第六章 基因的分离与鉴定

它不仅在词义上有名词和动词之分，而且在不同的学科之间和不同的研究层次上亦有不同的含义。

在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个个体或数个个体组成的群体。

在细胞水平上，克隆是指由同一个祖细胞（ perogenitor cell ）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。

在分子水平上，克隆是指凡带有一段 DNA 插入序列的、独特的寄主／载体单元。

“ 克隆”（ clone ）的含义

包含着待研究的目的基因的分离和鉴定两个主要的内容。

整个基因克隆的过程则包括如下四个基本的步骤：　（ i ）用于基因克隆的 DNA 材料的选择，及 DNA 分子的片段化；　（ ii ）外源 DNA 片段与载体分子的体外连接反应；　（ iii ）将人工重组的 DNA 分子导入它们能够进行正常复制的寄主细胞的程序；

　（ iv ）获得了重组体分子的转化子克隆的选择或筛选 .

用于基因克隆的 DNA 材料的来源，主要是从特定组织提取的染色体基因组 DNA或是 mRNA 反转录成的 cDNA 拷贝。

大分子量的染色体基因组 DNA 分子，必须先片段化成适于克隆的 DNA 片段群体。这些 DNA 片段群体，在体外同选择好的载体分子重组后，被导入到大肠杆菌感受态细胞群体中，并涂布在含特定抗菌素的培养基平板上生长。由于载体分子的转化子细胞才能够生长存活，而且每一个抗性细胞均生长成一个菌落（或噬菌斑），即克隆。如此在细菌中增殖形成的克隆 DNA 片段之集合体，便叫做基因文库。

基因的克隆

概念：从基因文库中筛选出含有目的基因的特定克隆。

对于编码产物是已知的目的基因，一方面可以应用互补的核苷酸序列作探针进行直接的分离。另一方面，也可以应用特定的蛋白质抗体及蛋白质的功能测定，来筛选克隆基因的蛋白质产物。

对于其编码产物未知的目的基因，则需要用特殊的分离手段，诸如差别显示技术、差减杂交方法等。

基因的分离

大肠杆菌中克隆真核基因的一般程序

一．基因组 DNA 的片段化　（ l ）利用限制酶片段化基因组 DNA 的一般问题　　鸟枪法（ shotgun approach ）：利用限制酶消化给体基因组 DNA 。这种消化产物，不经过凝胶电泳分部分离．就直接用来同载体分子作连接反应的克隆方法。前提是待克隆的给体材料是双链的基因组 DNA 。

第一节 DNA 克隆片段的产生与分离

全鸟枪法测序的主要步骤：

第一，建立高度随机、插入片段大小为 2kb 左右的文库。克隆 数要达到一定数量，即经末端测序 的片段的碱基总数应达到 5倍以上。

第二，高效、大规模的末端测序 。对文库中每一个，进行两端测序 ， TIGR 在完成流感嗜血杆菌的时，使用了 14台测序 仪，用三个月时间完成了必需的 28,463 个测序 反应，测序 总长度达 6 倍。

第三，序列集合。 TIGR发展了新的软件，修改了序列集合规则以最大限度地排除错误的连锁匹配。

第四，填补缺口。有两种待填补的缺口，一是没有相应模板 DNA 的物理缺口，二是有模板 DNA 但未测序 的序列缺口。他们建立了插入片段为 15-20kb 的 λ 文库以备缺口填补。

鸟枪法测序的缺点1 ，随着所测总量增大，所需测序 的片段大量增加，各个片段重叠或一个连续体的概率是 2n2 -2n等真核生物（如人类）中有大量重复序列，导致判断失误。

2 ，所形成的重组体分子，实际上是一群带有大小不同的插入片段的重组体的混合群体，筛选工作量大。

3 ，目的基因的核苷酸序列中，对所采用的限制酶可能会存在着一个甚至数个识别位点。就必须同时分离好几个克隆，才有可能获得目的基因的全序列。

4 ，应用限制酶消化法片段化的基因组 DNA 进行克隆，还会因某些限制片段的分子量太大或太小的缘故，而出现不能被克隆的情况。

5 ，选择用于产生 DNA 克隆片段的限制酶，还必须考虑到它对 DNA 序列应该具有最佳的识别位点分布规律。　

Clone contig 法

首先用稀有内切酶把待测降解为数百 kb 以上的片段，再分别测序 。

靶标鸟枪法 (direted shotgun)

根据染色体上已知基因和标记的位置来确定部分 DNA 片段的相对位置，再逐步缩小各片段之间的缺口。

对鸟枪法的改进

　　 1978年， T ． Maniatis 等人提出了利用两种限制酶混合消化基因组 DNΑ 的实验策略。应用这种方法可以获得适于克隆的随机片段化的 DNA 群体。他们所选用的均是具有4 个核苷酸识别位点的核酸内切限制酶，因此对基因组 DNA 具有较高的切割频率。

（ 2 ）基因组 DNA 的双酶消化策略

　　在克隆之前，先对片段化的给体 DNA 群体进行按大小的分部分离，会明显地提高克隆基因的分离频率。

　　通常是使用琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度离心进行 DNA片段的分部分离。采用琼脂糖凝胶电泳分部分离技术，可以在很窄的范围内获得高纯度的某种 DNA 片段，或是大小相近的 DNA 片段。

二． DNA 片段的大小分部

　　经限制酶消化的基因组 DNA 制剂，通过凝胶电泳或蔗糖梯度离心之后，不同长度的 DNA 片段便会按大小顺序彼此分开。根据事先已测定的编码目的基因的克隆片段的分子量大小．从电泳凝胶的相应谱带上蔗糖梯度的相应部位中，收集 DNA 片段，于是便达到了富集目的基因 DNA 片段的要求。

基本的前提 :那就是被克隆的目的基因的全序列，必须是位于一条 DNA 片段上，而不是分布在彼此交叠内的种片段上。因此，随机片段化的 DNA 是不适用于这种方法的。

三．编码目的基因的克隆片段的富集

第二节 重组体 DNA 分子的构建及导入受体细胞

一．外源 DNA 片段同载体分子的重组

DNA 分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和 DNA连接酶的作用。

大多数的核酸内切限制酶都能够切割 DNA 分子，形成具有 1～4 个核苷酸的粘性末端。

当载体和外源给体 DNA 用同样的限制酶，或是用能够产生相同的粘性末端的限制酶切割时所形成的 DNA 末端就能够彼此退火，并被 T4 连接酶共价地连接起来，形成重组体分子。　

构建重组DNA

分子的途径

目的基因的获取与克隆

已知序列基因的克隆 3 法 未知序列基因的克隆 3 大步骤

方 法 条 件 步 骤

1. 限制酶切除法① 限制酶切除直接分离法②限制酶消化 / 分段筛选法③ 从已克隆在载体上片断制备

已知原物理图谱未知物理图谱，须有筛选条件，如探针等

1. 选择含有目的基因的实验材料，可以是染色体 DNA 或 mRNA逆转录生成 cDNA 。

2. PCR/ 或 RT/PCR扩增 已知基因序列 /

或基因两侧序列2. 选择合适的方法制备 DNA 片段并使之克隆

3. 化学合成 已知基因序列 3. 选择合适的方法筛选目的基因

（ 1 ）外源 DNA 片段定向插入载体分子

　　用两种不同的限制酶同时消化一种特定的 DNA 分子，将会时出具有两种不同粘性末端的 DNA 片段。

载体分子和待克隆的 DNA分子，都是用同一对核酸内切限制酶切割，然后混合起来，那么载体分子和外源 DNA 片段将按一种取向退火形成重组 DNA 分子

（ 2 ）非互补粘性末端 DNA 分子间的连接

用附加衔接物的办法来提高平末端间的连接作用的效率。

衔接物是一种用人工方法合成的 DNA 短片段，具有一个或数个在其要连接的受到 DNA 上并不存在的限制酶识别位点。

1. 用 Sl 核酸酶除去粘性末端，形成平末端的片段；

2. 按平末端连接法分别给它们加上相同的一段衔接物。

3. 用只在衔接物中具有的唯一识别位点的限制酶切割，结果就会产生出能够彼此互补的粘性末端。

4. 这样就可以按照常规的办法，用 T4 DNA 连接酶将它们连接起来

　　阻止经限制酶切割后的线性载体分子自身的再环化作用，以提高 DNA 片段的插入效率。目前通用的有三种办法：第一，用碱性磷酸酶处理由限制酶消化产生的线性载体分子。第二，使用同聚物加尾连接技术。第三，应用柯斯质粒。 　　在连接反应中，正确地调整载体 DNA 和外源 DNA 之间的比例，是能否获得高产量的重组体转化子的一个重要因素。如果是应用 λ 噬菌体或柯斯质粒作载体时，配制高比值的载体 DNA／给体 DNA 的连接反应体系，则有利于重组体分子的形成。若是使用质粒分子作为克隆的载体；当载体 DNA 与给体 DNA 的比值为 l 时，便有利于这类重组体分子的形成。　　此外，在体外连接反应中， DNA 的总浓度对形成什么样的DNA 分子类型同样也会有所影响。一般规律是，低浓度的 DNA低于 20DNA/ml）分子间的相互作用机会少，有利于环化作用；而高浓度的 DNA （高于 300～ 400μgDNA ／ ml） , 则有利于形成长的多连体 DNA 分子。　　 连接反应的温度也是影响连接效果的另一个重要因素。

（ 3 ）最佳连接反应

　　基因的扩增，是指带有外源 DNA 片段的重组体分子在体外构成之后，导入适当的寄主细胞进行繁殖，从而获得大量的纯一的重组体 DNA 分子的过程。

　　将外源重组体分子导人受体细胞的途径，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。转化和转导主要适用于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。　

二．重组体分子导入受体细胞的途径

rDNA 导入受体细胞方法举例（基因工程实验）

方法 原理概要 备注1. 重组质粒 DNA 导入 E.coli

(1) 低温 CaCl2 （冰浴）处理 Ecoli ，使成 为感受态细胞。 (2)rDNA 与受体菌混合－ > 冰浴－ >42℃热休克－ > 即可使 rDNA 进入 Ecoli 。 (3) 接种于含抗生素平皿中转化－ > 筛选

（ 1 ） compent cells 具 有摄取外源 DNA 能力的细胞。（ 2 ）高频电流电穿孔法（ elecroporation ）能使外源 DNA 进入 Ecoli 。

2. λphage－ rDNA 分子导入 Ecoli

(1) 包装 使 λphageDNA 重组 DNA 获得感染 Ecoli 能力(2) 接种合适的平皿上进行培养，溶菌生长皿上可见清亮的噬菌斑，溶源有一部溶菌，溶菌斑是混浊的

(1)λ 噬菌体感染 Ecoli 只注入核酸(2) 含 λ 噬菌体头、尾部蛋白已商品化，包装 rDNA使之获得感染 Ecoli 能力(3) 溶菌：产生子代 λ 噬菌体；溶源：不产生子代。

3. cosmid 导 入Ecoli

(1) 酶切 cosmid 和部分真核 DNA 并连接二者成 rDNA(2) 包装噬菌体成噬菌体颗粒感染 Ecoli(3) 用抗生素抗性标记筛选 rDNA

噬菌体 2 个尾巴＋质粒即 cosmid （粘尾质粒）。

● 受体细胞 (receptor cell) 又称为宿主细胞或寄主细胞 (host cell)等，从实验技术上讲是能摄取外源 DNA并使其稳定维持的细胞 ;从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。

● 感受态 (competence) 细胞处于能够吸收DNA的状态，称为感受态。

● 感受态细胞 (competence cell) 处于能够吸收DNA状态的细胞。

● 细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的 DNA ，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。

● 转化子 (transformant) ：经转化获得外源遗传物质的细胞。

● 转化 (transformation):指将质粒 DNA 或以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过程。

● 转染 (transfection):指病毒及其重组子导入受体细胞的过程。

● 转导 (transduction):指噬菌体及其重组子导入受体细胞的过程。

　　在基因操作中，转化（ transformation ）一词严格地说是指，感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体 DNA 分子的生命过程；而转染（ transfection ）一词，则是专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体 DNA 分子的生命过程。但从本质上讲，两者并没有什么根本的差别。无论转化还是转染，其关键的因素都是用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高膜的通透性，从而使外源 DNA 分子能够容易地进入细胞内部。

　　

（ 1 ）重组体 DNA 分子的转化或转染

A, 细菌转化（或转染）的具体操作程序

将 DNA 分子同经过氯化钙处理的大肠杆菌感受态细胞混合，置冰浴中培养一段时间之后，转移到 42℃下作短暂的热刺激。

A, 氯化钙法

B, 电穿孔法

电穿孔法 (electroporation): 是指在一个较大的电脉冲短暂破坏细胞膜的脂质双层，从而允许 DNA等分子通过细胞膜进入细胞，而后细胞膜快速复原，保持细胞的完整。这种方法称为电穿孔法。

最早用于将 DNA 导入真核细胞， 1988 年， Dower等人成功应用于大肠杆菌的转化。其基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源 DNA 的有效吸收。

原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（ Vm）约为 l00mV ，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。

可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。

不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。

电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源 DNA 浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每μg DNA 可以得到 109～ 1010转化子。电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将会有所提高，但同时导致受体细胞存活率的降低，转化效率的提高也因此被抵消。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致 50% ～ 70% 细菌死亡时，转化水平达到最高。

（ 2 ）体外包装的 λ 噬菌体的转导　　体外包装颗粒的转导，是一种使用体外包装体系的特殊的转导技术。它先将重组的 λ 噬菌体 DNA 或重组的柯斯载体 DNA ，包装成具有感染能力的 λ 噬菌体颗粒，然后经由在受体细胞表面上的 λDNA 接受器位点（ receptor sites） , 使这些带有目的基因序列的重组体 DNA注入大肠杆菌寄主细胞。

克隆基因在真核细胞中的表达一、真核表达系统和原核表达系统 (E.coli) 的特点

（一）不同表达系统蛋白质表达及翻译后修饰情况的比较

E.coli 酵母细胞 昆虫细胞 哺乳动物细胞

产率（ 以干重计算）

0-60% 0-10% 0-30％ 0-1%

蛋白酶消化 +/- +/- + +

糖基化 - + + +

分泌 +/- + + +

折叠 +/- +/- + +

磷酸化 - + + +

酰基化 - + + +

酰胺化 - - + +

（二） E.coli 表达产率高，但难以表达真核活性蛋白

从上表中可以看出，外源蛋白在 E.coli 中的产率最高，但是，大多数真核蛋白无法在原核细胞中获得活性表达，其原因主要包括：

1. 表达的蛋白不稳定，易受细菌蛋白酶的水解

2.缺乏翻译后加工系统，表达蛋白质不能有效，正确的折叠，二硫键配对错误，缺乏信号肽切除，糖基化，磷酸化和羟化等翻译后修饰等。

3. 表达产物对原核细胞有毒

因此，用真核细胞表达真核外源目的基因，尤其是功能性膜蛋白，需要翻译后修饰的蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复合体中的蛋白组合等等，应首先真核表达系统。用真核细胞表达外源目的基因已成为现代分子生物学研究的主要内容之一。

三、外源基因导入真核细胞的基本方法

近年来，基因导入方法不断改进，使得转染效率逐渐接近 100％，将外源基 因导入真核细胞的方法有 2类。

（一）病毒感染（ Virus infection ） 是一种将外源基因导入细胞的天然方法。

（二）质粒转染（ Transfection ）用非病毒的理化方法将外源基因导入真核细胞的方法称转染。 电穿孔技术

1 ．病毒感染 物理方法

基因导入方法 显微注射技术 2 ．转染

化学法 DEAE－葡聚糖转染 磷酸钙共沉淀法 脂质体介导法 醋酸锂法

 

哺乳动物细胞的基因导入方法 转染技术在初期时发展相当缓慢，分子生物学技术，特别是质粒DNA克隆技术的进步极推动了转染技术的进步。现在人们可以轻而易举地大量制备高纯度的 DNA和 RNA，但同时要求有更高效率的转染技术和更多的细胞种类。由此，人们发明了电穿孔和脂质体介导的技术。

对外源基因转染方法的要求包括：转移效率高，不影响细胞的正常生理活动，低毒性，容易使用，重复性好，易获得稳定转化子。根据转染的机制不同可将转染法分为化学转染法和物理法两大类。

（一）化学转染法 化学转染法包括 DEAE一葡聚糖法、磷酸钙法和人工脂质体法等。目前应用最广泛的是人工质体法。

1.DEAE- 葡聚糖转染法

二乙胺乙基葡聚糖是一种高分子量的多聚阴离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源 DNA ，因此被用于基因转染技术。

其促进细胞捕获 DNA 的机制还不清楚，可能是因为葡聚糖与DNA 形成复合物而抑制了核酸酶对 DNA 的作用，也可能是葡聚糖与细胞结合面引发了细胞的内吞作用。

优点：该方法可广泛用于转染病毒、病毒序列及其他 DNA ，适合于细胞瞬间表达检测及小量 DNA 的转染。

由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究。

基本原理：当 CaCl2、 DNA 和磷酸盐缓冲液缓慢混合时，即有磷酸钙微细沉淀形成，这些细小颗粒可以吸附在细胞表面，通过细胞膜的内吞作用将 DNA 吸收进入细胞质面后进入细胞核，其详细机制尚不明确。

DNA 多以多拷贝首尾相连的串珠状排列进入细胞，在细胞中常以多拷贝形式存在。

2.磷酸钙法即磷酸钙共沉淀转染法

原理：将磷脂、胆固醇或其他脂类的乙醚溶液加入到 DNA溶液中，经特殊处理得到单层或双层的带 DNA 的脂质体小泡，通过与细胞膜融合，被细胞内吞而实施基因转移。

优点：1，基因转移效率很高，据报道最高时， 100％离体细胞可

以瞬时表达外源基因。2，可以转染其它化学方法不易转染的细胞系3，而且转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的 DNA，

以及 RNA和蛋白质。4，脂质体法转染还适用于瞬时表达和稳定表达。5，脂质体还可以介导 DNA和 RNA转入动物和人的体内，

用于基因治疗。

3. 人工脂质体法

包括电穿孔、显微注射及基因枪等方法。

四种常用哺乳动物细胞电穿孔基因转染缓冲液 ①不含 Ca2+或Mg2+的 PBS ②HeBS（ 137 mmol／ L NaCI， 5 mmol／ L KCI、 0.7mmol／ L Na2HPO4，

6mmol／ L右旋葡萄糖、 21 mmol／ L HEPES）精确调节 pH至 7.05 ③无血清培养基 ④蔗糖一磷酸缓冲液 272 mmol/L蔗糖、 7 mmol/L K2PO4(pH至 7.4)、l mmol/MgCl2

（二）物理方法

作用原理是，利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进人的微孔。

电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。

影响转染效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。

1.电穿孔法（ eleetroPoration ）

将盛有细胞和 DNA混合物的特制小容器置于电脉冲仪的正负极之间，在 0度下加高压（ 2～ 4KV ），电脉冲 10分钟后，将待处理的细胞转移到新鲜培养基中生长 2 天，再进行筛选。存活细胞的回收率约为 60% ～ 80% 。

操作程序：

2 显微注射

指在显微镜下，将 DNA 由细胞玻璃针直接注入细胞。可以将 DNA 直接注入核内而减少溶酶体对外源 DNA的降解，有助于基因的整合与表达。

适用于多种贴壁生长细胞及悬浮生长细胞，包括原代及传代细胞、胚胎细胞等。

该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导人细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。

3.基因枪法 该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。

基本原理：

首先利用微小的金、钨等金属颗粒相 DNA 吸附，然后在高压作用下将 DNA 伴随金颗粒高速进入细胞，由于微粒的直径一般在 0.5-0.9 Fm 之间，远小于细胞．

因此可直接将 DNA 导入细胞质中，这种方法能有效地使 DNA 在活体组织、贴壁细胞和悬浮细胞中表达。由于该方法的高转染效率，通常只得少量 DNA 即可获得外源基因的表达并激发有效免疫应答。

首先将钨、金微粒 (直径约 0.4μm ，重量约 0.05mg) 与供体 DNA溶液 (1 ～ 2μl)混合并保温，使 DNA 吸附在金属微粒的表面，然后将该溶液置于所谓的“基因枪”仪器中，仪器高压放电将金属微粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在钨粒上的 DNA 以及溶液中的 DNA都可以进入受体细胞。

操作技术程序：

基因枪所用材料：（ 1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。（ 2）将 DNA 包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、 CaCl2 、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。

（ 3）所用动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微弹；另一类以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压蒸汽作为动力。

基因枪法的特点：（ 1）转化效率高。（ 2）受体广泛。（ 3）操作简单。

（ 1）双链 DNA 病毒转化载体

这类病毒是以双链 DNA 作为遗传物质，在这类病毒中，目前研究的最多的是花椰菜花叶病毒（简称 CaMV, Caullinus Mozic Virus）。

（ 2）单链 DNA 病毒转化载体

GeNV顾名思义，可翻译成“双联体病毒”或“孪生病毒”。GeNV 的感染范围较广，包括单子叶和双子叶植物，它们的传播媒介是昆虫。

（ 3）单链 RNA 病毒转化载体 迄今为止，还没有建立起一个完善的以植物 RNA 病毒为基因载体的基因转化体系，但是 RNA 病毒仍是一个很有希望作为基因工程载体的植物病毒。

（三）病毒感染

病毒颗粒是一类十分有效的基因释放系统，因此，它是将外源基因导人大量细胞最有效的方法。病毒感染具有高效率、可稳定遗传、适用于各种不同来源的细胞及操作简单等优点。但多数病毒有其潜在的危险性，操作者需要有一定的病毒操作经验和良好的设施。病毒表达系统内容十分丰富，其应用已越来越广泛。