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免疫染色
組織標本の中にある、或る“タンパク質”の場所を目で見えるようにするための方法。
目的とするタンパク質'抗原(にだけくっつく事ができる物質'抗体(を使う。
抗原=タンパク質
抗体=抗原とくっつく
抗原
簡単な原理
1(まず抗原に抗体'一次抗体(がくっつく
2(くっついた一次抗体に特異的にくっつく二次抗体をapplyする。
• 二次抗体が蛍光標識されいれば蛍光で光っている場所に抗原が存在
• 二次抗体に酵素が付いていれば、基質で様々な色に発色'酵素抗体法(
酵素と基質の組み合わせを変えれば、見たいものを何色にすることもできる。
Peroxidase ⇒ DABで茶色AECで赤色アセトニトリルで黒青色
など
Alkaline Phosphatase ⇒ Fast Redで赤色Fast blueで青色
など
酵素抗体法の場合
酵素と基質の組み合わせを変える事で何重染色も可能に!~特に、異なる細胞にそれぞれ標的とする抗原が存在する場合に有用~
'但し、一つの染色を終えるたびに、それまでにapplyした抗体をwash outしたり、変性させたりする必要あり(
しかし実際にはうまくいかない事も多い…………..
原因(•抗原が壊れてしまっている
•抗原がマスクされてしまっている
•抗体が免疫染色に不適である
•抗体の結合性が弱い
修復不能 ×
抗原賦活ができる事も
どうしようもない'事が多い(
感度を上げてみる
抗原賦活の方法
熱をかける オートクレーブ圧力釜電気ポット
酵素処理を行う Pepsin処理Protease K 処理Hyarulonidase 処理'室温~37℃、3-30分(
抗原賦活液クエン酸バッファーTRS溶液Immunosaver
L.A.B. Solution
など
ABC法(avidin-biotinylated peroxidase complex)
一次抗体を反応した後にビオチン標識二次抗体を作用させ、引き続き標識酵素を反応させる3ステップ法。直接法に比べて感度が高いが、LSABやポリマー法には敵わない。
注意( 熱による抗原賦活化処理で内因性ビオチンの非特異的反応が起こる
LSAB法(labeled streptavidin biotinyated antibody)
基本的にはABC法と同様であるが、ビオチンと酵素標識ストレプトアビジンの両者はきわめて親和性が高く非可逆的な結合性を示し、更なる高感度が得られる。キット商品も多数市販されている。注意( ABC法同様、熱による抗原賦活化処理で内因性ビオチンの非特異的反応が起こる
Envision method (DAKO)
(hyper-sensitive polymer method)
1.Apply primary antibody
2.Apply peroxidase-Envision
3.Apply substrate for color
(DAB)
Quick (three steps)
&
Sensible
Standard method for the routine immunostaining!
DAKO Envision
マウス&ラビット用Peroxidase標識
マウス一次抗体用Peroxidase標識
ラビット一次抗体用Peroxidase標識
マウス&ラビットAlkaline Phosphatase標識
Specimens are placed in a 60℃ oven beforehand.
① Deparaffinization (5 min)
② Antigen retrieval (microwave; 10 min; enzyme; 6 minutes)
③ Rinsed in running water
④ 100% methanol with 3% H2O2 (5 min)
⑤ Rinsed with running water, distilled water, and TBS-Tween
⑥ Soaked in TBS with 5% BSA (5min)
⑦ Exposure to the primary antibody ( 60 min-over night)
⑧ Rinsed in TBS with shaking (5min)
⑨ Application of the secondary antibody (Envision or Simple Stein)
( 60 min-over night)
⑩ Rinsed in TBS with shaking (5 min)
⑪ Immersed in DAB/H2O2 solution (5-15 min)
⑫ Rinsed in TBS and running water
⑬ Counterstaining
Dehydration, mounting and cover slipping
Standard immunostaining procedure
It takes more than 3 hours (~one day!)
Specimens are placed in a 60℃ oven beforehand.
① Deparaffinization (5 min)
② Antigen retrieval (microwave; 10 min; enzyme; 6 minutes)
③ Rinsed in running water
④ 100% methanol with 3% H2O2 (5 min)
⑤ Rinsed with running water, distilled water, and TBS-Tween
⑥ Soaked in TBS with 5% BSA (1 min)
⑦ Exposure to the primary antibody with intermittent irradiation (10
min)
⑧ Rinsed in TBS with Tween with shaking (1 min)
⑨ Application of the secondary antibody (Envision or Simple Stein)
with intermittent irradiation (10 min)
⑩ Rinsed in TBS with shaking (1 min)
⑪ Immersed in DAB/H2O2 solution with intermittent irradiation (5
min)
⑫ Rinsed in TBS and running water
⑬ Counterstaining
Dehydration, mounting and cover slipping
One-hour immunostaining procedure
Our procedure
Exposure to the primary antibody with
intermittent irradiation (10 min)
Standard procedure
Exposure to the primary antibody
( 60 min-over night)
Comparison between standard procedure and ours
Step 7
Special microwave equipment
(MI-77, Azumaya, Tokyo, JAPAN)
Variable
•Power (100W-500W)
•Irradiation time
•Intermittent irradiation mode
Apply red dye on the oil, calmly
MW irradiation, 5minNo MW irradiation
(still standing)
Not mixed Mixed
Caution!
Antibodies are protein, which is easily denatured by
high-temperature.
Try to decide the best condition for the
microwave irradiation
0
5
10
15
20
25
30
35
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
250w
300w
MW: power 250W, 300W, 350W
(continuous irradiation)
50ml water on the bottom of moist chamber
Temperature of the 200μliquid on the slide
350W; BSA was denatured within 5 minutes.
MW: power 250W
50ml water on the bottom of moist chamber
Temperature of the 200μliquid on the slide
0
5
10
15
20
25
30
35
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
continuous
5sec-on, 1sec-off
4sec-on, 2sec-off
4sec-on, 3sec-off
Duration
degree
Most suitable condition of irradiation to
avoid excessive temperature increase
•250W
•4-seconds-on and 3-seconds-off
10min 30min
Immunostaining of cytokeratin (CK) 5/6
with intermittent microwave irradiation
5min
Evaluation of specific positive reaction could be performed
correctly in the specimen with 10 min irradiation
Advantage of microwave irradiation
for antibodies incubation
•Incubation time: very short '10 min)
•Background: clear
Non-specific reaction (NS) increase in
proportion to incubation period (I.P.)
NS=αxI.P.
Immunostaining of CD79a(Lymphnode)
10min
without MW
10 min
with MW
60 min
without MW
Low magnif. High magnif.
ホルマリン固定パラフィン包埋標本で免疫染色がうまくいかない時
1. 抗体のinformation sheetを確認2. 抗原賦活法を変えてみる3. より感度の高い方法を検討する4. 抗原と抗体のインキュベーションにマイクロウエーブや超音波を試す
それでもダメなら
標本の固定法を変える'ホルマリン⇒4%PFA,アセトンなど(抗原維持に優れた各種固定法を試す'AMEX、HOPEなど(
それでもダメなら
凍結標本でtry