en CEP17

Doelstelling

• Doelstelling:• Verbetering van diagnostiek op spoedbepalingen d.m.v. FISH op beenmerg• Sneller uit kunnen geven van een uitslag

• Met probes:• Vysis PML-RARA t(15;17) bij promyelocytenleukemie• Vysis IGH t(11;14) bij mantelcellymfomen• Vysis BCR-ABL t(9;22) bij CML• Vysis LSI RB1 bij CLL• Vysis ATM bij CLL• Vysis TP53 bij CLL• Vysis LSI IGH/CCND1 bij CLL

Inleiding• Huidig protocol FISH op

beenmerg:• Kweken en oogsten van

beenmergmateriaal• Spatten• Voorbehandeling• Inzetten FISH preparaten• Wassen• Analyseren

• Te onderzoeken protocol:• Beenmergsmear maken• Inzetten FISH preparaten• Wassen• Analyseren

Materiaal & Methode• Beenmerguitstrijk maken

• Per objectglas 2 à 3 druppels bloed m.b.v. een naald• Strijk maken: egaal verdelen van bloed op het objectglas• Laten drogen en fixeren in methanol/azijnzuur, 10 minuten• Laten drogen en controleren op genoeg kernen met een fasecontrastmicroscoop

Materiaal & Methode• Denaturatie en Hybridisatie

• Probe opbrengen (5 microliter per spot)• Denatureren: 3 minuten bij 76°C• Hybridiseren: 120 minuten bij 37°C

Materiaal & Methode• Wassen

• 0,4× SSC bij 76°C, 2 minuten• 2,0× SSC+Tween(0.1%), 1 minuut• Dehydreren in 70%, 90% en 100% ethanol• Afdekken met DAPI- vectashield, 1:1

Materiaal & Methode• Verschillen met het huidige protocol

• Overslaan van enkele stappen: • Kweken en oogsten van cellen• Spatten van cellen op objectglas• Voorbehandeling

Materiaal & Methode • Overslaan van voorbehandeling

• RNase behandeling• Ribonuclease A, dat enkelstrengs RNA in stukjes knipt. Beter signaal en

minder achtergrond• Pepsine behandeling

• Afbraak van eiwitten rond de nucleïnezuren en kerneiwitten, betere toegang target DNA

• Formaldehyde

• Herstellen van eventuele verstoring van morfologie van de chromosomen en kernen

Resultaten• Gebruikte probes (tot nu toe)

• Vysis: BCR-ABL Dual Color Fusion (9q34/22q11) • Vysis: MLL Dual Color Break (11q23)

Resultaten

BCR-ABL probe: 2×BCR, 2×ABL MLL probe, 2 fusiegenen

MLL probe, 1 fusiegen en splitBCR-ABL probe: 3×BCR, 2×ABL

Casus Vrijdag 27 september ‘13

• FISH op beenmergmateriaal van een patiënt met de indicatie AML

• Gevonden afwijking met de BCR-ABL probe• 3 BCR signalen (groen)

→ trisomie 22?

Casus Vrijdag 27 september ‘13

• FISH op beenmergmateriaal van een patiënt met de indicatie AML

• Vervolg: CBFB (inv(16)) probe

• Inversie op chromosoom 16• Komt voor in ± 20% bij AML patiënten• Trisomie 22 komt vaker voor bij dit type AML

Casus Woensdag 2 oktober ‘13

• Definitieve uitslag:

• Na chromosomenonderzoek• 48,XY,+8,inv(16)(p13.1q22.1),+22[13]/46,XY[2]

• PCR

• FISH nomenclatuur• nuc ish(CBFB×2)(3’CBFB sep5’CBFB×1)

Hoe verder?• Testen van probes voor verschillende indicaties:

Probe: Indicatie:

Vysis LSI PML/RARA Dual Color, Dual Fusion Promyelocytenleukemie

Vysis LSI IGH Dual Color, Break Apart Mantelcellymfoom

Vysis LSI RB1 CLL

Vysis LSI IGH/CCND1 Dual Color, Dual Fusion CLL

Vysis LSI PML/RARA CLL

Bedankt!