Tinción Gram

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I. IntroduccinLa correcta identificacin de un microorganismo permite entender mejor el comportamiento del mismo, para ello es importante el uso de tcnicas especializadas en dicho campo, que permitan establecer diferencias morfolgicas, qumicas, fsicas entre otras. Ante dicha necesidad, la tincin diferencial de Gram nos brinda la solucin, pues permite la diferencia de 2 grupos de bacterias: Gram (+) y Gram (-), a partir de la estructura de su pared celular. Como toda tcnica de reconocimiento tiene cierto pasos que debe seguirse con exactitud. Empezando por requerir 4 soluciones el primero, el colorante bsico que tie la clula; el segundo el mordiente, ayuda en la fijacin del colorante en las estructuras; el tercero, el decolorante que retira el colorante en las Gram (-) mientras que en el otro grupo no tiene efecto dicha sustancia es principalmente quien establece diferencias entre ambas divisiones y el cuarto que es el contrastante, da el color contrastante al inicial principalmente en las Gram (-). Expuesto lo anterior se procede a mostrar los procedimientos adecuados as como la fundamentacin tericos para desarrollar dicha tcnica.

Objetivos: Demostrar a travs de la tcnica de tincin diferencial de Gram, la existencia de dos grupos principales de bacterias.

Comprender el uso de cada compuesto que compone la tincin de Gram y entender su propsito de uso.

Staphylococcus aureus teida por tincin Gram.II. Materiales y mtodos

Materiales

TUBO DE ENSAYO CON MUESTRAASA DE KOLLEPORTA OBEJETOS

PINZA

SOPORTE PARA TINCIN

MECHEROMICROSCOPIO

LUGOLSAFRANINAACEITE DE INMERSINDECOLORANTECRISTAL VIOLETA

PROCEDIMIENTO

1. Preparar 4 lminas fijas de:1 Escherichia coli.2 Staphylococus aureus.3 Bacillus cereus.4 Mezcla de los 3 mencionados anteriormente.

2. Agregar el colorante en exceso: Cristal Violeta. Reposar 30 segundos y lavar la muestra.

3. Agregar el mordiente en exceso: Lugol. Reposar 2 minutos y lavar la muestra.

4. Agregar el decolorante 6-8 gotas: Alcohol Acetona. Su adicin sirve para retirar el colorante debe repetirse 2 veces de ser posible para una correcta tincin posterior de las Gram (-). Lavar la muestra.

5. Agregar el colorante contrastante en exceso: Safranina Dejar reposar por 2 minutos y lavar.

6. Secar la muestra con papel toalla. Debe ser con toque suaves para evitar la perdida de la muestra, seguido limpiar con algodn la parte anterior del cubre objetos para quitar el humo segregado por el mehero. Colocar dos gotas de aceite, colocar al microscopio y observar.

III. Resultados

Figura 1 Escherichia coli (EC) Gram negativa

Figura 2 Bacillus cereus (BC) Gram positiva

Figura 3 Staphylococcus aureus (ST) Gram positiva

Figura 4 - Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus

Bacterias (y combinaciones)Tincin GramVisualizacin de la muestra

Escherichia coli (EC).

Gram negativa. Pequeas bacterias en forma de cocobacilo (muchas de ellas apenas perceptibles a la vista), de color rosado (no llego a teirse de rojo intenso como se esperaba).

Bacillus cereus (BC). Gram positiva.Bacterias medianas en forma de bacilo, de color violeta intenso, mostrando asociacin de estreptobacilo.

Staphylococcus aureus (ST).Gram positiva.Bacterias medianas en forma de coco, de color violeta intenso, mostrando asociacin de estafilococo.

Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus.

Gram negativa, Gram positiva y Gram positiva, respectivamente.Se observa la comparacin del tamao de las tres bacterias, donde el Bacillus c. y el Staphylococcus a. muestran tener un tamao idntico. Mientras que la Escherichia c. muestra tener un tamao mucho menor a tal punto que llega a ser casi imperceptible a la vista.

IV. Discusin de los resultadosUna de las coloraciones diferenciales ms aplicadas en microbiologa, la tincin Gram, fue inventada por el mdico dans Christian Gram en 1884, cuando buscaba nuevos mtodos para colorar bacterias. Dicha tincin consiste en tratar un frotis con un compuesto de la pararosanilina (como por ejemplo, el cristal violeta, luego con una solucin de ioduro de potasio (lugol), decolorarlo con alcohol y finalmente tratarlo con un colorante llamado contraste (que puede ser la fucsina, safranina, marrn Bismarck, etc). Las bacterias que no pierden el primer colorante luego de ser tratadas con alcohol, apareciendo de color violeta, se llaman Gram positivas. Y aquellas que se decoloran con el alcohol y se decoloran con el segundo colorante o de contraste, apareciendo teidas de rosado, se denominan Gram negativas. As, este mtodo sirve para distinguir dos grandes grupos de bacterias. (Garassini L.; 1958).En la prctica, se trabajo con tres muestras de bacterias: La Escherichia coli, un bacilo Gram negativo relacionado con las vas entricas (patgeno dentro y fuera de la misma), es la causa ms comn de infecciones de las vas urinarias y de sepsis por bacilos Gram negativos. Es una de las dos causas ms importantes de meningitis neonatal agente que ms a menudo acompaa a la diarrea del viajero; tambin es el anaerobio facultativo ms abundante en colon y heces. El bacillus cereus, un bacilo Gram positivo, que al igual que los bacillos Gram positivos, es un formador de esporas, y es importante en medicina debido a que causa intoxicacin alimentaria. Y por ltimo, el Staphylococcus aureus, que al igual que los dems estafilococos, son cocos esfricos ordenados a menudo en grupos irregulares, siendo un genero importante en medicina junto con el gnero Streptococus, y careciendo de aparato locomotor y la habilidad de formar esporas. (Wevinson W, Jawtz E.; 1999). La propiedad de retener el colorante es una particularidad caracterstica no solo de bacterias sino tambin de levaduras, pero esta propiedad puede variar con la edad de la bacteria y con el pH. Del medio principalmente, pues se observa que cuanto ms joven es el cultivo ms fuertemente reaccionan los microorganismos Gram positivos, perdiendo esta propiedad a medida que el cultivo envejece, transformndose en Gram negativos (Garassini L.; 1958). Se vuelven Gram negativos debido a que se tien por la safranina. Anlogo efecto produce en ocasiones por cambios en el medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecucin de la prctica. Por este motivo, es preciso atenerse, en la prctica del procedimiento establecido (Pelczar M., Reid R.; 1966). Un ejemplo de mala praxis en la prctica, es dejar que el decolorante (el alcohol) acte durante largo tiempo (en vez de echar unas cuantas gotas a modo de lavado, como se recomienda en la mayora de los manuales, aplicar una gran dosis y/o dejar reposar el decolorante por mucho tiempo) en la muestra. Consecuencia de ello es que los organismos Gram positivos pueden decolorarse tambin, de manera que despus de que la tincin se completa, aparecern como Gram negativos. Por otra parte, si la decoloracin no se lleva a cabo durante tiempo suficiente (respetar el tiempo establecido en la prctica de cada colorante), los organismos Gram negativos pueden aparecer como Gram positivos. Por lo tanto, se necesita mucha prctica antes de llevar a cabo la tincin de gran con xito (Burdon K., Williams R.; 1971).Este distinto comportamiento de las bacterias se basa en la propiedad que tienen los colorantes bsicos, derivados de la pararosanilina, de formar en presencia de soluciones ioduradas, compuestos iodados, que se fijan intensamente sobre ciertas sustancias, combinndose con ellos en forma estable y que los disolventes tardan en descolorar (Garassini L.; 1958).El cuerpo citoplasmtico de algunas bacterias contienen dichas sustancias, fijndose, por lo tanto, el primer colorante fuertemente al actuar la solucin de lugol. Los microorganismos, cuyo citoplasma no se combina con los compuestos iodurados del cristal violeta, al tratarlos con el alcohol se descoloran y pierden este colorante, y al tratarlos con otros colorantes se coloran nuevamente (Garassini L.; 1958).Benians afirma que el yodo forma con e lvioleta genciana una gran molcula soluble en el alcohol, que es arrastrada de las bacterias Gram negativas, y que retienen las Gram positivas; la diferencia se debera a la distinta permeabilidad de la membrana celular en los dos tipos de bacterias. Chruchman cree que los microorganismos Gram positivos poseen una zona cortical que es responsable de la retencin del colorante. Stearns y Atarns han demostrado que las protenas de las bacterias Gram positivas tienen un punto isoelctrico ms cido que las de las Gram negativas, lo que explica por qu estos microorganismos muestran mayor afinidad por los colorantes bsicos (Merchant I., Packer R.; 1970). Una hiptesis sugiere que en las bacterias quedan reaccin positiva (que retiene el cristal violeta) existe un complejo especial de magnesio-cido ribonucleico-protena-hidrato de carbono, el cual forma un compuesto insoluble con el colorante y el iodo. Una de las observaciones que apoyan esta hiptesis es el hecho de que, tratando las bacterias gram-positivas con la enzima ribonucleasa, se hacen gran-negativas; la ribonucleasa degrada el cido ribonucleico, y destruye as el complejo que se une al colorante. (Pelczar M. Reid R.; 1966). Deuszen afirma que la tincin de Gram se debe a una reaccin qumica dependiente de la propiedad de la nucleoprotena bacteriana de formar nuevos compuestos. La teora de Churchman ha sido reforzada cerca a la dcada de los setenta por Henry y Stacey, quienes han logrado despojar a las bacterias Gram positivas de una parte escencial de su material Gram positivo, dejando citoesqueletos y un extracto Gram negativos. Los investigadores mencionados lograron obtener estos resultados realizando un extracto de bacterias lavadas a 60oC con una solucin acuosa de una sal biliar al 2%, en presencia de oxgeno. El producto extrado puede precipitarse por el alcohol y consiste