ENSAYO DE DIFERENTES TIPOS DE

BIORREACTORES PARA ESCALAR

LA PRODUCCIÓN DE LA ENZIMA

LIGNINOPEROXIDASA EN CULTIVOS

SUMERGIDOS DE

PHANEROCHAETE CHRYSOSPIRIUM

ENZIMAS: Catalizadores biológicos que hacen posible el funcionamiento de la célula en condiciones ambientales moderadas.Las enzimas son proteínas y están clasificadas dependiendo del tipo de reacción que catalizan en oxireductasas, transferasas, hidrolasas, etc.

INTRODUCCIÓN

FACTORES DECISIVOS EN LA SELECCIÓN DEL MICROORGANISMO

1• Capaz de dar una alta producción de enzima al menor tiempo posible

de fermentación.

2• Que sean extracelulares.

3• Las cepas no deben producir sustancias toxicas.

4• Debe generar la menor cantidad de subproductos interferentes.

CONDICIONES OPTIMAS PARA LA CEPA SELECCIONADA

Debe ser determinada experimentalmente. En la cual la temperatura, la composición de la solución de nutrientes y la suplementación de sustrato optimas para los cultivos pueden ser determinados.

Tienen como desventaja que no se puede controlar los valores de pH y la concentración de oxigeno disuelto.

Para la selección del biorreactor se deben tener en cuenta los siguientes requerimientos:

FUNCIONALES

Debe existir una alta transferencia de masa liquido-gas.

Es necesaria la formación de interfaces liquido-gas.

Debe haber una adecuada relación de las fases dispersadas (gaseosa, liquida, solida)

ECONOMICOS

Fácil de operar bajo condiciones asépticas.

Flexibilidad razonable con respecto a los requerimientos de varios procesos.

Bajo poder especifico de consumo.

MATERIALES Y

MÉTODOS

BIOREACTORES: SE REALIZARON SEIS EXPERIMENTOS PARA LOS QUE SE DISEÑARON 3 TIPOS DE BIORREACTORES

BIORREACTORES: el biorreactor es sin duda uno de los equipos fundamentales de la microbiología industrial. Es el recipiente donde se realiza el cultivo, y su diseño debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los microorganismos.

El biorreactor de tanque agitado es de uso muy definido. La agitación se realiza mecánicamente mediante un eje provisto  de turbinas  ocasionada por un motor.

Biorreactor de Columna de Burbujeo.Este tipo de bioreactor carece de un sistema de transmisión mecánica para mezclar el caldo de cultivo, es básicamente un contenedor cilíndrico con un eyector de gas en el fondo. Este gas es expulsado en forma de burbujas ya sea hacia una fase liquida o hacia una suspensión solida liquida.

Esterilización de los biorreactores

Microorganismo y condiciones de cultivo

Composición del medio de expresión enzimática

ESTERILIZACIÓN DE LOS BIORREACTORESAntes del bioproceso, los bioreactores se trataron con una solución de hipoclorito de sodio al 0.25 % por 48 horas; luego se trataron con una solución de fenol al 3% por 15 minutos, posteriormente con una de etanol al 70 % por 15 minutos y finalmente fueron enjuagados con 500 ml de agua estéril. Los aditamentos para la entrada de aire y el control de espuma se esterilizaron de manera similar

Microorganismo y condiciones de cultivo: se utilizó la cepa Phanerochaetechrysosporium BKM-F-1767 (ATCC24725) replicada en medio YMPG, el cual contiene por cada 100 mililitros; extracto de levadura 1g, extracto de malta 1g, peptona bacteriológico 0.2g, glucosa 1g, asparagina 0.1g 0.2g 0.1g; tiamina clorhidrato 1mg y agar 2g. Se esterilizó y se colocó en cajas de Petri estériles; la cepa se replicó sobre este medio e incubo a 37 °C por 5 días y se mantuvo a 4°C.

Composición del medio de expresión enzimática

se preparó el fluido de expresión enzimático que contenía por cada 100 mililitro:

• Glucosa 1g g; tartrato de amonio 0.02g; 0.2g 0.05g; 0.01g; Tween 800.05g; tiamina HCl 0.1.mg; alcohol veratrilico 2,5 Mm y solución de elementos traza 7ml

Ácido nitrilo acético 1,5g; 3g; NaCl 1g; 0.1g; 0.1g; 0.1g; 0.01g; 0.01g; 0.01g; 0,01g; 0.1g

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE ESPORAS

: Al biorreactor estéril se le adicionaron 1000 ml de fluido de expresión esterilizado por filtración a través de filtros de 0.45 mm, y una suspensión de esporas de la cepa recién replicada en tween 80 al 0.1% hasta una concentración final entre 15x104 y 20x104 esporas/ml .

Actividad enzimática y seguimiento del bioproceso: Durante los seis ensayos se tomaron muestras dos veces por día, las cuales fueron filtrados por 0.45 mm. Se realizaron los siguientes análisis:

Pruebas específicas para cada ensayo:

Para los ensayos 1 y 2• se tomaron 10.0 ml de

muestra del biorreactor dos veces al día durante 15 días para el ensayo 1 y 27 días para el ensayo 2. Las muestras se filtraron por membrana de 0.45 µm prepesadas y se determinó el peso seco del micelio secando los filtros prepesados a 40°C en estufa de vacío hasta peso constante.

Para los ensayos 3 y 4• Para los ensayos 3 y 4:

se tomaron 5.0 ml de muestra del biorreactor dos veces al día, durante 11 días para el ensayo 3 y durante 23 días para el ensayo 4; se les determino la turbidez por UV-VI

Para los ensayos 5 y 6

• Para los ensayos 5 y 6 se tomaron 5.0ml de muestra dos veces al día, durante 13 días para el ensayo 5 y durante 35 días para el ensayo 6.

Tiempo de duración• cada ensayo se determinó

de acuerdo a los cambios que se iban presentando en el biorreactor (apariencia y olor del fluido de expresión, etc.) con los cuales se concluyó la viabilidad de cada ensayo.

• Alícuotas del ensayo 6 fueron precipitadas con metanol grado reactivo, pasada por filtros especiales para solventes orgánicos de 0.45 µm previamente pesados. Al residuo se les realizo un espectro IRTF en un Spectrum RXI FT-IR SystemPerkin Elmer, con el fin de observar los cambios en la estructura del PVOH

RESULTADOS Y

DISCUSIÓN

Para los ensayos 1 y 2

• Hongo creció en forma de pellets.

• Biomasa no homogénea por ello las gráficas de crecimiento dan puntos muy variables.

• El tamaño del hongo depende en gran parte de la agitación.

• Los pellets del primero fueron mas pequeños susceptibles a desintegrarse. (150 rpm)

• Máxima actividad enzimática se observó el día 16. (18.00 U/I)

• Día 23 para el segundo ensayo (24.96 U/I)

Biorreactor

Agitador orbital

Forma pellets Phanerochaete chrysosporium

máx.

máx.

Para los ensayos 3 y 4• No se utilizó agitación orbital.

• El suministro de aire es suficiente tanto para la oxigenación como para una agitación homogénea.

• Crecimiento sin pelletes.

• El polipropileno del biorreactor y accesorios(ejes, tuercas, tornillos) interactuaron con el medio.

• Cambios en sus características olor, color, morfología.

• La máxima actividad enzimática noveno dia 6.36 U/l y 9.46 U.I

Biorreactor Columna de burbujeo (polipropileno)

Forma filamentosa Phanerochaete chrysosporium

Para los ensayos 5 y 6• Reactor mas inerte.

• Aumento del volumen de aire de 300mL/min a 750mL/min.

• Crecimiento aglomerado filamentoso

• La máxima actividad al cuarto día (10.79 U/I) para el ensayo 5 y al día 30 (43.22 U/I) para el ensayo 6.

• Actividad mas estable y aumento gradual.

• En el ensayo 6 por medio de scan se observo formación de compuestos fenólicos que resultaron a partir de la biodegradacion del PVOH.

Biorreactor Columna de burbujeo (vidrio)

CONCLUSIONES Y

RECOMENDACIONES

Los resultados obtenidos hasta ahora, permiten concluir que el escalamiento del proceso exige un cuidadoso diseño del biorreactor.

Por la factilidad económica que tiene el biorreactor utilizado en los ensayos 5 y 6 y por la estabilidad en la producción de la LiP observada en el ensayo 6, se puede concluir que de los tres sistemas diseñados, este es el mas adecuado para continuar estandarizando las variables y optimizando el proceso para mejorar la obtención de la LiP.

EN LA PRODUCCION DE LiPes necesario buscar acelerar el

metabolismo del hongo con el fin de aumentar su tasa de crecimiento para que su producción enzimática

se inicie en el menor tiempo posiblepodría agregársele al medio aserrín

de pino porque en trabajos anteriores no publicados, se

comprobó que la presencia de éste, estabiliza el sistema y aumenta la

cantidad de enzima producida

Recomendaciones y conclusiones

Para mantener estables los niveles de enzima se podría realizar la fermentación como un proceso discontinuo hasta que el microorganismo se encuentre en su metabolismo

secundario, para luego convertirlo en un proceso continuo agregándole diariamente pequeñas cantidades de fluido de expresión, garantizándole al hongo un tiempo de vida

mayor.

FIN