TÉCNICAS DE TINCIÓN

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TCNICAS DE TINCINPara Micobacterias

Caractersticas microscpicas y de tincin

Las micobacterias son bacilos rectos o ligeramente curvados. Son inmviles y no esporulados. Con la tincin de Gram no se tien o se comportan como Gram positivos dbiles. La presencia de cido miclico en su pared les confiere una resistencia a la solucin de alcohol cido que los diferencia del resto de las bacterias. Aprovechando esta propiedad se desarroll una tincin especfica para bacterias cido alcohol resistentes. Con la tincin de Zielh-Neelsen las micobacterias se observan como bacilos de color rojo. Aparecen individualmente o formando pequeos grupos. y la tincin fluorocrmica con auramina ambas se basan en una propiedad peculiar de las micobacterias ya que resisten la decoloracin con alcohol clorhdrico.

Preparaciones fijadas y teidas.

Las preparaciones fijadas y teidas son las ms utilizadas en Microbiologa por dos razones: - La tincin facilita la visualizacin de la bacteria - Con varios colorantes clasificamos la bacteria en distintos grupos. La mayor desventaja es que la bacteria ya est muerta.

Tincin de Ziehl-Neelsen:

Este mtodo se basa en que las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (por ejemplo, el cido miclico) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan bacilos cido-alcohol resistentes o BAAR. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de ZiehlNeelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Tincin de Ziehl-Neelsen:

a) Filtre la fucsina fenicada antes de usarla. b) Cubra la superficie del extendido con fucsina. c) Pase la llama del mechero (o torunda empapada en alcohol) por debajo de la lmina, hasta que se produzca la emisin de vapores blanquecinos. Deje de calentar y repita el procedimiento dos veces ms. La emisin de los vapores blanquecinos debe lograrse tres veces en 5 minutos, que es el tiempo adecuado de contacto entre el extendido y el colorante. La fucsina no debe hervir sobre la lmina, si disminuye por evaporacin o derrame, hay que reponerla.

d) Elimine la fucsina con agua del tubo a baja presin, de manera que la pelcula no se desprenda. e) Gire la lmina para lavar su cara inferior y as eliminar la fucsina ah depositada. f) Cubra la superficie del extendido con alcohol-cido al 3% efectuando un movimiento de vaivn y espere 2 minutos de modo que el alcohol-cido lo decolore y arrastre suavemente la fucsina. Esta operacin puede repetirse hasta que sobre el extendido se observe un color rosado.

g) Lave la lmina con agua segn se describe en el punto d. h) Cubra el extendido durante 1 minuto con solucin de azul de metileno. i) Lave ambas caras de la lmina con agua. j) Seque las lminas a temperatura ambiente, en posicin vertical, con el extendido hacia el frente. k) Revise la identificacin de los frotis y rotlelos de nuevo si se borraron durante la tincin.

Ziehl-Neelsen:

Hacer un frotis de la muestra de esputo. Dejar el frotis sobre el puente de tincin. Aplicar fucsina-fenicada. Calentar con un mechero hasta la emisin de vapores (3-5 minutos). Decolorar con alcohol-cido. Aplicar azul de metileno (1 minuto). Enjuagar con agua

Observacin microscpica

La observacin microscpica debe determinar la presencia de BAAR (concordancia cualitativa) y establecer su nmero aproximado por campo microscpico (concordancia cuantitativa).

Considere campo microscpico til aquel en el cual se observan elementos celulares de origen bronquial (leucocitos, fibras mucosas y clulas ciliadas). Los campos en que no aparezcan dichos elementos no deben contabilizarse en la lectura.

Observe cada campo microscpico, en superficie y profundidad, con objetivo de inmersin. Establezca una pauta uniforme de observacin.

El nmero de campos que se debe observar variar segn la cantidad de bacilos que contenga la muestra. Si no se encuentran BAAR o se observa menos de 1 bacilo por campo en promedio, deben examinarse por lo menos 100 campos. Si se encuentran de 1 a 10 BAAR por campo en promedio, es suficiente observar 50 campos. Si se encuentran ms de 10 BAAR por campo en promedio, basta con observar 20 campos.

Cuando aparecen grumos de bacilos se debe contar como uno. Si el nmero de grumos que aparece es significativo, se debe hacer la observacin en el reporte: hay BAAR en grumos, para indicar que el nmero verdadero de BAAR puede ser mayor que el que se reporta.

Cuando el frotis es de otro tipo de muestra, que no sea esputo o del sedimento de un esputo, solamente se reporta cualitativamente.

Reporte de resultados

Negativo (-): No se encuentran BAAR en 100 campos observados (c.o.). o si se encuentran menos de 3 BAAR en 300 campos pticos observados.

Nmero exacto: de 1-9 BAAR en 100 campos observados. Positivo (+): Promedio de menos de 1 BAAR por campo, en 100 campos observados. Lo que es lo mismo, de 10 a 99 BAAR en 100 campos

Positivo (++): Promedio de entre 1 a 10 BAAR por campo, en 50 campos observados. Positivo (+++): Promedio de ms de 10 BAAR por campo, en 20 campos observados.

Ejemplos:

Si observa 24 BAAR en 100 campos pticos: 24/100=0,24 Lo que implica menos de 1 y corresponde reportar: BAAR positivo (+). Si observa 5 BAAR en 100 campos pticos: Lo que implica de 1-9 en 100 campos observados y corresponde reportar: Positivo (5) BAAR en 100 campos.

Bacilos cido Alcohol Resistentes.

Tincin de Auramina

Consiste en teir con Auramina (Colorante fluorocrmico), decolorar con cido alcohol, contracolorear con permanganato potsico, lavar con agua abundante y dejar secar.

Al observar la preparacin al microscopio de Fluorescencia con objetivo de 25 X los microorganismos cido alcohol resistentes (Micobacterias) aparecen con fluorescencia amarillo-naranja

La tincin fluorescente es mas rpida ya que la observacin se realiza sin objetivo de inmersin, utilizndose por tanto campos de observacin mas amplios con lo que se gana tiempo, por lo que su utilizacin esta plenamente justificada en aquellos laboratorios que deben realizar mas de 10 exmenes al da

El examen microscpico debe realizarse rastreando la preparacin observardo aproximadamente 100 campos microscpicos y contando los BAAR observados, ya que es necesario informar del n de BAAR presentes

G R A C I ASM E S A N. 3