MEDIMPEX LLC

qPCR БОЛОН RT-PCR ТЭДГЭЭРИЙН ОНЦЛОГ ЯЛГАА, ХЭРЭГЛЭЭ,

ДАВУУ ТАЛ Real-Time PCR буюу qPCR-quantitative

PCR-ийн нэг төрөл болох Real-Time PCR ийг RT-PCR гэж товчилдог байсан бөгөөд энэ нь доор дурьдагдах reverse-transcriptase PCR-ийн товчлолтой адил тэмдэглэгдэх болсоноос шалтгаалан хооронд нь ялгахын тулд (Quantitative) буюу qPCR гэж нэрлэдэг. Энэ нь уламжлалт PCR-ийг бодвол нилээд олон давуу талтай. Уламжлалт PCR-ийг хөгжүүлэх зорилгоор зохион бүтээгдсэн гэж ойлгож болно. Иймд илүү хурдан ганц шаттайгаар процессыг явуулдаг болон флоуресцент будагчийн тусламжтайгаар олшруулж байгаа (ДНХ, сДНХ, РНХ) хэсгийн тоон утгийг тодорхойлдог давуу талтай учир ийнхүү нэрлэдэг.

Agilent Mx3005P QPCR System and (HRM) High Resolution Melt Solution

RT-PCR буюу Reverse transcriptase PCR

Байгаль дээрх биологийн системүүдийн генетик мэдээлэл зөвхөн ДНХ-н моекулд хадгалагдахаас гадны ДНХ-ийг огт агуулдаггүй биологийн биетүүд байдаг. Зарим төрлийн (жишээ нь HIV буюу ДОХ-ын үүсгэгч, EAV буюу Адууны артритын үүсгэгч, гэх) Вирусууд бөгөөд геном нь зөвхөн РНХ-ийн молекулаас тогтдог. Эдгээр нь reverse-transcriptase хэмээх энзимын оролцоотойгоор РНХ-ын молекулыг сDNA буюу комплементар днх болгон хуулбарлан ашигладаг байна. Байгаль дээрхи энэ системд үндэслэн ажилладаг PCR-ын нэгэн төрөл бол RT-PCR буюу Reverse transcriptase-PCR юм. Мөн генийн экспрессийн судалгаанд днх-с илүүтэйгээр мРНХ дээрх мээдэлэл, болон түүний тоо хэмжээ илүү ач холбогдолтой байдаг учир энэхүү биологийн системээс ялгаж авсан mRNA молекулыг эхлээд Reverse transcriptase-PCR урвалд оруулан сДНХ болгон хувиргаад үргэлжлүүлэн өвөрмөц праймерүүдын тусламжтайгаар Real-Time PCR-ийг үргэжлүүлэн явуулдаг.

REAL-TIME-PCR ЕРӨНХИЙ ЗАРЧИМ: Ажиллагааны үндэс нь уламжлалт ПГУ-тай адил боловч Sybr-green хэмээн будагч бодис ашигладагн энэ нь давхар гинж бүхий днх-н молекулын эрчлээсны жижиг нугалаасны хэсэгт холбогдон тодорхой (520нм) долгионы урттай цацаргалт өгдөг. Нийлэгжсэн давхар гинжтай днх дараагийн циклд дахин денатурацид орж эхлэх үед будагч молекулын сигнал өөрчлөгддөг учир цикл бүрт дэхь днх-н гарц буюу харьцангуй агууламжыг цацаргалтын эрчмын өөрчлөлтөөр хайлах температурын муруйнд үндэслэн тодорхойлж болдог байна. Энэ нь уг аргын

хамгийн том давуу тал бөгөөд уламжлалт ПГУ-д ашиглагддаг гель-анализаас хавьгүй илүү нарийвчлалтайгаар тодорхойлдог. Сүүлийн үед Sybr-green-ээс гадна олон төрлийн илүү өндөр чанартай давхар сигнал үзүүлэгч өдөөгч молекултай холбогдсон проб-probe-ууд өргөн ашиглагддаг болж праймер дизайнууд нь янз бүрээр хийгдэх болсон (жишээ нь: LNA® Double-Dye probes, TaqMan® probes, Molecular Beacon probes, Scorpions® primers, FRET probes, MGB Eclipse® probes гэх мэт)

Уламжлалт PCR-ийн зарим сул талууд Мэдрэг чанар багатай Нарийвчлал муутай Бүрэн Автомат бус Зөвхөн днх-н урт буюу хэмжээнд

суурилан тодорхойлдог Үр дүн нь экспрессийн хэмжээтэй

тохирдоггүй Ашиглагддаг Ethidium bromide нь тоон

анализын чадамж султай PCR-н процесс дууссаны дараа

үргэлжлүүлэн явуулдаг учир Динамикийн өргөн багатай< 2 logs

Уламжлалт PCR нь урвалын явцад бүтээгдэхүүний гарцыг хянах боломжгүй урвалж явуулан дууссаны дараа агарозын-гель электрофорезын аргаар бүтээгдэхүүний тоо хэмжээг тодорхойлдог учир хугацаа ихээр зарцуулдаг. Днх-ийн тоон утгыг тодорхойлхын тулд ашиглагддаг хэт ягаан туяаны үйлчлэлд днх-молекултай холбогдон өнгө үзүүдэг Etidium-bromide хэмээх хүчтэй арьсны хавдар үүсгэгч будагч бодис ашигладаг учир судлаачдын эрүүл мэндэд халтай байдаг.

Уламжлат ПГУ болон qPCR –ийн хоорондын ялгааМ-молекул масс, болон урт нь тодорхой мэдэгддэг худалдааны маркерА-дээжВ-дээжЭнэ зурагт уламжлалт ПГУ-н дараа ялгаатай молекул масс, урт бүхий хоёр дээж маркертай харьцангуйгаар хоорондоо ижил мэт харагждаж байна. Харин хажуугийн хайлах температурын

муруй дээр А болон В дээж хоорондоо хэр ялгаатай нь тодорхой дүрслэгдэж байна. Үүгээрээ qPCR илүү мэдрэг чанартай байдаг.

QPCR ХЭРЭГЛЭЭ: Вирус тоолох, тоон шинжилгээ хийх (БЗХӨ,

Мөөгөнцөр, гепатит-В,С вирус гэх мэт) Хорт хавдын шинжилгээ хийх Микро-array-н дүнг баталгаажуулах Эмэн эмчилгээнд хяналт хийх ДНХ-н эвдрэлийг хэмжих ДНХ-н метилжилт Өвчин үүсгэгчийг тодорхойлох Генонипын судалгаа Рекомбинант уургийн үйлдвэрлэл GMO тодорхойлох Гений зохицуулга: генетик, эпигенетик Соматик мутацын анализ Нэг нуклеотидын полиморфизмын генотип бусад

References http://qpcr.gene-quantification.info/K. Mullis, F. Faloona, S. Scharf, R. Saiki, G. Horn, H. Erlich, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. (51) (1986) 263–273.R.K. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K.B. Mullis, G.T. Horn, H.A. Erlich, N. Arnheim, Science 230 (4732) (1985) 1350–1354.

http://www.genomics.agilent.com/en/HRM-Master-Mix/Brilliant-HRM-Ultra-Fast-Loci-Master-Mix/;jsessionid=vd01gJ1rA23azV1Gi1TPqZg8xuQo8lwLzb9n8dms8gGpbiWFA114!204910143?cid=AG-PT-190&tabId=AG-PR-1325