第十二章 DNA 的复制和修复

本章重点介绍遗传中心法则和 DNA

的半保留复制以及逆转录的过程和机理，对 DNA 的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。

思考

DNA 是绝大多数生物体遗传信息的载体，继 1953 年 Watson & Crick

提出 DNA 双螺旋结构模型后， 1958

年， Crick 提出了“中心法则” (Cent

ral dogma) 揭示了遗传信息的传递规律。

中心法则

遗传信息传递的 中心法则

蛋白质翻译

转录逆转录

复制

复制

DNA

RNA

生物的遗传信息以密码的形式储存在 DNA 分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过 DNA 复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给 RNA ，再由 RNA 通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些 RNA 病毒能以自己的 RNA 为模板复制出新的病毒 RNA ，还有一些 RNA 病毒能以其 RNA 为模板合成 DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。

中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。

目 录第一节 DNA的复制（ DNA 指导下的 DNA 合成）

第二节 逆转录作用（ RNA 指导下的 DNA 的合

成）

第三节 DNA的损伤与修复

第四节 DNA突变

第五节 DNA的遗传重组

第一节 DNA 的半保留复制

一、概念和实验依据

二、 DNA聚合反应有关的酶类

三、 DNA的复制的起始点和方式

四、原核细胞DNA的复制过程

五、 DNA复制的忠实性

六、真核细胞DNA的复制

DNA 的半保留复制的概念

DNA 在复制时，两条链解开分别作为模板，在 DN

A 聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的 DNA 分子。这样新形成的两个 DNA 分子与亲代DNA 分子的碱基顺序完全一样。由于子代 DNA 分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。

DNA的半保留复制实验依据

1958 年 Meselson & stahl 用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验 , 证明了 DNA 是采取半保留的方式进行复制 .

[15N] DNA

[14N- 15N] DNA

[14N] DNA

[14N- 15N] DNA

复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims 实验 )

将 3H- 胸苷标记大肠杆菌 DNA ，经过近两代的时间， 3H- 胸苷掺入大肠杆菌 DNA 。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体 DNA 释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（ C ）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（ B ）仅有一股链是标记的，另外一股双链（ A ）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为 1100 微米。

A

B

C

环状 DNA 的复制

AB

C

原核生物原核生物 DNADNA 聚合反应有关的酶类聚合反应有关的酶类（ 1 ） DNA聚合酶(DNA polymet

ases)

（ 2 ）引物酶 (peimase) 和引发体 (primosome) ：启动 RNA引物链的合成。 (3 ） DNA连接酶（ DNA ligase ）

（ 4 ） DNA 解链酶 (DNA helicase)

(5 ）单链结合蛋白 (single-strand binding protein,SSB) ：结合在解开的 DNA 单链上，防止重新形成双螺旋。

(6 ）拓扑异构酶 (topoisomerase): 兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将 DNA 超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。

解旋酶

DNA 聚合酶 III

解链酶

RNA 引物

引物酶和引发体

DNA聚合酶I

SSB

3´ 3´ 5´

3´5´

5´ RNA引物

DNA 聚合酶催化的链延长反应

5´RNA 引物 子链

3´

3´

5´ 5´

3´

3´

5´ 5´

3´

3´ 5´模板链

大肠杆菌三种 DNA 聚合酶比较DNA

聚合酶Ⅱ

分子量

每个细胞的分子统计数

5´-3 ´ 聚合酶作用

3´-5 ´ 核酸外切酶作用

5´-3 ´ 核酸外切酶作用

转化率

DNA聚合酶Ⅰ

109 ， 000

400

+

+

+

1

120 ， 000

100

+

+

-

0 .05

400 ， 000

10-20

+

+

-

50

比较项目 DNA聚合酶

切除引物修复

修复 复制功能

1999 年发现聚合酶 和，它们涉及 DNA 的错误倾向修复（ errooune repair ）

DNA 聚合酶的 3´- 5´ 外切酶水解位点

3´

3´5´

5´

错配碱基

3´- 5´ 核酸外切酶水解位点

DNA 聚合酶 5´- 3´ 外切酶活力

5´- 3´ 核酸外切酶水解位点

单链缺口

5´

大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能

延长因子

DNA 聚合酶Ⅲ 两个亚基夹住 DNA

DNA 聚合酶Ⅲ异二聚体

核心酶

校对

引物的结合和识别

促使核心酶二聚化

连接酶连接切口

Mg2+

连接酶 ATP 或 NAD ＋

AMP+PPi 或 NMN+AMP

A

T C

G

P

T T

PP P

A A C C T

G A

P

A C

PP PPOH

T G

G

A

T C

G

P

T T

PP P

A A C C T

G A

P

A C

PP P

T G

G

P

缺口

3'

3' 5'

5'

5'

5' 3'

3'

模板链

模板链

DNA 的双向和单向复制

环状 DNA 复制时所形成的 Q 结构

起始点

复制叉的推进

复制叉

起始点

起始点

起始点

复制叉复制叉

未复制 DNA

单向复制

双向复制

大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列

GATCTNTTNTTT

成串排列的三个 13bp 序列

共有序列 共有序列TTATCCACA

DnaA 蛋白结合位点四个 9bp 序列

DnaADnaB( 解螺旋酶 )

SSB

大肠杆菌 DNA 复制起点在起始阶段的结构模型

原核细胞 DNA的半不连续复制复制过程

复制叉的移动方向

解旋酶

DNA聚合酶III

解链酶

RNA 引物

引物体

DNA聚合酶I

SSB

3´ 3´ 5´

前导链

随后链

3´5´

复制的起始

DNA 链的延长

DNA 链终止

5´ RNA 引物

3´

3´

聚合酶 III 核心酶

大肠杆菌复制体结构示意图

聚合酶 I

聚合酶 III 核心酶

滞后链前导链

解螺旋酶引物合成酶

RNA 引物

引发体

拓扑异构酶 II

- 夹子- 聚体

- 夹子

- 复合物

RNA 引物

单链结合蛋白（ SSB ）

引物的消除和缺口的补充

大肠杆菌染色体复制的终止

oric

复制叉 2 复制叉 1

终止复制叉2

终止复制叉 1

复制叉 1复制叉 2

完成复制

DNA 拓扑异构酶

连锁染色体

DNA 复制的终止过程

• 1 、终止区域

• 大肠杆菌 DNA 上存在多重拷贝的 Ter顺序，这种 Ter 顺序长 20bp ，包括 TerA 、 TerB 、 TerC 、 TerD 、 TerF 和 TerG ，它们在 DNA 上排列以创造出一种“陷阱” ,阻止复制叉的移动。防止过分复制。

逆时针复制叉 顺时针复制叉

逆时针复制叉陷阱

11顺时针复制叉陷阱

• 2 、当任意一个复制叉碰到一个功能性 Tes-Tur 复合物时，就停止。而另一个复制叉碰到第一个被阻止的复制叉时也停止前进。这些大复合物中间的几百个核甘酸对以一种未知的机制被复制。完成两个环行染色体的拓扑学联系。分开这种连环需要拓扑异构酶Ⅳ。

复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型

聚合酶 III全酶

引物聚合酶 III

全酶引物

引物体引物体解旋酶 解旋酶

复制的忠实性复制的忠实性 DNA 复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌 DNA 复制 5109 碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点 :

DNA 聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为 7 10-6 ）

DNA 聚合酶的校对功能（错配碱基被 3’-5’

外切酶切除）

起始时以RNA作为引物

DNA 聚合酶的校对功能

5´- 核酸外切酶

3´- 核酸外切酶

裂缝

聚合中心

裂缝内部

DNA 聚合酶的校对功能

聚合酶

错配硷基

复制方向

正 确核苷酸

5´ 5´ 5´3´ 3´ 3´

切除错配核苷酸

起始时以 RNA 作为引物的作用 DNA 复制为什么要合成一个 RNA 引物，而后又把这

个引物消除呢？这是保证 DNA 聚合过程高度精确的又一措施。已知 DNA 聚合酶具有 35 外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始 D

NA 的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当 DN

A 开始聚合以后再以 53 外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。

真核细胞 DNA 复制的特点 多个起点复制

起点

起点

起点

起点

起点

起点

真核生物的DNA聚合酶

端粒（telemere）复制

真核生物的 DNA 聚合酶

DNA聚合酶

分子量

亚基数

细胞内分布

酶活力百分比

外切酶活力

DNA聚合酶

110-23 ， 00

0

多个

细胞核

～ 80%

无

120 ， 000

一个

细胞核和线粒体

2 ～ 15%

无 -

400 ， 000

一个

细胞核 +

10 ～ 25%

5-3 外切酶

DNA聚合酶

DNA聚合酶

45 ， 000

一个

细胞核

10 ～ 15

%

无

端粒酶（ telomerase ） DNA 复制需要引物，但在线形 DNA 分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段 . 如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含 RNA 的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于 RNA 模板的 DNA 片段的合成，使复制以后的线形 DNA 分子的末端保持不变。

初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。

5´3´

AAAACCCCAAAACCCCC

C A

端粒酶

端粒合成的一种模型

3´5´ TTTTGGGGTTTTG

5´3´

AAAACCCCAAAACCCCC

C A

AA

3´5´ TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG

5´3´

AAAACCCCAAAACCCCC

C A

AA

TTGGG

TGGG

T

3´

5´

AA

TTTTG

5´3´

AAAACCCCAAAACCCCC

C A

GTTTTG

整合和杂交

移位和再杂交

端粒合成的完成

TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT5´

3´n

AA

3´

TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5´

3´TTCCCCT

nAA 3´

TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5´

3´TTAAAACCCC AAAACCCC AAAACCCCT

n

进一步加工继续延伸

真核和原核 DNA 细胞复制比较

第二节 DNADNA 的损伤与修复的损伤与修复 某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于 DNA ，造成 DNA 结构和功能的破坏，称为 DNA

的损伤 . DNA 的修复主要有以下类型 :

暗修复四、诱导修复（ SOS 修复）

一、光裂合酶修复二、切除修复

三、重组修复

五、错配修复

DNA 紫外线损伤的光裂合酶修复

1 、形成嘧啶二聚体

2 、光复合酶结合于损伤部位

3 、酶被可见光激活

4 、修复后酶被释放

DNA 的损伤和切除修复碱基丢失 碱基缺陷或错配 结构缺陷

切开 核酸内切酶

核酸外切酶切除

DNA 聚合酶

DNA 连接酶

AP 核酸内切酶

核酸外切酶

切开

切除

修复

连接

糖苷酶

插入酶碱基取代

切除修复的分子机制

• 所谓切除修复，即是在一系列酶的作用下，将 DNA 分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使 DNA 恢复正常结构的过程。

• 这是比较普遍的一种修复机制，它对多种损伤均能起修复作用。切除修复包括两个过程：一是由细胞内特异的酶找到 DNA 的损伤部位，切除含有损伤结构的核酸链；二是修复合成并连接。

• 细胞内有许多种特异的 DNA 糖苷酶（ glycosyles

e ），它们能诀别 DNA 中不正常的碱基，而将其水解下来。例如，在 DNA 复制过程中聚合酶对 dTTP

和 dUTP 的分辨能力是不高的，因此常有少量脱氧尿苷酸掺入到 DNA 链中去。大肠杆菌的 dUTP 酶可以分解 dUTP 成 dUMP ，但是它的作用有限，仍然不能完全避免 dUTP 的混入。而且，胞嘧啶脱氨基后也会转变成尿嘧啶。对于 DNA 链上出现的这些尿嘧啶，细胞中的尿嘧啶 -N- 糖苷酶可以把它除去。腺嘌呤脱氨后形成次黄嘌呤，这一不正常的碱基可被次黄嘌呤 -N- 糖苷酶切掉。

• 无嘌呤（ apurinic ）或无嘧啶位点（ apyrimi

dinic site ）常称为 AP 位点。烷化剂可使碱基被修饰，如甲基磺酸甲酯作用于 DNA 可引起鸟嘌呤第 7 位氮原子，或腺嘌呤第 3 位氮原子甲基化。糖苷酶可识别并除去烷基化碱基。另一些糖苷酶可识别其他的碱基缺陷。 AP 位点也可由 DNA

的碱基被修饰后造成 N- 糖苷键不稳定而自发水解产生；酸也能使 DNA 脱嘌呤。

• 一旦 AP 位点形成后，即有 AP 核酸内切酶在AP 位点附近将 DNA 链切开。不同 AP 核酸内切酶的作用方式不同，或在 5’侧切开，或在 3’侧切开。然后核酸外切酶将包括 AP 位点在内的 D

NA 链切除。 DNA 聚合酶 I 兼有外切酶活性，并使 DNA 链 3’ 端延伸以填补空缺 ,DNA 连接酶将链连上。在 AP 位点必须切除若干核苷酸后才能进行修复合成，细胞内没有酶能在 AP 位置直接将碱基插入，因为 DNA 合成的前体物质是核苷酸而不是碱基。

• 通常只有单个碱基缺陷才以碱基切除修复 (bas

e-excision repair) 方式进行修复。• 如果 DNA 损伤造成 DNA 螺旋结构较大变形，

则需要以核苷酸切除修复 (nucleotide-excision repa

ir) 方式进行修复。• 最常见的是短片段的修复（ short-patch repai

r ）；只有多处发生严重的损伤才会诱导长片段修复（ long-patch repair ）。

• 损伤链由切除酶（ excinucleme ）切除。该酶也是一种核酸内切酶，但在链的损伤部位两侧同时切开，与一般的核酸内切酶不同。

• 编码此酶的基因是 Uvr 基因，由多个亚基组成。大肠杆菌 ABC切除酶包括三种亚基： UvrA( 相对分子质量 104000） ,Uvr B( 相对分子质量 78000）和 Uvr C( 相对分子质量68000）。由 Uvr A 和 Uvr B 蛋白组成复合物（ A2B ），它寻找并结合在损伤部位。 Uvr A 二聚体随即离解，留下 Uvr B 与 DNA牢固结合。

• 然后 Uvr C 蛋白结合到 Uvr B 上， Uvr B 切开损伤部位 3’侧第 5 个磷酸二酯键， Uvr C 切开乡侧第 8 个磷酸二酯键。结果 12 ～ 13 个核苷酸片段（决定于损伤碱基是 1 个还是 2 个）在 Uvr D 解螺旋酶帮助下被除去，空缺由 DNA

聚合酶Ⅰ和 DNA 连接酶填补。• 人和其它真核生物的酶水解损伤部位 3’侧第

6 个磷酸二酯键以及 5’侧第 22 个磷酸二酯键，切除 27 ～ 29 个核苷酸片段，然后用 DNA 聚合酶 E 和 DNA 连接酶填补空缺。

DNA 的重组修复

胸腺嘧啶二聚体

复制

核酸酶及重组蛋白

修复复制

DNA 聚合酶DNA 连接酶

重组

SOS 反应的机制未诱导的细胞

靶基因 lexA 基因被 LexA

蛋白质部分阻遏

recA 基因被 LexA

蛋白质部分阻遏（ 40 个不同的位点被阻遏）

LexA(阻遏物 ) RecA(辅蛋白酶 )

靶基因表达 lexA靶基因表达 但产物被分解

recA 大量表达

RecA促使分解 LexA

诱导的细胞单链 DNAATP

第三节 第三节 DNADNA 的的突变突变 DNA 分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致 DNA

的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为 DNA 的突变。它包括由于 DNA 损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同 DNA 分子之间的交换而引起的遗传重组。

二、诱变剂的作用 碱基类似物 (base analog)

碱基修饰剂 (base modifier)

嵌入染料 (intercalation dye) 紫外线 (ultraviolet) 和电离辐射 (ionizing radiation)

一、突变的类型 碱基对的置换 (substitution) 移码突变 (framesshift mutation)

DNADNA 突突变的类型变的类型

-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G-

-A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-

转换

野生型基因 -T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G-

-A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G-

-A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-

颠换

碱基对的置换 (substitution)

移码突变(framesshift mutation)

-T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G-

-A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-

插入

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G-

-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-

缺失

A

T

第二节第二节 逆转录作用逆转录作用一、概念

二、逆转录酶

三、病毒逆转录过程

四、逆转录的生物学意义

扩充了中心法则有助于对病毒致癌机制的了解与真核细胞分裂和胚胎发育有关逆转录酶是分子生物学重要工具酶

三种功能依赖 DNA 指导下的 DNA 聚合酶活

力

依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活力核糖核酸酶 H 活力

以 RNA 为模板合成 DNA ，这与通常转录过程中遗传信息从 DNA 到 RNA 的方向相反，故称为逆转录作用。

五、逆转录过程详解

逆转录过程中 cDNA 的合成

依赖 RNA 的DNA 聚合酶

核糖核酸酶 H 活力

依赖 DNA 的DNA 聚合酶

逆逆转录病毒的生活周期生活周期

RNA

衣壳

被膜

逆转录酶

转录

转译

整合入宿主细胞染色体 DNA

进入细胞丢失被膜

丢失衣壳

逆转录

RNA

RNA

cDNA

衣壳蛋白

被膜蛋白

逆转录酶

第五节 第五节 DNADNA 的遗传重组的遗传重组 DNA 分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组(genetic recombination) ，或者基因重排 (gene rearrangement ) 。重组产物称为重组体 DNA(recombinant DNA) 。

重组的意义在于，它能迅速地增加群体的遗传多样性；使有利的突变与不利突变分开；通过优化组合积累有意义的遗传信息。此外，重组还参与了许多重要的生物学过程，它为 DNA 损伤或复制障碍提供修复机制。某些生物的基因表达受基因重组的调节，生物发育过程也受到基因加工的控制。

一、同源重组（ homologous recombination ）二、特异位点重组（ site-specific recombination ）三、转座重组（ transpositional recombination ）

反（逆）转录• 反（逆）转录过程可分为 10步反应。其中需

要逆转录酶两次转换模板（两次跳跃）。• 1. 结合在 RNA5’端 BP位点的 tRNA 作为引物，

在逆转录酶的作用下合成 U5和 R区的互补 DNAU’5和 R’。

• 2. 在逆转录酶的 RNase H 将模板 RNA 的 U5 和 R区水解掉。

• 3. 新合成的 DNA 链的 R’与 RNA 端的 R配对，逆转录酶随之转换为以 RNA3’端作为模板，这是第一次跳跃。

• 4.（-）链 DNA继续延长。• 5.模板RNA的 U3、R和 poly(A)n被水解掉。• 6.以RNA的 3’端为引物合成（ +）链DNA的 U3-R-U5。

• 7.引物 tRNA 被降解。• 8. （ +）链DNA 和（ -）链 DNA在 BP位点处配对，即第二次跳跃，逆转录酶开始以新合成的（-）链 DNA为模板合成（ +）链DNA 。

• 9.继续合成（ +）链DNA。 • 10. （ -）链 DNAU3 ’ -R’-U5 ’与（ +）链DNA U3-R-U5解开， （ -）链 DNA重新合成 U3’-R’-U5’，形成两端长重复序列。

错配修复

• 错配修复依赖模板链提供的信息。

•因此、生物体必须有一个区分模板链和新合成链的机制，细胞往往采用甲基化的方式来为模板链加上标签。甲基化位置在 GATC 序列的 A N6上。

原核生物 DNA 的错配修复需要12 种以上的蛋白质

• Mut S 二聚体识别并结合到 DNA 错配的碱基部位。• Mut L 二聚体与 Mut S 结合形成复合物。每一个

Mut S 和一个 Mut L 为单位沿 DNA 双链向两个方向移动，直到在 DNA 链的 GATC 序列为止。复合物移动的能量由 ATP提供。到 GATC 序列再彼此结合，DNA 双链则形成突环。

• Mut H 核酸内切酶结合到 Mut S L 组成的复合体上，并在未甲基化链的 GATC 位点的 5’ 端切断 DNA 。

• 如果切开的位点在错配碱基的 3’端，由核酸外切酶 1或核酸外切酶Ⅹ由 3’→5’切除。如果切开处为 5’处，则由核酸外切酶Ⅶ或 Rec J 由 5’ →3’切除。切除的链可长达 1000 个碱基。直至将错配碱基完全切除。

• 新的 DNA 链由 DNA 聚合酶Ⅲ和 DNA 连接酶合成并连接。

1 、原核生物 DN

A 的错配修复机理

（ 1 ）、甲基指导的 DNA 错配修复早期阶段的模型

（ 2 ）、甲基指导的 DNA 错配修复完成

2 、真核生物 DNA 的错配修复机理

• 真核生物 DNA 的错配修复机理与原核生物的大致相同。

• 人类的 hMSH2 和 hMLH1 基因编码的蛋白质能够识别错配碱基和 GATC 序列。其余的过程都有对应的成分来完成。