5 JSLH-Diff 手順書(Standard Operation Procedure, SOP) · jslh 5diff. カクテル抗体試薬 (以下の内容)を使用する。 jslh. 抗体の内容：・ fitc. 標識cd16/cd3/cd56抗体

フローサイトメトリーによる白血球５分類算定法（JSLH-Diff 法）作成年月日：2017 年 10 月 17 日（第 1.0 版）

作成：日本検査血液学会標準化委員会血球計数標準化小委員会

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フローサイトメトリー法による

白血球 5 分類算定法（JSLH-Diff 法）

手順書(Standard Operation Procedure, SOP)

整合規格

CLSI 評価法：Validation, Verification, and Quality Assurance of Automated Hematology Analyzers; Approved Standard—Second Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, H26-A2 Vol.30 No.14, 2010. ICSH 評価法：ICSH guidelines for the evaluation of blood cell analysers including those used for differential leucocyte and reticulocyte counting, INTERNATIONAL COUNCIL FOR STANDARDIZATION IN HAEMATOLOGY, WRITING GROUP: C BRIGGS, N CULP, B DAVIS, G.D’ONOFRIO, G ZINI, S.J MACHIN, on behalf of the International Council for Standardization in Hematology (ICSH), International Journal of Laboratory Hematology 36: 613–627, 2014 JSLH 白血球分類参照法：Japanese Society for Laboratory Hematology flow cytometric reference method of determining the differential leukocyte count: external quality assurance using fresh blood sample, Y KAWAI ,Y.NAGAI ,E.OGAWA, H. KONDO on behalf of the the Standardization Subcommittee for Blood Cell Counting of the Japanese Society for Laboratory Hematology (JSLH), International Journal of Laboratory Hematology 39: 202–222, 2017

関連文献 CLSI 白血球分類参照法：Reference Leukocyte (WBC) Differential Count (Proportional) and Evaluation of Instrumental Methods; Approved Standard—Second Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, H20-A2 Vol.27 No.4. 2007 ICSH白血球分類参照法：Toward a Reference Method for Leukocyte Differential Counts in Blood: Comparison of Three Flow Cytometric Candidate Methods, Mikael Roussel,1* Bruce H. Davis,2 Thierry Fest,1,3,4 Brent L. Wood,5* on behalf of the International Council for Standardization in Hematology (ICSH), Cytometry Part A 81A: 973-982, 2012

改訂記録

版数作成日作成者変更内容変更理由等

第 1.0 版 2017/10/17 近藤弘新規作成



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1. 試薬の準備 1.1 JSLH 抗体（6color カクテル） JSLH 5Diff カクテル抗体試薬 (以下の内容)を使用する。

JSLH 抗体の内容：・FITC 標識 CD16/CD3/CD56 抗体・PE 標識 CD123 抗体

・PerCP 標識 HLA-DR 抗体・PE-Cy7 標識 CD14/CD33 抗体・Alexa Fluor647 標識 CD294 抗体・APC 標識 CD19 抗体・APC-H7 標識 CD45 抗体 1.2 溶血固定液 BD FACS Lysing Solution を蒸留水で 10 倍希釈して使用する（室温保存、用時調製）。

調製に使用する器具/試薬・目盛付きチューブ

・溶血固定液（BD FACS Lysing Solution、10％ホルムアルデヒド含有、BD バイオサイエンス社、 Cat.349202）

・蒸留水・シリンジ・0.20μm 滅菌フィルタ

操作 1）シリンジに 0.20μm 滅菌フィルタをセットし、蒸留水を濾過滅菌する。 2）溶血固定液：蒸留水＝1：9 になるように濾過した蒸留水を目盛付きチューブに分注する。 3）シリンジに 0.20μm 滅菌フィルタをセットし、溶血固定液を濾過滅菌する。 4）溶血固定液を必要量とり、2）の濾過した蒸留水が入った目盛付きチューブに加え、混和する。



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2. 測定試料の調製 2.1 使用する器具

・マイクロピペット A（エッペンドルフ）10-100µL ・マイクロピペット B（エッペンドルフ）100-1,000µL ・マイクロピペット用チップ（200μL 用、1mL 用）・Trucount チューブ（BD バイオサイエンス社,Cat.340334）・試験管立て・キムワイプ・ボルテックスミキサ

・タイマ・汎用フローサイトメータ（FCM）

2.2 試料調製に使用する試薬

・溶血固定液・JSLH 抗体 2.3 操作 1）EDTA-2K 加血液を使用し、採血後、4 時間以内に試料調製を開始する。 2）使用する JSLH 抗体を室温に 15 分以上放置し、室温に戻す。 3）Trucount チューブ内のステンレススチールリテーナ下にある小さな試薬（ビーズペレット）が球状になっていることを目

視により確認する。袋から取り出してから 1 時間以内に試料調製を終える。 4）マイクロピペット A に専用チップを装着し、チップ内壁を JSLH 抗体で 3 回馴染ませた後、20μL 採取し、フォワード法

で Trucount チューブに入れる。この時、Trucount チューブの底にあるビーズに抗体が触れないように、ステンレススチールリテーナ上部の管壁からフォワード法で入れ *2）、ビーズペレットが溶けていることを目視により確認する。

5）マイクロピペット A に専用のチップを装着し、リバース法 *3）で全血液を 50μL 採取し、チップの表面をキムワイプで綺麗に拭き取り、JSLH 抗体の入った Trucount チューブに入れる。チップの先がチューブに入っている抗体に触れないように注意する。

6）上記の試料をボルテックスで 1 秒間 3 回攪拌する。 7) 室温（18-22℃）、暗所にて 15 分間静置する（染色試料）。 8) マイクロピペット B専用チップを装着し、チップ内壁を溶血固定液で 3 回馴染ませた後、450μL採取し、フォワード法

で染色試料に加える。 9）上記の試料をボルテックスで 1 秒間 3 回攪拌する。

10）室温（18-22℃）、暗所にて 30 分間静置する（測定用試料）。



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3.測定 <BD FACSCanto II使用の場合> 機器調整に使用する試薬・BD Cytometer Setup & Tracking Beads Kit

(Diva ver.6.1.3 用 Cat.641319,642412, Diva ver.8.0.1 用 655050,655051) ・BD 7-Color Setup Beads (Cat.335775) 使用サンプル・全血を JSLH 抗体で染色し溶血、固定したサンプルを使用する。 3.1 機器調整方法 3.1.1 機器の立ち上げ

1）フローサイトメーターを起動させ、Diva ソフトウェア CST プログラムで機器の性能確認（精度管理）を行う。 2）Canto クリニカルソフトウェア、Setup プログラムで BD-7-color setup beads による蛍光検出器 PMT 電圧および蛍光補正値の設定を行う。 3）白血球 5 分類算定のための JSLH 法専用の Diva ソフトウェア Experiment Template を呼び出し用意する。

3.1.2 測定機器条件の設定

1）Experiment を開き、Cytometer Settings を右クリックし、Link Setup より『Lyse No Wash』を選択する。これにより、6 カラー解析用に最新の蛍光検出器 PMT 電圧および蛍光補正値が設定される。 2）Cytometer Settings をクリックしアクティブにし、Cytometer ウィンドウの Threshold タブを開き、Threshold

が APC-Cy7 か APC-H7 に設定されていることを確認し、値を“1,200”に設定する。 3) Cytometer Settings をクリックしアクティブにし、Cytometer ウィンドウの Parameter タブを開き、 FSC,SSC パ

ラメーターに、FSC-H, SSC-H が追加設定されていることを確認する。 4) FSC, SSC 検出器 PMT 電圧の調整：

溶血固定した全血サンプルを流し、リンパ球集団が FSC－H；50000-150000, SSC-A; 10- 50000 になるように FSC, SSC 検出器の PMT 電圧値を調整する。*3.2 ゲート設定の項【3】白血球プロットを参照し、

白血球全体がプロット内に表示されていることで感度確認する。（特に SSC A。必要に応じて微調整を行う。） 5) ストップカウント: 50,000 イベント（全イベント）にセットする。

3.2 測定用試料の測定

1) 測定用試料のチューブをボルテックスで撹拌した後、フローサイトメーターにセットする。 2) 注射器マークの左、＋マークをクリックし、下層の Tube アイコンを表示させ、チューブアイコンの左にあるポインタをクリッ

クして、緑（アクティブ）にする。 3) Acquisition Dashboard 内の Acquire Data ボタンをクリックし、測定を開始する。 4) 必要に応じて、Acquisition Dashboard 内の Threshold Rate が 2000 events/sec 以下になるよう、 Flow Rate （流速）を High か Medium に設定変更する。 5) イベント表示が安定したら、Record ボタンをクリックし、データの取り込みを行う。



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3.3 ゲート設定

【1】サイトグラムプロット【2】ビーズプロット【3】白血球プロット

【4】好中球・好酸球プロット【5】好酸球プロット【6】単球プロット

【7】好塩基球プロット【8】リンパ球ゲートプロット【9】T/NK・B リンパ球プロット

<JSLH 法用二次元プロット>



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1) FSC_H-SSC_A（サイトグラムプロット、Gate : All Events）で、デブリゲート（Debri）を設定する【1】。デブリゲートの FSC は、ビーズ分布（ 4μm 相当）の上限を目安としてリンパ球を含まないように、ゲート設定をする。『not』デブリゲートを設定する。 ※SSA-A パラメーターY 軸について、Bi Exponential 設定を行い、ゼロ以下のデブリを表示させデブリゲートの確認をするとよい。

2) CD3/16/56 FITC-CD123 PE（ビーズプロット、Gate : All Events）で、ビーズゲート（Beads）を設定する【2】。『not』ビーズゲートを設定する。

3) CD3/16/56 FITC-CD123 PE（ビーズプロット、Gate : All Events）で、死細胞等による非特異染色細胞ゲート（Non Specific Stain）を設定する【2】。『not』非特異染色細胞ゲートを設定する。以降、『not』ビーズゲート（Beads）と『not』デブリゲート（Debris）と『not』非特異染色細胞ゲート（Non Specific Stain）の『and』にて、二次元プロットを設定する【3】～【9】。

4) CD45 APC H7-SSC_A（白血球プロット、Gate : Not Beads AND Not Debris AND Non Specific Stain）で、白血球ゲート（CD45+ WBC）を設定する【3】。* CD45 ゲートは大きめに取り、最終的に好塩基球分布を確認し、CD45 ゲートの最適化を行う。以降、白血球ゲート（CD45+ WBC）にて二次元プロットを設定する【4】～【9】。

5) CD3/CD16/CD56 FITC-SSC-H（好中球/好酸球プロット、Gate : CD45+ WBC）で、CD16+/SSC high の集団に好

中球ゲート（Neut gate）、CD16dim/SSC high の集団に好酸球(一部好中球を含む)ゲート（Eos & Neut gate1）を設定する【4】。SSC 軸は “SSC-H”で設定する。好酸球(一部好中球を含む)ゲートラインの上限は、プロット上限を越えてはみ出るようにゲートをかける。

6) CD19/CD294 APC-SSC-H（好酸球プロット、Gate : CD45+ WBC）で、CD294+/SSC Very high の集団に好酸球ゲ

ート（Eos gate）を設定する【5】。SSC 軸 “SSC-H”で設定する。好酸球ゲートラインの上限は、プロット上限を越えてはみ出るようにゲートをかける。



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7) 好酸球(一部好中球を含む)ゲート（Eos & Neut gate1）と好酸球ゲート（Eos2gate）の『and』で、好酸球イベントとする【4】【5】。続けて、『not』好酸球イベントを作成する。

8) 好中球ゲート（Neut gate）と『not』好酸球イベントの『and』で、好中球イベントとする【4】。続けて『not』好中球ベントを作成

する。

9) CD14/CD33 PE Cy7-SSC_A（単球プロット、Gate : CD45+ WBC）で、CD14+ CD33+/SSC low の集団に単球ゲート（Mono gate）を設定する【6】。

10) HLA-DR PerCP -CD123 PE（好塩基球プロット、Gate : CD45+ WBC）で、HLA-DR-/CD123+の集団に好塩基球ゲ

ート（Baso）を設定し、好塩基球イベントとする【7】。好塩基球ゲートラインの下限（X軸）は、プロット下限を越えてはみ出るようにゲートをかける。『not』好塩基球イベントを設定する。 ※HLA-DR PerCP パラメーターX 軸について、Bi Exponential 設定を行い、ゼロ以下のデブリを表示させ CD123 PE 陽性細胞の確認をするとよい。HLA-DR+/CD123+の集団に形質細胞様樹状細胞ゲート（pDC）を設定し、樹状細胞イベントとする。

11) 8)の単球ゲート（Mono gate）and 『not』好中球ベント and 『not』好塩基球ゲートを単球イベントとする。『not』単球イ

ベントを作成する。

12) CD45 APC H7-SSC_A（リンパ球ゲートプロット、Gate : CD45+ WBC）で、リンパ球ゲート（P1）を設定する【8】。SSC は単球の半分ぐらいまで拡張し、CD45 APC Cy7 は好塩基球の 1/3 ぐらいまで拡張してゲート設定をする。P1 and 『not』単球イベント and 『not』好塩基球イベントのリンパ球ゲート（Lympho gate）を作成する【8】【7】【6】。

13) CD3/CD16/CD56 FITC-CD19/CD294 APC（T/NK,B リンパ球プロット、Gate : Lympho gate）で、CD19+/FITC-

の集団に B リンパ球ゲート（B cells）を設定する【9】。続けて、『not』B cells を作成する。【9】【8】。

14) リンパ球ゲート（Lympho gate） and 『not』B cells』を T/NK リンパ球イベントとする【9】【8】。

※検体ごとにゲート設定を行うときの注意検体ごとに二次元プロット上の各血球の分布状況が多少変化するので、検体ごとに全プロットのゲート設定の微調整を行う。微調整の詳細は以下のとおり。白血球プロット【3】

白血球ゲートは、not Debri になっているが、明らかにデブリスと判断できるイベントは CD45+WBC ゲートから外す。

好中球・好酸球プロット【4】好中球イベントおよび好酸球イベントが重なる時は、【4】を参考にして 2 つのゲートが重なっても構わないので、

取りこぼしがないようにゲートを設定する。9),10)で「and」および「not」の設定をしているため、2 つのゲートが重なってもそれぞれのイベント数は重複せずに表示される。

リンパ球ゲートプロット【8】リンパ球集団より大きめに取るようにして、単球集団および好塩基球集団にいるリンパ球などの取りこぼしがない

ようにゲートを設定する。12)で「and」および「not」の設定をしているため、単球および好塩基球に該当するイベントは重複せずにイベント数に表示される。



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4 測定 <BC Navios(8color, 10color モデル)使用の場合> 機器調整に使用する試薬・Flow-Check pro 標準粒子 (Cat. A63493) ・Flow-Set pro 標準粒子 (Cat. A63492) ・CytoComp cell キット (Cat. 6607023) ・QuickComp2 キット（CD45-FITC, CD45-PE）(Cat. 177018) ・CD45-APC (Cat.IM2473) ・Versacomp Antibody Capture Beads Kit (B22804) ・HLA-DR-PerCP (BD バイオサイエンス社, Cat.347364) ・CD14-PE-Cy7 (BD バイオサイエンス社, JSLH 抗体カクテル蛍光補正用パーツ番号；625339) ・CD45-APC-H7 (BD バイオサイエンス社, JSLH 抗体カクテル蛍光補正用パーツ番号；625340)

4.1 機器調整方法 4.1.1 機器設定用サンプルの調整

1) FCM 用チューブを 7 本準備（別途確認用に 2-3 で調整した JSLH 測定用試料 1 本も準備）。 2) それぞれのチューブを識別できるよう①～⑦まで番号を振る。 3) CYTO COMP CELL キットの青いキャップのバイアルの溶液を、黒いキャップのバイアルに全て添加する。沈殿物

が拡散するようによく攪拌し、15 分間放置する。 4) Quick COMP 試薬の CD45-FITC を FCM 用チューブ②へ、CD45-PE を FCM 用チューブ③へ、

HLA-DR-PerCP を④へ、CD14-PE-cy7 を FCM 用チューブ⑤へ、CD45-APC を FCM 用チューブ⑥へ、CD45-APC-H7 を⑦へ添加する(CD45-APC は 10μL、それ以外は 20μL を分注)。

5) ④(HLA-DR-PerCP)と⑤(CD14-PE-cy7)のチューブに Versacomp Antibody Capture Beads のpositive Beads を 1 滴（50μL）添加する。

6) 3）で調整した懸濁液を FCM 用チューブ②～⑦へ 100μL ずつ添加し、よく混和する。 7) 室温・暗所で 15 分間インキュベート。 8) FCM 用チューブ②～⑦に PBS を 1mL 添加する。 9) ①のチューブに混和した Flow SET PRO ビーズを 15 滴（500μL）添加する。 10) カルーセルに①～⑦の順でセットする。 11) 8 本目に JSLH 測定用試料をセットする。



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4.1.2 機器設定 I.パラメーターの設定 ①新規プロトコルを開く。 ②File から New-New Protocol を開く。 ③パラメータ選択

a) Cytometer Control アイコンをクリックして Cytometer Control を開く。 b)「Parameter」をクリック。

④下記のパラメータにチェックを入れて選択する。

FS Lin（Integral、Peak） SS Lin（Integral、Peak） FL1 Log (Integral) FL2 Log (Integral) FL4 Log (Integral) FL5 Log (Integral) FL6 Log (Integral) FL8 Log (Integral)

⑤「OK」をクリックしてプロトコルに名前をつけて保存する(例 5Diff Base)。 ⑥Cytometer Control の Maximum Events に 50000 を入力し、Flow Rate を High にしてから、Save Protocol

をクリックして上書き保存する。



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II.ADC用アプリケーションの作成

① Auto Setup Application Definition ウインドウを開く。 Tools > Auto Setup Application Definition

② Application Availability で All user(Common)あるいは Current user only のどちらかを選択し、Next をクリック

する（通常は All user を選択）。

③ Brows をクリックして Base Protocol を選択し、OPEN をクリックする。

④ Next をクリックし、フィルタ設定を確認してから、Next をクリックする。 ⑤ 必要があれば、各検出器の色素名を選択し、Next をクリックする。 ⑥ ターゲットチャンネルは変更せずに、そのまま Next をクリックする。

⑦ Application Name（5Diff-S など）を入力して、 Next をクリックする。(Setting プロトコル名も自動設定される）

ここで「5Diff Base」を選択。



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⑧ Create Verification Protocol にチェックを入れて、Next をクリック。

⑨ アプリケーションの内容を確認し、Finish をクリックすると、必要なプロトコルが自動作成され、フォルダに保存される。

⑩ Flow Set Pro ビーズ用のプロトコル（⑦で入力したアプリケーション名＋_STAND.pro）を呼び出す（例：5Diff-S_STAND.pro）。＊②で All users を選択した場合はプロトコルの Common(Acquisition)フォルダに、Current users only を選択した場合は使用中 User ID の Acquisition フォルダに作成されている。

⑪ 各リージョンを選択し、右クリックで Region Properties を選ぶ。



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⑫ 全てのリージョンで lower limit と upper limit に次の表の数値を入力し、OK をクリック。

⑬ Save Protocol をクリックして上書き保存する。

Flow-set pro ターゲット値

FS Pro 126 - 166 SS 313 - 393 FL1 24.3 – 44.3 FL2 90 - 140 FL4 48.9 – 68.9 FL5 1.62 – 3.62 FL6 1.26 – 2.26 FL8 20.2 – 30.2



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III.オートセッティングを使用した感度・蛍光補正の設定 ① Auto Setup Scheduler ウインドウを開く。 Tool -> Auto Setup Scheduler ② 目的のアプリケーションを選択し、使用するカローセルの No.を入力する。Schedule ボタンをクリックして、必要なプロトコルを

読み込む。

③ Carousel Load Report に示された順番でカローセルに各チューブをセットする。必要なら、Carousel Load Report を印刷する。

④ Close ボタンをクリックして Carousel Load Report ウインドウを閉じる。 ⑤ スタートボタンをクリックして測定を開始する。測定開始後すぐに AutoSetup ⅡWizard ウインドウの

Automatically approve steps where appropriate のチェックを外す。

⑥ Flow Set Pro チューブで自動感度調整が実行される。必要があれば各ピークがターゲットのリージョン範囲に入

るようにマニュアルで感度調整を行う。 ⑦ 測定終了後、Next をクリックすると、次のチューブの測定が開始される。

目的アプリケーショ

ンを選択

使用するカローセルの

No.を入力



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⑧ 蛍光補正用チューブ（チューブ②～⑦）では、測定終了後にゲート位置とヒストグラムのリージョン位置を確認し、必要に応じて修正してから next ボタンで次のチューブを測定する（図参照）。

ゲート位置：Cyto Comp cell の細胞集団をゲーティング Versacomp ビーズを添加したチューブ④(HLA-DR-PerCP)と⑤(CD14-PEcy7)はビーズ集団をゲーティングする。

リージョン位置：各チューブで染色した蛍光の陽性集団がリージョン内に入っていること。



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⑨ 8 本目の Verification チューブ（JSLH 調整試料）の測定が開始されたら、Discri を FL8 の 3 に変更してから、set up モードのチェックを外してデータ取得を行う。

⑩ 全てのチューブの測定が終了したら、Approve ボタンをクリックする。次の画面で Finish ボタンをクリックする。

⑪ Approve ボタンをクリックして、サイトセッティングを保存する。＊セッティングをやり直す必要がある場合は、Reject All をクリックする。この場合、サイトセッティングは保存されない。

＊次回以降、機器の感度設定と蛍光補正を再設定する場合は、「Ⅲ．オートセッティングを使用した感度・蛍光補正の設定」以降のみを実施する。



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IV.測定用プロトコルの作成 ① オートセッティングで保存されたセッティングファイル（アプリケーション名＋setting.pro）を呼び出す（プロット図

なし）。 ② 下記のプロット図を作成する。

FS PEAK vs SS INT, FL-1 vs SS INT, FL-2 vs SS INT, FL-4 vs SS INT, FL-5 vs SS INT, FL-6 vs SS INT, FL-8 vs SS INT

③ File -> Save Protocol as にて名前をつけて、プロトコルを別名保存する。 ④ 別名保存したプロトコルで JSLH 測定用試料を測定する。 ⑤ FL8/SS-INT プロット図にて Discr.の位置を確認し、CD45 陽性の白血球（特に好中球）が Discr.以下に

なっていないかを確認する。必要があれば、Discr.の位置を変更し、データ取得を行う。 ⑥ 4.2 ゲート設定の項【3】白血球プロットを参照し、白血球全体がプロット内に表示されていることで感度確認す

る。（特に SS INT。必要に応じて微調整を行う。）



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4.2 ゲート設定

【1】サイトグラムプロット【2】ビーズプロット【3】白血球プロット

【4】好中球・好酸球プロット【5】好酸球プロット【6】単球プロット

【7】好塩基球プロット【8】リンパ球ゲートプロット【9】T/NK・B リンパ球プロット



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1) JSLH 測定資料の測定結果（LMD）を Kaluza 解析ソフトで開く。 *kaluza ver1.5 以降を用いる場合は、プロットスケールがレガシーモードであることを確認する。

2) Edit―＞ Select all で全てのプロット図を選択し、Delete キーで削除する。 3) FS_PEAK vs SS INT（サイトグラムプロット、Gate : ungated）で、デブリゲート（Debri）を設定する【1】。デブリゲート

の FS はリンパ球を含まないように、ゲート設定をする。 4) CD3/CD16/CD56-FITC vs CD123-PE（ビーズプロット、Gate：ungated）で、ビーズゲート（Beads）と Non

Specific Stain ゲートを設定する【2】。 5) Boolean で、WBC plot ゲート[((Not Debri) AND (Not Beads)) AND (Not”Non Specific Stain)]を作成する。 6) CD45-APC H7 vs SS INT（白血球プロット、Gate：WBC plot）で白血球ゲート（CD45+ WBC）を設定する【3】。

* CD45 ゲートは大きめに取り、最終的に好塩基球分布を確認し、CD45 ゲートの最適化を行う。以降、白血球ゲート（CD45+ WBC）にて二次元プロットを設定する【4】～【8】。

7) CD3/CD16/CD56 FITC vs SS PEAK（好中球・好酸球プロット、Gate : CD45+ WBC）で、CD16+/SS high の

集団に好中球ゲート（Neut gate）、CD16dim/SS very high の集団に好酸球(一部好中球を含む)ゲート（Eos & Neut gate）を設定する【4】。SS 軸は “SS PEAK”で設定する。好酸球(一部好中球を含む)ゲートラインの上限は、プロットの線(SS PEAK 最大値)までゲートをかける。

8) CD19/CD294 APC vs SS PEAK（好酸球プロット、Gate : CD45+ WBC）で、CD294+/SS Very High の集団に好酸球ゲート（Eos gate）を設定する【5】。SS軸は、“SS PEAK”で設定する。好酸球ゲートラインの上限は、プロットの線(SS PEAK 最大値)までゲートをかける。

9) Boolean にて、好酸球(一部好中球を含む)ゲート（Eos & Neut gate）かつ好酸球ゲート（Eos gate）を、好酸球イベントとする(Eosi cells ：“Eos&Neut gate” and “Eos gate”)【4】【5】。続けて、「not」好酸球イベントを作成する（Not Eos：Not”Eosi cells”）。

10) 好中球ゲート（Neut gate）と not 好酸球イベントで、好中球イベントとする（Neut cells：”Neut gate” AND “”Not Eos”）。続けて「not」好中球ベントを作成する(Not Neut：NOT”Neut cells”)。

11) CD14/CD33 PE Cy7 vs SS INT（単球プロット、Gate : CD45+ WBC）で、CD14+ CD33+/SS low の集団に単球ゲート（Mono gate）を設定する【6】。

12) HLA-DR PerCP vs CD123 PE（好塩基球プロット、Gate : CD45+ WBC）で、HLA-DR-/CD123+の集団に好塩基球ゲート（Baso）を設定し、好塩基球イベントとする【7】。好塩基球ゲートラインの下限は線上までゲートをかける。not好塩基球イベント（Not Baso：NOT Baso）を設定する。※HLA-DR PerCP パラメータ X 軸について、Bi Exponential 設定(Logicle)を行い、ゼロ以下のデブリを表示させ CD123 PE 陽性細胞の確認をするとよい。HLA-DR+/CD123+の集団に形質細胞様樹状細胞ゲート（pDC）を設定し、形質細胞様樹状細胞イベントとする。

13) 11)の単球ゲート（Mono gate）と not 好中球ベントおよび not 好塩基球ゲートを単球イベントとする（Mono cells：("Mono gate" AND "Not Neut)" AND "Not Baso"）。not 単球イベント（Not Mono：NOT "Mono cells"）を作成する。

14) CD45 APC H7 vs SS INT（リンパ球ゲートプロット、Gate : CD45+ WBC）で、リンパ球ゲート（P1）を設定する【8】。SS は単球の半分ぐらいまで拡張し、CD45 APC H7 は好塩基球の 1/3 ぐらいまで拡張してゲート設定をする。P1 と not単球イベント、not 好塩基球イベントのリンパ球ゲート（Lympho gate：(P1 AND "Not Mono)" AND "Not Baso" )を作成する。

15) CD3/CD16/CD56 FITC vs CD19/CD294 APC（T/NK・B リンパ球プロット、Gate : Lympho gate）で、CD19+/FITC-の集団に B リンパ球ゲート（B cells）を設定する【9】。続けて、not B cells（Not B cells：NOT "B cells"）を作成する。

16) リンパ球ゲート（Lympho gate）と not B cells を T/NK リンパ球イベント（T/NK cells："Lympho gate" AND "Not B cells"）とする。

17) Plots&Table －＞ Gate Stastitics でゲート統計を表示する。Data －＞ Add All Gates で各ゲートの Numberを表示させる。



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※検体ごとにゲート設定を行うときの注意検体ごとに二次元プロット上の各血球の分布状況が多少変化するので、検体ごとに全プロットのゲート設定の微調整を行う。微調整の詳細は以下のとおり。白血球プロット【3】

白血球ゲートは、not Debri になっているが、明らかにデブリスと判断できるイベントは CD45+WBC ゲートから外す。

好中球・好酸球プロット【4】好中球イベントおよび好酸球イベントが重なる時は、【4】を参考にして 2 つのゲートが重なっても構わないので、

取りこぼしがないようにゲートを設定する。9),10)で「and」および「not」の設定をしているため、2 つのゲートが重なってもそれぞれのイベント数は重複せずに表示される。

リンパ球ゲートプロット【8】リンパ球集団より大きめに取るようにして、単球集団および好塩基球集団にいるリンパ球などの取りこぼしがない

ようにゲートを設定する。14)で「and」および「not」の設定をしているため、単球および好塩基球に該当するイベントは重複せずにイベント数に表示される。



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5. 白血球 5 分類百分率、絶対数および識別率の算出

1) 百分率

・ CD45+ WBC ゲート内のイベント数を用いて、各白血球（好中球 Neut cells、リンパ球 T/NK cells + B cells、単球 Mono cells、好酸球 Eosi cells、好塩基球 Baso、樹状細胞 DC）の百分率を算出する。

<計算式> 各白血球比率（％）＝各白血球イベント数 / CD45 陽性白血球イベント数【CD45+ WBC】 × 100 2) 絶対数

・白血球数＝CD45 陽性イベント数・各白血球（好中球 Neut cells、リンパ球 T/NK cells + B cells、単球 Mono cells、好酸球 Eosi cells、

好塩基球 Baso、樹状細胞 pDC）に対して、【2】ビーズプロットのビーズイベント数を用いて算出する。 <計算式> 各白血球数比率＝各白血球イベント数 / ビーズイベント数【Beads】

各白血球絶対数(/µL）＝各白血球数比率 × (Trucount Tube 記載ビーズカウント / 検体量 50(µL)) 3) 識別率

・ CD45+ WBC ゲート内のイベント数を用いて、各白血球（好中球 Neut cells、リンパ球 T/NK cells+B cells、単球Mono cells、好酸球Eosi cells、好塩基球Baso）の総和をCD45陽性細胞で割った値を、識別率として、定義する。・本法ではｐDCを参考値として提示していますが、このイベントはリンパ球として算定していますので、識別率にｐDCを加算する

必要はありません。また、ｍDC もリンパ球として算定していますので、補正をする必要はありません。・CD45+ WBC ゲート内のイベントで、白血球として識別されないイベントは、主に死細胞およびデブリス等となります。



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【留意事項】［正常白血球５分類以外の影響］

1. 健常人の末梢血液中に存在している正常白血球５分類以外に微量に含まれるものとしては、樹状細胞（形質細胞様樹状細胞 plasmacytoid dendritic cell ; pDC, 骨髄系樹状細胞 myeloid dendritic cell ;mDC）・造血幹細胞（CD34 陽性細胞）などが存在する。末梢血単核球における両細胞の比率は小さいが、白血球分類比率に若干の影響を与える可能性がある（a～c）。

a) 健常成人末梢血液中の樹状細胞出現率は 0.16-0.68％（mean±2SD；N=27）1)

b) 健常成人末梢血液中の形質様樹状細胞 pDC の出現率は 0.2～0.4％ 2),3)

c) 末梢血単核球における CD34 陽性細胞の出現率は 0.1～数%4)-6)

［正常白血球５分類以外の算定への影響］

2. 本法では樹状細胞および CD34 陽性細胞はリンパ球として算定される。また、pDC については、影響度合いの指標として、参考値を提供する。d)～e)を配慮して、必要に応じて正常白血球分類の値が妥当かどうかを判断する。

d) 本法では DC 分画のうち、CD123+HLA-DR+の pDC の検出が可能である。識別できていないイベントには、健常人の末梢血液中に存在している pDC ゲート外の樹状細胞、CD34 陽性細胞、死細胞およびデブリスなどが含まれる。

e) 樹状細胞および CD34 陽性細胞 4) （下図の黄色で示す領域）は、【8】リンパ球ゲートプロット（CD45/SSC プロット）では、リンパ球の CD45 発現強度より低めで、SSC はリンパ球と単球の間くらいに出現する。この領域は、P1 プロット内に含まれるため、【9】T/NK・B リンパ球プロットに展開される。従って、本法では両細胞はリンパ球として算定される。

【8】リンパ球ゲートプロット【9】T/NK・B リンパ球プロット

［識別率が低い場合には、死細胞およびデブリスの影響がある］

3. 本法で識別できていないイベントには、健常人の末梢血液中に存在している樹状細胞、造血幹細胞、死細胞およびデブリスなどが含まれる。識別率が低いと、死細胞およびデブリスが多かったり、ゲーティング不良、試薬不良および検体不良などが考えられるため、各白血球の百分率の合計が 99.0％以上であることを確認すること。



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［目視分類法との比較］

4. 本法はフローサイトメトリー法であることから、f)～h)を配慮して、目視分類法との比較をする必要がある。

f) ウェッジ法を採用していると、大型細胞が標本の引き終わりに分布してしまう傾向があり、フローサイトメトリー法の単球比率は、目視分類法よりも 10-20%高値を示す。これはフローサイトメーターを搭載している自動血球分析装置から得られる白血球分類値も含む 7),8)。

g) 目視分類法では smudge cells は百分率には入れずに算定しているため、本法と比較する場合には配慮する必要がある。

h) 本法では白血球絶対数の計測が可能だが国際標準測定操作法ではない。国際標準測定操作法は ICSH から公開されているが、一般の臨床検査室では実施困難な方法である 9)。

参考文献

1) Haller Hasskamp J, Zapas JL, Elias EG. Dendritic cell counts in the peripheral blood of healthy adults. Am J Hematol

2005;78:314–5.

2) Tavakoli S, Mederacke I, Herzog-Hauff S et al.Peripheral blood dendritic cells are phenotypically and functionally intact in chronic hepatitis B virus (HBV) infection. Clin Exp Immunol. 151(1):61-70, 2008

3) Nizzoli G, Krietsch J, Weick A et al.HumanCD1c+ dendritic cells secrete high levels of IL-12 and potently prime cytotoxic T-cell responses. Blood, 122(6): 932-42, 2013 Aug 8

4) Guidelines for CD34+ Cell Determination by Flow cytometry (JCCLS H3-A V2.0); Japanese Committee for Clinical Laboratory Standards ; JCCLS, Area Committee on Hematology, Subcommittee on Flow Cytometry, Journal of Japanese Committee for Clinical Laboratory Standards 32(1):51-74, 2017

5) Keeney M, Chin-Yee I, Weir K, et al.: Single platform flow cytometric absolute CD34+ cell counts based on the ISHAGE

guidelines. Cytometry. 34: 61-70, 1998

6) CLSI. Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry; Approved Guideline-2nd Edition. H42-A2. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2007

7) Reference Leukocyte (WBC) Differential Count (Proportional) and Evaluation of Instrumental Methods; Approved

Standard—Second Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, H20-A2 Vol.27 No.4. 2007

8) IJLH Japanese Society for Laboratory Hematology flow cytometric reference method of determining the differential leukocyte count: external quality assurance using fresh blood sample, Y KAWAI ,Y.NAGAI ,E.OGAWA, H. KONDO on behalf of the the Standardization Subcommittee for Blood Cell Counting of the Japanese Society for Laboratory Hematology (JSLH), International Journal of Laboratory Hematology 39: 202–222, 2017

9) ICSH guidelines for the evaluation of blood cell analysers including those used for differential leucocyte and reticulocyte counting: C BRIGGS, N CULP, B DAVIS, G.D’ONOFRIO, G ZINI, S.J MACHIN, on behalf of the International Council for Standardization in Hematology (ICSH), International Journal of Laboratory Hematology 36: 613–627, 2014



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6. 補足説明 *1）フォワード法

試薬の分注に使用します。分注する溶液を綺麗な容器（リザーバ）に入れます。 1．プッシュボタンを 1 段目まで押し下げます。 2．チップを分注液の液面から約 1cm 下まで浸し、プッシュボタンをゆっくり離します。チップを溶液か

ら引き上げ、容器の縁に先端を軽く触れて外側についた余分な溶液を除きます。 3．プッシュボタンを 1 段目まで静かに押し上げ、溶液を分注します。約 1 秒間後にプッシュボタンをさ

らに 2 段目まで押し下げ、チップの中を空にします。 1 2 3 4

*2）Trucount チューブ

ステンレススチールリテーナ抗体（ステンレススチール

リテーナ上部の管壁に入れる） Trucount ビーズ

*3）リバース法血液の分注（Trucount チューブ）に使用します。粘性の高い液体や泡立ちやすい液体、微量の分注に適しています。分注する溶液をきれいな容器（リザーバ）に入れます。

1．プッシュボタンを 2 段目まで押し下げます。 2．チップを分注液の液面から約 1cm 下まで浸し、プッシュボタンをゆっくりと離します、チップが溶液で満たされます。

チップを溶液から引き上げ、容器の縁に先端を軽く触れて外側についた余分な溶液を除きます。 3．プッシュボタンを 1 段目まで静かに押し下げ、設定した容量の溶液を分注します。プッシュボタンは、必ず 1 段目

までで止めてください。チップの中に少量の溶液が残りますが、これは分注しません。 4．チップ内の残った溶液を、廃棄するか元の容器に戻します。

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蛍光標識モノクローナル抗体

カクテル

540μL

50μL

暗所室温

（18℃～22℃）15min

フローサイトメトリー

スキャッタグラム

各白血球百分率(%)

絶対数(/μL)

Trucount Tubes

40μLJSLH抗体

EDTA加血液

90μL 溶血固定剤450μL

暗所室温

（18℃～22℃）30min

Trucount Tubes

[試料調製の手順]

20μL

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5 JSLH-Diff 手順書(Standard Operation Procedure, SOP) · jslh 5diff. カクテル抗体試薬 (以下の内容)を使用する。 jslh. 抗体の内容： ・ fitc. 標識cd16/cd3/cd56抗体

5 JSLH-Diff 手順書(Standard Operation Procedure, SOP) · jslh 5diff. カクテル抗体試薬 (以下の内容)を使用する。 jslh. 抗体の内容：・ fitc. 標識cd16/cd3/cd56抗体