НОВЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУППЫ

КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Причины ошибок при исследовании групповой принадлежности крови

«Группы крови – нормальные иммуногенетические

признаки крови людей, представляющие собой

определенные сочетания групповых изоантигенов в

эритроцитах с соответствующими им антителами в плазме»

В 1901 году на основании своих исследований, Ландштейнер пришел к выводу, что все люди по способности сыворотки и эритроцитов крови давать агглютинацию могут быть разделены на 3 группы:

А, В и С.Группа С в дальнейшем стала обозначаться 0 и подразумевает

отсутствие антигена, а не наличие антигена О.В 1907 году Янский, обследуя групповую принадлежность больных,

установил наличие группы крови АВ.

Характерной особенностью, отличающей систему антигенов эритроцитов АВ0 от других систем антигенов, является постоянное

присутствие в сыворотках людей (кроме лиц с группой крови АВ) антител, направленных к антигенам А или В.

Правило Ландштейнера:«Здоровые индивиды имеют в сыворотке антитела

к антигенам, отсутствующим на их эритроцитах»

По наличию на эритроцитах антигенов А и В, а также присутствию в сыворотках анти-А,

анти-В антител, различают следующие группы крови:

По международным правилам для обозначения групп крови используются только буквы 0, А,

В, АВ и не применяется цифровое обозначение (I), (II), (III), (IV).

Группы крови

0 А В АВ

Антигены на эритроцитах

Нет А В А+В

Антитела в сыворотке

Анти-А

Анти-В Анти-В Анти-А нет

По наличию на эритроцитах антигенов А и В, а также присутствию в сыворотках анти-А, анти-В антител, различают следующие группы крови:

По международным правилам для обозначения групп крови используются только буквы 0, А, В, АВ и не применяется цифровое обозначение (I), (II), (III), (IV).

Группы крови0 А В АВ

Антигены на эритроцитах

Нет А В А+В

Антитела в сыворотке

Анти-ААнти-В

Анти-В Анти-А нет

Кроме антигенов А и В на эритроцитах взрослых людей присутствует антиген Н. Он является предшественником антигенов

А и В, а также обнаруживается в большом количестве на поверхности эритроцитов, принадлежащих к группе крови 0.

В 1911 году было установлено, что существует 2 подгруппы А антигена: А1 и А 2.

Среди европейцев 80% индивидов имеют подгруппу А1, остальные 20% принадлежат к А2 подгруппе.

А2 антиген не существует отдельно, а представляет собой вариант А антигена.

Слабые формы антигена В также существуют, но они крайне редки.

Существует редкий фенотип эритроцитов, который наследуется и характеризуется отсутствием антигенов Н и АВ – фенотип Бомбей.

В сыворотке таких лиц содержатся анти-Н антитела.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУППЫ КРОВИ АВО

Определение группы крови АВ0 проводят:• По антигенам, содержащимся в исследуемых эритроцитах. В этом случае для исследования используются стандартные изогемагглютинирующие сыворотки или моноклональные антитела. • По антителам, содержащимся в сыворотке крови. В этом случае для исследования используются стандартные эритроциты групп крови АВ0.

Перекрестный метод – определение антигенов А, В и определение антител α и β.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУПП КРОВИ АВО при помощи стандартных

изогемагглютинирующих сывороток

Для исследования используют стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп О, А, В, АВ.

Прежде чем приступить к исследованию, необходимо убедиться, что флаконы со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками правильно расположены в штативе, прозрачны, не содержат осадка и срок годности, указанный на их этикетках, не истек.

Исследование проводится в 2 сериях стандартных сывороток. Под соответствующими обозначениями наносятся на плоскости по большой капле стандартной сыворотки (сверху – одна серия, под ней – другая). Таким образом получается 6 капель сывороток: 2 ряда по 3 капли.

- При помощи пипеток или стеклянных палочек по маленькой капле исследуемой крови наносят на плоскость рядом со стандартными сыворотками. После чего каждую каплю крови и сыворотки перемешивают. - Пластину покачивают не менее 5 мин и добавляют по одной капле изотонического раствора хлорида натрия. Учет результатов реакции проводят не ранее чем через 5 мин.Реакция агглютинации в каждой капле может быть положительной или отрицательной. При положительной реакции в смеси появляются видимые мелкие агглютинаты, которые постепенно сливаются в более крупные. При отрицательной реакции смесь остается равномерно окрашенной в красный цвет без присуствия агглютинатов.

Реакция агглютинации

Исследование со стандартными сыворотками может дать 4 различных

варианта:

Определение групп крови моноклональными антителами с

использованием цоликлонов

Для определения группы крови используются моноклональные антитела, для получения которых применяется гибридомная биотехнология.

Гибридома - это клеточный гибрид, образованный путем слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих "родителей": способность к неограниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту. Разработаны стандартные реагенты для определения группы крови по системе АВО: цоликлоны анти-А, анти-В, анти-АВ, которые применяют для определения агглютиногенов эритроцитов.

Методика определения группы крови с помощью цоликлонов позволяет отказаться от услуг доноров, кровь которых используют для

приготовления стандартных изогемаглютинирующих сывороток.

Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ наносят на белый планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями

Рядом с каплями антител наносят по одной маленькой капле (0,01мл) исследуемой крови. После перемешивания составных частей за реакцией агглютинации наблюдают в течение 2-3 мин.

После перемешивания составных частей за реакцией агглютинации наблюдают в течение 2-3 мин.

Моноклональные антитела  обладают высокой чувствительностью, характеризуются быстротой наступления и четкостью агглютинации.

Реагенты обеспечивают достоверный результат даже при слабой экспрессии антигенов.

! •При наличии агглютинации со всеми тремя цоликлонами Анти-А, Анти-В, Анти-АВ необходимо исключить неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроцитов

! •Для этого смешивают на плоскости одну каплю исследуемой крови или эритроцитов с каплей физиологического раствора хлорида натрия

! •Заключение о принадлежности исследуемой крови к АВ группе крови делают при отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе

Новые методы определениягруппы крови

Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов и

антиэритроцитарных антител – гелевые карты

Гелевая технология была предложена в 1989 году Лапиерром.

Принцип метода основан на реакции агглютинации (образование комплекса «антиген-антитело»), но в геле, содержащем специфические сыворотки, в результате чего значительно повышается чувствительность, специфичность и достоверность результатов. Карта DG Gel представляет собой пластиковый планшет с 8 микропробирками, состоящими из реакционно-инкубационной камеры и колонки. Каждая микропробирка промаркирована тем антигеном/ами, которые она выявляет. Специфические антитела, содержащиеся в геле микропробирок, выступают в качестве реакционной среды, и исследуемые эритроциты агглютинируют или не агглютинируют с ними.

Гелевая технология предусматривает разделение эритроцитов при центрифугировании, при этом

неагглютинированные эритроциты проходят через гель и оседают на дне пробирок (отрицательный

результат), в то время как агглютинированные эритроциты задерживаются на поверхности или в

толще геля (положительный результат).

Диапазон выполняемых тестов включает в себя определение фенотипа эритроцитов (включая слабые

и вариантные антигены), антиглобулиновый тест, скрининг и идентификацию антител, тесты на

совместимость и некоторые другие.

Принцип гелевого теста

Каждая микропробирка содержит гелевый раствор, смешанный с различными реагентами (антитела, эритроциты, античеловеческий глобулин или буфер).

Исследуемая кровь добавляется в верхнюю часть микропробирок диагностических карт, и при центрифугировании осуществляется разделение агглютинированных и неагглютинированных эритроцитов следующим образом: - неагглютинированные эритроциты имеют размер, сравнимый с размером пор геля, и свободно проходят сквозь них под действием центробежной силы, формируя на дне микропробирки компактный осадок красного цвета - отрицательный результат; - агглютинированные эритроциты ввиду больших размеров задерживаются на поверхности геля или в его толще – положительный результат.

В зависимости от силы реакции агглютинации в гелевой среде принята следующая оценка полученных результатов:

сильноположительный (++++) – образовавшиеся агглютинаты эритроцитов задержались на поверхности геля;

положительный (+++) – агглютинаты располагаются в верхней трети столбика геля;

слабоположительный (++) – агглютинаты фиксированы в верхних двух третях геля;

очень слабоположительный (+) – агглютинаты располагаются в нижней трети геля;

отрицательный (-) – эритроциты формируют на дне микропробирки компактный осадок

В соответствии с содержимым каждой микропробирки, существуют профили карт для проведения различных исследований.

Карта для определения

антигенов систем ABO и резус-фактора

(D), а также перекрестной

реакцией в гелевой

методике.

Определение антигенов

системы АВО и резус (антигены D, C, E), а также

определение группы крови

по системе АВО перекрестной

реакцией в геле.

Подтверждение групп крови

системы ABO и Rh (D) в гелевой

методике.

Определение антигенов

системы Резус и Келл

Карта для определения антигенов систем ABO и резус-фактора (D), а также перекрестной реакцией в гелевой методике.

Разные микропробирки определяются по буквенным обозначениям на карте:

ABO•микропробирка A: моноклональные анти-А •микропробирка B: моноклональные анти-В •микропробирка AB: моноклональные анти-АВ

DCE •микропробирка D: моноклональные анти-D •микропробирка CDE: моноклональные анти-CDE

Ctl, N/A, N/B•микропробирка Ctl: буферный раствор без антител (контрольная пробирка) •микропробирки N/B, N/В: буферный раствор без антител (определение группы крови АВО перекрестной реакцией)

В результате проведенных за несколько лет лабораторных тестов с применением гелевого метода было выявлено высокое качество данной медицинской продукции,

ряд существенных преимуществ гелевой системы по сравнению с классическими методами иммуногематологии.

Высокая чувствительность метода. При использовании гелевого метода гемагглютинаты застревают в полутвердом геле, поэтому слабоположительные реакции намного легче интерпретировать, чем при проведении исследований в пробирках или на плоскости.

Выявление антител помощью гелевого метода составляет 99% по сравнению с 57% при использовании желатина.

Постановка непрямого антиглобулинового теста не требует отмывания эритроцитов, что в свою очередь уменьшает возможность удаления с поверхности эритроцитов слабо фиксированных антител.

Простота и точность интерпретации результата. При определении на плоскости в некоторых случаях агглютинация бывает нечеткой, а при применении гелевых карточек неагглютинированные эритроциты четко отделяются от агглютинированных, что позволяет избежать ошибок при считывании результата.

Длительная стабильность (две недели) результата реакции, что открывает дополнительные возможности контроля.

Повышение уровня биологической безопасности для персонала вследствие закрытости системы.

Экспресс-диагностические карты для определения группы крови по системам AB0

и Резус у "постели пациента".

Настоящие диагностические карты представляют собой пластиковые одноразовые тест-системы для экспресс-диагностики (в том числе у постели больного) групповой AB0 и Резус-принадлежности. Высокая чувствительность достигается за счет содержания в реагенте лучших европейских клеточных клонов в установленном международным стандартом титре. Более высокий титр антител по сравнению с цоликлонами позволяет наблюдать агглютинацию в течение первых нескольких секунд.Можно использовать для исследований осадок эритроцитов, цельную кровь, эритроцитарную массу.Карты имеют запаянные пленкой, промаркированные (анти-А, анти-B, анти-D) лунки, содержащие соответствующие жидкие моноклональные реагенты.Пленка, покрывающая лунки, самозатягивающаяся, что способствует повышению биологической безопасности исследований.

В правой части карты поле для нанесения данных о групповой принадлежности, дате исследования, Ф.И.О. пациентов, а также серия и срок годности карт. Поле с записями можно отклеить и поместить в Карту пациента, при этом записи остаются на диагностической карте (копирка).

Техника примененияВыбрать для исследований необходимый вариант карты, промаркировать ее правое поле.

С помощью шприцов или шприц-пробирок взять цельную или на консерванте кровь у реципиента и донора.

Добавить по 1 капле исследуемой крови из одного шприца (например, реципиент), в верхний ряд лунок, затем из другого шприца - в нижний ряд лунок аналогичным образом.

Аккуратно горизонтально встряхнуть карту, до полного перемешивания крови с реагентом.

Считать наличие или отсутствие агглютинации в лунках в течении 1 минуты, реакция в анти-А и анти-В лунках начнется с первых 10 секунд.

Карта MD multicard - одна из последних разработок в области

экспресс-анализа клинически значимых антигенов эритроцитов

Взаимодействие антигенов эритроцитов с антителами, нанесенными на карту, проявляется

в виде красных полос напротив маркировки соответствующего антигена

Положительная реакция на А и D антигены

Отрицательные результаты по антигенам К и Е