ونمو البكتيريا على البيئةتلقيح و نقل Aseptic transfers

9

دكتور يوسف الشريك

:النقل عملية من الغرض•

بيئة من الميكروبات، نقل عن عبارة النقل، عملية تعتبر • .حولها المحيط تلوثً أو تلوثاً، دون معقمة أخرى، إلى

األنابيب من كل تداول لعملية معين، نظام إتباع يجب• والبيئات المعقمة، ،والبيئات تحضيرها قبل والبيئات

يجب كما وغيرها، التلقيح وإبر ، بيتري أطباق في المصبوبة في للتحكم السليمة، التداول عمليات إجراء طالب كل على

بالنقاط التقيد مع جيدة، نتائج إلى للوصول التلقيح، عملية :التالية

النمو، وبيئات بكتيريا من الضرورية، المواد جميع تجهيز يجب1. .التلقيح وأدوات ،بنزن اللهب وموقد

.به الخاصة التلقيح أنابيب على ميكروب كل اسم يكتب2.

.له المعدة البيئة في تلقيحه تم ميكروب كل أن من التأكد3.

. بنزن لموقد لهب يعدل4.

للطريقة تلوث، تسبب قد التي المواد، من التخلص يجب5.

.السليمة

،على Loop(لوب)الطرفية وعقدتها ، التلقيح إبرة تعقم6.

االحمرار حتى بنزن موقد لهب

أن يجب ,أخرى إلى بيئة من معين ميكروب نقل عند7.

والسعال الكالم، ويمنع ،نظيفاً حولها المحيط يكون

.الهوائية التيارات عن االبتعاد يجب كما والعطس،

التجربة، وبعد قبل بالمطهرات التعقيم مكان أسطح تعقم8.

تحتوي التي تلك في المستعملة المطهرات أهم ومن .Lysol ليسول 10%

البكتيريا ونمو تلقيح•• Cultivation and Growth of Bacterial Cultures البكتيرية المستعمرات أشكال• -:البكتيرية المستعمرات أشكال معرفة من الغرض• .البكتيرية المستعمرات من المختلفة، المجموعات وتعريف معرفة• .المستعمرة وشكل مظهر أساس على البكتيرية، المستعمرات عزل• Exponentially اآلسية بالدالة النمو في البكتيريا خلية تبدأ•

البسيط، الثنائي االنقسام بطريقة خلية كل وتنقسم ،(1 جدول) وشكل مظهر ويبدأ ، (26 شكل)مغذية بيئة على نقلها بمجرد وحتى اآلالف إلى (الخاليا) أعدادها وصول عند بالظهور، الخاليا

من نوع وكل الميكروبية، بالمستعمرة تعرف عندها الماليين، الشكل ناحية من للمستعمرة، معينة خصائص له الميكروبات المتخصص يساعد وهذا األخرى، الصفات من وغيرها والمظهر،

وصحيحة، جيدة، نتائج إلى والوصول متناهية، بدقة وصفها على .(27)شكل

عددددددددددد

الخاليا

قوة

الدالة

اآلسية

عدد الخاليا بدالة اآلسية

1 02 *

2 12 **

4 22 ****

8 32 ********

16 42 ****************

32 52 ********************************

تكاثر الخاليا البكتيرية عن طريق التقسيم الثنائي( 1) جدول

تقسيم الثنائي البسيط للبكتيريا( 26)شكل

(.28)شكل بعض صفات المستعمرات لبعض أنواع البكتيريا

:المرق في البكتيريا النمو صفات•

على يساعد المرق في البكتيريا نمو صفات على التعرف•

في وتميزها المعروفة، غير للبكتيريا النمو نوعية معرفة -:وبالتالي المرق

.عليها التعرف خالل المختلفة الميكروبات بين تمييز1.

صفات بعض طريق عن الميكروبات، أنواع بعض تمييز2. .بها الخاصة النمو

الذي ميكروب، ألي النمو، خواص بأن تتذكر، أن يجب 3.

الحرارة درجة منها المختلفة العوامل من بكثير، يتأثر

المستعملة البيئة ونوع الهيدروجيني، األس ودرجة

.األخرى العوامل من وغيرها

بعض المصطلحات المستعملة في • -:منهاوصف نمو البكتيريا

Uniformصافية عكارة•turbidity

or clumpsغير واضحة •Flocculent

راسب •Sediment

Ring orأو حلقة على السطح غشاء •pellicle growth on surface

(.29شكل )

يوضح نمو البكتيريا في المرق داخل أنابيب االختبار( 29)شكل

غشاء أو حلقة على السطح .4راسب .3صافية عكارة .2 .تلقيحالمراقب بدون .1

نمو البكتيريا في البرطمان غير هوائي•يستعمل -:من نمو البكتيريا في برطمان غير هوائيالهدف •

البرطمان غير هوائي، إلحداث بيئة غير هوائية اصطناعية، ويمكن إحداث مثل هذه .الهوائيةالتي تسمح بنمو البكتيريا غير

-:كالتاليداخل البرطمان غيرهوائيةالبيئة يوجد داخل الجهاز غالفان، يحتويان على مواد كيمائية، إلنتاج •

الهيدروجين وثاني أكسيد الكربون، وفي الوقت نفسه، يحدث تفاعل كيمائي في البرطمان، بين األكسجين والهيدروجين،

Palladium باالديوملتكوين الماء في وجود مركب كيميائي catalyst ،(.أ 31)شكل ، وإحداث بيئة غير هوائية

، لخفض األكسجين وإنتاج ثاني بداخله أو بواسطة إشعال شمعة •، وإحداث بيئة غير هوائية، ويحضن غالبا ما الكربونأكسيد

(.ب 31)س شكل 37º - 35بين

برطمان الشمعة غير الهوائي ( ب) Anaerobic Jar (Brewer's Gas

Pak) برطمان لنمو البكتيريا غير الهوائية( أ)( 31) شكل

البرطمان عمل طريقة•

.المغذي اآلجار على تحتوي بتري، أطباق من مجموعة تحضر1.

،4 إلى 1 من رقم قسم كل ويعطي أقسام، أربعة إلى طبق كل يقسم2. .(35 شكل) هوائية غير أو الهوائية البكتيريا اسم على يدل رقم وكل

النمو، هوائية غير أو هوائية بكتيريا الطبق، في قسم كل في يزرع3.

.بالمسح أو بالتخطيط

مختلفة بالبكتيريا زرعها بعد مجموعات، ثالثة إلى بتري أطباق تقسم4. -:كالتالي

.ساعة 48 لمدة م °35 حرارة درجة عند الحضانة في األول قسم يحضن•

يحتوي الذي ( أ 34شكل ) هوائي غير برطمان في الثاني القسم يوضع• .ساعة 48 لمدة م °35 حرارة درجة عند ويحضن ، بالديوم على

مكان في يوضع األكسجين، دليل على المحتوي شريط أو الغالف، يفتح•

بينما األكسجين، وجود على األزرق اللون ويدل بسهولة، مراقبته يمكن .العكس على األبيض اللون يدل

يقطع الجزء الجانبي العلوي من الغالف المحتوي على •الهيدروجين وثاني أكسيد الكربون ووضعه في البرطمان غير

.الهوائيمل من الماء المقطر، باستعمال الماصة عن طريق 10يضاف•

.الفتحة .يقفل البرطمان بإحكام•يبدأ الغالف في إنتاج الهيدروجين، وثاني أكسيد الكربون، بينما •

على اتحاد األكسجين مع الهيدروجين لينتج الباالديوميساعد .الماء

يحضن البرطمان، غير هوائي بمحتوياته، في حضانة درجة • .ساعة 48م لمدة ° 35حرارتها

توضع المجموعة الثالثة، في برطمان يحتوي على شمعة، • .الستهالك األكسجين فيه

.تشعل الشمعة،أسفل البرطمان، بجانب أطباق بتري•

على المحتوي الغالف من العلوي الجانبي الجزء يقطع5. غير البرطمان في ووضعه الكربون أكسيد وثاني الهيدروجين

.الهوائي

عن الماصة باستعمال المقطر، الماء من مل 10 يضاف6. .الفتحة طريق

.بإحكام البرطمان يقفل7.

الكربون، أكسيد وثاني الهيدروجين، إنتاج في الغالف يبدأ8. الهيدروجين مع األكسجين اتحاد على الباالديوم يساعد بينما .الماء لينتج

درجة حضانة في بمحتوياته، هوائي غير البرطمان، يحضن9. .ساعة 48 لمدة م °35 حرارتها

شمعة، على يحتوي برطمان في الثالثة، المجموعة توضع10. .فيه األكسجين الستهالك

.بتري أطباق بجانب البرطمان، الشمعة،أسفل تشعل11.

اشتعالها بعد الشمعة، على يحتوي الذي البرطمان يقفل11.

في اتخذت التي اإلجراءات، بقية وتتبع بإحكام، مباشرة،

الكيميائية المواد على المحتوي الهوائي، غير البرطمان

.الشمعة من بدال

التأكد البرطمانات،يجب فتح وقبل الحضانة، مدة انتهاء بعد12.

األكسجين دليل لون من

العادية، الحضانة في النمو بين ويقارن البرطمان، يفتح13.

.هوائي غير البرطمان في والنمو

،()++ الجيد النمو موضحاً جدول في المشاهدة، تسجل14.

.( 34 و 33 ) شكل (-) النمو وعدم ،()+ ضعيف ونمو

الكمي لنمو البكتيرياالتقدير

Bacterial Population Counts

-:المباشر العد طريقة•

وتحسب المجهر، بواسطة استخداما الطرق أكثر من وهي •

العدد)المباشرة غير العد طريقة .الحية وغير الحية الخاليا

كتلة )المستعمرات تعد -:Plate Count Method:(الكلي

،(واحدة بكتيرية خلية نمو من والناتجة المتجمعة، الخاليا

.فقط الحية الخاليا عدد عن تعبر وهي

التخفيفات من سلسلة إجراء على الطريقة، هذه وتعتمد •

المستعمرات بظهور تسمح، التي ،(37 شكل )الغذائية للعينة

،(وحدة) مستعمرة 250 – 25 بين الواحد الطبق في

-:كالتالي الطريقة هذه مميزات أهم ومن•

أو الغذاء، في الموجودة الهوائية للميكروبات الكلي، العدد يعطي• األغذية تصنيع أو تحضير في المستعملة، المعدات سطح على

:.اآلتي في ويفيد اللحوم ومنها

.الخام مواد جودة على مؤشرا، الكلي العدد يعطي•

اللحوم وتجفيف تدخين عمليات بعد مفيدا، يكون الكلي العدد•

ودرجة الزمن بين العالقة تحديد في جدا، مهم الكلي العدد• الحرارة

.الغذائية للسلعة النهائية جودة لتحديد جدا، مهم الكلي العدد•

طريقة اختبار عينة اللحوم•يجب تعقيم جميع األدوات، والمعدات وأماكن االختبار؛ لتفادي 1.

.حدوث التلوث .جرام، من عينة اللحوم، تحت ظروف صحية جيدة 25توزن 2.مل من محلول 225تنقل العينة إلى خالط معقم، يحتوي على 3.

.10/1، للحصول على التخفيف الببتونجيدا لمدة 10/1، لتخفيف الببتونتخلط العينة بمحلول 4.

.دقيقتين، إلى أنبوبة تحتوي على 10/1من التخفيف مل1.0ينقل 5.

2 - 10التخفيف .على مل ماء معقم، للحصول 9.0

.جيدااألنبوبة، وتخلط محتوياتها تغلق 6.

، بواسطة ماصة 2 - 10من التخفيف مل1ينقل 7.

تخفيف على مل ماء معقم، للحصول 9معقمة، إلى

10- 3 .

، وتنقل الكميات معقمة بيتريخمسة أطباق تجهز 8. -:كاآلتيالمذكور أعاله إليها التخفيفاتاآلتية من

.مل من التخفيف األول 1.0يؤخذ –

.من التخفيف الثاني مل1.0يؤخذ –

.من التخفيف الثالث مل1.0يؤخذ –

.تكتب البيانات على كل أنبوب بقلم مقاوم للحرارة والماء–

) إلى األطباق، بعد تبريده إلى درجة حرارية اآلجاريضاف 9.45º يوضع الدورق البيئة ) التي يستحملها الخد( س

مع التخفيف في اآلجارتخلط بيئة (.قبل صبه في األطباق

.بهدوء 8الطبق على شكل رقم

.عقبتصلب البيئة في الطبق، يقلب الطبق رأسا على بعد 10.

طريقتان لعدد الكلي للبكتيريا كما موضحتان في هناك 11.

-:وهما( 34)الشكل

.The pour plate method الصب البيئة في الطبق طريقة 12.

. The spread plate methodاالنتشار في الطبق طريقة 13.

للحصول )يومين م، لمدة ° 35األطباق عند درجة تحضن 14.

، أو تحضن (على بكتيريا المحبة للدرجات الحرارة المعتدلة

أيام، لنمو بكتيريا المحبة 10س لمدة ° 7عند درجة

.للبرودة

، اآلجارذلك يتم عد المستعمرات، المتكونة على سطح بعد 15.

.مستعمرة فقط 250 – 25التي عددها بين

.حدد عدد البكتيريا لكل مل في عينة الماء: مثال•

، Nutrient agarمغذي مرق على محتوي بيتر طبق يأخذ1. .للتجربة المطلوبة البيانات عليه وتسجل

ويضاف مل 11 منها ويؤخذ البرك، ماء من كمية تجمع2. أنبوب ) األمالح من خالياً المعقم، الماء من مل 99 إلى .جيداً محتوياته وتخلط ، (1 رقم

يحتوي الذي (2) أنبوب إلى ،(1) أنبوب من مل 1 ينقل3. وتخلط األمالح، من الخالي ، معقم ماء مل 9 على

.جيداً محتوياته

يحتوي ،الذي (3) أنبوب إلى (2) أنبوب من مل، 1 ينقل4. محتوياته وتخلط األمالح، من خالي معقم ماء مل 9 على .جيداً

التخفيفاتمل، من 1.0مقدار ( 3و 2و1)األنابيب من ينقل 5.ينقل إلى كل طبق تخفيف ) المتتالية، إلى ثالثة أطباق بتري

(.واحد فقط

مل، بعد تبريده إلى درجة حرارة 45، مقداره اآلجاريصب 6. .بتري، في كل طبق (يستحملها الخد) مناسبة

، عدد المرات، 8كل طبق، بعد ذلك حركة على شكل رقم يحرك 7. .جيداً لضمان توزيع العينة في البيئة المغذية

م لمدة ° 35األطباق لتبرد، وتقلب وتحضن، عند درجة تترك 8. .ساعة 48

عد المستعمرات، التي تكونت في كل طبق من األطباق يتم 9. .وحدة تكوين مستعمرة 250 - 25 الثالثة، يتراوح بين

-:الحل•

لتحديد عدد البكتيريا أو الفيروسات يستعمل •

تكوين Colony-forming units(CUFs)اصطالح

وحدة مستعمرة بكتيرية

وحدة تكوين نمو Plaque-forming units(PFUs)أو•

(.39)فيروسي أنظر الشكل التالي

يوضح نمو البكتيريا أو الفيروسات عل بيئة ( 39)شكل

مالئمة لكل منهما

وحدة 250 - 25كما هو معروف تعد األطباق ما بين •

أعطت هذه التجربة ثالثة نتائج .فقط،تكوين مستعمرة -:التالية

إلى التخفيفاتالمثالية وكيفية إضافة التخفيفاتتوضيح طريقة ( 40)شكل

.األطباق وعدد البكتيريا في األطباق لكل تركيز أو تخفيف

وحدة )المستعمرات فقد كان عدد ( 40)شكل كما هو موضح في • -:كاآلتي( تكوين مستعمرة

.وحدة تكوين مستعمرة 1•

.وحدة تكوين مستعمرة 45•

.وحدة تكوين مستعمرة 461•

.مستعمرة فقط 45إذا يتم حساب للطبق الذي يحتوي على •

مستعمرة كان 45التي أعطي 2التخفيف الكلي لألنبوب رقم •102/1×10/1 =103 /1.

.مل 1.0= بيتريكمية التخفيف التي نقلت إلى طبق •

= 410× 45= مستعمرة 45= ( م)المعادلة بتطبيق • مل / 450000= 105× 4.5

• 103 /1 ×10/1

بالعكارة البكتيري النمو تقدير•

•Turbidimetric Estimation of Bacterial Growth

spectrophotometer الضوئي الطيف قياس جهاز يستعمل • نمو تسببها التي المحلول عكارة درجة لقياس الموجي الطول األحادي الذي ) المرشح من النافدة الضوء أشعة تمر حيث فيه، البكتيريا

المعلق خالل (فقط المرغوب الموجي الطول بمرور فقط يسمح المعلق، من النافذ أو المنعكس، الضوء كمية وتقاس ، البكتيري وكلما النافذ، الضوء لتقدير بجهاز متصلة كهربية ضوء خلية بواسطة

كمية قلت المعلق، تعكير زاد ، المعلق في البكتيريا نمو تركيز زاد .(41 شكل )المعلق من النافذة الضوء

على الساقط للضوء لوغارثمية قيمة عن عبارة الضوئية والكثافة • OD) )الضوئية الكثافة تكون وعليهI =النافذ والضوء ، I0 =العالق

البكتيريا لنمو الضوئية الكثافة قيم من بياني رسم ويمكن•

(سبكتروفوتومتر)الطيفي آلية عمل الجهاز ( 41)شكل

:طريقة العمل•

B&L Spectronic )سبكتروفوتومتريجب معايرة جهاز 1. -:كالتاليقبل البدء في التجربة ( (20

.يوصل الجهاز بالتيار الكهربائي2.

( .42شكل )التشغيل يشغل عن طريق مفتاح 3.

.دقيقة قبل إجراء التجربة 20يترك لمدة 4.

. 686ويعدل الجهاز على الطول الموجي 5.

.وتعدل مؤشر التعديل على الصفر 6.

في مكان العينة ( Cuvette )الزجاجية الخلية توضع 6.

مل مرق المغذي 3، والتي تحتوي على المحلول لقراءة

.المعقم، ويغلق مكان العينة بعد ذلك

للضوء النافذ من % 100مؤشر القراءات على يعدل 7.

المرق المغذي، وبعد التأكد بأن قراءات الجهاز ما بين

.% 100الصفر و

، المغذي مرق على المحتوية الزجاجية الخلية تخرج•

المراد البكتيريا نمو بالتخفيف مرة كل في وتعبأ وتفرغ،

ويغلق القراءات مكان في ووضعها نموها، درجة تقدير

على تخفيف كل عن قراءات خذ{وت العينة، وضع مكان .حده

التجربة خطوات•

المحتوية االختبار أنبوبة إلى بكتيرية بيئة مل 0.1 ينقل• .المغذي المرق من مل 5 على

جيداً التلقيح عملية بعد األنبوب مكونات تمزج• . م °37 درجة عند األنبوب يحضن• قبل شرحه سبق كما سبكتروفوتومتر الجهاز يعدل يشغل•

.االختبار أنبوب في البكتيريا نمو قراءات أخذ ما لمدة ساعة، نصف كل لألنبوب بالجهاز قراءات تؤخذ•

لمزج قراءة كل قبل األنبوب رج مع ساعة، 12 – 10 بين .جيداً العالق

الزمن يكون بحيث البيانات البياني، رسم ورقة على يوضع• المحور على النمو ولوغاريتم (س)األفقي محور على

.(ص)العمودي

الكليقياس النمو بحساب عدد الخاليا •

حساب عدد الخاليا مباشرة باستعمال شريحة خاصة يمكن •

تحتوي في منتصفها حجرة مقسمة إلى مربعات متساوية في

(42شكل )المساحة

خطوات طريقة المباشرة لحساب عدد الخاليا الكلية( 42)شكل

خطوات التجربة•

يضاف بالماصة كمية صغيرة من المرق المغذي المحتوي • على البكتيريا، إلى غرفة العد

.تضع الشريحة الزجاجية الرقيقة عليها•

20تفحص تحت المجهر، وتعد الخاليا في ما ال يقل عن •

مربعاً، خمسة في كل زاوية من المقسم الكبير وخمسة في .الوسط

(.42)الشكل تحسب عدد الخاليا كما هو موضح في •

طريقة الحساب•

=( 42شكل )الكبير حجم المعلق في مقسم •

.خلية بكتيرية 14يحتوي مقسم الكبير على •

17,500,000= = المقسم إذاً عدد الخاليا في هذا •