ANALIZA MIARECZKOWA METODY MIARECZKOWE · • atomowa • emisyjna spektrometria • atomowa • kolorymetria • metody ekstrakcyjne • metody immunometrycznei enzymatyczne •

2014-12-10

1

METODY ANALITYCZNE METODY ANALITYCZNE STOSOWANE W ANALIZIE STOSOWANE W ANALIZIE

YWNOCIYWNOCI

KATARZYNA ZABOCKA-SOWISKA

KATEDRA I ZAKAD BROMATOLOGII I DIETETYKI

AKADEMIA MEDYCZNA WE WROCAWIU

METODY ANALITYCZNEMetody miareczkowe

alkacymetria (alkalimetria, acydymetria);

redoksymetria (r-kcjeutleniania lub redukcji);

miareczkowanie strceniowe;

kompleksometria; miareczkowanie

potencjometryczne;

Metody instrumentalne metody fizyczne oznaczanie gstoci oznaczanie lepkoci chromatografia spektrofotometria fluorymetria absorpcyjna spektrometria atomowa emisyjna spektrometria atomowa kolorymetria metody ekstrakcyjne metody immunometryczne i

enzymatyczne elektroforeza kapilarna

METODY METODY MIARECZKOWEMIARECZKOWE

ANALIZA MIARECZKOWA Dzia analizy ilociowej, ktrej podstaw jest miareczkowanie -

czynno polegajca na dodawaniu TITRANTA do r-ru zawierajcego jeden lub wicej oznaczanych skadnikw.

TITRANT = ROZTWR MIANOWANY roztwr zawierajcy reagent o znanym steniu.

PUNKT RWNOWANOCI MIARECZKOWANIA punkt, ktry odpowiada teoretycznie stechiometrycznemu przereagowaniu oznaczanego skadnika z dodawanym titrantem.

PUNKT KOCOWY MIARECZKOWANIA punkt, w ktrym wystpi odpowiednia zmiana, wiadczca o osigniciu lub nieznacznym przekroczeniu punktu rwnowanoci

PUNKT KOCOWY = PUNKT RWNOWANOCI

GRAFICZNY OBRAZ GRAFICZNY OBRAZ MIARECZKOWANIAMIARECZKOWANIA

ANALIZA MIARECZKOWAANALIZA MIARECZKOWAIdealna sytuacja:

PUNKT KOCOWY = PUNKT RWNOWANOCIBdy podczas miareczkowania:-bd ujemny-bd dodatni

Naley dy do tego, aby bd miareczkowania jest jak najmniejszy: 0,05 0,1%.Aby uzyska jak najmniejszy bd pomiaru stosuje si rne metodydetekcji, wybierajc najlepsz z nich.

METODY DETEKCJI:-wzrokowa-instrumentalna (potencjometria, konduktometria, miareczkowanieamperometryczne, miareczkowanie fotokolorymetryczne)

You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

http://www.novapdf.com

2014-12-10

2

PODZIA METOD MIARECZKOWYCH PODZIA METOD MIARECZKOWYCH

1. Ze wzgldu na typ reakcji

2. Ze wzgldu na sposb prowadzenia miareczkowania

M.BEZPOREDNIEUywany jest jeden roztwr mianowany - TITRANT

M.ODWROTNENadmiar TITRANTU odmiareczkowuje si innym, odpowiednio dobranym roztworem mianowanym

M.PODSTAWIENIOWEMiareczkuje si substancj bdc produktem reakcji skadnika oznaczanego z odczynnikiem(oznaczenia jodometryczne)

Oznaczanie liczby nadtlenkowejRO2 +2KJ + CH3COOH R-O + J2 + CH3COOK + H2O

J2 + 2Na2S2O4 2NaJ + Na2S4O6

PODZIA METODPODZIA METODZE WZGLDU NA ZE WZGLDU NA

TYP REAKCJITYP REAKCJI

ALKACYMETRIA ALKACYMETRIA METODA METODA ZOBOJTNIANIAZOBOJTNIANIA

Nazywana rwnie analiz objtociowMetoda miareczkowa polegajca na oznaczaniu

kwasw zasadami (alkalimetria) bd zasad kwasami (acydymetria).Metoda powszechnie stosowana do oznaczania

kwasw i zasad, zarwno organicznych jak i nieorganicznych.

ALKACYMETRIA ALKACYMETRIA METODA METODA ZOBOJTNIANIAZOBOJTNIANIA

W celu przeprowadzenia oznaczenia istotny jest pomiar wartoci pH, ktry monadokona nastpujcymi metodami:

-metoda wizualna wskaniki pH-metoda potencjometryczna pomiar potencjau elektrody

ALKACYMETRIA ALKACYMETRIA --PRZYKADYPRZYKADYBIAKA:

1. mineralizacja prbki w obecnoci st. H2SO4 i katalizatorw2. destylacja amoniaku z par wodn

3. miareczkowanie: 2NH4OH + H2SO4 (NH4 )2SO4+ 2H2O

H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 +H2O

ALKACYMETRIA ALKACYMETRIA PRZYKADY C.D.PRZYKADY C.D.

TUSZCZE- SAPONIFIKACJA - liczba zmydlenia (LZ)- liczba mg KOH, potrzebnych do zmydlenia zestryfikowanych i zobojtnienia wolnych kwasw tuszczowych, zawartych w 1 g tuszczu.

LZ = (a-b) 28,055 / ma obj. 0,5 M HCl potrzebna do zmiareczkowania lepej prby [cm3 ]b obj. 0,5 M HCl potrzebna do zmiareczkowania badanej prby [cm3

]28,055 ilo KOH obecna w 1 cm3 0,5 M r-ru KOHm- masa tuszczu



2014-12-10

3


- liczba kwasowa (LK)- wyraa ilo mg KOH, potrzebn do zobojtnienia wolnych kwasw tuszczowych zawartych w 1g tuszczu.

RCOOH + KOH RCOOK + H20LK = a 5,611/m

a - obj. 0,1 M KOH potrzebna do zmiareczkowania nawaki tuszczu [cm3 ]

5,611 - ilo KOH zawarta w 1 cm3 mianowanego r-ru [mg]

m- masa badanego tuszczu [g]


- na podstawie wartoci LZ i LK mona wyliczy liczbestrow (LE), czyli ilo mg KOH, potrzebn dozmydlenia zestryfikowanych kwasw tuszczowych,zawartych w 1 g tuszczu.

Liczba Estrowa = Liczba Zmydlania-Liczba Kwasowa


KWASY ORGANICZNE Kwasy organiczne odgrywaj znaczc rol w utrzymaniu jakoci i

wartoci odywczej rnych produktw spoywczych. Wyrnia si:

- kwasy naturalnie wystpujce w surowcach

- kwasy powstajce w procesach fermentacyjnych

- kwasy dodawane celowo do ywnoci jako substancje zakwaszajce, stabilizujce, konserwujce (kwas benzoesowy, sorbowy)

- kwasy powstajce w wyniku aktywnoci enzymw rodzimych lub drobnoustrojw prowadzcych do rozkadu tuszczw, w wyniku czego uwalniane s kwasy tuszczowe


Analiz kwasw organicznych obejmuj badania:- ich oglnej zawartoci poprzez wyznaczanie kwasowoci produktw spoywczych

- oznaczania iloci kwasu lub kwasw charakterystycznych dla danego produktu.

W badaniach kwasowoci wykonuje si oznaczenia kwasowoci aktywnej (czynnej) i potencjalnej (biernej). Dodatkowo wan pozycj zajmuje wyznaczanie kwasowoci lotnej.


Kwasowoaktywna

dotyczy jedynie jonw hydroniowych H3O+ i wyraana jestjako pH;

w gwnej mierze zaley od mocy kwasu obecnego wroztworze.

Odgrywa znaczc rol w charakterystyce produktwspoywczych, gdy:

-wskazuje na stopie zakwaszenia,-charakteryzuje jako i smak-pozwala oceni moliwo rozwoju niektrychdrobnoustrojw.

ALKACYMETRIA ALKACYMETRIA --PRZYKADY C.D.PRZYKADY C.D.

Kwasowo aktywn wyznacza siz udziaem metod:

-potencjometrycznych

-kolorymetrycznych - polegajcych na okreleniu pHprzy uyciu wskanikw kwasowo-zasadowych, tj. papierkwlakmusowych lub wskanikw jedno-, dwu- lub wielobarwnych,ktre zmieniaj barw przy rnych steniach pH. Metody te sjednak mao dokadne.



2014-12-10

4


Kwasowooglna = potencjalna = bierna

cakowite stenie w r-rze kwasowych atomw wodoru,wystpujcych zarwno w postaci zdysocjowanej jak iniezdysocjowanej, ktre w reakcji z zasadami ulegajzobojtnieniu. Jest ona jednakowa dla kwasw sabych imocnych, przy tym samym steniu molowym jonwwodorowych w r-rze.

ALKACYMETRIA PRZYKADY C.D.

Kwasowo ogln wyznacza si z udziaem metod:

-miareczkowania alkacymetrycznego wobec wskanikw (najczciej fenofloftaleiny)

-miareczkowania potencjometrycznego


KWASOWO LOTNA KWASOWO LOTNA - wynika z obecnoci w produktach spoywczych niskoczsteczkowych kwasw lotnych, takich jak kwasy: octowy, mrwkowy, masowy, propionowy. Poziom tych kwasw jest czsto wskanikiem prawidowo prowadzonego procesu technologicznego oraz skadowania produktw i surowcw.

Metoda: lotno kwasw jest cech powszechnie wykorzystywan przy ich oznaczaniu.

Etapy:- destylacja kwasw lotnych- miareczkowanie alkacymetryczne oddestylowanego kwasu

REDOKSYMETRIAREDOKSYMETRIA

Redoksymetria dzia analizy, wykorzystujcy metody reduktometryczne bd oksydometryczne.

Reduktometria miareczkowanie odbywa si czynnikiem redukujcym a substancja oznaczana musi by w postaci utlenionej.

Oksydymetria -miareczkowanie odbywa si czynnikiem utleniajcym a substancja oznaczana musi by w postaci zredukowanej.

REDOKSYMETRIA REDOKSYMETRIA PRZYKADYPRZYKADY

WGLOWODANY wrd metod chemicznych dominujc rol w oznaczaniu zawartoci wglowodanw w produktach spoywczych odgrywaj metody oparte na redukcji Cu2+ przez cukry redukujce, w rodowisku alkalicznym, w temp. wrzenia.

- metoda Fehlinga - opiera si na redukcji jonw miedzi (II) do miedzi (I) w obecnoci winianu sodowo-potasowego. Koniec miareczkowania rozpoznaje si po zaniku barwy niebieskiej.- metoda Lane-Eynona modyfikacja metody Fehlinga (pod koniec miareczkowania dodawany jest bkit metylenowy, bdcy wskanikiem oksydo-redukcyjnym).- metoda Nizowkina - Jemielianowej dodanie wskanika bkitu metylenowego w postaci rozpuszczonej w odczynniku Fehlinga I.-metoda Bertranda polega na przeprowadzeniu w roztworze alkalicznymredukcji soli miedzi cukrem i oznaczeniu miedzi w wydzielonym tlenku miedzi (I).Oznaczanie Cu polega na utlenieniu Cu2O w wyniku redukcji jonw Fe (III) do Fe(II) i oznaczeniu Fe (II) manganometrycznie

Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 2CuSO4 + FeSO4 + H2010 FeSO4 + KMnO4 +8H2SO4 5Fe(SO4)3 + K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O

REDOKSYMETRIA PRZYKADY C.D.

TUSZCZE-liczba nadtlenkowa (liczba cm3 0,002 M tiosiarczanu sodu potrzebnado redukcji jodu wydzielonego z KI przez nadtlenki obecne w 1 g tuszczu.)

RO2 + RCOOH + KJ RO + RCOOK + J2 +H20J2 + Na2S204 2NaJ + Na2S406

- liczba jodowa (liczba g wolnego jodu przyczona do wiza podwjnych 100 g tuszczu)

R-CH=CH-R + J2 R-CHJ-CHJ-RJ2 + Na2S2O3 2NaJ + Na2S4O6



2014-12-10

5

KOMPLEKSOMETRIA

KOMPLEKSOMETRIA tworzenie si trwaego, trudno dysocjujcego,rozpuszczalnego zwizku kompleksowego.

miareczkowanie chelatometryczne (miareczkowanie za pomocEDTA)

miareczkowanie niechelatometryczne (reakcja jonw rtciowychz jonami jodkowymi)

Hg2+ + 4Cl- HgCl2-4HgCl2-4 + Hg2+ 2HgCl2

Kompleksometryczne oznaczanie wapnia polega na miareczkowaniu r-rwzawierajcych kationy wapnia mianowanym r-rem EDTA (kwasetylenodwuaminoczterooctowy). Zalet tej metody jest moliwooznaczania oprcz wapnia rwnie magnezu w tym samym r-rzezmineralizowanej prbki.

MIARECZKOWANIE MIARECZKOWANIE STRCENIOWESTRCENIOWE

MIARECZKOWANIE STRCENIOWE PRECYPITOMETRIA wydzielanieoznaczanej substancji w postaci trudno rozpuszczalnego osadu przyuyciu mianowanego r-ru drugiej substancji.

Oznaczanie chlorkw:- metoda Mohra -miareczkowanie r-ru zawierajcego jony Cl- mianowanym

r-rem AgNO3 wobec CrO42- jako wskanika. Podczas miareczkowaniapocztkowo wytrca si chlorek srebra, a nastpnie chromian srebra(czerwonobrunatne zabarwienie)

- metoda Volharda wytrcenie jonw Cl- w rodowisku kwanym zapomoc nadmiaru dokadnie odmierzonej iloci AgNO3 iodmiareczkowaniu nadmiaru soli za pomoc SCN- w obecnociFe(NH4)(SO4)2 a do rowoczerwonego zabarwienia r-ru.

POTENCJOMETRIAPOTENCJOMETRIA Metody potencjometryczne pozwalaj na wyznaczenie

pH badanego roztworu poprzez pomiar SEM ogniwa, ktrego jednym pogniwem jest elektroda wskanikowa, a drugim elektroda porwnawcza o staej wartoci.

POTENCJOMETRIAPOTENCJOMETRIA Prawo Nernsta: SEM ogniwa zoonego z dwch elektrod

zanurzonych w badanym roztworze zaley od stenia odpowiednich jonw w nim zawartych.

Szerokie zastosowanie potencjometrii:-miareczkowanie alkacymetryczne-miareczkowanie redox-miareczkowanie strceniowe-oznaczanie kwasowoci produktw ywnociowych

MIARECZKOWANIE POTENCJOMETRYCZNE

Miareczkowanie potencjometryczne Analiz przeprowadza si dodajc maymi porcjami kwas lub zasad do roztworu badanego, umieszczonego na mieszadle magnetycznym. Jednoczenie przeprowadza si pomiar pH.

Jonoselektywne Elektrody Membranowe

MIARECZKOWANIE MIARECZKOWANIE POTENCJOMETRYCZNEPOTENCJOMETRYCZNE



2014-12-10

6

MIARECZKOWANIE MIARECZKOWANIE POTENCJOMETRYCZNEPOTENCJOMETRYCZNE

CECHY METOD POTENCJOMETRYCZNYCH: dua szybko oznaczenia brak konicznoci stosowania wskanikw PK prostota wykonania atwo automatyzacji moliwa daleko idca miniaturyzacja prostota aparatury szerokie zastosowanie w rnych rodzajach

miareczkowania moliwo dokonania pomiaru pH dua selektywno pomiarw przy zastosowaniu

membran jonoselektywnych

METODY METODY INSTRUMENTALNEINSTRUMENTALNE

METODY INSTRUMENTALNE

Metody instrumentalne metody, w ktrych sygnaanalityczny uzyskuje si za pomoc aparatury pomiarowej.

Wrd wielu dostpnych metod instrumentalnych, do analizyywnoci stosuje si najczciej:

-chromatografi

-metody spektroskopowe

CHROMATOGRAFIACHROMATOGRAFIAChromatografia fizyczny rozdzia skadnikw

jednorodnych mieszanin w wyniku ich podziaumidzy dwie fazy: ruchom i nieruchom ukaduchromatograficznego. Umoliwia analizjakociow i ilociow

CHROMATOGRAFIACHROMATOGRAFIA

Najbardziej rozpowszechnione metody:- chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

- chromatografia gazowa (GC)

- wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)

Wybr metody podyktowany jest przede wszystkim: rodzajem badanej ywnoci

rodzajem skadnikw poywienia, ktre s analizowane

wzgldami ekonomicznymi

CHROMATOGRAFIA CHROMATOGRAFIA POJCIA PODSTAWOWEPOJCIA PODSTAWOWE

Faza stacjonarna (nieruchoma) ciao stae bd ciecz osadzona na noniku, el.

Faza ruchoma, mobilna (eluent) ciecz, gaz lub ciecz, gaz w stanie nadkrytycznym (fluid), ktre kontaktujc si z faz stacjonarn powoduj migracj substancji rozdzielanej.

W ukadzie chromatograficznym musi by zagwarantowana odrbno faz (rnica polarnoci). Zazwyczaj faza silnie polarna jest faz stacjonarn a mniej polarna faz ruchom i przepywa przez faz stacjonarn.

Czas przebywania danego skadnika w kolumnie to CZAS RETENCJI



2014-12-10

7

PODZIA METOD PODZIA METOD CHROMATOGRAFICZNYCHCHROMATOGRAFICZNYCH

Ze wzgldu na zjawiska decydujce o procesie rozdziauwyrniamy:

Chromatografi adsorpcyjn- rozdzia mieszanin jest uwarunkowany rnym

powinowactwem adsorpcyjnym skadnikw mieszaniny doodpowiednio dobranej powierzchni fazy stacjonarnej

Chromatografi podziaow- rozdzia mieszanin oparty na rnicach w wartociach

wspczynnika podziau midzy dwie nie mieszajce si fazy (ciecz na noniku ciecz, fluid, gaz)

PODZIA METOD PODZIA METOD CHROMATOGRAFICZNYCHCHROMATOGRAFICZNYCH

Chromatografi jonowymienn:- podstaw rozdzielania stanowi reakcje wymiany jonowej midzy

jonami z roztworu a jonami zwizanymi z faz stacjonarn -jonitami. Jonity to wielkoczsteczkowe substancjenierozpuszczalne w wodzie zdolne do wymiany jonw.

Chromatografi sitow (elow)- o rozdziale substancji decyduj rozmiary czstek. Wypenienie

kolumn stanowi ele o rednicach porw zblionych dorozmiarw czsteczek analizowanych substancji. Substancjerozdzielane o rozmiarach czsteczek wikszych od rednicy porwwypenienia przechodz do eluatu, czsteczki o mniejszychrozmiarach wnikaj w pory elu i wolniej przesuwaj si wzdukolumny.

PODZIA PODZIA CHROMATOGRAFICZNYCH CHROMATOGRAFICZNYCH

METOD ROZDZIELANIAMETOD ROZDZIELANIAFAZA STACJONARNA FAZA CIEKA FAZA STAA

ZASADA ROZDZIAU PODZIA ADSORPCJA

FAZA RUCHOMA

GAZOWAChromatografia

gazowa

Chromatografia gazowa podziaowa

Chromatografia gazowa adsorpcyjna

CIEKAChromatografia

cieczowa

Chromatografia cieczowa

podziaowa

Chromatografiacieczowa

adsorpcyjna

SCHEMAT CHROMATOGRAFU GAZOWEGO

WYNIK ANALIZY WYNIK ANALIZY --CHROMATOGRAMCHROMATOGRAM

OPRACOWANIE WYNIKWOPRACOWANIE WYNIKW

podstaw analizy jakociowej, czyli identyfikacjipikw odpowiadajcych poszczeglnym skadnikomprbki, s wielkoci retencyjne

porwnuje si czas retencji piku identyfikowanejsubstancji z czasem retencji piku wzorca,chromatografowanych w jednakowych warunkach



2014-12-10

8

OPRACOWANIE WYNIKW OPRACOWANIE WYNIKW ANALIZA ILOCIOWAANALIZA ILOCIOWA

metoda wzorca zewntrznego metoda krzywej kalibracyjnej -przygotowuje si roztwory kalibracyjne, tzn. roztworysubstancji oznaczanej albo mieszaniny analizowanychsubstancji w kilku rnych steniach

na podstawie powierzchni lub wysokoci pikw wyznacza siprzebieg krzywej kalibracyjnej, bd oblicza si wartociwspczynnikw w rwnaniu kalibracyjnym dla kadej zoznaczanych substancji


metoda wzorca wewntrznego -polegajca na dodaniu do prbki znanej iloci skadnika, tzw. wzorca wewntrznego (IST), ktry jest jednak inny od substancji oznaczanych i nie moe by obecny w analizowanych prbkach przed jego dodaniem.

wykrela si zaleno stenia analitu w funkcji stosunku powierzchni piku analitu do piku wzorca wewntrznego

WADY I ZALETY METODY WADY I ZALETY METODY WZORCA WEWNTRZNEGOWZORCA WEWNTRZNEGO

pozwala na skorygowanie strat w przypadku zoonej, wieloetapowej procedury przygotowania (izolacja, wzbogacanie, derywatyzacja itp.)

uniezalenienie otrzymywanych wynikw od waha iloci dozowanej prbki.

bogata matryca -trudny dobr odpowiedniej substancji jako wzorca wewntrznego.

metoda nieco bardziej pracochonna ni metoda krzywej kalibracyjnej.

METODA DODATKU METODA DODATKU WZORCA WEWNTRZNEGOWZORCA WEWNTRZNEGO

Zastosowanie maj zwizki, ktre przypominaj badane anality w jak najwikszym stopniu idodaj je do prbki przed jej obrbk lub przygotowaniem do analizy. Wzorzec wewntrznypowinien charakteryzowa si waciwociami chemicznymi, chromatograficznymi iwidmami, zblionymi do waciwoci analitu, a ponadto wzorzec powinien by oddzielonyod badanego analitu.

Wzorzec wewntrzny powinien charakteryzowa si znan chemiczn struktur, bydostpny o wysokiej czystoci.

Idealny standard wewntrzny jest np. izotopem analitu, ktry bdzie koeluowa z analitemale bdzie mona go rozdzieli metod MS lub alternatywn metod tak jak detekcjaradiometryczna. Poniewa ukad detekcji przy zastosowaniu UV, fotodiod, jest najczciejstosowany w HPLC, izotopy nie wystarczaj. Dlatego te, uytkownik musi wybraodpowiedni analit, ktrego struktura rni si nieznacznie ale jest podobna do waciwocichromatograficznych i zwizanych ze zwrotem.

We metodzie wzorca wewntrznego ksztat i symetria piku powinny by zblione do tych

parametrw, ktre charakteryzuj analit. Stenie wzorca dodanego do prbki powinno byzblione do stenia analitu.


metoda dodatku wzorca - dodanie do prbki znanych iloci(najkorzystniej znanej masy) analitw

na podstawie uzyskanych chromatogramw, wykrela sikrzyw kalibracyjn, tj. zaleno powierzchni piku analitu wfunkcji iloci analitu dodanej do prbki

umoliwia wykonanie kalibracji w matrycy rzeczywistej

CHROMATOGRAFIA CHROMATOGRAFIA GAZOWA GAZOWA -- PRZYKADYPRZYKADY

oznaczanie zawartoci kwasw tuszczowychwyekstrahowany tuszcz poddaje si hydroliziezasadowej, a nastpnie uwolnione kwasyprzeprowadza si w estry metylowe.

oznaczanie fitosteroli



2014-12-10

9

CHROMATOGRAFIA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA CIECZOWA -- PRZYKADYPRZYKADY

szeroki zakres i uniwersalno tej techniki analitycznej podstawowy warunek - istnienie rozpuszczalnika dla

analizowanej substancji

Przykady: rozdzielanie i detekcja chlorofilu metod HPLC moliwo rozdzielania peptydw i biaek zastosowanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej

w analizie witamin

CHROMATOGRAFIA CHROMATOGRAFIA PRZYKADY C.D.PRZYKADY C.D. Oznaczanie cukrowcw metod chromatografii bibuowej i

cienkowarstwowej - umoliwia identyfikacj wikszoci cukrw prostych i ich pochodnych

Oznaczanie biaek metod chromatografii bibuowej dwukierunkowej, cienkowarstwowej, chromatografii jonowymiennej.

Oznaczanie karotenoidw metod chromatografii kolumnowej Oczyszczanie ekstraktw tiaminy za pomoc chromatografii na

kolumnie kationitowej. Tiamina ulega sorpcji na kolumnie, a aniony i zwizki niezdysocjowane usuwane s przez przemywanie wod.

Oczyszczanie pirydoksyny i oznaczanie poszczeglnych jej form.Oczyszczanie polega na rozdziale chromatograficznym hydrolizatw w kolumnie jonowymiennej.

ZJAWISKA OPTYCZNE ZJAWISKA OPTYCZNE --ABSORPCJOMETRIAABSORPCJOMETRIA

Dzia analizy chemicznej, w ktrym jako podstaw ilociowegooznaczania substancji w roztworze wykorzystywana jest zalenomidzy wartoci absorpcji fali elektromagnetycznej o okrelonejdugoci a steniem zawartej w tym roztworze substancji.

Absorpcjometria nazywana jest rwnie spektrofotometriabsorpcyjn.

PROMIENIOWANIE PROMIENIOWANIE ELEKTROMAGNETYCZNEELEKTROMAGNETYCZNE

Zakres dugoci fal wiata widzialnego

Zakres dugoci fal promieniowania elektromagnetycznego

PRAWA ABSORPCJIPRAWA ABSORPCJI Jeeli na warstw jednorodnego ciaa pada wizka wiata jednobarwnego o

nateniu (I0), to pewna cz tego wiata zostanie odbita (Ir), cz ulegnie absorpcji (Ia), a reszta zostanie przepuszczona (It).

I0 = Ir + Ia + It W przypadku r-rw wodnych odbicie wiata jest bardzo mae i dlatego mona

je pomin.I0 = Ia + It

Transmitancja= przepuszczalno okrela jaka cz wiata, wyraona wprocentach, zostaa przepuszczona przez r-r.

T = ItIo

Absorbancja = gsto optyczna = ekstynkcja wartoci okrelajce zdolnopochaniania wiata przez badany r-r.

A = log 1T = log IoIt

PRAWO ABSORPCJIPRAWO ABSORPCJI

prawo Lamberta-BeeraA = lc

wspczynnik absorpcjil dugo drogi optycznej (grubo warstwyroztworu)c stenie analitu



2014-12-10

10

PODZIA METOD PODZIA METOD ABSORPCJOMETRYCZNYCABSORPCJOMETRYCZNYC

HH podzia metod absorpcjometrycznych:-w nadfiolecie (UV)

-w wietle widzialnym (VIS)

-w podczerwieni (IR)

-w dalekiej podczerwieni (FIR)

-Ramana (LRS)

Brak wikszych rnic teoretycznych i aparaturowych

SPEKTROFOTOMETRIA SPEKTROFOTOMETRIA ABSORPCYJNAABSORPCYJNA

metody spektroskopowe - oddziaywanie promieniowaniaelektromagnetycznego z materi

najstarsza technika instrumentalna wraz z metodami chromatogaficznymi najczciej

wykorzystywana znalazy zastosowanie w oznaczaniu wikszoci skadnikw

ywnoci, przede wszystkim jako techniki spektrofotometryczne,wykorzystujce wiato widzialne, nadfioletowe i podczerwone

APARATURA POMIAROWA APARATURA POMIAROWA --SPEKTROFOTOMETRSPEKTROFOTOMETR

Budowa spektrofotometru UV-Vis:-rdo promieniowania lampy spektralne, lasery, lampy arowe-monochromator (siatka dyfrakcyjna, pryzmat, kolimator)-komory pomiarowe kuwety kwarcowe, szklane, zbudowane z krysztaw NaCl, KBr, CsBr,

polietylen (15-300 m)-detektory zamiana energii docierajcego do nich promieniowania elektromagnetycznego na

sygna elektryczny (fotokomrki, fotopowielacze, fotodiody najczciej krzemowe)Spektrofotometry IR:- wkno Nersta- sztucznie wyhodowane krysztay jonowe np. NaCl

SCHEMAT SCHEMAT PRZEPROWADZANIA PRZEPROWADZANIA

POMIARW POMIARW nastawienie aparatu na wymagan dugo fali przepuszczenie wizki wiata monochromatycznego przez

kuwet zawierajc roztwr porwnawczy bd prb lep

przeczenie na absorbcj rwn zero (wyzerowanie aparatu) odczyt absorbcji roztworu badanego w identycznej kuwecie odczyt stenia z krzywej wzorcowej (zaleno absorbancji w

funkcji stenia)

KRZYWA ZALENOCI KRZYWA ZALENOCI WARTOCI WARTOCI ABSORBANCJIABSORBANCJI

OD STENIAOD STENIAKrzywe kalibracyjne

SPEKTROFOTOMETRY SPEKTROFOTOMETRY --PRZYKADYPRZYKADY



2014-12-10

11

SPEKTROFOTOMETRIA W SPEKTROFOTOMETRIA W ZAKRESIE WIATA ZAKRESIE WIATA

WIDZIALNEGOWIDZIALNEGO

technika pomiarowa, ktrej zadaniem jest ilociowy opis barwy poprzez pomiar zespou parametrw wyznaczajcych j jednoznacznie w przyjtym umownie ukadzie barw.

aparaty do pomiaru barwy:

-spektrokolorymetr (pryzmat, siatka dyfrakcyjna)

-kolorymetry (filtry wietlne)

BARWA A STRUKTURA BARWA A STRUKTURA CZSTECZKICZSTECZKI

barwa ciaa wiadczy o tym, e pochania ono promieniowanie z zakresuwidzialnego w sposb selektywny

zabarwienie obserwowane jest dopenieniem barwy promieniowaniaabsorbowanego

substancje bezbarwne - reakcja chemiczna BARWNA POCHODNA ODCZYNNIK BARWICY: reaguje tylko z badan substancj nie wchodzi w reakcj z adn inn substancj obecn w roztworze.

POWSTAA BARWA POWINNA BY: trwaa, niewraliwa na wiato, niepodatna na zmiany pH, niezalena od zmian temperatury i nadmiaru odczynnika barwicego.

STRUKTURA A BARWA STRUKTURA A BARWA CZSTECZKICZSTECZKI

CZYNNIKI WPYWAJCE NA ABSORPCJ PROMIENIOWANIA WZAKRESIE WIDZIALNYM I NADFIOLECIE:

liczba i rozmieszczenie elektronw w czsteczce lub jonie;

substancje nieorganiczne absorpcja - nie zapeniona powoka elektronowajest ekranowana inn trwa powok, utworzon najczciej przez wizaniakoordynacyjne z innymi atomami;

zabarwienie wykazuje wikszo zwizkwmetali przejciowych.

zwizki organiczne: niedobr elektronw i deformacja struktury elektronowejczsteczki; jedno podwjne wizanie - absorpcja w dalekim nadfiolecie.

im wicej wiza podwjnych lub potrjnych wiza sprzonych posiadaczsteczka tym bardziej maximum absorbcji przesunite jest w kierunku falduszych.

SPEKTROFOTOMETRIA SPEKTROFOTOMETRIA --PRZYKADYPRZYKADY OZNACZANIE CUKROWCW:OZNACZANIE CUKROWCW:

-metoda antronowa przeprowadzenie pentoz w furfural, a heksoz w 5 hydroksymetylofurfural, dugo fali 620 nm-metoda rezorcynowa suy do oznaczania ketocukrw -produkty reakcji wraz z rezorcyn tworz barwny kompleksy; dugo fali 520 nm - ketoheksozy, a 620 nm - ketopentozy-metoda elazicyjankowa - aldocukry w rodowisku zasadowym redukuj heksacyjanoelazian (III) do heksacyjanoelazianu (II), ktry z jonami elaza (III) tworz bkit pruski; dugo fali 690 nm.

SPEKTROFOTOMETRIA SPEKTROFOTOMETRIA --PRZYKADYPRZYKADY OZNACZANIE BIAEK :

-metoda biuretowa polega na powstaniu barwnych kompleksw w wyniku utworzenia si wiza koordynacyjnych midzy jonami Cu2+ i atomami azotu POMIAR ABSORBANCJI 540 nm

- w zakresie nadfioletu (dugo fali: 260-290 nm): aminokwasy aromatyczne

SPEKTROFOTOMETRIA SPEKTROFOTOMETRIA --PRZYKADYPRZYKADYspektrofotometryczne oznaczanie obok siebie witamin A i D zzastosowaniem odczynnika Carr-Pricea, tworzcego z witaminami barwnezwizki. Absorpcj witamin mierzy si przy dugoci fali, odpowiednio: 618nm i 500 nm

oznaczanie zawartoci alkoholu etylowego - pozwala na oznaczanieetanolu w obecnoci innych zwizkw: aldehydw, ketonw, estrw ikwasw organicznych. Zawarto alkoholu w roztworach wodnych nie moeprzekracza 0,05%. Reakcja barwna z uyciem roztworu azotanu cerowo-amonowego , d. fali 475-487 nm.

oznaczanie kwasw lotnych - reakcja barwna z roztworem azotanulantanu, d. fali 600 nm.



2014-12-10

12

METODY IMMUNOMETRYCZNE I ENZYMATYCZNE

metody immunometryczne pozwalaj na odrnienie i oznaczenieilociowe biaek o bardzo podobnej budowie z zastosowaniem przeciwciaawobec danego biaka.

-umoliwiaj rozrnienie biaek rnicych si tylko 1 reszt aminokwasow-okrelenie iloci biaka mniejszej ni 1 ngprzykad: ocena immunoreaktywnoci frakcji gliadyn

ELISA metoda immunoenzymatyczna oznaczania biaek

-oznaczanie zawartoci kwasu askorbinowego metoda enzymatyczna zuyciem

-oznaczanie zawaoksydazy askorbinianowejrtoci glukozy i fruktozy metodaenzymatyczna z uyciem oksydazy glukozowej i dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej

przeciwciao antygen przeciwciaa znakowane enzymem

substrat dla enzymu barwna reakcja

SPEKTROFOTOMETRYCZNY POMIAR NATENIA BARWY

ELISAELISA

FLUORYMETRIA FLUORYMETRIA PODSTAWY TEORETYCZNEPODSTAWY TEORETYCZNE podczas pochaniania kwantu wiata nastpuje przejcie elektronu

ze stanu podstawowego w stan wzbudzony

elektron w stanie wzbudzonym przebywa krtko, po czym powracado stanu podstawowego

emisja bezpromienista, lub emisja promieniowania (fluorescencjalub fosforescencja).

fluorescencja zanikanatychmiast poprzerwaniu wzbudzenia,

fosforescencja trwa zajeszcze przez pewien czas.

FLUORYMETRIA FLUORYMETRIA PODSTAWY PODSTAWY TEORETYCZNE C.D.TEORETYCZNE C.D.

widma fluorescencyjne - substancja absorbujca w nadfiolecie lub krtkofalowej czci widma widzialnego. zwizki organiczne o wizaniach podwjnych,

potrjnych, sprzonych itp. czynniki wpywajce na natenie fluorescencji:

- temperatura, - pH, - rodzaj rozpuszczalnika, - dodatek obcego skadnika

APARATURAAPARATURA

aparaty suce do pomiarw fluorymetrycznych:1. wizualne absorpcjometr Pulfricha z przystawk do bada

fluorymetrycznych2. fotoelektryczne wyposaone w rdo wiata nadfioletowego

i dwa filtry:- korygujcy promieniowanie wzbudzajce- korygujcy promieniowanie emitowane3. spektrofluorymetry odpowiedniki spektrofotometrw, suce

do precyzyjnych pomiarw fluorymetrycznych.

FLUORYMETRIA FLUORYMETRIA --PRZYKADYPRZYKADY

oznaczanie uwolnionej, wyekstrahowanej i oczyszczonej tiaminy metodamifluorescencyjnymi po utlenieniu jej do tiochromu ( w UV niebieska fluorescencja przydugoci fali 365 nm)

oznaczanie ryboflawiny (tozielona fluorescencja przy pH = 7 i dugoci fali 430-450 nm) metoda lumiflawinowa oznaczania ryboflawiny: przeprowadzenie nierozpuszczalnej w

chloroformie ryboflawiny w rozpuszczaln lumiflawin i pomiar niebieskiej fluorescencji oznaczenie kwasu L-askorbinowego: utlenienie do L-dehydroaskorbinowego i

przyprowadzenie reakcji z o-fenylenodiamin, w wyniku ktrej powstaje fluoryzujcykompleks.

zastosowanie fluorescencji do analizy olejw rolinnych:-tokochromanole (tokotrienole, tokoferole)-barwniki chlorofilowe-zwizki fenolowe zastosowanie fluorescencji w metodach aktywnoci przeciwutleniajcej (ORAC, TRAP)



2014-12-10

13

ASA ASA ATOMOWA ATOMOWA SPEKTROMETRIA SPEKTROMETRIA ABSORPCYJNA ABSORPCYJNA --

PODSTAWY TEORETYCZNEPODSTAWY TEORETYCZNE w metodzie absorpcji atomowej mierzy si ilo wiata

zaabsorbowanego przy danej dugoci fali w czasie przejciaprzez chmur atomw

na podstawie pomiarw iloci zaabsorbowanegopromieniowania, mona prowadzi ilociowe oznaczanie wprbce analitu

odpowiednie rdo wiata oraz prawidowa dugoci falipozwalaj na selektywne oznaczanie zawartoci danegopierwiastka w obecnoci innych atomw

ASA ASA PODSTAWY PODSTAWY TEORETYCZNETEORETYCZNE

stan podstawowy stan atomu charakteryzujcy si najmniejsz energi dlapodstawowej konfiguracji elektronw

stan wzbudzony dostarczenie do atomu odpowiedniej, charakterystycznej dlaniego energii powoduje przeniesienie elektronu walencyjnego do poziomu owyszej energii

spektrometria - oddziaywanie promieniowania elektromagnetycznego zzakresu bliskiego nadfioletu i wiata widzialnego (190 700 nm) z materi;

materi t s atomy (nie czsteczki i nie jony) std atomowa; a ze wzgldu na to, e sygnaem analitycznym jest osabienie mierzonego

natenia promieniowania na skutek absorpcji absorpcyjna.

APARATURAAPARATURAPodstawowy spektrometr absorpcji atomowej skada si z trzech niezbdnych elementw:

rdo promieniowania atomizer ukad pomiarowy

rdo promieniowania: lampy z katod wnkow. S to lampy pozwalajce na emisj widma atomowego wybranego atomu. Dla niektrych pierwiastkw nie mona stworzy lampy HCL, wtedy stosuje si bezelektrodow lamp wyadowcz EDL. atomizer: element sucy do otrzymywania wolnych atomw oznaczanego pierwiastka: pomie, piec grafitowy, technika generowania wodorkw i zimnych par, technika ICP.ukad pomiarowy: monochromator, fotopowielacz.

*

METODY WPROWADZANIA METODY WPROWADZANIA PRBEKPRBEK absorpcja atomowa z atomizacj w pomieniu

oznaczenia na poziomie mg/l mona prowadzi dla wikszoci znanych pierwiastkw

METODY WPROWADZANIA METODY WPROWADZANIA PRBEKPRBEK oznaczanie rtci metod zimnych paratomy Hg mog wystpowa w stanie podstawowym w

temperaturze pokojowej

rt obecna w prbce jest redukowana do stanu podstawowego za pomoc silnych reduktorw: SnCl2, NaBH4

reakcja zachodzi w naczyniu zamknitym

lotne atomy rtci s wymywane strumieniem gazu do komory pomiarowej

METODY WPROWADZANIA METODY WPROWADZANIA PRBEKPRBEK technika generowania wodorkwprzypomina w duym stopniu technik generowania zimnych

par rtcireduktorem stosowanym do redukcji prbek jest NaBH4produktem reakcji reakcji s lotne w temperaturze pokojowej

wodorkiwolne atomy analitu uzyskuje si w wyniku dysocjacji

wodorkw w wysokiej temperaturze pierwiastki tworzce wodorki:As, Bi, Ge, Pb, Sb, Se, Sn, Te



2014-12-10

14

METODY WPROWADZANIA METODY WPROWADZANIA PRBEKPRBEK

atomizacja w piecu grafitowym

Kuweta grafitowa

METODY WPROWADZANIA METODY WPROWADZANIA PRBEKPRBEK

atomizacja w piecu grafitowym:oznaczanie na poziomie ng/l

dua czuo oznacze;

wysoka automatyzacja oznacze;

szerokie zastosowanie - moliwo oznaczenia wikszoci pierwiastkw w rnego rodzaju prbach;

POMIENIOWA EMISYJNA SPEKTROMETRIA ATOMOWA

(FAES) wykorzystuje si zjawisko emisji linii widmowych przez wzbudzone w pomieniu palnika atomy zalety:

- krtki czas analiz;

- atwy, bezporedni pomiar;

- stosunkowo niski koszt aparatury.

wady:

- ograniczone zastosowanie nadaje si tylko do analizy pierwiastkw o niskim potencjale wzbudzenia (g. litowcw, berylowcw);

- metoda oznaczania pojedynczych pierwiastkw;

- odchylenie od prostoliniowej zalenoci.

ELEKTROFOREZA ELEKTROFOREZA KAPILARNAKAPILARNA ELEKTROFOREZA zjawisko migracji czstek obdarzonych

adunkiem w polu elektrycznym w kierunku elektrody oprzeciwnym znaku.

rozdzia analitw - wewntrz kwarcowej kapilary orednicy kilku m, wypenionej elektrolitem ookrelonym pH, gdzie pod wpywem przyoonegonapicia anality poruszaj si z rn prdkoci.

TEMPO WDRWKI SUBSTANCJI ZALEY OD: - adunku elektrycznego; - masy; - ksztatu czsteczki

ELEKTROFOREZA KAPILARNA ELEKTROFOREZA KAPILARNA SCHEMAT SCHEMAT

PRZEPROWADZANIA ANALIZYPRZEPROWADZANIA ANALIZY prbk badan wprowadza si do koca kapilary po stronie anody

(hydrodynamiczna grawitacyjna, hydrodynamiczna-cinieniowa, elektrokinetyczna)

przy katodowym kocu znajduje si detektor (spektrofotometria, konduktometria, potencjometria)

SCHEMAT PRZYRZDU DO SCHEMAT PRZYRZDU DO ELEKTROFOREZY ELEKTROFOREZY

KAPILARNEJKAPILARNEJ



2014-12-10

15

DETEKTORY STOSOWANE DETEKTORY STOSOWANE W ELEKTROFOREZIEW ELEKTROFOREZIE

Fluorymetryczne, Spektrofotometryczne, Elektrochemiczne, Spektrometria masowa Laserowe Ultrafioletowe

MICELARNA MICELARNA CHROMATOGRAFIA CHROMATOGRAFIA

ELEKTROKINETYCZNAELEKTROKINETYCZNA micelarna chromatografia elektrokinetyczna (ang. MicellarElectrokinetic Chromatography, MEKC) - rozdzia skadnikwmieszanin, ktrych czsteczki s obdarzone adunkiem, jak rwnieelektrycznie obojtnych.

micele tworz si po osigniciu krytycznego stenia micelarnego(CMC)

podzia analizowanych skadnikw midzy micele: (rodowiskohydrofobowe) i bufor (rodowisko hydrofilowe)

wykorzystujc t technik mona rozdzieli np.: wglowodany,witaminy, aminokwasy, peptydy, oligonukleotydy

INNE TECHNIKI INNE TECHNIKI ELEKTROFORETYCZNEELEKTROFORETYCZNE elowa elektroforeza kapilarna: rozdzia substancji wielkoczsteczkowych

nastpuje w wyniku rnicy ich wielkoci. Proces ten przebiega w kapilarze wypenionej elem o odpowiedniej rednicy porw (kwasy nukleinowe, oligonukleotydy, peptydy, biaka).

kapilarne ogniskowanie izoelektryczne: skadniki mieszaniny rozdzielane s na podstawie rnicy wartoci punktw izoelektrycznych (pI). W kapilarze generowany jest gradient pH (od najniszego do najwyszego). Zwizki poruszaj si a do momentu dotarcia do pH rwnemu pI. Rozdziaowi t metod poddaje si gwnie substancje o waciwociach amfoterycznych.

PRAKTYCZNE PRAKTYCZNE WYKORZYSTANIE METOD WYKORZYSTANIE METOD ELEKTROFORETYCZNYCHELEKTROFORETYCZNYCH oznaczanie zawartoci zarwno zwizkw wielkoczsteczkowych, np. biaek czy

fragmentw DNA, jak i drobnoczsteczkowych: aminokwasw, wglowodanw,witamin, flawonoidw, jonw nieorganicznych oraz kwasw organicznych.

oznaczanie frakcji biakowych mleka krowiego, koziego, owczego, a take biaek wjajach kurzych i w zboach

oznaczanie aminokwasw w napojach oznaczanie zawartoci cukrw prostych i oligocukrw w owocach, warzywach,

napojach, sokach owocowych oznaczanie zawartoci witamin rozpuszczalnych w wodzie i w tuszczach oznaczanie polifenoli oznaczanie zawartoci poszczeglnych jonw oznaczanie zawartoci kwasw organicznych w produktach spoywczych oznaczanie kwasw nukleinowych, dziki czemu istnieje moliwo sprawdzenia czy

produkt by genetycznie modyfikowany

SPEKTROMETRIA MASSPEKTROMETRIA MAS

spektrometria mas jest technik analityczn, ktra suyzarwno do badania lub potwierdzenia strukturyzwizkw organicznych jak i oznaczania jakociowegooraz ilociowego okrelonych zwizkw wystpujcych wmieszaninie.

w spektrometrii mas czsteczki badanej substancji sjonizowane a analizie podlegaj powstae jony.

SPEKTROMETRIA MASSPEKTROMETRIA MAS

PODSTAW POMIARU W SPEKTROMETRII MAS JEST STOSUNEK MASY DO ADUNKUELEKTRYCZNEGO ANALIZOWANEGO JONU

UMOLIWIA:

okrelanie masyatomowej zwizku chemicznego

analiz jakociow i ilociow

precyzyjne okrelenie struktury zwizku

analiz skadu izotopowego



2014-12-10

16

BUDOWA I ZASADA DZIAANIA SPEKTROMETRU MASOWEGO INNE METODY ANALITYCZNE NEFELOMETRIANEFELOMETRIA pomiar natenia wiata

rozproszonego przez czsteczki w kierunkuprostopadym do kierunku padania

TURBIDYMETRIATURBIDYMETRIA pomiar natenia wiataprzechodzcego przez roztwr wykazujcy zmtnienie

REFRAKTOMETRIAREFRAKTOMETRIA metoda analityczna opierajcasi na pomiarze wspczynnikw zaamania wiata

POLARYMETRIAPOLARYMETRIA metoda analityczna opierajca si na pomiarze kta skrcania wiata

spolaryzowanego

INNE METODY ANALITYCZNE

enzymatyczno-wagowa metoda oznaczania bonnika- hydroliza enzymatyczna i wagowe oznaczanie bonnika

nierozpuszczalnego

- bonnik rozpuszczalny jest wytrcany za pomoc 96% etanolu i take oznaczany wagowo

mikrobiologiczne metody oznaczania witamin (witaminy z grupy B)

- metody detekcji: turbidymetria, nefelometria, pomiar produktw metabolizmu wytworzonych organizmy testowe



Documents

ANALIZA MIARECZKOWA METODY MIARECZKOWE · • atomowa • emisyjna spektrometria • atomowa • kolorymetria • metody ekstrakcyjne • metody immunometrycznei enzymatyczne •