Poglavlje 1

Poglavlje 1

1. Pregledno o stanicama i istraivanju stanica

Porijeklo i evolucija stanica 4

Stanice kao eksperimentalni modeli 15

Orua stanine biologije 20

KLJUNI EKSPERIMENT: Kultura animalnih stanica 32

MOLEKULARNA MEDICINA: Virusi i rak 35

Molekularna biologija stanice aktivno je podruje istraivanja koje predstavlja osnovu za sve bioloke znanosti. Ova injenica istinita je ne samo sa stajalita bazine znanosti, nego takoer, s obzirom na rastui broj primjena, u medicini, poljoprivredi, i biotehnologiji. Naroito nakon zavretka sekvenciranja ljudskog genoma, napredak u staninoj i molekularnoj biologiji otvara nove horizonte u medicinskoj praksi. Meu udarne primjere spada razvoj novih lijekova koji specifinim ciljanjem spreavaju rast tumorskih stanica te potencijalna uporaba matinih stanica (engl. stem cells) u zamjeni oteenih tkiva i lijeenju pacijenata oboljelih od stanja kao to su dijabetes, Parkinsonova bolest, Alzheimerova bolest, ozljede lene modine i srana bolest.

Budui da se polje istraivanja stanine i molekularne biologije naglo iri, vano je razumjeti njegove eksperimentalne osnove kao i sadanje spoznaje. Prema tome, ovo poglavlje e se usredotoiti na naine istraivanja stanica te na pregledni prikaz nekih njihovih osnovnih svojstava. Za razumijevanje stanine biologije posebice je vano shvatiti slinosti i razlike meu stanicama. Prvi dio ovog poglavlja raspravlja stoga i o jedinstvenosti i o razliitosti dananjih stanica uzimajui u obzir njihovu evoluciju iz zajednikog pretka. S jedne strane, sve stanice dijele zajednike temeljne osobine koje su ostale sauvane tijekom evolucije. Primjerice, sve stanice upotrebljavaju DNA kao svoj genetiki materijal, okruene su plazma membranama, i koriste iste temeljne mehanizme za metabolizam potreban pri proizvodnji energije. S druge strane, dananje stanice su razvile razliite oblike ivota. Mnogi organizmi, poput bakterija, ameba, i kvasaca sastoje se od jedne jedine stanice koja je sposobna za samostalno umnaanje. Sloeniji organizmi izgraeni su od zbirki stanica ije je djelovanje usklaeno, a razliite stanice specijalizirane su za izvravanje odreenih zadataka. Primjerice, ljudsko tijelo izgraeno je od preko 200 razliitih vrsta stanica od kojih je svaka specijalizirana za neku od posebnih funkcija kao to je pamenje, vid, kretanje ili probava. Raznolikost koju iskazuju razliite vrsta stanica vrlo je dojmljiva; primjerice, razmotrimo razlike izmeu bakterija i stanica ljudskog mozga.

Temeljne slinosti izmeu razliitih vrsta stanica predstavljaju zajedniku temu stanine biologije koja omoguava da se temeljni principi steeni iz eksperimenata s jednom vrstom stanica ekstrapoliraju na druge tipove stanica i uope. Nekoliko vrsti stanica i organizama na veliko se koristi u prouavanju razliitih aspekata stanine i molekularne biologije; u slijedeem odjeljku ovog poglavlja raspravlja se o nekim svojstvima tih stanica koja ih ine osobito vrijednim eksperimentalnim modelima. Konano, vano je shvatiti da napredak stanine biologije posebno ovisi o raspoloivosti eksperimentalnih orua koja znanstvenicima omoguuju postizanje novih opaanja ili provoenje novih tipova eksperimenata. Prema tome, uvodno poglavlje zavrava raspravom o nekim eksperimentalnim pristupima koji se koriste za istraivanje stanica, te takoer pregledom nekih najznaajnijih povijesnih napredaka koji su doveli do sadanjeg razumijevanja stanine strukture i funkcije.

Porijeklo i evolucija stanica

Stanice su podijeljene u dvije velike grupe koje su poetno definirane time da li sadre ili ne sadre jezgru. Prokariotske stanice (bakterije) nemaju jezgrinu ovojnicu, a eukariotske stanice imaju jezgru u kojoj je genetiki materijal odvojen od citoplazme. Prokariotske stanice openito su manje i jednostavnije od eukariotskih; osim toga to im nedostaje jezgra, njihovi genomi su jednostavniji i ne sadre citoplazmatske organele ili citoskelet (Tabela 1.1). Usprkos ovim razlikama, isti osnovni molekularni mehanizmi upravljaju ivotom kako prokariota tako i eukariota, pokazujui da sve dananje stanice potjeu od zajednikog prvobitnog pretka. Kako se razvila ta prva stanica? A kako se razvila sloenost i raznolikost koju posjeduju dananje stanice?

Prva stanica

ini se da je prvi ivot nastao pred najmanje 3.8 milijardi godina, po prilici 750 milijuna godina nakon to se Zemlja formirala. (Slika 1.1). Kako se ivot pojavio i kako je nastala prva stanica predmeti su iste spekulacije, budui da se ti dogaaji ne mogu reproducirati u laboratoriju. Usprkos tome, nekoliko razliitih vrsti pokusa dalo je vane podatke u svezi nekih stupnjeva tog procesa.

1920-tih po prvi put je predloeno da se jednostavne organske molekule mogu spontano polimerizirati u makromolekule u uvjetima za koje se pretpostavlja da su postojale u primitivnoj Zemljinoj atmosferi. Smatra se da je, u vrijeme kada se ivot pojavio, Zemljina atmosfera sadravala malo ili nije sadravala nita slobodnog kisika nego je umjesto toga sadravala uglavnom CO2 i N2 i uz to manje koliine plinova kao to su H2, H2S i CO. Takva atmosfera osigurava reducirajue uvjete u kojima se mogu spontano formirati organske molekule, uz izvore energije kao to je suneva svjetlost ili elektrino pranjenje. Spontano formiranje organskih molekula prvi puta je eksperimentalno dokazano 1950-tih, kada je Stanley Miller (tada jo student) pokazao da izbijanje elektrine iskre u mjeavini H2, CH4 i NH3, u prisustvu vode, omoguuje formiranje razliitih organskih molekula, ukljuujui i nekoliko aminokiselina (Slika 1.2). Iako Millerovi eksperimenti nisu tono ponovili uvjete na primitivnoj Zemlji, ipak su jasno pokazali vjerojatnost spontanih sinteza organskih molekula kao osnovnih materijala iz kojih su nastali prvi ivi organizmi.

Idui korak u evoluciji bio je formiranje makromolekula. Dokazano je da se monomeri kao osnovne graevne jedinice makromolekula mogu spontano polimerizirati u vjerojatnim prebiotskim uvjetima. Zagrijavanje suhe mjeavine aminokiselina, primjerice, rezultira njihovom polimerizacijom i formiranjem polipeptida. Ali, kritina osobina makromolekule iz koje se razvio ivot morala je biti njezina sposobnost da se replicira. Jedino makromolekula sposobna da upravlja sintezom vlastitih novih kopija trebala bi biti sposobna za reprodukciju i daljnju evoluciju.

Od dviju glavnih vrsti informacijskih makromolekula u dananjim stanicama (nukleinske kiseline i proteini), jedino su nukleinske kiseline sposobne upravljati vlastitom replikacijom. Nukleinske kiseline slue kao kalupi za vlastitu sintezu, to se temelji na specifinom sparivanju baza izmeu komplementarnih nukleotida (Slika 1.3). Znaajan korak u razumijevanju molekularne evolucije bio je postignut u ranim 1980-tim godinama, kada je u laboratoriju Sida Altmana i Toma Cecha otkriveno da je RNA sposobna katalizirati odreeni broj kemijskih reakcija, ukljuujui i polimerizaciju nukleotida. Daljnje studije proirile su opseg poznatih katalitikih aktivnosti RNA, ukljuujui opis RNA molekula koje upravljaju sintezom novog RNA lanaca prema RNA kalupu. Prema tome, RNA posjeduje jedinstvenu sposobnost da slui kao kalup i da katalizira vlastitu replikaciju. Stoga se openito vjeruje da je RNA bila inicijalni genetiki sustav, a smatra se da su se rani stupnjevi kemijske evolucije temeljili na samoreplicirajuim RNA molekulama period evolucije poznat kao RNA svijet. Zatim su pravilne interakcije izmeu RNA i aminokiselina evoluirale u dananji genetiki kod, a DNA je konano zamijenila RNA kao genetiki materijal.

Pretpostavlja se da se prva stanica razvila tako da se samoreplicirajua RNA okruila membranom izgraenom od fosfolipida (Slika 1.4). Kako se detaljno raspravlja u slijedeem poglavlju, fosfolipidi su osnovne komponente svih dananjih biolokih membrana, ukljuujui plazma membrane kako prokariotskih tako i eukariotskih stanica. Kljunu osobinu fosfolipida koji formiraju membrane predstavlja injenica da su oni amfipatske molekule, to znai da je jedan dio molekule topiv u vodi, a drugi nije. Fosfolipidi imaju duge, ugljikovodine lance netopive u vodi (hidrofobne), vezane za vodo-topive (hidrofilne) glave koje sadre fosfat. Kada ih stavimo u vodu, fosfolipidi se spontano agregiraju u dvosloj tako da su fosfatne glave izvana u vodenoj sredini, a ugljikovodini repovi u unutranjosti, meusobno se dodirujui. Takav lipidni dvosloj oblikuje stabilnu barijeru izmeu dva vodena odjeljka pa tako, primjerice, odvaja unutranjost stanice od vanjskog okolia.

Zatvaranje samoreplicirajue RNA i pridruenih joj molekula unutar fosfolipidne membrane moglo ih je tako odrati kao jedinicu, sposobnu za samoreprodukciju i daljnju evoluciju. U to vrijeme mogla se ve razviti i sinteza proteina ovisna o RNA, pa se u tom sluaju prva stanica morala sastojati od samoumnoavajue RNA i proteina koje je ona kodirala.

Evolucija metabolizma

Budui da su se stanice razvile u moru organskih molekula, bile su sposobne dobivati hranu i energiju direkno iz svog okolia. Ali takva situacija je sama po sebi ograniavajua, pa su stanice trebale razviti svoje vlastite mehanizme za proizvodnju energije i sintezu molekula potrebnih za svoju replikaciju. Proizvodnja i kontrolirana upotreba metabolike energije kljuna je za sve stanine aktivnosti, pa su osnovni metaboliki putevi i dobivanje energije (detaljno opisano u poglavlju 2) uvelike evolucijski sauvani u dananjim stanicama. Sve stanice koriste adenozin 5'-trifosfat (ATP) kao svoj izvor metabolike energije za provoenje sinteze staninih dijelova i izvravanje drugih aktivnosti za koje je potrebna energija, poput kretanja (npr. miina kontrakcija). Smatra se, da su se mehanizmi koje stanice koriste za proizvodnju ATP-a razvili preko tri stupnja, to odgovara evoluciji glikolize, fotosinteze i oksidativnog metabolizma (Slika 1.5). Razvoj ovih metabolikih puteva promijenio je atmosferu Zemlje, ime se promijenio i tijek daljnje evolucije.

Pretpostavlja se da su prve reakcije stvaranja energije, u Zemljinoj atmosferi koja je u poetku bila anaerobna, ukljuivale razlaganje organskih molekula u odsustvu kisika. Te reakcije su vjerojatno bile oblik dananje glikolize anaerobna razgradnja glukoze u mlijenu kiselinu, sa istim dobitkom energije od dvije molekule ATP-a. Uz koritenje ATP-a kao svojeg izvora stanine kemijske energije, sve dananje stanice vre glikolizu, to je u skladu s idejom da su se te reakcije pojavile vrlo rano tijekom evolucije.

Glikoliza je omoguila mehanizam kojim se energija sadrana u ve oblikovanim organskim molekulama (npr. glukoza) moe pretvoriti u ATP, koji se tada moe upotrebiti kao izvor energije za pokretanje drugih metabolikih reakcija. Openito je miljenje da je razvoj fotosinteze bio idui veliki evolucijski korak koji je dopustio da stanica iskoristi energiju suneve svjetlosti ime se postigla neovisnost od koritenja ve oblikovanih organskih molekula. Prva fotosintetska bakterija, koja se razvila prije vie od 3 milijardi godina, vjerojatno je koristila H2S da pretvori CO2 u organske molekule put fotosinteze koji neke bakterije jo uvijek koriste. Koritenje H2O kao donora elektrona i vodika za pretvorbu CO2 u organske spojeve razvilo se kasnije, a vana posljedica je bila mijenjanje Zemljine atmosfere. Koritenje H2O u fotosintetskim reakcijama proizvodi kao nusprodukt slobodni O2; misli se da je ovaj mehanizam bio odgovoran za stvaranje obilnih koliina O2 u Zemljinoj atmosferi.

Oslobaanje O2 kao posljedice fotosinteze promijenilo je okoli u kojem su se stanice razvijale pa se openito smatra da je to dovelo do razvoja oksidativnog metabolizma. S druge strane, mogue je da se oksidativni metabolizam razvio prije fotosinteze, porastom atmosferskog O2 koji je tada pruio jaku selektivnu prednost za organizme sposobne za koritenje O2 u reakcijama koje proizvode energiju. U svakom sluaju, O2 je visoko reaktivna molekula, pa je oksidativni metabolizam, koristei tu reaktivnost, omoguio mehanizam za stvaranje energije iz organskih molekula koji je puno efikasniji od anaerobne glikolize. Primjerice, potpuna oksidativna razgradnja glukoze na CO2 i H2O stvara energetski ekvivalent od 36 do 38 molekula ATP-a, za razliku od 2 molekule ATP-a koje nastaju anaerobnom glikolizom. Uz nekoliko iznimaka, dananje stanice koriste oksidativne reakcije kao svoj glavni izvor energije.

Dananji prokarioti

Dananji prokarioti, u koje ubrajamo sve razliite tipove bakterija, podijeljeni su u dvije skupine arhebakterije i eubakterije koje su se rano razdvojile tijekom evolucije. Neke arhebakterije ive u ekstremnom okoliu koji danas nije uobiajen, ali je vjerojatno prevladavao na primitivnoj Zemlji. Primjerice, termoacidofili ive u vruim sumpornim vrelima u temperaturama do 800 C sa niskom pH vrijednosti do 2. Eubakterije, meu koje spadaju uobiajeni oblici dananjih bakterija, velika su grupa organizama koja ivi u razliitim vrstama okolia kao to su zemlja, voda, i drugi organizmi (npr. ljudski patogeni).

Bakterijske stanice su veinom okrugle, tapiaste ili spiralne, sa promjerom od 1 10 m. Sadraj DNA varira od 0.6 milijuna do 5milijuna parova baza, to je dovoljna koliina da kodira oko 5000 razliitih proteina. Najvei i najsloeniji prokarioti su cijanobakterije, bakterije u kojima se razvila fotosinteza.

Struktura tipine prokariotske stanice objanjena je na primjeru Escherichiae coli (E. coli), normalnog stanovnika ljudskog probavnog trakta (Slika 1.6). Stanica je tapiasta, promjera oko 1m i duljine oko 2m. Kao i mnogi drugi prokarioti, E. coli je obavijena krutom staninom stijenkom izgraenom od polisaharida i peptida. Ispod stanine stijenke je plazma membrana, graena od dvosloja fosfolipida i pridruenih proteina. Dok je stanina stijenka porozna i lako proputa razliite molekule, plazma membrana osigurava funkcionalno odvajanje izmeu unutranjosti stanice i vanjskog okolia. DNA E. coli je jedna kruna molekula u nukleoidu, koji za razliku od jezgre eukariota, nije obavijen membranom koji ga odvaja od citoplazme. Citoplazma sadri po prilici 30,000 ribosoma (mjesta sinteze proteina), koji su odgovorni za njezin zrnati izgled.

Eukariotske stanice

Poput prokariotskih stanica, sve eukariotske stanice su okruene plazma membranama i sadre ribosome. Meutim, eukariotske stanice mnogo su sloenije grae i sadre jezgru, razliite citoplazmatske organele i citoskelet (Slika 1.7). Najvea i najbolje vidljiva organela eukariotskih stanica je jezgra, s promjerom od oko 5m. Jezgra sadri genetsku informaciju stanice, koja je u eukariota sadrana u linearnim, a ne cirkularnim DNA molekulama. Jezgra je mjesto gdje se replicira DNA i sintetizira RNA; translacija RNA u proteine odvija se na ribosomima u citoplazmi.

Uz jezgru, eukariotska stanica sadri u svojoj citoplazmi razliite organele okruene membranama. Ove organele odreuju odjeljke u kojima su lokalizirane razliite metabolike aktivnosti. Eukariotske stanice su openito mnogo vee od prokariotskih stanica, esto sa staninim volumenom najmanje tisuu puta veim. Stvaranje odjeljaka pomou citoplazmatskih organela osigurava eukariotskoj stanici efikasnije funkcioniranje. Dvije od ovih organela, mitohondriji i kloroplasti, imaju kljune uloge u stvaranju metabolike energije. Mitohondriji, koji se nalaze u gotovo svim eukariotskim stanicama, mjesta su odvijanja oksidativnog metabolizma i prema tome odgovorni za proizvodnju veine ATP-a dobivenog razgradnjom organskih molekula. Kloroplasti su mjesta gdje se odvija fotosinteza i naeni su samo u biljnim stanicama i zelenim algama. Lizosomi i peroksisomi takoer odreuju specijalizirane metabolike odjeljke za probavu makromolekula kao i za razliite oksidativne reakcije. Uz to, mnoge biljne stanice sadre velike vakuole koje obavljaju razliite funkcije, ukljuujui probavu makromolekula i spremanje kako otpadnih produkata tako i hranjivih tvari.

Zbog veliine i sloene grae eukariotskih stanica, transport proteina na njihovo tono odredite unutar stanice je golem zadatak. Dvije citoplazmatske organele, endoplazmatski retikulum i Golgijev aparat, su specifino odreene za rasporeivanje i transport proteina namijenjenih za sekreciju, ugradnju u plazma membranu i unoenje u lizosome. Endoplazmatski retikulum je opsena mrea unutarstaninih membrana, koja se prostire od jezgrine ovojnice kroz itavu citoplazmu. Njegova funkcija nije samo u obradi i transportu proteina nego takoer u sintezi lipida. Od endoplazmatskog retikuluma proteini se transportiraju u unutar malih membranskih vezikula do Golgijevog aparata, gdje se dalje obrauju i razvrstavaju za transport do konanih odredita. Uz ulogu u transportu proteina, Golgijev aparat predstavlja mjesto gdje se sintetiziraju lipidi i (u biljnim stanicama) mjesto gdje se sintetiziraju neki polisharidi koji izgrauju staninu stijenku.

Eukariotske stanice imaju jo jednu razinu unutranje organizacije: citoskelet, mreu proteinskih filamenata koja se prostire kroz citoplazmu. Citoskelet predstavlja strukturnu osnovu stanice, odreujui stanini oblik i openitu organizaciju citoplazme. Uz to, citoskelet je odgovoran za pokretanje cijelih stanica (npr. kontrakcija miinih stanica) i za unutarstanini transport i poloaj organela i drugih struktura, ukljuujui i kretanje kromosoma tijekom stanine diobe.

Eukarioti su se razvili pred barem 2.7 milijardi godina, to je uslijedilo nakon 1 do 1.5 milijardi godina tijekom kojih su se razvili prokarioti. Istraivanja njihovih DNA sekvencija pokazuju da su arhebakterije i eubakterije meusobno razliite kao to je i svaka od njih razliita od dananjih eukariota. Prema tome, izgleda da je vrlo rani dogaaj u evoluciji bio grananje u tri linije potomstva od zajednikog pretka, dajui dananje arhebakterije, eubakterije, i eukariote. Zanimljivo je, da su mnogi geni arhebakterija mnogo sliniji genima eukariota nego genima eubakterija, to pokazuje da arhebakterije i eukarioti dijele zajedniko evolucijsko porijeklo i put i da su meusobno srodniji nego ijedno od njih s eubakterijama (Slika 1.8).

Vaan korak u evoluciji eukariotskih stanica bio je stjecanje staninih organela okruenih membranom, to je omoguilo razvoj sloenih karakteristika ovih stanica. Smatra se da su organele bile steene kao rezultat povezivanja prokariotskih stanica s pretkom eukariota.

Hipoteza da su eukariotske stanice evoluirale simbiotikim povezivanjem s prokariotima endosimbioza osobito je dobro potkrijepljena istraivanjima mitohondrija i kloroplasta za koje se smatra da su se razvili iz bakterija koje su ivjele u veim stanicama. Oboje, mitohondriji i kloroplasti, slini su bakterijama po veliini, a kao i bakterije, reproduciraju se diobom. Kao najvanije treba istaknuti da i mitohondriji i kloroplasti sadre vlastitu DNA, koja kodira neke njihove dijelove. DNA mitohondrija i kloroplasta replicira se svaki put kad se organela dijeli, a geni koje kodira prepisuju se unutar organele i informacija se prevodi na ribosomima organele. Tako mitohondriji i kloroplasti sadre vlastite genetike sustave, koji se razlikuju od genoma stanine jezgre. Nadalje, ribosomi i ribosomske RNA ovih organela srodniji su bakterijskima nego onima koji su kodirani genomom jezgre eukariota.

Endosimbiotsko porijeklo ovih organela je sada ope prihvaeno, s time da se smatra da su se mitohondriji razvili iz aerobnih bakterija, a kloroplasti iz fotosintetskih bakterija, kao to su cijanobakterije. Dobitak aerobne bakterije osigurao bi anaerobnoj stanici provoenje oksidativnog metabolizma. Dobitak fotosintetske bakterije osigurao bi prehrambenu neovisnost pomou sposobnosti obavljanja fotosinteze. Ovakva endosimbiontska udruivanja davala su neobino veliku prednost partnerima to je bilo vano za njihov evolucijski odabir. Tijekom vremena, veina originalnih gena iz ovih bakterija oito se ugradila u genom stanine jezgre, tako da genomi organela kodiraju jo samo nekoliko sastavnih dijelova mitohondrija i kloroplasta.

Razvoj viestaninih organizama

Mnogi eukarioti su jednostanini organizmi, koji su poput bakterija, izgraeni samo od jedne stanice sposobne za samoumnoavanje. Najjednostavniji eukarioti su kvasci. Kvasci su mnogo sloeniji od bakterija, ali mnogo manji i jednostavniji nego stanice ivotinja ili biljaka. Primjerice, najee istraivani kvasac Saccharomyces cerevisae promjera je oko 6 m i sadri 12 milijuna parova baza u DNA (Slika 1.9). Ostali jednostanini eukarioti, meutim, mnogo su sloenije stanice, a neke sadre toliko DNA koliko imaju i ljudske stanice (Tabela 1.2). Meu njima su organizmi specijalizirani za izvravanje najrazliitijih zadataka, ukljuujui fotosintezu, pokretanje, te hvatanje i gutanje drugih organizama kao hrane. Amoeba proteus, primjerice, velika je stanica, sloene grae. Njen volumen vie je od 100,000 puta vei od E. coli, a duina premauje 1mm kada je stanica potpuno ispruena (Slika 1.10). Ameba je vrlo pokretan organizam koji upotrebljava citoplazmatska produenja (izdanke), nazvane pseudopodiji, za kretanje i prodiranje hrane koju ine drugi organizmi poput bakterija i kvasaca. Drugi jednostanini eukarioti (zelene alge) sadre kloroplaste i sposobni su vriti fotosintezu.

Viestanini organizmi razvili su se iz jednostaninih eukariota pred najmanje 1.7 milijardi godina. Neki jednostanini eukarioti oblikuju viestanine agregate, pa se smatra da predstavljaju evolucijski prijelaz od jedne stanice prema viestaninim organizmima. Na primjer, stanice mnogih algi (npr. zelena alga Volvox) udruuju se meusobno i formiraju viestanine kolonije (Slika 1.11), za koje se smatra da su evolucijske pretee dananjih biljaka. Poveanje stanine specijalizacije tada je dovelo do prijelaza kolonijalnih agregata u prave viestanine organizme. Nastavljanje stanine specijalizacije i podjela rada meu stanicama jednog organizma dovele su do sloenosti i razliitosti koje se mogu opaziti kod mnogih tipova stanica koji grade dananje biljke i ivotinje te ljudska bia.

Biljke su izgraene od manjeg broja staninih tipova nego ivotinje, ali svaka od razliitih vrsta biljnih stanica je specijalizirana za provoenje specifinih zadataka potrebnih cijelom organizmu (Slika 1.12). Stanice biljaka su organizirane u tri glavna sustava tkiva: osnovno tkivo, kono tkivo, i provodno tkivo. Osnovno tkivo sadri parenhimske stanice, koje izvode veinu metabolikih reakcija biljke, ukljuujui i fotosintezu. Osnovno tkivo takoer sadri dvije specijalizirane vrste stanica (kolenhimske stanice i sklerenhimske stanice) koje imaju karakteristinu debelu staninu stijenku, i omoguuju strukturnu potporu biljke. Kono tkivo pokriva povrinu biljke i izgraeno je od epidermalnih stanica, koje oblikuju zatitni sloj i omoguuju apsorpciju hranjivih tvari. Konano, nekoliko razliitih tipova izduenih stanica gradi provodni sustav (ksilem i floem), koji je odgovoran za transport vode i hranjivih tvari kroz biljku.

U ivotinja se nalazi puno vie razliitih stanica nego u biljaka. Primjerice, ljudsko tijelo izgraeno je od vie od 200 razliitih vrsta stanica, za koje se openito smatra da su sastavni dijelovi petorih glavnih tkiva: epitelnog tkiva, vezivnog tkiva, krvi, ivanog tkiva i miinog (Slika 1.13). Epitelne stanice tvore slojeve koji pokrivaju povrinu tijela i unutarnjih organa. Ima mnogo razliitih vrsta epitelnih stanica, a svaka je specijalizirana za odreenu funkciju kao to je zatita (koa), apsorpcija (npr. stanice tankog crijeva), i sekrecija (npr. stanice lijezda slinovnica). U vezivno tkivo ubrajamo kost, hrskavcu i masno tkivo, a svako od njih tvore razliite vrste stanica (osteoblasti, hondrociti, adipociti). Rahlo vezivno tkivo koje lei ispod epitelnog sloja i popunjava prostore izmeu organa i tkiva u tijelu je sainjeno od druge vrste stanica, fibroblasta. Krv sadri nekoliko razliitih vrsta stanica, koje imaju funkciju u transportu kisika (crvene krvne stanice ili eritrociti), upalnim reakcijama (granulociti, monociti i makrofagi) i imuno-odgovoru (limfociti). ivano tkivo je graeno od ivanih stanica ili neurona, koje su visoko specijalizirane za prijenos signala kroz tijelo. Razliite vrste osjetilnih stanica, kao to su stanice u oku ili uhu jo su k tome specijalizirane za primanje signala iz okolia. Konano, nekoliko razliitih tipova miinih stanica odgovorno je za snagu i kretanje.

Jasno je da je evolucija ivotinja ukljuivala razvoj odgovarajue raznolikosti i specijalizacije na staninoj razini. Razumijevanje mehanizama koji kontroliraju rast i diferencijaciju tako sloenog niza specijaliziranih stanica, polazei od jedne oploene jajne stanice, jedan je od glavnih izazova s kojim se suoava suvremena stanina i molekularna biologija.

Stanice kao eksperimentalni modeli

Evolucija dananjih stanica iz zajednikog pretka vrlo je znaajna za staninu i molekularnu biologiju kao eksperimentalnu znanost. Budui da su osnovna svojstva svih stanica ouvana tijekom evolucije, temeljni principi spoznati iz eksperimenata sa jednom vrstom stanica, openito su primjenjivi na druge vrste stanica. S druge strane, zbog velike raznolikosti dananjih stanica, mnoge vrste eksperimenata mogu se mnogo lake izvesti s jednom vrstom stanica nego s nekom drugom. Nekoliko razliitih vrsta stanica i organizama openito se koristi kao eksperimentalne modele u istraivanju razliitih podruja stanine i molekularne biologije. Prema raspravi u odlomcima koji slijede osobine odreenih stanica ine ih posebno pogodnim pokusnim modelima.

E.coli

Zbog njihove relativne jednostavnosti, prokariotske stanice (bakterije) su idealni modeli za istraivanje temeljnih procesa u biokemiji i molekularnoj biologiji. Najtemeljitije istraivana vrsta bakterija je E. coli, koja je dugo bila najomiljeniji organizam za istraivanje bazinih mehanizama molekularne genetike. Veina naih dananjih spoznaja iz molekularne biologije ukljuujui nae razumijevanje replikacije DNA, genetskog koda, ekspresije gena i sinteze proteina proizale su iz istraivanja ove skromne bakterije.

E. coli je izuzetno korisna molekularnim biolozima zbog svoje relativne jednostavnosti i lakoe kojom se moe razmnoavati i istraivati u laboratoriju. Genom E. coli, primjerice, sastoji se od otprilike 4.6 milijuna parova baza i sadri oko 4000 gena. Ljudski genom je gotovo tisuu puta vei (priblino 3 milijardi parova baza) i smatra se da sadri 30-40,000 gena (Tabela 1.2). Mali genom E. coli (koji je potpuno sekvenciran 1997. godine) predstavlja oiglednu prednost za genetike analize.

Molekularno genetike eksperimente nadalje olakava brzi rast E. coli pod dobro definiranim laboratorijskim uvjetima. U optimalnim uvjetima kulture, E. coli dijeli se svakih 20 minuta. tovie, klonalna populacija E. coli , u kojoj su sve stanice dobivene diobama iz jedne ishodne stanice, mogu lako biti izolirane kao kolonije koje rastu u polutekuem agaru s medijem (Slika 1.14). Budui da se bakterijske kolonije koje sadre akd 108 stanica mogu razviti preko noi, izoliranje genetske varijante soja E. coli na primjer, mutante rezistentne na antibiotik kao to je penicilin lako je i brzo. Lakoa kojom takve mutante mogu biti izolirane i analizirane bila je odluna za uspjeh eksperimenata koji su definirali temeljna naela molekularne genetike, o emu se raspravljalo u Poglavlju 3.

Hranjivi medij u kojem se E. coli najbre dijeli sastoji se od glukoze, soli, i razliitih organskih spojeva, poput aminokiselina, vitamina i pretea nukleinskih kiselina. Meutim, E. coli moe takoer rasti na mnogo jednostavnijim medijima koji sadre samo soli, izvor duika (kao to je amonijak) i izvor ugljika i energije (kao to je glukoza). U takvom mediju, bakterije rastu neto sporije (vrijeme diobe je oko 40 minuta) jer moraju same sintetizirati sve aminokiseline, nukleotide i druge organske spojeve. Sposobnost E. coli da izvri ove biosintetske reakcije u jednostavnim definiranim medijima uinila ih je izuzetno pogodnim za razjanjavanje biokemijskih puteva. Dakle, brzi rast i jednostavni hranidbeni zahtjevi E. coli uvelike su olakali osnovne eksperimente u molekularnoj biologiji i biokemiji.

Kvasci

Iako su bakterije bile neobino vrijedan model za istraivanje mnogih evolucijski ouvanih svojstava stanice, one oigledno nisu mogle biti upotrebljene za istraivanje stanine strukture i funkcije jedinstvene za eukariote. Kvasci, najjednostavniji eukarioti, posjeduju brojne eksperimentalne prednosti sline onima u E. coli. Posljedica toga je bila da su kvasci postali kljuni model za studij mnogih temeljnih procesa u staninoj biologiji eukariota.

Genom najistraenijeg kvasca, Saccharomyces cerevisiae, sastoji se od oko 12 milijuna parova baza DNA i sadri oko 6 000 gena. Premda je genom kvasaca po prilici tri puta vei nego genom E. coli, s njime se moe puno lake izai na kraj prilikom istraivanja nego sa genomima sloenije graenih eukariota, kao to su ljudi. I u svojoj jednostavnosti, stanica kvasca pokazuje sve tipine osobine eukariotske stanice (Slika 1.15). Ona sadri jezgru obavijenu jezgrinom ovojnicom, njena genomska DNA je organizirana u 16 linearnih kromosoma, a citoplazma sadri citoskelet i stanine organele.

Kvasci se mogu lako uzgajati u laboratoriju i mogu se istraivati mnogim od molekularnih pristupa koji su bili toliko uspjeni u E. coli. Premda se kvasci ne mogu replicirati tako brzo kao bakterije, oni se ipak esto dijele, svaka 2 sata, a mogu lako stvarati kolonije iz jedne stanice. Prema tome, kvasci se mogu koristiti za razliite genetike manipulacije sline onima koje se mogu izvoditi u bakterijama.

Ove osobine uinile su od stanice kvasca najpristupaniju eukariotsku stanicu sa stajalita molekularne biologije. Mutante kvasca postale su vane za razumijevanje mnogih temeljnih procesa u eukariota, ukljuujui DNA replikaciju, transkripciju, RNA obradu, razvrstavanje proteina i regulaciju stanine diobe, o emu e se raspravljati u slijedeim poglavljima. Jedinstvo molekularne biologije stanica postalo je prilino jasno s injenicom da su temeljna naela stanine strukture i funkcije otkrivena u prouavanjima kvasaca primjenjiva na sve eukariotske stanice.

Dictyostelium discoideumDictyostelium discoideum je sluzavac, koji je poput kvasca relativno jednostavan jednostanini eukariot. Genom Dictyostelium-a je po prilici deset puta vei od genoma E. coli mnogo sloeniji nego genom kvasca, ali znatno jednostavniji nego genomi viih eukariota. tovie, Dictyostelium moe dobro rasti u laboratoriju i pogodan je za razliite genetske manipulacije.

U obilnim prehrambenim uvjetima, Dictyostelium ivi kao jednostanina ameba, hranei se bakterijama i kvascima. Vrlo je pokretna stanica, a to svojstvo ini Dictyostelium vanim modelom za studiranje molekularnih mehanizama odgovornih za pokretanje animalnih stanica (Slika 1.16). Primjerice, uvoenjem odgovarajuih mutacija u Dictyostelium bila je otkrivena uloga nekolicine gena odgovornih za stanino pokretanje.

Slijedea zanimljiva osobina Dictyostelium-a je sposobnost jedne stanice da agregira u viestanine strukture. Kada je opskrba hranom nedovoljna, stanice se udruuju u crvolike strukture nazvane puevima (engl. slug), od kojih svaka sadri i do 100,000 stanica koje funkcioniraju kao jedinka. Prema tome, ini se da je Dictyostelium na granici izmeu jednostaninih i mnogostaninih organizama i predstavlja vaan model za prouavanje stanine signalizacije i interakcije izmeu stanica.

Caenorhabditis elegans

Jednostanini eukarioti Saccharomyces i Dictyostelium su vani modeli za istraivanje eukariotskih stanica, ali za razumijevanje razvoja mnogostaninih organizama potrebne su eksperimentalne analize biljaka i ivotinja, koji su mnogo sloeniji organizami. Nematoda Caenorhabditis elegans (Slika 1.17) posjeduje nekoliko znaajnih osobina koje je ine jednim od najvie upotrebljavanih modela za prouavanje razvoja ivotinja i stanine diferencijacije.

Premda je genom C. elegans (oko 100 milijuna parova baza) vei nego genomi jednostaninih eukariota, ipak je jednostavniji i mnogo pogodniji za rukovanje od genoma veine ivotinja. Kompletna sekvenca njegova genoma odreena je, pa se otkrilo da genom C. elegans sadri oko 19,000 gena po prilici trostruki broj gena od kvasca, i pola od broja gena u ljudi. Bioloki, C. elegans je relativno jednostavan mnogostanini organizam: odrasle jedinke sadre samo 959 somatskih stanica, plus 1000 do 2000 zametnih stanica. Uz to, C. elegans se moe lako uzgajati i podvrgavati genetikim manipulacijama u laboratoriju.

Jednostavnost grae C. elegans omoguila je detaljno prouavanje tijeka njegovog razvitka pomou mikroskopa. Ovakve analize uspjeno su ule u trag embrionalnom porijeklu i lozi svih stanica odrasle jedinke. Genetika istraivanja takoer su otkrila mnoge mutacije odgovorne za razvojne abnormalnosti, to je dovelo do izolacije i karakterizacije kljunih gena koji kontroliraju razvitak i diferencijaciju nematoda. Vano je da slini geni takoer djeluju u sloenim ivotinjama (ukljujui ovjeka), to C. elegans ini vanim modelom za prouavanje razvitka ivotinja.

Drosophila melanogaster

Poput C. Elegans, vinska muica Drosophila melanogaster (Slika 1.18) predstavljala je kljuni model ivotinjskog organizma u razvojnoj biologiji. Genom Drosophila-e je veliinom slian onom C. elegans, iako Genom Drosophila-e sadri samo oko 14,000 gena. Nadalje, Drosophila se moe biti lako odravati i uzgajati u laboratoriju, a njen kratak reprodukcijski ciklus (oko dva tjedna) ini je vrlo pogodnim organizmom za genetike eksperimente. Mnogi temeljni pojmovi genetike kao to je odnos izmeu gena i kromosoma proizali su iz istraivanja Drosophila-e poetkom dvadesetog stoljea (vidi Poglavlje 3).

Iscrpna genetika analiza Drosophila-e otkrila je mnoge gene koji kontroliraju razvoj i diferencijaciju, a sadanje metode molekularne biologije omoguile su detaljnu analizu funkcije tih gena. Kao rezultat toga, istraivanja Drosophila-e dovela su do znaajnog napretka u razumijevanju molekularnih mehanizama koji upravljaju ivotinjskim razvojem, osobito s obzirom na uspostavljanje plana grae tijela sloenih viestaninih organizama. Kao kod C. elegans, slini geni i mehanizmi postoje kod kraljenjaka, pa je koritenje Drosophila-e kao glavnog eksperimentalnog modela u suvremenoj razvojnoj biologiji nesporno.

Arabidopsis thaliana

Istraivanje biljne molekularne biologije i razvoja predstavlja aktivno i sve opsenije podruje znaajne ekonomske vanosti kao i intelektualnog interesa. Budui da genomi biljaka imaju razinu sloenosti usporedivu sa ivotinjskim genomima (vidi Tabelu 1.2), optimalni model za istraivanje biljnog razvoja bio bi relativno jednostavan organizam s nekima pogodnim svojstvima C. elegans i Drosophila-e. Malena biljka cvjetnjaa Arabidopsis thaliana (Slika 1.19) ispunjava te kriterije i zbog toga se naveliko koristi kao model za istraivanje biljne molekularne biologije.

Arabidopsis je znaajan zbog svog genoma od oko samo 120 milijuna parova baza, koji sadri otprilike 15,000 razliitih gena sloenost slina onoj C. elegans i Drosophila-e. Osim toga, Arabidopsis se relativno lako uzgaja u laboratoriju, pa su razvijene metode molekularnih genetikih manipulacija s ovom biljkom. Istraivanja su dovela do identifikacije gena ukljuenih u razliite aspekte biljnog razvoja, kao to je razvoj cvijea. Analiza ovih gena ukazuje na mnoge slinosti, ali i izrazite razlike, izmeu mehanizmima koji kontroliraju razvoj biljaka i ivotinja.

Kraljenjaci

Najsloenije ivotinje su kraljenjaci, ukljuujui ljude i druge sisavce. Ljudski genom ima otprilike 3 milijardi parova baza oko 30 puta je vei od genoma C. elegans, Drosophilae ili Arabidopsisa i sadri 30 - 40 tisua gena. Osim toga, ljudsko tijelo se sastoji od vie od 200 razliitih vrsta specijaliziranih tipova stanica. Ova sloenost ini istraivanje kraljenjaka tekim za prouavanje sa stajalita stanine i molekularne biologije, ali veina zanimanja za bioloke znanosti ipak izvire iz elje da se razumije ljudski organizam. tovie, razumijevanje mnogih pitanja od neposredne praktine vanosti (npr. u medicini) mora se bazirati direktno na istraivanjima ljudskih (ili blisko srodnih) tipova stanica.

Vaan pristup istraivanju ljudskih stanica i stanica ostalih sisavaca je uzgoj izoliranih stanica u kulturi, gdje se njima moe manipulirati pod kontroliranim laboratorijskim uvjetima. Upotreba kultiviranih stanica omoguila je istraivanje mnogih aspekata stanine biologije sisavaca, ukljuujui eksperimente koji su razjasnili mehanizme replikacije DNA, ekspresije gena, sinteze i obrade proteina, i stanine diobe. tovie, sposobnost stanica da se kultiviraju u kemijski definiranim medijima, omoguilo je istraivanja signalnih mehanizama koji normalno kontroliraju stanini rast i diferencijaciju unutar organizma.

Specijalizirane osobine nekih visoko diferenciranih tipova stanica uinile su ih vanim modelima za istraivanja odreenih aspekata stanine biologije. Primjerice, miine stanice su visoko specijalizirane za kontrakciju, proizvodei snagu i pokret. Zbog te specijalizacije, miine stanice su kljuni model za istraivanje staninog kretanja na molekularnoj razini. Drugi primjer pruaju ivane stanice (neuroni), koje su specijalizirane za provoenje elektrokemijskih signala na velike udaljenosti. U ljudi, aksoni ivanih stanica mogu biti dui od jednog metra, a neki beskraljenjaci, poput lignje, imaju ogromne neurone s velikim aksonima koji imaju i do 1 mm u promjeru. Zbog njihove visoko specijalizirane strukture i funkcije, ovi ogromni neuroni su vani modeli za istraivanja transporta iona kroz plazma membranu, i ulogu citoskeleta u transportu organela iz citoplazme.

aba Xenopus laevis vaan je model za istraivanje ranog razvoja kraljenjaka. Jaja Xenopus-a su neobino velike stanice, s promjerom od otprilike 1 mm (Slika 1.20). Budui da se ta jaja razvijaju izvan majke, svi stupnjevi razvoja od jaja do punoglavca mogu se lako prouavati u laboratoriju. Uz to, lako se moe pribaviti velik broj jaja Xenopusa to olakava biokemijsku analizu. Zbog ovih tehnikih prednosti, Xenopus se mnogo koristio u istraivanjima razvojne biologije i pruio je vane uvide u molekularne mehanizme koji kontroliraju razvoj, diferencijaciju, i diobu stanica zametka.

Zebrasta riba (Slika 1.21) posjeduje brojne prednosti za istraivanja genetike razvoja kraljenjaka. Ove malene ribe lako je odravati u laboratoriju i brzo se mnoe. Uz to, zameci se razvijaju izvan majke i prozirni su, tako da se rane faze razvoja mogu lako promatrati. Mone metode razvijene su da olakaju izolaciju mutacija koje zajedniki utjeu na razvoj zebraste ribe, a nekoliko tisua takvih mutacija je ve identificirano. Budui da je zebrasta riba kraljenjak koji se lako prouava, obeava premotavanje jaza izmeu ljudskih i jednostavnijih beskraljenjakih sustava, poput C. elegans i Drosophilae.

Meu sisavcima, mi je najprikladniji za genetike analize, koje e biti olakane nedavnim dovravanjem sekvenciranja mijeg genoma. Iako su tehnike potekoe u istraivanju genetike mia velike (u usporedbi, primjerice, sa genetikom kvasaca ili Drosophilae), identificirane su mnoge mutacije koje utjeu na razvoj mia. Najvanije je, da su nedavna postignua u molekularnoj biologiji omoguila stvaranje transgeninih mieva, u kojem su specifini mutirani geni uvedeni u zametne stanice mijeg zametka, tako da se uinak unesenih gena na razvoj ili druge stanine funkcije moe istraiti direktno u cijeloj ivotinji. Prikladnost mia kao modela za prouavanje ljudskog razvoja indicirana je ne samo slinou mijeg i ljudskog genoma nego i injenicom da mutacije homolognih gena rezultiraju slinim razvojnim nepravilnostima kod obje vrste; poseban oblik poemeaja pigmentacije predstavlja izvanredan primjer (Slika 1.22).

ALATI & METODE STANINE BIOLOGIJE

Sva znanstvena eksperimentalna istraivanja, a to podrazumijeva i istraivanja u staninoj biologiji, ovise o laboratorijskim metodama koje se koriste u ispitivanju strukture i funkcije stanice. Brojni znaajni pomaci u naem razumijevanju stanica direktna su posljedica razvoja novih metoda, koje su omoguile potpuno nove pristupe istraivanjima. Soga je poznavanje i pravilno razumijevanje eksperimentalnih alata i metoda koji stoje na raspolaganju staninom biologu, presudno ne samo za razumijevanje sadanjeg statusa, ve i za razumijevanje smjerova razvoja kojima stremi ovo vrlo propulzivno podruje znanosti. U pasusima koji slijede opisane su neke od vanih metoda stanine biologije. Preostali eksperimentalni pristupi, ukljuujui biokemijske metode i metode molekularne biologije, biti e opisani u narednim poglavljima.

SVJETLOSNA MIKROSKOPIJA

Zbog injenice da je veina stanica premalena da bi se vidjele golim okom, ispitivanje stanica uvelike je ovisilo o upotrebi mikroskopa. U stvari, otkrie stnice potaknuto je razvojem mikroskopa: Robert Hook prvi je uveo naziv stanica promatrajui komadi pluta jednostavnim svjetlosnim mikroskopom 1665. godine (Slika 1.23). Koristei mikroskop koji je poveavao objekte oko 300 puta, Antony van Leeuwenhoek je 1670. godine mogao promatrati razliite tipove stanica (spermije, crvene krvne stanice, i bakterije). Stanina teorija koju su predloili Matthias Schleiden i Theodor Schwann 1838. godine, moe se pak smatrati roenjem suvremene stanine biologije. Mikroskopska ispitivanja biljnih tkiva koja je vrio Schleiden, te isptivanja animalnih tkiva koja je provodio Schwann dovela su do istog zakljuka: svi se organizmi sastoje i graeni su od stanica. Nedugo nakon tog otkria, shvaeno je da stanice ne nastaju de novo, nego diobom ve postojeih stanica. Time prepoznavanje stanice kao fundamentalne jedinice svih ivih organizama zahvaljujemo opaanjima vrenim svjetlosnim mikroskopom.

Uz tehnika poboljanja koja dozvoljavaju vizualizaciju sve veeg broja detalja stanine strukture, svjetlosni mikroskop i dalje ostaje osnovnim alatom stanine biologije. Dananji svjetlosni mikroskopi mogu poveati objekte do priblino 1000 puta njihove stvarne veliine. Kako je promjer veine stanica izmeu 1 i 100 (m, cijele se stanice kao i neki od veih staninih organela (jezgre, kloroplasti, i mitohondriji) mogu promatrati svjetlosnim mikroskopom. Meutim, razluivanje svjetlosnog mikroskopa nije dovoljno snano za uoavanje finih detalja stanine strukture. Razluivanje, a to je sposobnost mikroskopa da susjedne bliske objekte razlikuje kao odvojene strukture, vanije je od same sposobnosti poveavanja. Slike mogu biti poveane po elji (na primjer, projekcijom na veliki pano), ali na taj nain dobivena poveanja ne doprinose ujedno i razaznavanju veeg broja detalja.

Maksimalno razluivanje svjetlosnog mikroskopa iznosi priblino 0.2m. Stoga se dva objekta koji se nalaze na manjoj udaljenosti od 0.2m uoavaju kao jedan objekt ili slika, i ne mogu se meusobno razlikovati jedan od drugoga. Teoretska granica razluivanja svjetlosnog mikroskopa odreena je s valnom duljinom ( vidljive svjetlosti i sabirnom moi lea mikroskopa (numerika apertura, NA), a izraunava se prema jednadbi:

Razluivanje = 0.61/NA

Valna duljina vidljive svjetlosti iznosi 0.4 do 0.7 m, pa se uzima da je vrijednost svjetlosnog mikroskopa priblino 0.5 m. Numerika apertura moe se definirati kao stoasti snop svjetla koji nakon prolaza kroz bioloki uzorak, ulazi u lee mikroskopa (Slika 1.24). Numerika se apertura izraunava prema jednadbi:

NA = ( sin (gdje je ( indeks refrakcije ili loma svjetlosti medija kroz koji prolazi svjetlost na putu izmeu uzorka i lee. Vrijednost ( za zrak je 1.0, no moe se poveati do priblino 1.4, koristei lee (imerzione lee, imerzione objektive) prilagoene gledanju uzorka kroz kap imerzionog ulja. Kut ( odgovara polovini irine stoastog snopa svijetla koji je proao kroz leu. Maksimalna vrijednost za ( je 90(, kod koje je sin ( = 1, pa je najvea mogua vrijednost numerike aperture 1.4.

Teortsko maksimalno razluivanje svjetlosnog mikroskopa moe se prema tome izraunati na slijedei nain:

Razluivanje = 0.61 x 0.6/1.4 = 0.22 m

Mikroskopi koji su sposobni dosei tu vrijednost razluivanja izraeni su ve krajem devetnaestog stoljea, pa se u tom smislu daljnja poboljanja svjetlosnog mikroskopa ne oekuju.

Nekoliko se tipova svjetlosnih mikroskopa koriste rutinski u ispitivanju razliitih aspekata stanine strukture. Najjednostavniji je svjetlosni mikroskop na principu prolaznog svjetla, odnosno mikroskopija svjetlog polja, (engl.: bright-field microscopy), kod kojega svjetlost prolazi direktno kroz stanicu, a sposobnost razlikovanja pojedinih staninih dijelova ovisi o kontrastu koji je rezultat absorpcije vidljive svjetlosti od strane staninih komponenata. Da bi se poveao kontrast izmeu razliitih dijelova stanice, u mnogim se sluajevima stanice boje bojama koje reagiraju s proteinima ili nukleinskim kiselinama Prije samog bojanja, uzorci se obino podvrgavaju fiksaciji (alkoholom, octenom kiselinom, ili formaldehidom) ija je svrha stabilizacija i ouvanje staninih struktura. Analiza fiksiranih i obojanih uzoraka tkiva svjetlosnim mikroskopom, standardan je pristup ispitivanjima uzoraka tkiva u histolokim laboratorijima (Slika 1.25). Tehnike bojanja dovode do ugibanja stanica, i stoga takav nain pripremanja stanica za analizu nije prikladan za mnogobrojne eksperimente kojima se eli ispitati ive stanice,

Bez bojanja, direktan prolaz svjetlosti pak ne stvara kontrast dovoljan za razlikovanje mnogih unutarstaninih dijelova, to ograniava upotrebu mikroskopa sa svjetlim poljem. Meutim, kontrast izmeu valova svjetlosti koji prolaze kroz regije stanice razliitih gustoa moe se poveati modificiranjem optike svjetlosnog mikroskopa. Dva najea naina vizualizacije ivih stanica njihova je analiza fazno-kontrastnim i diferencijalno interferentno-kontrastnim mikroskopom (slika 1.26). Oba tipa mikroskopa koriste optike sisteme za pretvaranje razlika u gustoi ili debljini razliitih staninih dijelova, u razlike u kontrastu na konanoj slici. Kod mikroskopa sa svjetlim poljem transparentne strukture (kao to je jezgra) slabo su kontrastne jer slabo absorbiraju svjetlo. Meutim, brzina svjetla se smanjuje prolazom kroz te strukture, pa je faza svjetlosti promijenjena (zaostaje) u usporedbi sa fazom svjetla koje je prolo kroz okolnu citoplazmu. Fazno-kontrastna i interferentno-kontrastna mikroskopija pretvaraju razlike u fazi svjetlosti u razlike u kontrastu, to rezultira poboljanom kvalitetom slika ivih, neobojanih stanica.

Snaga svjetlosnog mikroskopa moe se pojaati upotrebom video kamera i kompjutera za analizu i obradu slika. Takovi elektronski sistemi za obradu slika mogu srazmjerno poveati kontrast slike dobiven svjetlosnim mikroskopom, dozvoljavajui vizualizaciju malih objekata koji se inae ne bi mogli uoiti. Na primjer, videom pojaana interferentno-kontrastna mikroskopija dozvoljava vizualizaciju pomicanja organela, proteinskih filamenata citoskeleta du mikrotubula promjera 0.025 m (Slika 1.27). Meutim, to pojaanje ne prelazi teoretsku granicu razluivanja svjetlosnog mikroskopa od priblino 0.2 (m. Iako videom pojaano razluivanje omoguava vizualizaciju mikrotubula, oni su na konanoj slici nerazgovjetni i mutni, promjera od najmanje 0.2 m. Pri tom se pojedini mikrotubuli ne mogu razlikovati od susjednih struktura.

Svjetlosna mikroskopija dosegla je razinu molekularnih analiza, metodama oznaavanja (engl. labeling) specifinim molekulama koje se unutar stanica mogu vizualizirati. Specifini geni i RNA transkripti mogu se detektirati hibridizacijom DNA/RNA probama s komplementarnom sekvencom, a proteini upotrebom odgovarajuih anatitijela (vidi Poglavlje 3). I DNA/RNA probe i antitijela mogu se oznaiti razliitim molekulama (engl. tag) koji omoguuju njihovu vizualizaciju u svjetlosnom mikroskopu, inei moguim odreivanje poloaja specifinih molekula unutar pojedinane stanice.

Fluorescentna mikroskopija u irokoj je primjeni kao izuzetno senzitivna metoda ispitivanja distribucije staninih molekula (Slika 1.28). Fluorescentna boja (fluorokrom, fluorofor) koristi se za oznaavanje molekule od interesa unutar fiksiranih ili ivih stanica. Fluorescentna boja je molekula koja absorbira svjetlost jedne valne duljine, a emitira svjetlost druge valne duljine. Fluorescencija se postie osvjetljivanjem uzorka svjetlou valne duljine koja ekscitira fluorescentnu boju, a upotrebom odgovarajuih filtera odreuje se specifina valna duljina svjetlosti koju potom emitira fluorescentna boja. Fluorescentni se mikroskop danas koristi u ispitivanjima brojnih razliitih molekula unutar stanica. esta primjena sastoji se u oznaavanju protein-specifinih antitijela fluorescentnim bojama, za odreivanje distribucije proteina unutar pojedinih stanica.

Upotreba zelenog fluorescentnog proteina (GFP, engl.: green fluorescent protein) meduza za vizualizaciju proteina unutar ivih stanica, predstavlja vano nedavno unapreenje fluorescentne mikroskopije. Standardnim metodama rekombinantne DNA, GFP se moe vezati za bilo koji protein od interesa. Spoj GFP i proteina moe se uvesti u stanicu i vizualizirati fluorescentnim mikroskopom, bez potrebe za fiksacijom i bojenjem stanica (to bi bilo potrebno u sluaju detekcije proteina antitijelima). Zbog svoje svestranosti, primjena GFPa u staninoj biologiji izuzetno je popularna, a koristi se u praenju poloaja i kretanja velikog broja razliitih proteina u ivim stanicama (Slika 1.29).

Konfokalna mikroskopija sjedinjuje znaajke fluorescentnog i mikroskopa s elektronskom analizom i obradom slike, ime se postie dobivanje slika s vie detalja i jaeg kontrasta. Malen snop svjetla, u prvilu dobiven laserom, fokusira se na odreenu dubinu uzorka. Emitirano fluorescentno svjetlo se potom sakuplja pomou detektora (video kamere). Prije nego li emitirano svjetlo dosegne detektor, ono mora proi kroz siunu konfokalnu aperturu. Konfokalna apertura precizno je smjetena na mjestu gdje se svjetlo emitirano s odabrane dubine uzorka nalazi u fokusu (Slika 1.30). Stoga je samo svijetlo koje je emitirano s ravnine u fokusu, sposobno dosegnuti detektor. Skeniranje uzorka proizvodi dvodimenzionalnu sliku ravnine u fokusu, koja je mnogo otrija od slike koja se moe postii standardnim fluorescentnim mikroskopom (Slika 1.31). tovie, serija slika dobivenih s razliitih dubina moe posluiti za rekonstrukciju trodimenzionalne strukture uzorka koji se ispituje.

Multi-foton ekscitacijska mikroskopija je alternativa konfokalnom mikroskopu u primjeni analize ivih stanica. Uzorak se osvjetljava s valnom duljinom svjetla na nain da ekscitacija fluorescentne boje zahtijeva istovremenu absorpciju dva ili vie fotona (Slika 1.32). Vjerojatnost da dva fotona istovremeno ekscitiraju fluorescentnu boju znaajna je samo u onoj toci uzorka gdje se ulazni laserki snop svjetla (engl. beam) nalazi u fokusu. Na taj se nain postie emisija fluorescencije samo s ravnine fokusa ulaznog svjetla. Ta vrlo precizno lokalizirana ekscitacija automatski proizvodi trodimenzionalo razluivanje stvarajui trodimenzionalni slikovni prikaz ivih stanica, bez potrebe da emitirano svjetlo prolazi kroz aperturu (kao u sluaju konfokalnog mikroskopa). Stovie precizna lokalizacija ekscitacije smanjuje na minimum oteivanje biolokog uzorka tijekom mikroskopiranja.

Elektronska mikroskopija

Zbog ogranienog razluivanja svjetlosnog mikroskopa, analiza detalja stanine strukture zahtijevala je snaniju mikroskopsku tehnikuelektronsku mikroskopiju (EM), koja je razvijena 1930tih godina. Albert Claude, Keith Porter, i George Palade, 1940tih i 1950tih godina prvi su primjenili elektronsku mikroskopiju u analizi biolokih uzoraka. Elektronski mikroskop moe dosei znatno vee razluivanje od svjetlosnog mikroskopa jer je valna duljina elektrona kraa od valne duljine svjetlosti. Valna duljina elektrona u elektronskom mikroskopu moe biti i do 0.004 nm, to je stostruko manja vrijednost od valne duljine vidljive svjetlosti. Teoretski tom bi se valnom duinom moglo postii razluivanje od 0.002 nm. Meutim, to se razluivanje u praksi ne moe postii, budui je razluivanje odreeno ne samo valnom duljinom, ve i numerikom aperturom lea mikroskopa. Numerika apertura je ograniavajui faktor u elektronskoj mikroskopiji jer znaajke elektromagnetskih lea odreuju veliinu kuta njihove aperture na priblino 0.5o, to odgovara numerikim aperturama od oko 0.2 nm. Nadalje, razluivanje koje se moe postii s biolokim uzorcima, ogranieno je i nedostatkom njihovog svojstvenog kontrasta. To je razlog da maksimalno razluivanje elektronskog mikroskopa iznosi 1 do 2 nm za bioloke uzorke. Premda je to razluivanje EM znatno manje od razluivanja predvienog izraunavanjem valne duljine elektrona, ono predstavlja vie od stostrukog poveanja snage razluivanja svjetlosnog mikroskopa.

Dva osnovna tipa ekeltronskih mikroskopa, transmisijski (TEM) i scanning (SEM), primjenjuju se u brojnim staninim ispitivanjima, a zajedniko im je to da u stvaranju slike koriste snop elektrona. Princip transmisijske elektronske mikroskopije slian je mikroskopiji u svjetlom polju. Uzorci se fiksiraju i boje solima tekih metala, koje omoguuju stvaranje kontrasta. Snop elektrona prolazi kroz uzorak i fokusira se to dovodi do stvaranja slike na fluorescentnom zaslonu. Elektroni koji nalijeu na ione tekih metala, prolazei kroz uzorak skreu i udaljuju se, pa ne doprinose konanoj slici. Na konanoj su slici obojene regije uzorka tamne.

Uzorci koji se ispituju transmisijskim elektronskim mikroskopom mogu se prirediti s pozitivnim ili negativnim bojenjem. U pozitivnom bojenju, uzorci tkiva reu se u ultratanke prereze koji se boje solima tekih metala (osmijev tetraoksid, uranil acetat, olovni citrat), koji reagiraju s lipidima, proteinima, i nukleinskim kiselinama. Ioni tekih metala veu se na razne stanine strukture, to rezultira tamnim bojenjem na finalnoj slici (Slika 1.33). Alternativne procedure pozitivnog bojanja takoer se koriste u identifikaciji specifinih makromolekula u stanici. Na primjer, antitijela oznaena s tekim metalima (partikulama zlata) koriste se esto u lokalizaciji specifinih proteina. Ta je metoda slina fluorescentnoj mikroskopiji kod koje se antitijela oznaavaju fluorescentnim bojama.

Negativno bojenje korisno je za vizualizaciju intaktnih i neoteenih staninih struktura (bakterija, izoliranih staninih organela, i makromeolekula) (Slika 1.34). Kod te metode, bioloki uzorak je uklopljen na nosau prekrivenim tankim filmom. Metalna boja se ostavi osuiti oko povrine uzorka, ime se neobojeni uzorak okrui filmom boje, stvarajui sliku u kojoj uzorak izgleda svjetao nasuprot tamno obojene pozadine.

Sjenjanje metalom (engl. metal shadowing) je jo jedna tehnika koja se koristi u vizualizaciji povrine izoliranih staninih struktura ili makromolekula u transmisijskom elektronskom mikroskopu (Slika 1.35). Uzorak se prekrije tankim slojem metalnih para (na pr. platina). Metalne pare se raspruju po uzorku pod odreenim kutem, pa su povrine biolokog uzorka koje su direktno usmjerene prema izvoru molekula metalnih para deblje premazane nego li ostale povrine uzorka. Te razlike u debljini sloja metalnih para stvaraju efekt sjene, dajui uzorku trodimenzionalni izgled na elektronskoj mikrofotografiji.

Prepariranje uzoraka metodom smrzavanja i lomljenja (engl. freeze fracture), u kombinaciji sa tehnikom sjenjanja metalom, bila je napose vana u istraivanju strukture membrane. Uzorci se smrznu u tekuem duiku (na -196oC), a zatim lome otricom noa. Taj proces esto razdvoji dvostruki lipidni sloj, to omoguava prikazivanje unutarnjih strana stanine membrane (Slika 1.36). Uzorak se zatim sijenja platinom, a bioloki se materijal otapa kiselinom, stvarajui metalnu repliku povrine biolokog uzorka. Analizom replika u elektronskom mikroskopu vide se brojna povrinska ispupenja, koja odgovaraju proteinima koji se proteu kroz dvoslojnu lipidnu membranu. Varijacija ove tehnike nazvana smrzavanje i urezivanje (engl. freeze etching) omoguuje ujedno vizualizaciju i vanjskih povrina staninih membrana i unutarnjih strana membrana.

Drugi tip elektronskog mikroskopa, scanning elektronski mikroskop koristi se za dobivanje trodimenzionalne slike stanica (Slika 1.37). Kod scanning elektronskog mikroskopa snop elektrona ne prolazi kroz bioloki uzorak. Umjesto toga povrina stanice je prekrivena tekim metalom, a snop elektrona se koristi za skeniranje po uzorku. Elektroni koji se odbijaju sa povrine uzorka, sakupljaju se stvarajui tridimenzionalnu sliku kako se snop elektrona pomie po stanici. Budui je razluivanje elektronskog scanning mikroskopa samo oko 10 nm, njegova je primjena uglavnom ograniena na ispitivanja cijelih stanica.

FRAKCIONIRANJE STANICE (engl. SUBCELLULAR FRACTIONATION)

Premda je elektronski mikroskop omoguio detaljnu vizualizaciju stanine strukture, sama mikroskopija nije dostatna za definiranje funkcija raznih komponenata eukariotskih stanica. Da bi se adresirala brojna pitanja vezana uz funkciju staninih organela, pokazalo se neophodnim izolirati organele eukariostskih stanica u obliku koji se moe koristiti u biokemiskim ispitivanjima. To se obino postie diferencijalnim centrifugiranjem, metodom koju su uglavnom razvili Albert Claude, Christian de Duve i njihovi suradnici, 1940tih i 1950tih godina, a kojom se stanine komponente meusobno odvajaju na osnovu njihove veliine i gustoe.

Prvi korak u staninom frakcioniranju je razbijanje stanine membrane pod uvjetima koji ne unitavaju ostale unutarstanine komponente. Koristi se nekoliko metoda, ukljuujui sonikaciju (izlaganje uzorka visokim frekvencijama zvuka), usitnjavanje u mehanikom homogenizatoru, ili tretiranje u mjealici velikih brzina. Svi ti postupci dovode do pucanja stanine membrane i endoplazmatskog retikula u male fragmente, dok ostale komponente stanice (jezgra, lizosomi, peroksisomi, mitohondriji i kloroplasti) ostaju neoteene.

Suspenzija se razbijenih stanica (koja se naziva lizat ili homogenat) zatim frakcionira u komponente serijom centrifugiranja u ultracentrifugi, koja rotira uzorke vrlo velikom brzinom (preko 100 000 rpm), pri emu se stvaraju sile i do 50 000 puta vee od sile gravitacije. Ta sila uzrokuje da se stanine komponente pomiu prema dnu epruvete stvarajui sediment (engl. pallet) (proces se nazviva sedimentacija) brzinom koja ovisi o njihovoj veliini i gustoi, s time da se najvee i najtee strukture najbre sedimentiraju (Slika 1.38). Obino se stanini homogenati prvo centrifugiraju kod malih brzina, kod kojih se sedimentiraju netaknute stanice i jezgre kao najvee stanine strukture. Tako se kod niih brzina centrifugiranaja sedimentiranjem moe dobiti obogaena frakcija jezgara, dok ostale stanine komponente ostaju resuspendirane u supernatantu (u tekuem dijelu iznad sedimenta). Supernatant se zatim centrifugira kod veih brzina za sedimentiranje mitohondrija, kloroplasta, lizozoma i peroksisoma. Ponovnim centrifugiranjem supernatanta kod sve veih brzina sedimentiraju se fragmenti stanine membrane i endoplazmatski retikul. etvrto uzastopno centrifugiranje kod jo vee brzine dovodi do sedimentacije ribosoma, ostavljajui samo topiv dio citoplazme (citosol) u supernatantu.

Razliite frakcije dobivene diferencijalnim centrifugiranjem predstavljaju obogaene, ali ne i iste pripravke organela. Vei stupanj purifikacije moe se postii centrifugiranjem u gradijentu gustoe, u kojem se organeli odvajaju sedimentiranjem kroz gradijent guste supstance, kao to je otopina saharoze. U centrifugiranju temeljenom na brzini sedimentacije poetni se materijal postvalja na vrh gradijenta otopine eera (Slika 1.39). Partikule razliitih veliina sedimentiraju se kroz gradijent razliitim brzinama, stvarajui diskretno uoljive pruge. Nakon centrifugiranja razliite se frakcije gradijenta (pruge), odnosno frakcije organela slinih veliina mogu odvojiti jedne od drugih.Centrifugiranje temeljeno na ekvilibriju gradijenata gustoa, moe se uptrebiti za odvajanje staninih komponenta na bazi njihove gustoe plutanja (engl. buoyant density) gustoe, novisno od njihove veliine i oblika. U tom postupku, uzorak se centrifugira u gradijentu koji sadri vrlo koncentriranu otopinu saharoze ili cezij klorida. Umjesto da ih se odvoji na osnovi brzine sedimentacije, uzorak partikula se centrifugira sve dok ne dosegnu poloaj ekvilibrija, kod kojega je njihova gustoa plutanja jednaka gustoi okolne otopine saharoze ili otopine cezij klorida. Centrifugiranje kojim se postie ekvilibrij, korisno je za odvajanje razliitih tipova membrana jedne od drugih, a dostatno je osjetljivo i kao metoda odvajanja makromolekula koje su oznaene razliitim izotopima. Klasian je primjer (opisn u 3. poglavlju) analiza DNA replikacije odvajanjem DNA molekula s tekim i lakim izotopima duika (15N i 14N) centrifugiranjem u ekvilibriju gradijenta gustoe otopine cezij klorida.

RAST ANIMALNIH STANICA U KULTURI

Analiza stanica uvelike ovisi o spremnosti stanica za rast u laboratorijskim uvjetima, te u kojoj je mjeri rukovanje stanicama u laboratoriju zahtijevno. Iako je proces tehniki tei od kultiviranja bakterija ili gljivica kavasca, velik broj ivotinjskih i biljnih stanica mogu rasti u kulturi. Takovi in vitro sistemi staninih kultura omoguili su znanstvenicima ispitivanje rasta i diferencijacije stanica, kao i genetske manipulacije, nune za razumijevanje strukture i funkcije gena.

Kulture animalnih stanica postavljaju se usitnjavanjem tkiva na njegove komponente koji se dodaju u posudicu za kulturu sa hranjivim medijem (tvorei suspenziju stanica). Veina tipova animalnih stanica (kao fibroblasti i epitelne stanice), prihvaaju se za dno plastine povrine posudice za staninu kulturu (Slika 1.40). Embriji i tumori esto se u istraivanjima koriste kao primarni materijal jer sadre stanice koje brzo rastu. Fibroblasti embrija posebno dobro rastu u kulturi, pa su u istraivanjima jedan od najee upotrebljavanjih tipova animalnih stanica. Meutim, pod odgovarajuim uvjetima mnogi specijalizirani tipovi stanica mogu rasti u kulturi, omoguavajui da se diferencijacija kao i razliite znaajke stanica ispituju u kontroliranim eksperimentalnim uvjetima. Embrionalne matine stanice odlian su primjer tome. Embrionalne matine stanice (stanice ranog embrija) kultiviranjem in vitro zadravaju sposobnost diferencijacije u sve tipove stanica koji su prisutni u odraslome organizmu. Zato su ove stanice imale vanu ulogu u ispitivanju funkcija brojnih gena tijekom (embrionalnog) razvoja mia. Potencijal embrionalnih matinih stanica je da kao osnova tkiva za transplantacijsku terapiju, doprinesu uspjenom lijeenju bolesti ovjeka.

Medij (ili hranjiva podloga) za kulturu i propagiranje animalnih stanica puno je sloenijeg sastava od minimalnog medija za potpomaganje rasta bakterija i plijesni. Rana istraivanja staninih kultura koristila su se neprecizno definiranim medijima (kao to su plazma, serum ili ekstrakt embrija). Prekretnica u ovom podruju uinjena je 1955. godine, kada je Harry Eagle opisao prvi tono definiran medij koji omoguava rast animalnih stanica. Uz soli i glukozu, medij za rast animalnih stanica sadri razliite amino kiseline i vitamine koje stanice ne mogu same sintetizirati. Medij za kulturu veine animalnih stanica takoer sadi i serum koji predstavlja izvor polipeptida faktora rasta, nunih za stimulaciju staninih dioba. Identificirano je nekoliko faktora rasta. Oni slue kao regulatori rasta i diferencijacije stanica u viestaninih organizama, omoguavajui provoenje signala kojima razliite stanice komuniciraju meusobno. Na primjer, jedna od vanih funkcija fibroblasta koe u intaktinh ivotinja je da proliferiraju kad je potrebno poraviti oteenje uzrokovano ranom ili porezotinom. Njihovu diobu potiu faktori rasta koji se oslobaaju iz trombocita za vrijeme zgruavanja krvi, stimulirajui na taj nain proliferaciju fibroblasta oko oteenog tkiva. Identifikacija pojedinih faktora rasta omoguila je uspostavu kultura raznih stanica u medijima bez seruma (engl. serum-free media; mediji u kojima je serum zamijenjen specifinim faktorima rasta potrebnih za proliferaciju stanica u pitanju).

Inicijalno uspostavljene stanine kulture zovu se primarne stanine kulture (Slika 1.41). Stanice u primarnoj kulturi obino rastu dok ne prekriju povrinu dna posudice u kojoj se nalaze. Nakon toga, stanice se mogu izvaditi iz posudice i u razrijeenoj koncentraciji ponovno nasaditi, predstavljajui sekundarnu kulturu. Taj proces nasaivanja moe se ponoviti mnogo puta, no veina normalnih stanica u kulturi ne moe beskonano rasti. Na primjer, normalni fibroblasti ovjeka mogu se propagirati 50 do 100 puta (doseui 50 do 100 populacijskih udvostruenja), nakon ega prestaju rasti i ugibaju. Nasuprot tome, embrionalne matine stanice kao i stanice tumorskog porijekla u kulturi imaju sposobnost neograniene proliferacije, i te se kulture nazivaju permanentnim ili besmrtnim staninim linijama (engl. immortal cell lines) . Nadalje, brojne permanentne kulture glodavaca izolirane su iz kultura normalnih fibroblasta. Umjesto da nakon 50-100 populacijskih udvostruenja uginu kao veina ostalih stanica fibroblasta, nekoliko stanica u tim kulturama nastavlja s proliferacijom, tvorei permanentne kulture nalik onima izvedenim od tumora. Te su permanentne stanine linije korisne u najrazliitijim tipovima eksperimenata, jer predstavljaju kontinuirani i uniformni izvor stanica za manipulaciju, kloniranje i neogranieno propagiranje stanica u laboratoriju.

ak i u optimalnim uvjetima, stanini ciklus (vrijeme jedne stanine diobe) animalnih stanica koje najaktivnije rastu u kulturi traje 20 sati, a to je deset puta due od vremena potrebnog da se podijeli stanica plijesni. Zato su eksperimenti s kulturama animalnih stanica mnogo tei i traju znatno dulje od eksperimenata s bakterijama ili kvascem. Na primjer, rast jedne stanice u vidljivu koloniju animalnih stanica traje tjedan dana ili due, dok se kolonije E.coli ili plijesni razviju preko noi od jedne stanice. Unato tome, genetske manipulacije animalnih stanica u kulturi od neprocjenjive su vrijednosti za nae razumijevanje strukture i funkcije stanice.

Kultura biljnih stanica

Blijne stanice takoer se mogu kultivirati u hranjivom mediju koji sadri odgovarajue molekule za regulaciju rasta. Nasuprot polipeptidnim regulatorima rasta animalnih stanica, regulatori rasta biljnih stanica su male molekule koje mogu proi kroz stijenku biljne stanice. U prisustvu odgovarajue smjese tih molekula regulatora rasta, mnogi tipovi biljnih stanica proliferiraju u kulturi, stvarajui masu nediferenciranih stanica koja se naziva kalus (engl. callus) (Slika 1.42).

Vrijedno je spomenuti da su mnoge biljne stanice sposobne stvarati bilo koji od razliitih tipova tkiva koji su u konanici potrebni za regeneracije itave biljke. Stoga se odgovarajuom manipulacijom hranjivih sastojaka i molekula regulatora rasta, nediferencirane biljne stanice u kulturi mogu potaknuti na diferencijaciju u razliita biljna tkiva, ukljuujui korjen, stabljiku i lie. U mnogim sluajevima, ak se i cijela biljka moe regenerirati iz jedne jedine stanice u kulturi. Sposobnost stvaranja nove biljke od jedne jedine stanice manipulacijom u kulturi, osim teoretskog interesa, lakim ini uvoenje promjena genetskog materijala biljke, otvarajui vane mogunosti za genetsko inenjerstvo poljoprivrednih kultura.

VIRUSI

Virusi su unutarstanini paraziti koji se ne mogu replicirati sami. Oni se razmnoavaju infekcijom stanice domaina uzurpirajui staninu maineriju za produkciju virusnih partikula. U svojem najjednostavnijem obliku, virusi su graeni samo od genomske nukleinske kiseline (DNA ili RNA) obavijene proteinskim omotaem (Slika 1.43). Virusi su vani za staninu i molekularnu biologiju jer predstavljaju najjednostavniji sistem koji se moe iskoristiti za istraivanje staninih funkcija. Obzirom da replikacija virusa ovisi o metabolizmu inficirane stanice, istraivanja na virusima otkrila su brojne fundamentalne aspekte stanine biologije. Ispitivanja bakterijskih virusa znatno su doprinjela naem razumijevanju bazinih mehanizama molekularne genetike, a eksperimenti s biljnim virusima (virus mozaika duhana) prvi su demonstrirali genetski potencijal RNA. Animalni su pak virusi omoguili vrlo senzitivne naine ispitivanja raznih aktivnosti eukariotskih stanica.

Brzi rast i malena veliina genoma, bakterije ini odlinim eksperimentalnim modelom molekularne biologije, a virusi bakterija (bakteriofagi) jo su vie pojednostavnili ispitivanje genetike bakterija. Jedan od najvanijih bakteriofaga je bakteriofag T4 koji inficira E.coli. Infekcija jednom partikulom T4 vodi ka stvaranju priblino 200 potomaka virusnih partikula za 20-30 minuta. To dovodi do lize odnosno prsnua inficirane stanice, i oslobaanja virusnih partikula u medij, u kojem mogu inficirati nove stanice. U kulturi bakterija na agaru, replikacija T4 vodi ka stvaranju plakova (engl. plaque), jasnih podruja liziranih stanica (Slika 1.44). Jednako tako kako je lako kultivirati viruse, tako je lako izolirati i virusne mutante (virusi koji rastu u jednom soju E.coli ali ne rastu u drugom soju E.coli), te je manipulacija T4 u ispitivanjima molekularne genetike, jednostavnija, direktnija i bra od ispitivanja na E.coli. Nadalje, genom T4 je 20 puta manji od genoma E.coli (sadri oko 200 000 parova baza) to dodatno olakava genetsku analizu. Neki drugi bakteriofagi imaju jo manje genome, a najjednostavniji su graeni od RNA molekula sastavljenih od samo 3600 nukleotida. Iz tih su razloga virusi bakterija postali krajnje jednostavan i lak eksperimentalni sistem za molekularnu genetiku. Istraivanja vrena na bakteriofagima u mnogome su doprinjela razjanjenju brojnih fundamentalnih principa molekularne biologije.

Zbog poveane sloenosti genoma animalnih stanica, virusi su jo vaniji u ispitivanjima animalnih stanica nego li u ispitivanjima bakterija. Mnogi animalni virusi repliciraju se i mogu se ispitati stvaranjem plakova u staninoj kulturi kao i bakteriofagi. tovie, genomi animalnih virusa sline su kompleksnosti kao i genomi bakteriofaga (veliina genoma im se kree od 3000 do 300 000 parova naza), pa je rukovanje animalnim virusima daleko lake, nego li njihovim stanicama domainima.

Mnogo je razliitih anaimalnih virusa, koji sadre DNA ili RNA kao genetski materijal (Tablica 1.3). Veina virusa s RNA genomom replicira se u inficiranim stanicama sintetizirajui nove RNA kopije njihova genoma s RNA kalupa. Meutim, retrovirusi (porodica animalnih virusa) sadre RNA genom u virusnim partikulama, ija je specifinost da u inficiranoj stanici sintetiziraju DNA kopiju njihova genoma. Zbog toga ti virusi predstavljaju dobar primjer vanosti virusa kao eksperimentalnih modela. Studije su retrovirusa po prvi puta demonstrirale sintezu DNA s RNA kalupa, to predstavlja fundamentalni nain prenosa genetske informacije, danas poznat da se zbiva u eukariotskim stanicama. Drugi primjeri u kojima su animalni virusi predstavljali vane modele za ispitivanja njihovih stanica domaina, ukljuuju ispitivanja DNA replikacije, transkripcije, RNA procesiranje, te transport i sekreciju proteina.

Napose je vano istaknuti, da infekcija nekim animalnim virusima, ne ubija stanice, ve transformira normalnu stanicu u tumorsku stanicu. Istraivanja virusa koji uzrokuju nastanak raka, (prvi je opisao Peyton Rous jo 1911), nisu samo stvorila bazu za nae dananje razumijevanje raka na molekularnoj i staninoj razini, ve su vodila ka rasvjetljavanju mnogih molekularnih mehanizama koji kontroliraju rast i diferencijaciju animalnih stanica.

SAETAK

PORIJEKLI I EVOLUCIJA STANICA

Prva stanica: Sve dananje stanice prokariota i eukariota, potiu od jedne jedine stanice pretka. Smatra se da se prva stanica pojavila prije 3.8 milijarde godina kao rezultat okruivanja samoreplicirajue RNA s fosfolipidnom membranom.

Evolucija metabolizma: Najranije reakcije za stvaranje metabolike energije bile su oblik anaerobne glikolize. Nakon toga je evoluirala fotosinteza, iza koje je slijedio oksidativni metabolizam.

Dananji prokarioti: Dananji se prokarioti dijele u grupu arhebakterija i grupu eubakterija, koje su se razdvojile rano u evoluciji.

Eukariotske stanice: Eukariotske stanice, koje su vee i sloenije od stanica prokariota, sadre jezgru, organele citoplazme, i citoskelet. Smatra se da su evouluirale od simbiostskih zajednica prokariota.

Razvoj viestaninih organizama: Najjednostavniji eukarioti su jednostanini organizmi (na pr. plijesni i amebe). Viestanini su organizmi evoluirali od asocijacija tih jednostaninih eukariota, a podjela rada dovela je do razvoja mnogih vrsta specijaliziranih stanica koje sainjavaju dananje biljke i ivotinje.

STANINI EKSPERIMENTALNI MODELI

E.coli: Zbog genetske jednostavnosti i lakoe ispitivanja, bakterije kao to je E.coli napose su korisne za ispitivanja fundamentalnih aspekata biokemije i molekularne biologije

Gljivice kvasca/plijesni: Kao najjednostavnije eukariotske stanice, kvaeve gljivice vaan su model za ispitivanje raznih aspekata stanine biologije eukariota.

Dictyostelium discoideum: Jednostanian eukariot koji se esto koristi za eksperimentalnu analizu pokretanja stanice.

Ceanorhabditis elegans: Nematod C. elegans jednostavan je viestanian organizam koji slui kao vaan model u razvojnoj biologiji.

Drosophila melanogaster: Zbog ekstenzivne genetske analize, ispitivanja su vinske muice dovela do glavnih napredaka u razumjevanju razvoja ivotinja.

Arabidopsis thaliana: Mala biljka cvjetnica Arabidopsis u estoj je upotrebi kao model u ispitivanjima molekularne biologije i razvoja biljaka.

Kraljenjaci (Vertebrata): Mnoge vrste stanica kraljenjaka mogu rasti u kulturi, gdje se mogu ispitivati u kontroliranim laboratorijskim uvjetima. Specijalizirani tipovi stanica, kao to su na primjer neuroni i miine stanice, predstavljaju korisne modele za ispitivanje odreenih aspekata stanine niologije. aba Xenopus laevis i riba Zebrafish vani su modeli za ispitivanje ranih stadija razvoja kraljenjaka, a mi kao vrsta siasavca je prikladan za genetsku anlizu.

ALATI STANINE BIOLOGIJE

Svjetlosna mikroskopija: Koristei svjetlosni mikroskop kao alat, u vizualizaciji stanica i lokalizaciji specifinih unutarstaninih molekula primjenjuju se brojne metode.

Elektronska mikroskopija: Elektronska mikroskopija ije je razluivanje priblino stostruko vee od razluivanja svjetlosnog mikroskopa, koristi se u analizi detalja stanine strukture.

Frakcioniranje staninih organela: Organeli eukariotskih stanica mogu se izolirati diferencijalnim centriugiranjem za biokemijsku analizu.

Rast animalnih stanica u kulturi: Propagiranje animalnih stanica u kulturi omoguila su ispitivanja mehanizama koji kontroliraju rast i diferencijaciju stanica

Kultura biljnih stanica: Kultivirane stanice biljaka mogu se diferencirati u specijalizirane stanine tipove, a u nekim sluajevima mogu regenerirati itavu biljku.

Virusi: Virusi prestavljaju jednostavne modele za ispitivanje stanine funkcije.

KLJUNI POJMOVI

prokariotska stanica, eukariotska stanica, RNA svijet, fosfolipid, amfipatian (dvostranost fosfolipidnih membrana, engl. amphipatic ), hidrofoban, hidrofilan

adenozin 5-trifosfat (ATP), glikoliza, fotosinteza, oksidativni metabolizam

Arhebakterije, eubakterije, cijanobakterije, Escherichia coli (E.coli), stanina stijenka, plazmina/stanina membrana, ribosom

Jezgra, mitohondrij, kloroplast, lizosom, peroksisom, vakuola, endoplazmatski retikul, Goli-jev aparat, citoskelet, endosimbioza

kvasaeve gljivice/plijesni, Saccharomyces cerevisiae, pseudopodij, epitelne stanice, fibroblast, eritocit, granulocit, monocit, makrofag, limfocit, neuron

Dictyostelium discoideum

Caenorhabditis elegans

Drosophila melanogaster

Arabidopsis thaliana

Xenopus laevis, zebrafish, transgenini mi

razluivanje, mikroskopja svjetlog polja, fazno-kontrastna mikroskopija, videom pojaana diferencijalno iterferentno-kontrastna mikroskopija, fluorescentna mikroskopija, zeleni fluorescentni protein (GFP), konfokalna mikroskopija, multi-foton ekscitacijska mikroskopija

transmisijski elektronski mikroskop, sjenjanje metalom, smrzavanje i lomljenje, scanning elektronski mikroskop

diferencijalno centrifugiranje, ultracentrifuga, centrifugiranje u gradijentu gustoe, centrifugiranje temeljeno na brzini, centrifugiranje u ekvilibriju gustoe

embrionalne matine stanice, primarna kultura, stanina linija

kalus (engl. callus)

bakteriofag, retrovirus

PITANJA

1. Koje su zajednike fundamentalne znaajke svih ivih stanica na Zemlji? (navedi barem tri)

2. to su pokazali eksperimenti o nastanku organskih molekula koje je vrio Stanley Miller?

3. Koji je tip makromolekula je sposoban upravljati svojom vlastitom replikacijom?

4. Zato se smatra da je evolucija fotosinteze pogodovala evoluciji oksidativnog metabolizma?

5. Zato je stvaranje polupropusne plazma membrane oko seta samoreplicirajuih makromolekula tako vaan korak u nastanku ivota?

6. Raspravi injenicu da su mitohondriji i kloroplasti porijeklom od bakterija koje su progutali prekursori eukariotskih stanica.

7. Koliko se razluivanje moe postii sa svjetlosnim mikroskopom ako se uzorak promatra kroz zrak (suhi objektiv), a ne kroz ulje (uljni ili imerzioni objektiv) ? Uzmi da je valna duljina vidljive svjetlosti 0.5 (m.

8. Koje su prednosti zelenog fluorescentnog proteina u ispitivanjima poloaja i kretanja proteina u stanicama u usporedbi s antitijelima koji su oznaeni fluorokromom?

9. Identificiraj razliite karakteristike organela koji se odvajaju centrifugiranjem brzinom u gradijentu saharoze i centrifugiranjem u evkvilibriju u gradijentu saharaoze.

10. Kvaeve gljivice koritene su kao model za ispitivanja mnogih aspekata biologije eukariotskih stanica. Zato su oni pogodan model za analizu pokretanja eukariotskih stanica?

11. Zatoje je kutiviranje embrionalnih matinih stanica vano?

12. Koja je razlika izmeu primarne i permanentne stanine kulture?

KLJUNI EKSPERIMENT

Kultura animalnih stanica___________Nutrition Needs of Mammalian Cells in Tissue Culture

Harry Eagle

National Institutes of Health, Bethesda, MD

Science, Volume 122, 1955, pages 501-504___________

Harry EagleKontekst

Najranije stanine kulture ukljuivale su rast stanica od fragmenata tkiva uklopljenih u zgusnutu plazmu, sistem koji je bio daleko od prikladnog za eksperimentalnu analizu. Kasnih 1940tih godina, glavni je napredak uinjen uspostavom staninih linija dobivenih rastom izoliranih stanica privrenih za stijenku posudice za kulturu. Meutim, te su stanice jo uvijek rasle u nedfiniranom mediju sastavljenom od razliitih kombinacija ektrakata seruma i embrija. Na primjer, esto upoterbljavana tumorska stanina linija (nazvana HeLa stanice) prvotno je uspostavljena 1952. godine rastom u mediju koji se satojao od pilee plazme, ekstrakta goveeg embrija, i seruma pupkovine (placente) ovjeka. Koritenje tako kompleksnih i neprecizno definiranih medija inili su analizu specifinih potreba rasta animalnih stanica nemoguim. Harry Eagle je prvi prijeio taj problem, provevi sistematsku analizu hranjivih sastojaka potrebnih za rast animalnih stanica u kulturi.

Eksperimenti

Eagle je ispitivao rast dvije stanine linije: HeLa stanica i stanine linije fibroblasta nazvane L stanice. Uzgajao je te stanice u mediju sastavljenom od smjese soli, uhljikohidrata, aminokiselina i vitamina, uz dodatak proteina seruma. Sistematskim variranjem komponentata tog medija, Eagle je uspio odrediti specifine hradnidbene potrebe za stanini rast. U dodatku soli i glukoze, te hranjive tvari ukljuuju 13 aminokiselina i nekoliko vitamina. Mala koliina proteina seruma takoer je potrebna. Bazalni medij kojeg je razvio Eagle opisan je u priloenoj tablici prevedenoj iz njegova rada objavljenog 1955. godine.

Utjecaj

Medij kojeg je definirao Eagle jo se uvijek koristi kao bazini medij za kulturu animalnih stanica. Njegova je upotreba omoguila znanstvenicima da kultiviraju razne stanice u definiranim eksperimentalnim uvjetima, koji su kritini za ispitivanje rasta i diferencijacije animalnih stanica, ukljuujui identifikaciju fakotora rasta prisutnih u serumu (za koje se danas zna da ukljuuju polipeptide koji kontoliraju ponaanje pojedinanih stanica u intaktnim ivotinjama).

Tablica 4. Bazalni medij za kultiviranje HeLa stanica i mijih fibroblasta (10)

L-aminokiseline*

Vitamini

Razno

(mM)

(mM)

Arginin

0.1

Biotin

10-3

Glukoza

5mM

Cistin

0.05 (0.02)

Holin

10-3

Penicilin

0.005%#

Glutamin

2.0 (1.0)||

Folna kiselina10-3

Streptomicin0.005%#

Histidin

0.05 (0.02)

Nikotinamid10-3

Fenolno crvenilo0.0005%#

Izoleucin

0.2

Pentotenska kis.10-3

__________________________________________Leucin

0.2 (0.1)

Piridoksal10-3

Lizin

0.2 (0.1)

Tiamin

10-3

Za ispitivanje stanine hrane

Metionin

0.05

Riboflavin10-4

Dijalizirani serum konja, 1%

Fenilalanin0.1 (0.05)

Soli

Dijalizirani humani serum, 10%

Treonin

0.2 (0.1)

(mM)

Triptofan

0.02 (0.01)

Za stone kulture

Tirozin

0.1

NaCl

100

Konjski serum, 5%

Valin

0.2 (0.1)

KCl

5

Humani serum, 10%

NaH2PO4 x H2O 1

NaHCO3

20

CaCl2

1

MgCl2

0.5

* Prikladno uvati u hladnjaku kao pojedinane 20x koncentrirane stok otopine aminokiselina

Za mije fibroblaste

Prikladno uvati kao pojedinane 100 ili 1000 puta koncentrirane stok otopine; uvati stok otopine u smrznutom stanju

Prikladno uvati u hladnjaku kao dvije stok otopine; jedna koja sadri NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, i glukozu kao 10 puta koncentrirane stok otopine, a druga koja sadri CaCl2 i MgCl2 kao 20 puta koncentrirana optopina

|| uva se kao 100mM stok otopina; uva se u smrznutom obliku kad nije u upotrebi

# uva se kao pojedinana 100 puta koncentrirana stok otopina penicilina, streptomicina i fenolnog crvenila.

MOLEKULARNA MEDICINA

Virusi i rak

Bolest

Rak predstavlja skupinu bolesti koju karakterizira nekontrolirani rast i proliferacija stanica. Rast noramalnih animalnih stanica paljivo je reguliran s ciljem zadovoljenja potreba cijelog organizma. Nasuprot tome, stanice raka rastu na nereguliran nain, konano interferijajui s funkcijom normalnih tkiva i organa. Rak je nakon bolesti srca drugi najei uzrok smrti u SAD. Priblino e jedan od tri Amerikanca razviti rak tijekom svog ivota, usprkos velikog napretka u lijeenju, a gotovo jedan od etiri Amerikanca umire od ove bolesti. Razumijevanje uzroka raka i razvijanje efikasnijih metoda lijeenja raka, predstavljaju stoga glavne ciljeve medicinskih istraivanja.

Molekularna i stanina osnova

Danas je poznato da je rak rezultat mutacija gena koji normalno kontroliraju proliferaciju stanica. Glavni uvid koji je vodio ka identifikaciji tih gena spoznat je kroz ispitivanja virusa koji urokuju rak u ivotinja, a iji je prototip izolirao Peyton Rous 1911. godine. Rous je naao da se sarkomi (rak vezivnih tkiva) pilia mogu prenjeti virusom koji je danas poznat kao Rousov virus sarkoma (engl. Rous sarcoma virus, ili RSV). Obzirom da je RSV retrovirus iji genom ima samo 10 000 parova baza, on se moe puno direktnije ispitivati nego li kompleksan genom pilia ili genom neke druge animalne stanice. Takva ispitivanja konano su dovela do identifikacije specifinih gena virusa koji uzrokuju rak (onkogeni), i otkria analognih gena u normalnim stanicama svih vrsta kraljenjaka, ukljuujui ovjeka. Neki tipovi raka u ovjeka uzrokovani su virusima; drugi su pak rezultat mutacija normalnih staninih gena slinih onkogenu prvi puta identificiranom u RSV.

Prevencija i Lijeenje

Rak ljudi koji je izazvan virusima ukljuuje rak cerviksa i druge anogenitalne karcinome (papilloma virusi), karcinome jetre(hepatitis B i C virusi), i neke tipove limfoma (Epstein-Barr virus, i humani T-cell limphotrophic virus). Tumori inducirani tim virusima ine ukupno oko 20% incidencije raka u svijetu. U principu, ti bi se tumori mogli prevenirati vakcinacijom protiv odgovornih virusa. Razvojem efikasnih cjepiva protiv hepatitisa B uinjen je srazmjeran napredak u tom je podruju.

Ostali tumori ovjeka izazvani su mutacijama normalnih gena, veina kojih se deava tijekom ivota neke osobe, a rijee su tumori nasljedni. Istraivanja virusa koji uzrokuju rak dovela su do identifikacije mnogih gena odgovornih za tipove raka koji nisu izazvani virusima, i do razumijevanja molekularnih mehanizama odgovornih za razvoj raka. Glavni napori usmjereni su danas za primjenu tih spoznaja u molekularnoj i staninoj biologiji raka za razvoj novih pristupa lijeenju raka. Prvi dizajnirani efikasan lijek u tretmanu raka u ljudi (STI-571, opisan je u 15.poglavlju) razvijen je protiv gena vrlo slinog RSV onkogenu.

Literatura

Rous,P.1911. A sarcoma of the fowl transmissible by an agent separable from the tumor cells. J.Exp.Med.13:379-411.

Slika : Tumor iz kojeg je RSV izoliran.

Slika 1.1 Vremenska skala evolucije

Skala prikazuje priblino vrijeme za koje se smatra da su se upravo tada zbili neki od glavnih dogaaja u evoluciji stanica.

Sadanjost

0

1

Viestanini organizmi

2

Prolost u

milijardama

godina Prvi eukarioti

Oksidativni metabolizam

3 Fotosinteza

Prve stanice

4

4.6 Formiranje Zemlje

5

Slika 1.2 Spontano formiranje organskih molekula

Vodena para cirkulirala je kroz atmosferu koja je sadravala CH4, NH3, i H2 u kojoj je dolazilo do elektrinog pranjenja. Analize produkata reakcije otkrile su nastanak razliitih organskih molekula, ukljuujui aminokiseline alanin, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu i glicin.

Electrode

Electric discharge

Cooling

Water

Heat

Organic molecules

Alanine

Aspartic acid

Glutamic acid

Glycine

Urea

Lactic acid

Acetic acid

Formic acidElektroda

Elektrino izbijanje

Hlaenje

Voda

Zagrijavanje

Organske molekule

Alanin

Asparaginska kiselina

Glutaminska kiselina

Glicin

Urea

Mlijena kiselina

Octena kiselina

Mravlja kiselina

Slika 1.3 Samoumnoavanje RNA

Komplementarno sparivanje izmeu nukleotida (adenina (A) sa uracilom (U) i gvanina (G) sa citozinom (C)) omoguuje jednom lancu RNA da poslui kao kalup za sintezu novog lanca sa komplementarnom sekvencom.

Slika 1.4. Ograivanje samoumnoavajue RNA fosfolipidnom membranomSmatra se da su se prve stanice razvile ograivanjem samoumnoavajue RNA i pridruenih okolnih molekula membranom graenom od fosfolipida. Svaka fosfolipidna molekula ima dva duga hidrofobna repa vezana za hidrofilnu grupu. Hidrofobni repovi su ugraeni u lipidni dvosloj; hidrofilne glave su izloene vodi na obje strane membrane.

RNA

Phospholipid membrane

Water

Phospholipid molecule:

Hydrophilic head group

Hidrophobic tail

RNA

Fosfolipidna membrana

Voda

Fosfolipidna molekula:Hidrofilna glava

Hidrofobni rep

Slika 1.5 Stvaranje metabolike energije

Glikoliza je anaerobno cijepanje glukoze do mlijene kiseline. Fotosinteza koristi energiju suneve svjetlosti za sintezu glukoze iz CO2 i H2O, a pri tome se oslobaa O2 kao sporedni produkt. O2 osloboen fotosintezom koristi se u oksidativnom metabolizmu, u kojem se glukoza cijepa do CO2 i H2O oslobaajui mnogo vie energije nego to se dobije glikolizom.

Glikoliza

C6H12O6 -> 2C3H6O3 Nastaje 2ATP

Glukoza mlijena kiselina

Fotosinteza

6 CO2 + 6 H2O -> C6H12O6 + 6O2 Glukoza

Oksidativni metabolizam

C6H12O6 + 6O2 -> 6CO2 + 6H2O Nastaje 36-38 ATP

Glukoza

Slika 1.6 Elektronskomikroskopska slika E. coliStanica je obavijena staninom stijenkom ispod koje se nalazi plazma membrana. DNA je smjetena u nukleoidu. (Menge i Wurtz/Biozentrum, University of Basel/Science Photo Library/Photo Researches, Inc.)

Plasma membrane

Cell wall

NucleoidPlazma membrana

Stanina stijenka

Nukleoid

Slika 1.7 Strukture ivotinjskih i biljnih stanica

Obje stanice, i animalna i biljna, okruene su plazma membranom i sadre jezgru, citoskelet, i mnoge zajednike citoplazmatske organele. Biljne stanice su jo obavijene staninom stijenkom i sadre kloroplaste i velike vakuole.

Animalna stanica

Centriole

Mitochondrion

Nucleus

Nucleolus

Plasma membrane

Golgi apparatus

Ribosomes

Cytoskeleton

Lysosome

Smooth endoplasmic reticulum

Rough endoplasmic reticulumCentriol

Mitohondrij

Jezgra

Jezgrica

Plazma membrana

Golgijev aparat

Ribosomi

Citoskelet

Lizosom

Glatki endoplazmatski retikulum

Hrapavi endoplazmatski retikulum

Biljna stanica

Cytoskeleton

Peroxisome

Chloroplasts

Cell wall

Plasma membrane

Golgi apparatus

Nucleus

Nucleolus

Rough endoplasmic retikulum