Wykonywanie mikrobiologicznych badań żywności

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

MINISTERSTWO EDUKACJI

NARODOWEJ

Alicja Królak

Wykonywanie mikrobiologicznych badań żywności 321[09].Z4.04 Poradnik dla ucznia Wydawca Instytut Technologii Eksploatacji – Państwowy Instytut Badawczy Radom 2006

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego” 1

Recenzenci: mgr inż. Teresa Kubiak – Zespół Szkół Ponadgimnazjalnych Nr 2 w Białymstoku mgr inż. Aleksandra Ptak – Gagatek – Zespół Szkół Nr 1 w Wieluniu Opracowanie redakcyjne: Konsultacja: mgr inż. Maria Majewska – Centrum Doradztwa Rolniczego w Brwinowie Korekta: Poradnik stanowi obudowę dydaktyczną programu jednostki modułowej 321[09.Z4.04 „Wykonywanie mikrobiologicznych badań żywności”, zawartego w modułowym programie nauczania dla zawodu technik technologii żywności. Wydawca Instytut Technologii Eksploatacji – Państwowy Instytut Badawczy, Radom 2006


SPIS TREŚCI 1. Wprowadzenie 3 2. Wymagania wstępne 5 3. Cele kształcenia 6 4. Materiał nauczania 7

4.1. Sprzęt i materiały do badań mikrobiologicznych 7 4.1.1. Materiał nauczania 7 4.1.2. Pytania sprawdzające 10 4.1.3. Ćwiczenia 10 4.1.4. Sprawdzian postępów 14

4.2. Wykonywanie oznaczeń bakteriologicznych w zakładach przetwórstwa spożywczego 15 4.2.1. Materiał nauczania 15 4.2.2. Pytania sprawdzające 22 4.2.3. Ćwiczenia 22 4.2.4. Sprawdzian postępów 26

5. Sprawdzian osiągnięć 27 6. Literatura 31


1. WPROWADZENIE

Poradnik będzie Ci pomocny w przyswajaniu wiedzy dotyczącej badań mikrobiologicznych mających na celu wykrycie grup drobnoustrojów występujących w badanym produkcie oraz określenie ich liczby w analizowanej próbce.

W poradniku zamieszczono: − wymagania wstępne, w których określono co powinieneś umieć przystępując do realizacji

tej jednostki modułowej, − cele kształcenia, które określają umiejętności jakie powinieneś opanować w wyniku

procesu kształcenia, − materiał nauczania, który pomoże Ci samodzielne przygotować się do wykonania ćwiczeń

i zaliczenia sprawdzianów. Wykorzystaj do poszerzenia wiedzy wskazaną literaturę oraz inne źródła informacji. Obejmuje on również ćwiczenia zawierające polecenie, sposób wykonania oraz wyposażenie stanowiska pracy.

− sprawdzian postępów, który umożliwi Ci sprawdzenie poziomu wiedzy po wykonaniu ćwiczeń,

− wykaz literatury. Sprawdzian osiągnięć opracowany jest w formie testu zawierającego:

− instrukcję, − zestaw zadań testowych, − punktację zadań, − kartę odpowiedzi. Bezpieczeństwo i higiena pracy

Przebywając w laboratorium analizy żywności musisz przestrzegać regulaminu pracowni,

przepisów bezpieczeństwa i higieny pracy oraz przepisów przeciwpożarowych. Przy wykonywaniu ćwiczeń zachowaj ostrożność podczas ogrzewania roztworów. Postępuj ostrożnie z roztworami kwasów i zasad szczególnie stężonych. Kwasy do pipety naciągaj za pomocą pompki, a nie ustami.


Schemat układu jednostek modułowych

321[09].04 Analiza żywności w przetwórstwie spożywczym

321[09].04.01 Wykonywanie wagowej analizy żywności

321[09].04.02 Wykonywanie objętościowej analizy żywności

321[09].04.05 Wykonywanie towaroznawczych badań żywności

321[09].04.03 Wykonywanie

instrumentalnej analizy żywności

321[09].04.04 Wykonywanie

mikrobiologicznych badań żywności


2. WYMAGANIA WSTĘPNE

Przystępując do realizacji programu jednostki modułowej powinieneś umieć: − korzystać z różnych źródeł informacji, − posługiwać się sprzętem laboratoryjnym, − korzystać z wag technicznych i analitycznych, − sączyć roztwory, − wskazywać zagrożenia związane z pracą w laboratorium oraz podczas wykonywania

ćwiczenia, − przeliczać stężenia, − interpretować wyniki badań laboratoryjnych, − stosować metody Dobrej Praktyki Laboratoryjnej, − korzystać z programów komputerowych, − korzystać z dokumentacji technicznej i technologicznej przy wykonywaniu badań

mikrobiologicznych, − ustalać punkty kontroli w procesach produkcji artykułów spożywczych poprzez

wykonywanie monitorujących analiz żywności, − zastosować zasady bezpieczeństwa i higieny pracy, ochrony przeciwpożarowej oraz

ochrony środowiska.


3. CELE KSZTAŁCENIA

W wyniku realizacji programu jednostki modułowej powinieneś umieć: − określić niepożądane rodzaje drobnoustrojów w produktach spożywczych, − scharakteryzować czynniki i warunki przeciwdziałające rozwojowi szkodliwej mikroflory

w środkach spożywczych i przetwórniach surowców spożywczych, − określić wpływ zanieczyszczeń mikrobiologicznych żywności na zdrowie człowieka, − skorzystać z dokumentacji technicznej i technologicznej przy wykonywaniu badań

mikrobiologicznych żywności, − przygotować próbki do badań mikrobiologicznych, − wykonać badania mikrobiologiczne żywności, − wykonać badania mikrobiologiczne w zakładach przetwórstwa spożywczego, − zinterpretować wyniki badań mikrobiologicznych, − zarejestrować wyniki badań, − zastosować zasady Dobrej Praktyki Laboratoryjnej, − ustalić krytyczne punkty kontroli w procesach produkcji artykułów spożywczych poprzez

wykonywanie monitorujących analiz żywności (HACCP), − zastosować zasady bezpieczeństwa i higieny pracy, ochrony przeciwpożarowej oraz

ochrony środowiska, − skorzystać z różnych źródeł informacji zawodowej.


4. MATERIAŁ NAUCZANIA 4.1. Sprzęt i materiały do badań mikrobiologicznych 4.1.1. Materiał nauczania Szkło i sprzęt laboratoryjny

Sprzęt i materiały do badań powinny być czyste i wyjałowione. Szkło używane w pracowniach mikrobiologicznych jeśli jest nowe należy przetrzymać je przez kilkanaście minut w ok. 1-procentowym roztworze węglanu sodu w temperaturze ok. 50°C, a potem umyć pod bieżącą ciepłą wodą. Na koniec należy umyć w zimnej wodzie destylowanej. Szkło używane nie zawierające nie zawierające drobnoustrojów należy umyć w 2-procentowym ciepłym roztworze mydła lub detergentu, następnie opłukać w zimnej wodzie destylowanej. Naczynia zawierające hodowle mikroorganizmów należy moczyć w 10-procentowym roztworze kwasu solnego lub w środkach odkażających w celu ich zabicia. Środkiem odkażającym może być lizol. Naczynia można także wyjaławiać w temperaturze 121°C przez 30 minut potem, umyć w ciepłej wodzie bieżącej, a na koniec w zimnej destylowanej. Suszenie szkła odbywa się na rozłożonych arkuszach czystego papieru lub bibuły filtracyjnej. Można również suszyć je w suszarkach o temperaturze 40÷60°C. Wysuszone szkło poddaje się wyjaławianiu. Kolby, butelki, probówki należy zatkać korkiem z waty. Do pipet należy włożyć odpowiedniej wielkości tamponiki z waty. Pipety i probówki pakować należy po kilka sztuk zawijając w papier. Butelki wyjaławiane są z korkami zakładając pomiędzy korki i szyjki paski papieru. Same korki i szyjki również owijane są papierem i obwiązywane sznurkiem. Płytki Petriego wyjaławiane są w specjalnie do tego celu przygotowanych metalowych puszkach, owinięte także papierem jak inne szkło. Przygotowany sprzęt wyjaławiany jest przez 2 godziny w suszarce o temperaturze 160°C lub w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121°C. Naczynia szklane wstawiane do autoklawu owija się w pergamin. Sprzęt pomocniczy można wyjaławiać przed użyciem zanurzając w 96-procentowym etanolu i opalenie w płomieniu palnika gazowego. Pożywki i podłoża hodowlane

Do hodowli drobnoustrojów oraz ich identyfikacji jakościowych lub ilościowych stosowane są pożywki hodowlane. Pożywki są to roztwory wodne substancji odżywczych. Podłoża hodowlane to pożywki zestalone agar-agarem lub żelatyną. Podobnie jak pożywki służą do identyfikacji jakościowej oraz do ilościowego oznaczania drobnoustrojów. Dobór pożywek i podłóż do hodowli drobnoustrojów jest zależny od właściwości fizycznych i chemicznych środowiska. Powinny one spełniać określone wymagania w zakresie jakości, mianowicie: − muszą zawierać wszystkie składniki pokarmowe w odpowiednich stężeniach niezbędnych

do optymalnego wzrostu drobnoustrojów, − wykazywać właściwy odczyn środowiska, − powinny być przejrzyste, ponieważ ułatwiona jest wówczas obserwacja wzrostu i liczenie

kolonii drobnoustrojów, − muszą być jałowe, nie zawierać żywych drobnoustrojów, ich form przetrwalnikujących ani

zarodników.


Pożywki i podłoża mogą być ogólne i wybiórcze. Do najczęściej stosowanych ogólnych pożywek w analizie mikrobiologicznej jest niechmielona brzeczka piwna oraz bulion czyli wyciąg mięsny z dodatkiem peptonu i chlorku sodu doprowadzony do pH 7,8. Brzeczka piwna stosowana jest do hodowli pleśni i drożdży, natomiast bulion do hodowli bakterii. Pożywki hodowlane wybiórcze przygotowywane są z mleka odtłuszczonego, serwatki lub hydrolizatów białkowych. Przygotowanie pożywek i podłóż hodowlanych

Wyciąg mięsny otrzymywany jest z mięsa końskiego lub wołowego oczyszczonego ze ścięgien i tłuszczu. Rozdrobnione mięso zalewa się wodą w stosunku 1: 2 i pozostawia w lodówce na 12÷15 godzin. Po upływie tego czasu gotuje się całość przez 30 minut, następnie sączy przez lnianą tkaninę. Otrzymany wyciąg rozlewa się do butelek i wyjaławia w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121°C. Wyciąg można przechowywać w lodówce i używać jako składnika pożywek i podłoży hodowlanych po uprzednim przesączeniu przez sączek z waty.

Podłoże Endo: bulion zwykły – 1000 cm3, woda destylowana doprowadzona do pH 6,5 – 2000 cm3, pepton, chlorek sodu – 10 g, agar – 60 g, laktoza – 30 g, fuksyna zasadowa roztwór alkoholowy 3% – 30 cm3, siarczyn sodu, roztwór wodny 10% - 160 cm3, wodorotlenek sodu, roztwór wodny 10% - do zobojętnienia.

Do zlewki o pojemności 4 dm3 odmierzyć wodę destylowaną, dodać agar-agar i ogrzewać w autoklawie do chwili upłynnienia. Dodać bulion mięsny, pepton, chlorek sodu i laktozę. Mieszać do rozpuszczenia się składników. Doprowadzić pH do 7,8 dodając z biurety 10% roztwór NaOH. Tak przygotowane podłoże rozlać do kolb stożkowych o pojemności 150 cm3 każda i wyjaławiać 30 minut w temperaturze 117°C. Przed użyciem do badań podłoże należy upłynnić ogrzewając kolby w kąpieli wodnej. Następnie dodaje się fuksyny zasadowej (1÷1,5 cm3 na każde 150 cm3 płynu) oraz 10% roztwór siarczynu sodu do chwili zabarwienia się podłoża na bladoróżowy kolor. Podłoże rozlewa się na płytki Petriego i przechowuje w ciemnym miejscu do czasu prowadzenia badań mikrobiologicznych, nie dłużej jednak niż dwa dni.

Pożywka Eijkmana: woda destylowana – 1000cm3, pepton – 10 g, chlorek sodu – 5 g, laktoza – 10 g, purpura bromokrezolowa, 1% roztwór w 50% etanolu – 1cm3, wodorotlenek sodu, roztwór wodny 10% - do zobojętnienia.

Odmierzyć wodę destylowaną do zlewki o pojemności 2 dm3, dodać pepton i chlorek sodu, mieszać bagietką do rozpuszczenia składników. Doprowadzić roztwór do pH 6,8÷7,0 dodając z biurety 10% roztwór NaOH. Zawartość zlewki ogrzać do wrzenia i sączyć na gorąco przez bibułę filtracyjną. Do przesączu dodać laktozę i wskaźnik. Pożywkę rozlać do


probówek z rurkami Durhama, zamknąć korkami z waty i wyjaławiać 30 minut w temperaturze 117°C. Roztwór soli fizjologicznej: woda destylowana – 1000 cm3, chlorek sodu – 9 g, Chlorek sodu rozpuszcza się w wodzie destylowanej, rozlewa roztwór do kolb stożkowych i wyjaławia 10 minut w temperaturze 121°C. Płyn Lugola: woda destylowana – 300cm3, jodek potasu – 2g, jod – 1g.

Pobrać 20 cm3 wody destylowanej do butelki z ciemnego szkła zamykanej doszlifowanym korkiem, dodać jodek potasu, a po jego rozpuszczeniu jod. Całość mieszać do rozpuszczenia jodu. Dodać pozostałą część wody destylowanej i wymieszać. Przechowywać do czasu badań analitycznych. Sporządzanie preparatów bakterioskopowych. Barwienie metodą Grama.

Charakter lub liczbę drobnoustrojów w badanym produkcie określa się za pomocą preparatów mikroskopowych. Oglądane są one pod mikroskopem przy odpowiednio dobranym powiększeniu.

Preparaty bakteriskopowe można wykonać np. z mięsa lub jego przetworów. Są to preparaty odciskowe, które barwi się metodą Grama. Kolejność postępowania przy barwieniu metodą Grama jest następująca: − przygotowanie preparatu odciskowego z mięsa chudego, − wysuszenie preparatu, − barwienie roztworem fioletu krystalicznego, − działanie na preparat płynem Lugola, − spłukiwanie preparatu 96% alkoholem etylowym do odbarwienia, − barwienie fuksyną fenolową, − spłukiwanie wodą destylowaną, − suszenie preparatu bibułą i obserwacja pod mikroskopem. Barwienie preparatu metodą Grama umożliwia rozpoznanie charakteru występującej mikroflory. Do bakterii Gram-dodatnich, które barwią się na fioletowo, należą między innymi bakterie z rodziny Bacillaceae (rodzaje Bacillus – tlenowe laseczki przetrwalnikujące i Clostridium – beztlenowe laseczki przetrwalnikujące, gronkowce chorobotwórcze oraz bakterie fermentacji mlekowej). Natomiast do bakterii Gram-ujemnych, które barwią się na czerwono, zalicza sięrodzinę Enterobacteraceae (są to pałeczki z grupy okrężnicy, z grupy Salmonella i inne). Płyn Ringera woda destylowana – 1000cm3, chlorek sodu – 9g, chlorek potasu – 0,42g, chlorek wapnia bezwodny – 0,24g, wodorowęglan sodu – 0,20g, Wodę destylowaną należy ogrzać do wrzenia, dodać pozostałe składniki, mieszać do całkowitego rozpuszczenia. Płyn rozlać do kolb stożkowych i wyjaławiać przez 20 minut w temperaturze 121°C.


Rys. 1. Cieplarka laboratoryjna CLN 53 [8]

Cieplarka posiada naturalny obieg powietrza i mikroprocesorowy sterownik temperatury i czasu. Wnętrze i obudowa komory zbudowane są ze stali nierdzewnej. 4.1.2. Pytania sprawdzające

Odpowiadając na pytania, sprawdzisz, czy jesteś przygotowany do wykonania ćwiczeń.

1. Jakie znasz metody badań mikrobiologicznych? 2. Jakich roztworów należy używać do mycia naczyń i sprzętu w laboratorium

mikrobiologicznym? 3. Jakie są warunki wyjaławiania sprzętu do badań mikrobiologicznych? 4. Jakie znasz rodzaje pożywek i podłóż hodowlanych? 5. Jak przygotować preparat bakterioskopowy? 4.1.3. Ćwiczenia Ćwiczenie 1

Porównaj wyposażenie i urządzenia laboratorium szkolnego i zakładowego. Sposób wykonania ćwiczenia Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1) wymienić sprzęt i szkło znajdujące się w laboratorium szkolnym, 2) wymienić sprzęt i szkło stosowane w laboratorium zakładowym, 3) porównać wyposażenie, urządzenia i sprzęt laboratoriów zakładowego i szkolnego, 4) wyciągnąć wnioski dotyczące różnicy w oznaczeniach wykonywanych w laboratorium

szkolnym i zakładowym.

Wyposażenie stanowiska pracy: − schemat, mikrobiologicznego laboratorium zakładowego, − foldery z urządzonymi laboratoriami zakładów przetwórstwa spożywczego, − zdjęcia, foldery mikrobiologicznego laboratorium analiz żywności Terenowej Stacji

Sanitarno- Epidemiologicznej ewentualnie spostrzeżenia z wycieczki.


Ćwiczenie 2 Przygotuj sprzęt i szkło do badań mikrobiologicznych. Sposób wykonania ćwiczenia Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1) przetrzymać nowe szkło w 1- procentowym roztworze węglanu sodu w temperaturze 50°C,

2) umyć w bieżącej, ciepłej wodzie, 3) umyć w zimnej wodzie destylowanej, 4) odstawić do suszenia w powietrzu rozłożone na arkuszach czystego papieru lub bibuły

filtracyjnej lub suszyć w suszarkach o temperaturze 40÷60°C, 5) umyć szkło używane w 2-procentowym ciepłym roztworze mydła lub detergentu, 6) wypłukać w ciepłej wodzie bieżącej, a potem w zimnej destylowanej, 7) suszyć jak w punkcie 4, 8) namoczyć naczynia zawierające hodowle drobnoustrojów w 10-procentowym roztworze

kwasu siarkowego lub w środkach odkażających np. w 2-procentowym lizolu, 9) umyć w ciepłej bieżącej wodzie, 10) umyć w zimnej wodzie destylowanej, 11) suszyć jak podano w punkcie 4, 12) zatkać korkami z waty kolby, butelki, probówki, pipety, 13) zapakować w papier pipety i probówki (po kilka sztuk), 14) włożyć paski papieru pomiędzy korki i szyjki butelek z doszlifowanymi korkami, 15) owinąć korki i szyjki butelek papierem i obwiązać sznurkiem, 16) wyjaławiać sprzęt przez 2 godziny w suszarce o temperaturze 160°C lub 30 minut

w autoklawie o temperaturze 121°C, 17) zanurzyć sprzęt metalowy w 96-procentowym etanolu, 18) opalić w płomieniu palnika gazowego.

Wyposażenie stanowiska pracy: − sprzęt i szkło laboratoryjne, − roztwory do mycia: 1-procentowy roztwór węglanu sodu, 2-procentowy roztwór mydła, − woda destylowana, − lizol, − 10%H2SO4, − wata, − papier, − bibuła, − palnik gazowy, − suszarki do wyjaławiania szkła laboratoryjnego Ćwiczenie 3

Przygotuj 1500 cm3 niechmielonej brzeczki piwnej. Sposób wykonania ćwiczenia Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1) wytarować garnek emaliowany z łopatką, 2) dodać 200 g słodu mielonego oraz 1,2 dm3 wody wodociągowej,


3) ustawić garnek z zawartością na trójnogu, 4) ogrzewać do temperatury 45°C utrzymując w tym stanie przez 30 minut, 5) ogrzewać garnek do temperatury 70°C (1°C na 1 minutę), 6) utrzymywaać temperaturę końcową przez 10 minut, 7) sprawdzić stopień scukrzenia przenosząc bagietką kroplę zacieru na bloczek gipsowy, 8) zadać kroplą płynu Lugola, (żółte zabarwienie świadczy o pełnym scukrzeniu, niebieskie

o niepełnym), 9) schłodzić po osiągnięciu pełnego scukrzenia, 10) uzupełnić wodą masę do 1800 g, 11) wymieszać, odsączyć przez lnianą tkaninę, 12) zebrać przesącz do kolby okrągłodennej o pojemności 1,5 dm3, 13) wyjałowić w temperaturze 121° przez 30 minut, 14) schłodzić i sklarować utrwaloną brzeczkę pozostawiając na kilka godzin, 15) sprawdzić gęstość areometrem Ballinga, 16) doprowadzić stężenie do 10°Blg przez dodanie odpowiedniej ilości wody, 17) przesączyć brzeczkę przez sączek z bibuły filtracyjnej, 18) rozlewać do butelek o pojemności 250 cm3, 19) zamknąć butelki korkami z waty, 20) utrwalić brzeczkę temperaturze 117°C w czasie 30 minut.

Wyposażenie stanowiska pracy: – słód browarniany mielony – 200 g, – garnek emaliowany o pojemności 2 dm3, – łopatka drewniana, – trójnóg, – pinceta, – palnik gazowy, – termometr o zakresie temperatur 0÷150°C, – bagietka szklana, – bloczek gipsowy, – areometr Ballinga o zakresie 0 ÷25°Blg, – cylinder szklany o pojemności 250 cm3, – tkanina lniana, – sączek z bibuły filtracyjnej, – butelki o pojemności 250 cm3 – 6 sztuk, – kolba okrągłodenna o pojemności 1,5 dm3, – autoklaw. Ćwiczenie 4

Przygotuj bulion zwykły.

Sposób wykonania ćwiczenia Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1) przygotować wyciąg mięsny według niżej podanego przepisu, a) rozdrobnić w maszynce do mięsa 1 kg mięsa wołowego lub końskiego, b) przełożyć do garnka emaliowanego i zalać 2,2 dm3 wody destylowanej, c) wstawić do lodówki na 12÷15 godzin, d) gotować następnego dnia 30 minut,


e) przesączyć przez płótno, f) rozlać do kolb lub butelek, g) wyjaławiać przez 20 minut w temperaturze 121°C, h) wyciąg przechowywać w chłodni, a przed użyciem, jako składnika podłoży

przesączyć przez watę, 2) przygotować bulion zwykły zgodnie z podanym niżej przepisem,

a) zmieszać 1000cm3 wyciągu mięsnego z 10g peptonu i 5g chlorku sodu w garnku emaliowanym,

b) doprowadzić odczyn do pH 7,8 za pomocą 10-procentowego NaOH, c) ogrzewać 30 minut w temperaturze 121°C, d) skorygować odczyn do pH 7,8, e) przesączyć przez bibułę i rozlać do kolb lub probówek, f) wyjaławiać w temperaturze 121°C przez 20 minut, pH 7,4÷ 7,6.

Wyposażenie stanowiska pracy:

− mięso wołowe lub końskie 1 kg, − woda destylowana, − wyciąg mięsny, − pepton, − chlorek sodu, − garnek emaliowany, − butelki, − autoklaw. Ćwiczenie 5

Przygotuj preparaty do badań mikroskopowych. Sposób wykonania ćwiczenia Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1) przygotować preparat odciskowy z mięsa chudego (przeprowadź odtłuszczanie szkiełka wyjętego z etanolu, wycierając go miękką ściereczką do sucha, a następnie przetrzeć kawałkiem suchego mydła i ponownie wytrzeć ściereczką. Szkiełko przepalić w płomieniu i odcisnąć na nim powierzchnię cięcia badanej próbki mięsa tak, aby otrzymany ślad był wyraźny, cienki i bez wolnych przestrzeni),

2) wysuszyć przygotowany preparat, 3) utrwalić preparat, 4) barwić preparat roztworem fioletu krystalicznego, 5) działać na preparat płynem Lugola, 6) spłukać preparat 96-procentowym alkoholem etylowym, aż do odbarwienia, 7) barwić preparat fuksyną fenolową (rozcieńczoną dziesięciokrotnie), 8) spłukać wodą destylowaną, 9) osuszyć preparat bibułą i obserwować pod mikroskopem używając obiektywu

immersyjnego, 10) określić charakter mikroflory licząc w 40 polach widzenia ziarniaki, pałeczki Gram-

dodatnie oraz pałeczki Gram-ujemne.


Wyposażenie stanowiska pracy: − mięso chude, − roztwór fioletu krystalicznego, − płyn Lugola, − alkohol etylowy, − fuksyna fenolowa, − bibuła, − szkiełko przedmiotowe, − mikroskop. 4.1.4. Sprawdzian postępów Czy potrafisz: Tak Nie 1) zdefiniować pojęcia pożywki i podłoża hodowlanego? 2) przygotować sprzęt i materiały do badań mikrobiologicznych? 3) przygotować podłoża i roztwory do badań bakteriologicznych? 4) dobrać pożywki i podłoża hodowlane zależnie od wymagań

drobnoustrojów? 5) wyjałowić szkło i sprzęt laboratoryjny? 6) przygotować płytki Petriego do posiewu? 7) przygotować probówki z rurkami Durhama do posiewu?


4.2. Wykonywanie oznaczeń bakteriologicznych w zakładach przetwórstwa spożywczego

4.2.1. Materiał nauczania Zasady przygotowania próbek do badań i posiewów

Przygotowanie próbek do orientacyjnego określenia stopnia zakażenia polega na jałowym podzieleniu próbki (ok. mięsa) wielkości 20 g w taki sposób, aby otrzymać jeden kawałek wielkości 10 g (przeznaczony do posiewów na podłoże stałe), natomiast resztę należy podzielić na kawałki ok. 1 g (przeznaczenie na podłoże płynne).

Przygotowanie próbek do badań ilościowych polega na wykonaniu rozcieńczeń. Rozróżnia się dwa sposoby rozcieńczeń. Pierwszy sposób stosowany jest w przypadku oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów w 1 g lub miana. Drugi sposób ma miejsce, gdy celem badań jest określenie liczby drobnoustrojów na powierzchni 1 cm2 lub miana z 1 cm2.

Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów Produkty spożywcze, surowce roślinne i zwierzęce stanowią dobre źródło rozwoju

drobnoustrojów, które powodują niekorzystne zmiany sensoryczne, a także zmiany składu chemicznego. Zachodzi konieczność dokonywania oceny żywności pod względem zakażenia drobnoustrojami. Wynik oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów w surowcach pozwala na określenie jakości higienicznej surowców, ich przydatności do przerobu, jakości i trwałości otrzymanych z tych surowców produktów. W przypadku oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów w wyrobach gotowych wynik pozwala dokonać oceny: − prawidłowości procesów technologicznych, − warunków higienicznych, w jakich odbywała się produkcja, − jakości i trwałości mikrobiologicznej ocenianych wyrobów. Wymagania ilościowe podane są w normach jakościowych. Do oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów stosowane są dwie metody: − metoda reduktazowa, − hodowlana metoda płytkowa.

Metoda reduktazowa należy do metod orientacyjnych i sprowadza się do określenia stopnia zakażenia środowisk drobnoustrojami. Polega na obserwacji czasu odbarwiania się barwników oksydoredukcyjnych (błękit metylenowy, rezazuryna) w badanych środowiskach, po inkubacji w określonych warunkach temperatury.

Metodę reduktazową stosuje się do szybkiej oceny jakości bakteriologicznej mleka surowego. Stwierdzono, że czas odbarwiania barwników oksydoredukcyjnych w mleku jest tym krótszy, im więcej zawiera ono drobnoustrojów.

Drobnoustroje w wyniku procesu oddychania wydzielają wodór, który wiąże najpierw tlen zawarty w mleku, a po wyczerpaniu się tlenu akceptorami wodoru są dodane barwniki oksydoredukcyjne: błękit metylenowy lub rezazuryna. Barwniki redukując się przechodzą w bezbarwne formy, czyli leuko.

Błękit metylenowy dodany do mleka barwi je na niebiesko. Po redukcji błękitu metylenowego do formy leukozwiązku barwa znika. W próbie z rezazuryną bezpośrednio po jej wymieszaniu z mlekiem barwa jest stalowoniebieska, następnie przechodzi w różową, a po całkowitej redukcji rezazuryny następuje całkowicie odbarwia się. Czas odbarwiania barwników w mleku waha się od kilku minut do kilku godzin w zależności od zakażenia mleka. Im bardziej zakażone tym czas odbarwiania dłuższy.

Hodowlana metoda płytkowa sprowadza się do posiewu pewnych ilości środowisk (surowca, produktu) do podłoża ogólnego w płytkach Petriego i policzenia kolonii wyrosłych


drobnoustrojów na zestalonym podłożu. Pod pojęciem kolonii drobnoustrojów rozumie się zespół komórek widoczny makroskopowo, powstały z rozmnożenia jednej komórki na podłożu stałym, w odizolowaniu od innych komórek.

Używaną do posiewu ilość surowca lub produktu uzależnia się od spodziewanej w nim liczby drobnoustrojów. Zakłada się, że z jednej komórki wyrasta kolonia i że każda komórka jest w stanie rozmnożyć się i utworzyć swoją kolonię. Nie zawsze założenia te są ścisłe. Czasami poza pojedynczymi komórkami mogą występować zespoły komórek w postaci gronek lub łańcuszków, które dają pojedyncze kolonie. Ponadto nie wszystkie komórki rozwijają swoje kolonie ze względu na brak optymalnych warunków rozwoju. Metodę płytkową uważa się za porównawczą. Określa ona liczbę żywych komórek w badanych środowiskach, zdolnych do rozwoju na użytych podłożach i w danych warunkach hodowli. W zależności od badanego środowiska stosuje się różne podłoża hodowlane. W celu uzyskania porównywalnych wyników oznaczeń ogólnej liczby drobnoustrojów metodą płytkową należy przestrzegać ściśle tego samego sposobu postępowania, w którym wyróżnia się podstawowe etapy: − przygotowanie odpowiedniego rozcieńczenia badanego środowiska, − dokonanie posiewu, − hodowla drobnoustrojów, − liczenie kolonii i interpretacja wyników.

Surowce roślinne zawierają zwykle dużą liczbę drobnoustrojów, dlatego przed posiewem na zestalone podłoże należy je rozcieńczyć jałowym roztworem soli fizjologicznej lub płynem Ringera w odpowiednim stosunku, aby po inkubacji liczba kolonii wyrosłych na płytce Petriego mieściła się w zakresie 30÷300. Rozcieńczenia wykonuje się w butelkach o pojemności 200 cm3 lub 20 cm3, do których pobiera się odpowiednio 90 lub 9 cm3 rozcieńczalników, (sól fizjologiczna, płyn Ringera). Rozcieńczalnik może być wyjałowiony lub można go wyjaławiać w butelkach w autoklawie. Z badanej próbki surowca należy pobrać 10cm3 produktu lub odważyć 10 g i przenieść do butelki zawierającej 90 cm3 rozcieńczalnika. Zawartość butelki wymieszać dokładnie. W ten sposób otrzymuje się rozcieńczenie próbki pierwotnej 1:10. Pobierając z tej próbki inną jałową pipetą 1 cm3 i przenosząc do następnej butelki zawierającej 9 cm3 rozcieńczalnika uzyskuje się rozcieńczenie 1:100 itd. Schematycznie sposób rozcieńczania przedstawia rysunek 1. Postępując analogicznie uzyskuje się żądane rozcieńczenie próbki pierwotnej. Z ostatniego rozcieńczenia pobiera się 1 cm3 do posiewu na podłoże hodowlane w płytce Petriego.

Rys. 2. Schemat przygotowywania rozcieńczeń do posiewu [3, s. 406]


Rys.3. Przykłady posiewu rysowego [3, s. 104]

Rys. 4. Różne kształty kolonii drobnoustrojów [3, s. 99] W celu wykonania posiewu należy pobrać pipetą 1 cm3 płynu z odpowiedniego

rozcieńczenia, uchylić lekko wieczko płytki Petriego wprowadzić koniec pipety do środka i wdmuchnąć delikatnie zawartość pipety nie dotykając dna płytki i unikając rozprysku płynu. Następnie należy wlać podłoże hodowlane uprzednio upłynnione we wrzącej łaźni wodnej i ochłodzone do temperatury 47÷50°C. Przed wylaniem podłoża na płytki Petriego naczynie z pożywką otwiera się tuż przy płomieniu palnika gazowego, opala się brzegi i szyjkę, a następnie wylewa płynne podłoże do płytki mieszając ruchem kołowym. Płytki pozostawia się na ok. 15 minut na czas skrzepnięcia agaru, po czym odwraca do góry dnem w celu zapobieżenia kondensacji pary wodnej na powierzchni podłoży. Płytki wstawia się do cieplarki, układając jedną na drugiej, nie więcej niż 4 w jednym słupku. Jednocześnie wkłada się do cieplarki dwie płytki kontrolne.

Hodowlę prowadzi się w temperaturze 28÷30°C przy swobodnym dostępie tlenu do podłoża, gdyż najczęściej oznacza się liczbę drobnoustrojów tlenowych, mezofilnych. Czas hodowli wynosi trzy doby, co zapewnia możliwość obserwacji kolonii wyrosłych gołym okiem.

Liczenie kolonii odbywa się przy wykorzystaniu płytek kontrolnych całkowicie wolnych od drobnoustrojów. Do obliczeń pobiera się płytki z posiewami z dwu kolejnych rozcieńczeń, z liczbą kolonii mieszczącą się w zakresie 10÷300, a policzone kolonie zaznacza się dermatografem na zewnętrznej powierzchni denka płytki. Sumuje się liczby kolonii z poszczególnych płytek dla tego samego rozcieńczenia i dzieli przez liczbę płytek uzyskując średnią liczbę kolonii dla jednej płytki.


Liczbę mnoży się przez dzielnik krotności rozcieńczenia (10, 100, itd.) co daje liczbę kolonii drobnoustrojów w 1cm3 lub 1g badanego surowca lub produktu. Jeżeli wyniki oznaczeń dla dwu kolejnych rozcieńczeń nie różnią się o więcej niż 10% jako ostateczny wynik przyjmuje się wartość średniej arytmetycznej uzyskanych wyników. W innym przypadku za podstawę przyjmuje się wyniki uzyskane przy zastosowaniu większego rozcieńczenia.

Kolonie wyrosłe w postaci smug przyjmuje się za kolonie pojedyncze. Jeśli kolonie zajmują więcej niż połowę powierzchni podłoża płytki eliminuje się z oznaczeń, jako płytki zalane.

Uzyskane wyniki ogólnej liczby drobnoustrojów w surowcach lub produktach przemysłu spożywczego porównuje się z wymaganiami norm jakościowych. Zgodność uzyskiwanych wyników z normami jest podstawą do uznania wyrobu za nadający się do spożycia. Po analizie sensorycznej i składu chemicznego do zaliczenia wyrobu do odpowiedniej klasy jakości.

Oznaczanie miana coli w produktach spożywczych W przemyśle spożywczym znajdują się bardzo dobre warunki do rozwoju bakterii coli

czyli pałeczki okrężnicy należącej do enterobakterii. Bakterie te występują w przewodzie pokarmowym, a także w odchodach, skąd dostają się do wody. Obecność większej liczby bakterii coli świadczy o niskim poziomie higieny produkcji w zakładach przetwórstwa spożywczego. Dodatkowym źródłem zanieczyszczeń może być brak higieny osobistej personelu zatrudnionego przy produkcji. W analizie mikrobiologicznej produktów spożywczych oznacza się bakterie coli jako miano coli tj. najmniejszą ilość produktu (w gramach lub cm3), w której stwierdza się jeszcze występowanie pałeczki okrężnicy. Do oznaczeń stosuje się metodę hodowlaną w pożywce płynnej. Wykorzystuje się zdolność bakterii coli do fermentacji laktozy z wytworzeniem gazów CO2 i H2, które zbierają się w zanurzonych w pożywce rurkach Durhama. Do oznaczania miana coli konieczne jest dokonywanie posiewów z wielu rozcieńczeń badanego produktu do pożywki płynnej. Pożywki poddaje się inkubacji w temperaturze 37°C przez 48 godzin, następnie prowadzi się obserwację, czy w rurkach Durhama pojawia się gaz. Rozcieńczenia muszą być tak dobrane, by co najmniej w jednej probówce z posiewem odpowiadającym największemu rozcieńczeniu badanego produktu nie było już wzrostu bakterii Coli (brak gazu w rurce). W przeciwnym wypadku wynik oznaczenia nie będzie ściśle określony. Największe rozcieńczenie przyjmuje się za podstawę obliczeń miana coli, przy czym ilość gazu w rurce Durhama musi wynosić co najmniej 10% objętości rurki.

Rys. 5. Probówki z pożywką i rurkami Durhama [4, s. 409] a) rurka Durhama wypełniona pożywką (bez gazu), b) rurka Durhama częściowo napełniona gazem


Miano coli zapisuje się w postaci ułamka dziesiętnego, który oznacza ilość badanego produktu wprowadzonego do probówki z pożywką. Jeśli na przykład gaz występuje w rurkach Durhama w probówkach, do których posiano po 1 cm3 z rozcieńczeń 10-1 i 10-3, a przy posianiu dalszych rozcieńczeń gaz już nie występuje wówczas miano coli wynosi 0,001. Oznacza to, że w objętości 0,001 cm3 próbki pierwotnej występowała co najmniej jedna komórka bakterii coli. Gdy gaz był obecny we wszystkich próbkach z przygotowanych rozcieńczeń badanego produktu wówczas podaje się słownie, że miano coli jest niższe od ok. 0,01; 0,001. Jeśli nie stwierdza się obecności coli w żadnym z rozcieńczeń należy podać, ze miano coli jest wyższe od najmniejszego rozcieńczenia, ok. od 0,1 lub 0,001.

Rys.6. Anaerostat [3, s.107] Zasady hodowli beztlenowców

Wyhodowanie beztlenowców wymaga usunięcia tlenu ze środowiska, gdyż przy dostępie tlenu komórki wegetatywne beztlenowców szybko giną. Występuje kilka metod hodowli bakterii beztlenowych, mianowicie: − hodowla na pożywce płynnej pod warstwą oleju parafinowego, przy czym do pożywki

dodaje się substancje pochłaniające tlen(np. kostki wątroby w podłożu Wrzoska), − hodowla w specjalnych aparatach aerostatach (rys. 6), z których usuwa się powietrze za

pomocą pompy próżniowej (po uprzednim umieszczeniu hodowli), a następnie wstawia się je do cieplarki,

− hodowla w wysokim słupku agaru lub żelatyny, na powierzchnię którego wprowadza się dodatkowo warstwę agaru lub żelatyny, przez co zamyka się dostęp powietrza do podłoża,

− hodowla w warunkach beztlenowych wywołanych usunięciem tlenu środkami chemicznymi,

− hodowla symbiotyczna beztlenowców z tlenowcami polegająca na tym, że na jednej połowie płytki posiewa się bakterie tlenowe, a na drugiej beztlenowe. Płytkę z posiewami zamyka się szklaną taflą, a brzegi oblepia plasteliną. Tlenowce w czasie wzrostu zużywają tlen zawarty w podłożu i naczyniu, stwarzając w ten sposób odpowiednie warunki rozwoju beztlenowców.


Oznaczanie obecności pałeczek duru i czerwonki Badania obecności pałeczek duru i czerwonki wykonuje się w przypadku wystąpienia

zatruć pokarmowych lub podejrzenia o zakażenie produktów tymi bakteriami. W badaniach wstępnych stosowane są: − dwa płynne podłoża namnażające: podłoże z czterotionianem sodu według Kauffmana

oraz podłoże z kwaśnym selenitem sodu (podłoże SF); − podłoża stałe wybiórczo-różnicujące: podłoże Mac Conkeya i podłoże „SS”.

W wymienionych badaniach należy posiać duże ilości badanego materiału (25g) w celu zwiększenia możliwości wykrycia bakterii rodzaju Salmonella i Shiggella, ponieważ nie mają one warunków do rozwoju w produktach spożywczych. Podłoże z czterotionianem sodu według Kauffmana − Bulion o pH 7,4÷7,6 - 900,0 cm3

− Węglan wapnia - 45,0 g − Jod w roztworze wodnym jodku potasu - 20,0 cm3 − Tiosiarczan sodu (Na2S2O3 · 5H2O) - 100,0 cm3 − Zieleń brylantowa, roztwór 0.1% - 10,0 cm3 − Żółć bydlęca - 50,0 cm3

Przygotowanie składników: 1. Węglan wapnia wyjałowić w kolbie poj. 2dm3 w suszarce w temp. 160ºC w ciągu 60 min. 2. W 100 cm3 wody destylowanej rozpuścić 25g jodku potasu, a następnie 20g jodu. 3. 50 g tiosiarczanu sodu rozpuścić w 100cm3 wody destylowanej i wyjałowić w autoklawie

w temp.120ºC w ciągu 15 min. 4. Żółć bydlęcą przesączyć przez watę i wyjaławiać w autoklawie w temp.120ºC w ciągu

30 min. Przygotowanie podłoża

Do kolby z węglanem wapnia dodać w sposób jałowy bulion, roztwór jodu, tiosiarczan sodu, żółć i zieleń brylantową, dokładnie wymieszać i rozlać do kolb po 200 cm3. Wyjaławiać dwukrotnie w parze bieżącej przez 20 minut. Oczyszczanie ścieków

Ścieki są to odpływy powstające przy wykorzystywaniu wody w gospodarstwach domowych, dla celów sanitarnych i przemysłowych, zawierające składniki charakterystyczne dla środowiska, w którym użyto wodę. Rozróżnia się ścieki domowe lub bytowo-gospodarcze, wody opadowe, ścieki poprodukcyjne, ścieki miejskie. Charakter i skład ścieków przemysłowych jest różny i zmienny, zależny od rodzaju przemysłu, użytych surowców, metod produkcji. Na ogół we wszystkich ściekach zawierających substancje organiczne znajdują się bakterie i inne drobnoustroje. Liczba bakterii w ściekach zależy od wielu czynników np. od rodzaju i stężenia ścieków, pH, stanu świeżości, temperatury itd. Jest ona zmienna i może się wahać od kilkuset do wielu milionów komórek w 1 dm3 ścieków.

Zdolność do samooczyszczania się wód naturalnego odbiornika ścieków jest ograniczona. Nie chcąc doprowadzić przez przeciążenie odbiornika ściekami do zniszczenia jego wartości użytkowych należy zawsze rozważyć i ustalić, czy dana ilość ścieków mieści się w granicach dopuszczalnych procesami samooczyszczania się, Granice te ustalają odpowiednie przepisy prawne. Biorąc pod uwagę specyficzne właściwości ścieków oraz obowiązujące przepisy, w większości przypadków ścieki miejskie i przemysłowe wymagają oczyszczenia przed odprowadzeniem ich do naturalnych odbiorników. Wybór metody oczyszczania ścieków zależy od wielkości odbiornika oraz jakości i ilości ścieków. Metody mechaniczne pozwalają usunąć ze ścieków substancje pływające zawieszone. Metodami fizyko-chemicznymi usuwa się ze ścieków substancje koloidalne i zawiesinę nie opadającą. W metodach biologicznych


drobnoustroje głównie bakterie rozkładają zawarte w ściekach substancje organiczne rozpuszczone, koloidalne lub występujące w postaci drobnej zawiesiny. Całość procesów oczyszczania rozdzielono umownie na 4 fazy zwane stopniami oczyszczania: − oczyszczanie I stopnia – wstępne (najczęściej fizyczne), − oczyszczanie II stopnia – biologiczne, − oczyszczanie III stopnia – doczyszczanie ścieków z usuwaniem substancji biogennych, − oczyszczanie IV stopnia – odnowa wody.

Oczyszczanie I stopnia oczyszczania mogą być niekiedy poprzedzane dodatkowym napowietrzaniem w odrębnych komorach przed osadnikami wstępnymi. W ramach oczyszczania I stopnia stosuje się proste operacje mechaniczne i procesy fizyczne: cedzenie, sedymentacja, filtrowanie, przez które zmierza się do wydzielania większych ciał pływających i wleczonych (skratki), cząstek ziarnistych o umownym zakresie 0,1 mm i większych (piasek), zawiesin łatwo opadających (osady wstępne), olejów i tłuszczów podatnych na wydzielanie.

Oczyszczanie biologiczne przeprowadza się z reguły przy udziale przystosowanej do tego biocenozy. Zanieczyszczenia te służą mikroorganizmom jako pokarm i jako budulec nowych komórek. Dzięki tym procesom życiowym następuje rozkład, utlenianie i ubytek zawartych

w ściekach zanieczyszczeń – w tym zwłaszcza organicznych. Oczyszczone biologicznie ścieki są mniej podatne na zagniwanie, a tym samym w mniejszym stopniu naruszają równowagę tlenową wód płynących. Podstawową miarą efektywności pracy oczyszczalni II stopnia jest zdolność obniżania ładunku zanieczyszczeń organicznych podatnych na rozkład i wyrażonych przez ubytek BZT5. Umownie wyróżnia się niepełne biologiczne oczyszczanie, gdy osiąga się 85% obniżenia BZT (biochemiczne zapotrzebowanie tlenu) i pełne, gdy osiąga się efektywność powyżej 85% (zwykle 95%), a stężenie zawiesin nie przekracza 30 mg/dm3. Dodatkowymi miernikami II stopnia oczyszczania są ubytki CHZT bakterii, a także usuwanie zanieczyszczeń biogennych. Najbardziej rozpowszechniły się dwie formy oczyszczania biologicznego: − z biocenozą osiadłą – złoża biologiczne, − z biocenozą pływającą – komory z osadem czynnym.

Mikroflora powietrza

Wyniki badań mikrobiologicznych wykazały, że powietrze zawiera różne ilości drobnoustrojów. Mikroflora powietrza jest reprezentowana przez różne gatunki bakterii i grzybów. Spotyka się bakterie dające kolonie różnej barwy (białe, żółte, pomarańczowe), jak np. ziarniaki – Micrococcus, pakietowce – Sarcina, pałeczki z rodzaju Achromobacter, laseczki, jak np. Bacillus subtilis i inne. Spośród drożdży spotyka się gatunki z rodzaju Torulopsis i Rhodotorula. Występują też pleśnie z rodzaju Aspergillus, Penicillum, Rhizopus, Mucor, Cladosporium, Dematitum i wielw innych. Wśród mikroflory powietrza mogą znajdować się różne zarazki groźnych chorób zakaźnych dostających się do powietrza z kurzem lub rozsiewane przez chorych. Jedną z podstaw oceny sanitarno-higienicznej zakładów spożywczych jest stan ilościowy i jakościowy mikroflory powietrza. Drobnoustroje dostają się z opadającym pyłem na produkty spożywcze, surowce roślinne lub zwierzęce – zakażają je w stanie surowym lub w czasie produkcji. Produkty spożywcze oraz surowce służące do ich wytwarzania są dobrym podłożem do rozwoju drobnoustrojów. Powodują psucie się zarówno surowców, jak i półproduktów oraz gotowych wyrobów spożywczych odpowiednio nie zabezpieczonych. Pył opada również na przedmioty, z którymi styka się gotowy produkt lub surowiec. Dlatego utrzymanie powietrza w stanie optymalnej czystości mikrobiologicznej ma specjalnie duże znaczenie we wszystkich zakładach przemysłu spożywczego wytwarzających artykuły żywnościowe dla człowieka, jak również produkty paszowe dla zwierząt.


Do oczyszczania powietrza stosowane są specjalne filtry, przez które przepuszczane jest powietrze. Zatrzymują one całkowicie pyły znajdujące się w powietrzu łącznie z drobnoustrojami. Stosuje się także odkażanie powietrza promieniami ultrafioletowymi, emitowanymi przez różne lampy rtęciowe.

4.2.2. Pytania sprawdzające

Odpowiadając na pytania, sprawdzisz, czy jesteś przygotowany do wykonania ćwiczeń. 1. Na czym polega próba reduktazowa oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów? 2. Jak oznaczyć ogólną liczbę drobnoustrojów hodowlaną metodą płytkową? 3. W jaki sposób dokonać rozcieńczenia badanych środowisk? 4. Jak wykonać posiew na płytkę Petriego? 5. Jak oznaczyć miano coli? 6. Jak zinterpretować wynik otrzymany przy oznaczaniu miana coli?

4.2.3. Ćwiczenia Ćwiczenie 1

Oznacz ogólną liczbę drobnoustrojów tlenowych w mięsie.


1) przygotować szablony do badania stopnia zakażenia powierzchni, 2) wyciąć z blachy do wyrobu puszek okienko w kształcie kwadratu, prostokąta lub koła

o powierzchni 25 cm2, 3) pozostawić obramowanie dookoła okienka o szerokości 2 cm z rączką do trzymania

szablonu, 4) opiłować brzegi szablonu, wyjałowić przed użyciem w autoklawie w temperaturze nie

niższej niż 117°C przez 15 minut, 5) przyłożyć szablon do powierzchni badanej próbki, 6) uchwycić pincetą wyjałowiony tampon z gazy wielkości ok. 2 cm2, 7) zanurzyć tampon w jałowym płynie do rozcieńczeń, 8) wycisnąć płyn z tamponu przez przyciśnięcie go do wewnętrznej powierzchni kolby, 9) wykonać tamponem dokładny wymaz z całej powierzchni próbki znajdującej się

w okienku szablonu, 10) przenieść tampon do kolby i wstrząsać ok. 1000 razy, 11) wypłukać tampon, sporządzić rozcieńczenia, 12) umieścić kolby z agarem odżywczym w łaźni wodnej, 13) ogrzewać w temperaturze 100°C do całkowitego rozpłynnienia podłoża, 14) oziębić pożywkę do temperatury ok. 45°C, 15) przygotować odpowiednia liczbę płytek Petriego, 16) przeznaczyć po dwie płytki na każde rozcieńczenie, 17) zaznaczyć dermatografem na płytce rodzaj próbki, datę badania i wielkość rozcieńczenia 18) przenieść kolejno na płytki po 1 cm3 z poszczególnych rozcieńczeń, używając do każdego

rozcieńczenia innej pipety, 19) wykonać po dwa równoległe posiewy z każdego rozcieńczenia,


20) zalać posiewy ostudzonym podłożem agarowym, uchylając nieco pokrywkę i wylewając na płytkę po ok. 10 cm3 pożywki,

21) wymieszać ruchem kołowym płytkę i pozostawić do zastygnięcia, 22) wstawić płytki do góry dnem do cieplarki o temperaturze 30°C na 72 godziny, 23) policzyć wyrosłe kolonie po zakończeniu hodowli, 24) podać liczbę drobnoustrojów na powierzchni 1cm2 produktu, 25) dokonać analizy i interpretacji wyników. Na przykład do obliczeń wybrano płytki

z posiewami z rozcieńczenia 1:100. Na jednej z nich wyrosło 43 kolonie, na drugiej – 47. Średnia liczba kolonii na jednej płytce wynosiła 45. Zatem liczba kolonii na powierzchni 1 cm2 produktu była: 45 · 100 = 4500, czyli 4,5 · 103.

26) interpretacja wyników. Dokonać analizy uzyskanych wyników, wykorzystując informacje z biologii i podane w materiale nauczania. Oceń przydatność technologiczną badanego mięsa. Wyposażenie stanowiska pracy:

− taca z próbką, − szablon o powierzchni 25cm2, − tampon z gazy, − kolba o pojemności 250 ÷ 300cm3 zawierająca 25cm3 płynu do rozcieńczeń, − pinceta, probówki z 9cm3 płynu do rozcieńczeń, − pipety poj.1 cm3 (10 sztuk), − płytki Petriego (10 sztuk), − agar odżywczy (ok.100cm3), − cieplarka, − normy jakościowe.

Ćwiczenie 2

Oznacz miano coli w wodzie pitnej. Sposób wykonania ćwiczenia Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1) przetrzeć kran tamponem z waty zwilżonym denaturatem i opalić w płomieniu, 2) otworzyć kran całkowicie i spuszczać wodę przez 10 minut, 3) pobrać 150cm3 wody do butelki i przystąpić do dokonania posiewu, 4) posiewać do 10 probówek z podwójną pożywką Eijkmana jeśli z wody wodociągowej

korzysta ponad 50 tysięcy mieszkańców, 5) posiewać do 5 probówek z podwójną pożywką Eijkmana jeśli z wodociągu korzysta mniej

niż 50 tysięcy mieszkańców, 6) umieścić statyw z probówkami w liczbie 5 lub 10, do których posiano po 10 cm3 badanej

wody w cieplarce temperaturze 37ºC na 48 godzin, 7) wyjąć statyw z probówkami i obserwować kolejno probówki na obecność gazu w rurkach

Durhama, 8) zinterpretować wyniki. Jeżeli nie stwierdza się obecności gazu (powyżej 10% objętości

rurki) w żadnej z probówek oznacza to, że miano coli jest niższe od 50 lub 100, co jednocześnie dyskwalifikuje badaną wodę jako przydatną do spożycia.


Wyposażenie stanowiska pracy: − pożywka Eijkmana (podwójna) w probówkach z rurkami Durhama, − jałowe szkło: butelka o pojemności 200 cm3, − pipeta o pojemności 10 cm3, − statyw do probówek, − wata, − denaturat, − cieplarka. Ćwiczenie 3

Oznacz obecność pałeczek Salmonella w mięsie. Sposób wykonania ćwiczenia Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1) przygotować próbkę mięsa podejrzanego o zakażenie pierwotne, 2) opalić próbkę w płomieniu palnika i rozciąć jałowym nożem, 3) pobrać materiał z głębi próbki, 4) rozdrobnić próbkę za pomocą noża, albo maszynki do mięsa, z zachowaniem warunków

jałowości, 5) wprowadzić próbkę wielkości 25g pincetą do kolbki z podłożem czterotionianu sodu

według Kauffmana, 6) zanurzyć lub wymieszać z podłożem, 7) inkubować posiewy w temperaturze 37ºC przez trzy dni, wstrząsając co 24 godziny, 8) dokonać obserwacji, 9) zinterpretować wyniki. Posiew do podłoża z czterotionianem sodu jest namnażaniem

selektywnym. Wzrost wskazuje na prawdopodobieństwo zakażenia mięsa bakteriami z grupy Salmonella. Wyposażenie stanowiska pracy:

− taca z próbką mięsa, − nóż, − maszynka do mięsa, − pinceta, − palnik, − kolbka z 200 cm3 podłoża z czterotionianem sodu. Ćwiczenie 4

Porównaj mikrobiologiczne metody oczyszczania ścieków w zakładach przetwórstwa spożywczego.


1) pobrać próbki ścieków z zakładu przemysłu spożywczego, 2) porównać stan ogólny wód ściekowych z wymaganiami i warunkami dotyczącymi

odprowadzanych wód ściekowych (wykorzystać normy), 3) wskazać mikroorganizmy wykorzystywane do oczyszczania ścieków,


4) porównać metody mikrobiologicznego oczyszczania ścieków z metodami fizykochemicznymi,

5) zinterpretować przepisy dotyczące oczyszczania ścieków.

Wyposażenie stanowiska pracy: – próbki ścieków z zakładów przemysłowych. – tekst dotyczący biologicznych i fizykochemicznych metod oczyszczania ścieków, – normy dla wód ściekowych. Ćwiczenie 5

Oznacz stopień zakażenia powietrza w zakładzie przetwórstwa spożywczego.


1) przygotować dwie płytki Petriego z agarem odżywczym, 2) ustawić otwarte płytki w hali produkcyjnej zakładu przetwórczego na 5÷15 minut, 3) zamknąć płytki zaznaczając na wieczku miejsce pobrania próby i czas trwania posiewu, 4) wstawić płytki z posiewem (dnem do góry), do termostatu o stałej temperaturze 37°C na

48 godzin, 5) po okresie inkubacji wyjąć płytki z termostatu, 6) obliczać wyrosłe kolonie przy zamkniętych płytkach. Zakładając, że każda kolonia

rozwinęła się z pojedynczej komórki obliczyć liczbę drobnoustrojów x znajdujących się w 10dm3 powietrza według wzoru:

kbax

⋅⋅

=100

gdzie: a – średnia arytmetyczna z liczby kolonii wyrosłych na dwóch płytkach z tym samym podłożem, b – powierzchnia płytki w cm2 (dla płytki o średnicy 10 cm powierzchnia wynosi 78,5 cm2), k – współczynnik czasu ekspozycji płytki, dla 5 minut k=1; dla 10 minut k=2; dla 15 minut k=3, 100 – przeliczenie płytki na 100 cm2, 100 – przeliczenie płytki na 100 dm2. Powietrze można uznać za bardzo czyste jeśli liczba drobnoustrojów w 10dm3 nie jest większa niż 10. Zakażenie przekraczające 100 uważa się za bardzo duże. 7) zinterpretować wyniki.

Wyposażenie stanowiska pracy: − płytki Petriego, − agar, − woda destylowana, − termostat.


4.2.4 Sprawdzian postępów Czy potrafisz: Tak Nie 1) zdefiniować pojęcia metoda reduktazowa, miano coli, metoda

płytkowa? 2) dokonać rozcieńczeń badanego produktu do badań

mokrobiologicznych? 3) oznaczyć miano coli? 4) policzyć wyrośnięte kolonie na płytkach Petriego i zinterpretować wynik? 5) ustalić kolejność postępowania przy barwieniu preparatów metodą

Grama? 6) określić techniki mikroskopowania oraz zasady przygotowywania

preparatów?


5. SPRAWDZIAN OSIĄGNIĘĆ INSTRUKCJA DLA UCZNIA 1. Przeczytaj uważnie instrukcję. 2. Podpisz imieniem i nazwiskiem kartę odpowiedzi. 3. Zapoznaj się z zestawem zadań testowych. 4. Test zawiera 20 zadań dotyczących mikrobiologicznych badań żywności. 5. Udzielaj odpowiedzi tylko na załączonej karcie odpowiedzi. 6. Pracuj samodzielnie, bo tylko wtedy będziesz miał satysfakcję z wykonanego zadania. 7. Kiedy udzielenie odpowiedzi będzie Ci sprawiało trudność, wtedy odłóż jego rozwiązanie

na później i wróć do niego, gdy zostanie Ci wolny czas. 8. Trudności mogą przysporzyć Ci zadania: 15-20, gdyż są one na poziomie trudniejszym niż

pozostałe. 9. Na rozwiązanie testu masz 45 min. ZESTAW ZADAŃ TESTOWYCH 1. Próbki do badań mikrobiologicznych można przechowywać w temperaturach:

a) 0÷20°C. b) 0÷15°C. c) 0÷10°C. d) 0÷5°C.

2. Pożywki hodowlane to roztwory wodne substancji odżywczych do:

a) badań wybiórczych. b) utrwalania preparatów mikroskopowych. c) hodowli drobnoustrojów. d) barwienia preparatów.

3. Naczynia zawierające hodowle drobnoustrojów moczy się w 10% roztworze:

a) H2 SO4 lub 2% roztworze lizolu. b) HCl lub 3% roztworze lizolu. c) NaOH lub 1% roztworze lizolu. d) H2CO3 lub 4% roztworze lizolu.

4. Bakterie coli to mikroorganizmy bytujące w wodzie zanieczyszczonej

a) pestycydami. b) siarczanami. c) odchodami. d) azotanami.

5. Brzeczka jest pożywką, której sucha masa zawiera:

a) chlorek sodu, dekstryny, amylazę. b) maltozę, dekstryny, sacharozę. c) amylazę, laktozę, bulion. d) pepton, wyciąg mięsny, wodę destylowaną.


6. Do oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów stosuje się metodę: a) Grama. b) porównawczą. c) reduktazową. d) rezazurynową.

7. Do badań bakterioskopowych stosuje się preparaty odciskowe barwione metodą

a) Leifsona. b) Grama. c) Browna. d) Schaeffera-Fultona.

8. Bakterie gnilne wywołują:

a) rozkład tłuszczów. b) redukcję azotynów. c) rozkład cukrów. d) rozkład białek.

9. Wyciąg mięsny stosowany do podłoży i pożywek otrzymywany jest ze ścięgien i tłuszczu

mięsa: a) wieprzowego lub kurzego. b) baraniego lub cielęcego. c) wołowego lub końskiego. d) koziego lub oślego.

10. Płytki Petriego przeznaczone do wyjaławiania umieszcza się w:

a) puszkach metalowych. b) folii aluminiowej. c) bibule do sączenia. d) szmatce lnianej.

11. Do hodowli drobnoustrojów w metodzie płytkowej używane są:

a) rurki Durhama. b) płytki Petriego. c) szkiełka mikroskopowe. d) anaerostaty.

12. Do oznaczania laseczek beztlenowych przetrwalnikujących używa się:

a) podłoża Wrzoska. b) agaru wodnego. c) podłoża Wilson- Blaira. d) wyciągu mięsnego.

13. W rurkach Durhama o obecności drobnoustrojów świadczy zmętnienie i gazy:

a) CO2 i H2. b) CH4 i NH3. c) CO2 i O2. d) CO i NH3.


14. Pałeczki odmieńca mają właściwości: a) fermentacyjne. b) gnilne. c) rozkładania cukrowców. d) porażania mięśni.

15. Pożywki i podłoża stosowane do hodowli drobnoustrojów muszą:

a) zawierać wszystkie składniki pokarmowe. b) wykazywać właściwy odczyn środowiska. c) być jałowe i przejrzyste. d) spełniać wymienione wyżej warunki.

16. Roztwór fizjologiczny soli zawiera

a) NaCl i wodę destylowaną. b) Laktozę i KCl. c) CaCl i wodę destylowaną. d) Na2CO3 i wodę destylowaną.

17. Jeżeli nie ma wzrostu bakterii coli to miano wynosi:

a) 0,5 lub 5. b) 0,1 lub1,0. c) 1,5 lub 15. d) 2,0 lub 20.

18. Do podłóż o przeznaczeniu ogólnym zalicza się:

a) bulion mięsny, agar. b) podłoże Wrzoska. c) podłoże Endo. d) fuksynę fenolową.

19. Do oznaczania pałeczek duru i czerwonki stosuje się podłoże:

a) z czterotionianem sodu. b) z kwaśnym seleninem sodu. c) Mac Conkeya i „SS”. d) wszystkie odpowiedzi są prawdziwe.

20. W skład płynu Lugola wchodzi:

a) jod i jodek potasu. b) alkohol i błękit metylenowy. c) chlorek sodu i woda destylowana. d) laktoza i wodorotlenek potasu.


KARTA ODPOWIEDZI Imię i nazwisko.......................................................................................... Wykonywanie mikrobiologicznych badań żywności Zakreśl poprawną odpowiedź

Nr zadania Odpowiedź Punkty

1. a b c d 2. a b c d 3. a b c d 4. a b c d 5. a b c d 6. a b c d 7. a b c d 8. a b c d 9. a b c d

10. a b c d 11. a b c d 12. a b c d 13. a b c d 14. a b c d 15. a b c d 16. a b c d 17. a b c d 18. a b c d 19. a b c d 20. a b c d

Razem:


6. LITERATURA 1. Budsławski J., Drabant Z.: Metody analizy żywności. WNT, Warszawa 1999 2. Drewniak T.: Analiza techniczna w przemyśle mięsnym. WSiP Warszawa1993 3. Drzazga B.: Analiza techniczna w przemyśle spożywczym. WSiP, Warszawa 1992 4. Drzazga B.: Analiza techniczna w przemyśle spożywczym. WSiP, Warszawa 1992 5. Kosewska L.: Analiza mikrobiologiczna w przemyśle spożywczym. WSiP, Warszawa

1986 6. Maliszewski J.: Higiena w przemyśle spożywczym. Aspekty mikrobiologiczne. WNT,

Warszawa 1982 7. Sobczak E. red.: Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. SGGW, Warszawa 1993 8. http://www.pol-eko.com.pl/

http://www.pol-eko.com.pl/

Technology

Wykonywanie mikrobiologicznych badań żywności