Bc CN Enz Hoan Chinh

Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG

DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL

GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương

MỤC LỤC

MUC LUC________________________________________________________1

Chương 1: GIƠI THIÊU_____________________________________________3

Chương 2: TÔNG QUAN____________________________________________4

2.1 Enzyme cellulase____________________________________________4

2.2 Aspergillus Niger ___________________________________________4

2.3 Giới thiệu cơ chất___________________________________________5

2.4 Cơ chế xúc tác______________________________________________6

2.5 Tâm hoat đông______________________________________________8

2.6 Các thông sô cân xác đinh_____________________________________9

Chương 3: QUY TRINH LÊN MEN, THU NHÂN VA TINH SACH ENZYME

CELLULASE____________________________________________________10

3.1 Sơ lươc quy trinh lên men____________________________________10

3.1.1 Môi trương nuôi cấy___________________________________11

3.1.2 Giông______________________________________________12

3.1.3 Lên men____________________________________________12

3.1.4 Các yếu tô ảnh hưởng đến sinh tổng hơp enzyme cellulase____12

3.2 Quy trinh thu nhân va tinh sach________________________________13

3.2.1 Thu nhân enzyme cellulase_____________________________13

3.2.2 Tinh sach enzyme cellulase_____________________________14

3.3 Phương pháp xác đinh hoat tinh_______________________________15

Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 1




Chương 4: ƯNG DUNG CUA ENZYME CELLULASE TRONG SAN XUÂT NHIÊN

LIÊU SINH HOC ETHANOL________________________________________17

4.1 Giới thiệu vê nhiên liệu sinh hoc ethanol________________________17

4.2 Sơ đô sản xuất ethanol va thuyết minh quy trinh sản xuất___________20

4.2.1 Sơ đô quy trinh sản xuất________________________________20

4.2.2 Thuyết minh quy trinh_________________________________21

4.2.2.1 Tiên xử lý_____________________________________21

4.2.2.2 Thuy phân_____________________________________22

4.2.2.3 Lên men______________________________________23

4.2.2.4 Chưng cất- khử nước____________________________24

4.3 Các thông sô ky thuât cua hệ enzyme cellulase___________________24

4.4 Phương pháp xác đinh đương glucose sinh ra_____________________25

Chương 5: KÊT LUÂN_____________________________________________26

PHU LUC_______________________________________________________27

1. Phương pháp xác đinh ham lương enzyme cellulase bằng phương pháp

Bradford________________________________________________________27

2. Phương pháp xác đinh ham lương đương khử bằng phương pháp

DNS____________________________________________________________28

3. Phương pháp tinh sach enzyme cellulase bằng phương pháp sắc ki loc

gel_____________________________________________________________30

TAI LIÊU THAM KHAO___________________________________________32





Chương 1: GIƠI THIÊU

Enzyme cellulase la môt trong những enzyme thương mai hóa lớn nhất hiện nay

đươc sử dụng chu yếu trong công nghiệp dệt như lam mêm sơi bông, tẩy hay giữ mau,

chông kết tua…; dùng để tách chiết trong thực phẩm hay công nghiệp giấy va bôt giấy.

Thi trương cellulase dùng để tiên xử lý nguyên liệu cellulose sản xuất hang hóa

như bioethanol va các sản phẩm sinh hoc cơ bản khác trên quy mô lớn đã tăng đôt

ngôt. Vi dụ như thi trương cellulase tiêm năng đươc ước đoán trên 400 triệu USD mỗi

năm, chỉ riêng sử dụng thuy phân bắp va rơm khô va trong tương lai sẽ chiếm khoảng

33% tổng giá tri công nghiệp enzyme cua My. Sự tiêm năng cua thi trương enzyme

cellulase có vai trò quan trong cua nổi bât trong công nghiệp năng lương sinh hoc va

các sản phẩm cơ bản cua sinh hoc, la môt đông lực to lớn để phát triển công nghệ

cellulase thuy phân vách tế bao thực vât. Để phát triển công nghiệp cellulase đòi hỏi

cân phải có những đặc điểm như hiệu suất xúc tác phản ứng cơ chất cellulose cao trong

môi trương không hòa tan, tăng sự ổn đinh cua môi trương nhiệt đô cao, khi pH thay

đổi, va không bi ức chế nông đô sản phẩm cao.

Ngoai ra hệ enzyme cellulase trong Aspergillus niger cũng đươc nghiên cứu từ

lâu nhằm ứng dụng để sản xuất các chế phẩm sinh hoc nhằm phục vụ nhu câu chế biến

thực phẩm, trong nông nghiệp sử dụng dể xử lý đất nhằm tăng đô mau mỡ.





Chương 2: TÔNG QUAN

2.1 Enzyme cellulase

Cellulase la enzyme thuôc nhóm thuy phân cellulose thanh glucose.

Enzyme cellulase đươc thu nhân từ các nguôn khác nhau:

Thực vât: trong hat ngũ côc nảy mâm như đai mach, yến mach, lúa mi mach

đen…

Đông vât: chu yếu la do các vi sinh vât sông công sinh trong ruôt cua đông vât

nhai lai hay môi

Vi sinh vât: các loai xa khuẩn, vi khuẩn, nấm sơi, nấm men…

Trong thực tế ngươi ta thương thu nhân enzyme cellulase từ vi sinh vât. Các chung vi

sinh vât thương sử dụng:

Nấm môc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus,

Trichodesma reesei …

Xa khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…

Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus Subtilis, Bacillus pumilis…

Trong đó nấm môc va vi khuẩn la 2 nguôn tao cellulase chu yếu, ở mức đô it hơn

la mâm malt va hat cây.

Trong ky thuât, cellulase đươc sản xuất chu yếu từ nấm Trichodesma reesei,

Aspergillus niger va vi khuẩn Cellulomonas.

2.2 Aspergillus Niger

Aspergillus niger thuôc giới Eukaryota, lớp Eurotiomycetes, bô Eurotiales, ho

Trichocomaceae, la môt dang nấm phổ biến nhất trong chi nấm môc Aspergillus.





Nấm Aspergillus còn goi la môc tương. Sơi nấm có vách ngăn, cuông mang bao

tử bụi phông lên ở ngon. Các chuỗi bao tử bụi từ đâu phông moc tỏa khắp moi hướng.

Bao tử bụi cua Aspergillus niger có mau đen.

Asp. niger la nguyên nhân gây bệnh môc đen ở môt sô loai thực vât nhưng lai it

có khả năng gây bệnh cho ngươi, nó chỉ có thể gây hai cho ngươi khi hit vao với môt

lương lớn, từ đó có thể gây ra các bệnh vê phổi va hô hấp, nó cũng có thể gây nhiêm

trùng tai. Nó đươc nuôi cấy trong nhiêu nganh công nghiệp như sản xuất acid citric,

acid gluconic, hoặc thu các chế phẩm enzyme amylase, cellulase, α-galactosidase.

2.3 Giới thiệu cơ chất

Enzyme cellulase có khả năng sử dụng nhiêu loai cơ chất. Ngươi ta phân ra lam

2 loai chu yếu sau:

Cơ chất tự nhiên: gôm các nguôn phụ phẩm cua các nganh nông nghiệp

như bã mia, bã ca phê, rơm ra, sơi bông, cong khoai mi, dây đâu sau thu

hoach…Chẳng han như cellulose la homopolymer mach thẳng, đươc cấu

tao khoảng vai ngan gôc glucose nôi với nhau bằng liên kết β-1,4-

glucoside. Cellulose có cấu tao sơi, cấu trúc không đông nhất gôm vùng

kết tinh va vùng vô đinh hinh. Khoảng 40 sơi liên kết lai với nhau tao

thanh liên kết microfibrin. Nhiêu sơi microfibrin tâp hơp lai thanh sơi

macrofibrin có đương kinh mặt cắt khoảng 0,5nm.

Cơ chất nhân tạo: gôm các cơ chất dùng để phân tich hoat tinh enzyme

cellulase như CMC (carboxulmethyl cellulose), HEC (hydroxyethyl

cellulose… CMC (Carboxymethylcellulose) la môt dẫn xuất cua

cellulose. Cấu trúc cua CMC dựa trên liên kết β-(1 4)-D-

glucopyranose, có thanh phân tương tự nhưng chỉ có liên kết cua phân vô

đinh va ngắn hơn so với cellulose.





Bang: Các loai cơ chất tan va không tan dùng đêt nuôi cấy va cô đinh hoat tinh enzyme.

Cơ chất tan Cơ chất không tan

Radio-labeled cellodextrin

Dẫn xuất cellodextrin

β-methyllumbelliferul-

oligosaccharides

p-nitophenol-oligosaccharides

Cacboxymethyl cellulose (CMC),

hydroxyethyl cellulose (HEC)

Cellulose kết tinh như:

Cellulose kết tinh

Valonia cellulose

Cellulose vô đinh hinh-PASC, RAC

Cellulose nhuôm

Cellulose phát huỳnh quang

Dẫn xuất sinh mau

Trinotrophenyl-

carboxymethylcellulose (TNP-CMC)

Fluram-cellulose

2.4 Cơ chế xúc tác

Enzyme cellulase la môt phức hệ gôm nhiêu enzyme tham gia vao quá trinh

chuyển hóa cellulose.

Enzyme endogluconase (endo-1,4- β-D-glucanase (EC 3.2.1.4)) hay Cx: tên

khác la CMCase- goi tên theo cơ chất nhân tao sử dụng để xác đinh hoat tinh

cua enzyme. EG bắt đâu thuy phân cellulose trên các vi tri vô đinh hinh trên

bê mặt sơi microfibrin ở các vi tri ngẫu nhiên lam xuất hiện các đuôi khác

nhau trên phân chất vô đinh hinh, từ cellulose tao thanh các cellobiose, tiên đê

cho xúc tác cua cellobiosehydrolase trên các đâu mút cua chuỗi tự do. Điêu





nay cho biết ảnh hưởng cua enzyme trên phân carboxymethylcellulose va

cellulose kết tinh. Enyme endoglucanase cua nấm thương la môt monomer, có

pH hoat đông trong khoảng pH=4-5 va nhiệt đô t= 50 -70oC.

Enzyme exoglucanase (cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)) hay C1 : sẽ cắt va

giải phóng các cellobiose từ đâu không khử (đâu mút cua chuỗi) tao thanh

trong bước đâu tiên. Exocellulase chiếm khoảng 40-70% thanh phân hệ

enzyme cellulase cua nấm, xúc tác bằng cách tao ra các câu liên kết giữa cơ

chất với enzyme. Với Exocellulase pH hoat đông từ 4-5, nhưng khoảng nhiệt

đô rông hơn so với endocellulase khoảng 37-60oC.

Enzyme β-glucanase (1,4- β - D -glucosidase(EC 3.2.1.21) ): thuy phân liên

kết β-1,4-glucoside, cắt va giải phóng glucose tự do. β –glucosidase thuy phân

cellobiose, môt sô trương hơp cellodextrin thanh glucose. Enzyme β-

glucanase cũng bi ức chế canh tranh bởi glucose, enzyme nay có pH tôi ưu

dựa vao nơi hoat đông cua nó va có nhiệt đô tôi ưu khoảng 45-75oC.

Cơ chế xúc tác của enzyme CMCase cơ chất CMC: Do cơ chất CMC chỉ có

vât chất vô đinh hinh trong phân tử nên phức hơp 3 enzyme cua cellulose chỉ

có enzyme endoglucanase hoat đông. Do đó CMC đươc dùng chu yếu để xác

đinh hoat tinh endoglucanase (Cx) nên đươc goi la CMCase.





Hình: Sơ đồ các bước thủy phân cellulose bởi enzyme cellulase

2.5 Tâm hoạt đông

Trung tâm hoat đông cua enzyme la phân cua phân tử enzyme trực tiếp kết hơp

với cơ chất, tham gia trực tiếp trong việc tao thanh va chuyển hóa phức chất trung gian

giữa enzyme va cơ chất để tao thanh sản phẩm phản ứng. Trung tâm hoat đông bao

gôm nhiêu nhóm chức năng khác nhau cua amino acid, phân tử nước liên kết va nhiêu

khi có cả cofactor hữu cơ (coenzyme) va vô cơ.

Ở các enzyme một thành phần, trung tâm hoạt động thường bao

gồm một tổ hợp các nhóm chức năng của acid amin không tham gia

tạo thành trục chính của sợi polypeptide.





Giữa cơ chất va trung tâm hoat đông tao thanh nhiêu tương tác yếu, do đó có thể

dê dang bi cắt đứt trong quá tr.nh phản ứng để giải phóng enzyme va sản phẩm phản

ứng.

Trung tâm hoat đông cua các enzyme có cấu trúc bâc 4 có thể nằm trên môt phân

dưới đơn vi hoặc bao gôm các nhóm chức năng thuôc các phân dưới đơn vi khác nhau.

Đôi với cellulase, tâm hoat đông la acid amin va không có cofactor cũng như

coenzyme.

2.6 Các thông sô cân xác đinh

Trong quy trinh lên men, thu nhân va tinh sach enzyme cellulase từ Asp. niger, ta

cân chú ý các thông sô đặc tinh cua enzyme như sau:

Khôi lương phân tử [Asp. niger]: 26000 Da

Chất nên: carboxymethylcellulose + H2O

Nhiệt đô cất giữ: -15oC trong khoảng thơi gian dai hoặc 4oC trong 3 ngay.

Khoảng nhiệt đô hoat đông: nhiệt đô quá cao hay quá thấp thương dê lam biến

tinh enzyme do enzyme có bản chất la protein do đó enzyme hoat đông trong khoảng

20oC – 60oC.

Nhiệt đô tôi ưu: 45 oC

Khoảng pH : pH có vai trò quan trong trong việc tao môi trương cho hoat đông

enzyme, mỗi enzyme có môt vùng hoat đông tôt nhất riêng cho minh nên khi pH thay

đổi sẽ ảnh hưởng tới đô phân ly các nhóm chức cấu trúc nên trung tâm hoat đông cua

enzym như OH, SH.. hoat đông cua hệ enzyme trong nấm môc Aspergillus niger

thương có môi trương axit: 3 – 8.

pH tôi ưu: 3.8 – 4.





Nông đô cơ chất: cơ chất vừa có vai trò la chất cảm ứng vừa có vai trò la chất ức

chế sự sinh tổng hơp enzyme khi môi trương dinh dưỡng can kiệt.

Chất ức chế : Ag+

Chương 3: QUY TRINH LÊN MEN, THU NHÂN VA TINH SACH

ENZYME CELLULASE





3.1 Sơ lươc quy trinh lên men

Quy trinh lên men giông nấm môc Asp. niger thuôc dang lên men bê mặt va đươc

thực hiện theo sơ đô sau:

3.1.1 Môi trương nuôi cây

Môi trương bán rắn có các thanh phân gôm bã mia va cám mi theo tỉ lệ 4:6, đô ẩm

40 – 50%.

Sau khi trôn đêu môi trương ta cho vao các binh tam giác thể tich 250ml, sau đó

hấp khử trùng ở 121oC/30 phút.

Lam nguôi môi trương va chuẩn bi cấy giông.

3.1.2 Giông


Môi trương nuôi cấy

Lên men

Khử trùng

Giông

Chế phẩm enzyme thô

Khoáng va chất tăng trưởng (nếu có)

Canh trương

Nước + đệm

Ly tâm va tua bằng côn lanh




Giông Asp. niger đươc cung cấp bởi phòng thi nghiệm trương ĐH Ky thuât công

nghệ TP.HCM.

Cấy dich huyên phù tế bao vao môi trương nuôi cấy với mât đô 106 bao tử/g môi

trương.

3.1.3 Lên men

Lên men bán rắn bê mặt trong các khay.

Nuôi cấy Asp. Niger trong 2 ngay, sau đó bắt đâu thu nhân enzyme thô.

3.1.4 Các yếu tô ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme cellulase

Đô thoáng môi trường

Bã mia, cám mi tác nhân lam cho môi trương thoáng xôp, tao điêu kiện cho nấm

môc phát triển tôt. Ban đâu nấm môc sẽ tân dụng những chất dê tiêu trong môi trương

như các loai đương nhưng khi môi trương dinh dưỡng bi can kiệt thi nấm môc phải tiết

ra những enzyme để phân huy cơ chất khác thanh đương để tiếp tục tôn tai va phát

triển. Tuy nhiên, cũng tùy thuôc vao nông đô cua cơ chất nhiêu hay it ma nấm môc sẽ

tiết ra lương enzyme khác nhau.

Đô ẩm

Đô ẩm la khoảng 40 -50 %, đây la yếu tô quan trong trong môi trương. Nếu đô

ẩm quá thấp thi xảy ra hiện tương loai nước ra khỏi tế bao nấm môc va lam cho tế bao

bi chết. Điêu nay sẽ lam han chế sự sinh trưởng va phát triển cua nấm môc. Nếu đô ẩm

quá cao thi cũng không tôt cho sự sinh trưởng va phát triển.

Yếu tô khác





Sự tổng hơp cua enzyme còn phụ thuôc vao khả năng tiết tôi đa cua từng loai vi

sinh vât có nghĩa la nếu tăng ham lương cơ chất vươt quá môt giới han nhất đinh thi

Hoat tinh enzyme sẽ giảm do 2 nguyên nhân, thứ nhất do cơ chất tao áp lực lam

giảm quá trinh sinh tổng hơp, thứ hai do cơ chất tăng trong khi năng lực tiết tôi đa

không đổi lam hoat tinh enzyme giảm.

Khi cấy nấm môc vao môi trương, chúng sẽ không tiết ngay ra enzyme ma sẽ tiết

kiệm năng lương đến mức tôi đa va sử dụng ngay những chất dê sử dụng nhất la các

đương đơn, khoáng chất có sẵn. Sau đó chúng sẽ tiết ra enzyme tùy vao thanh phân các

chất có trong môi trương.

Nấm môc phát triển đươc chia ra thanh 4 giai đoan như sau: thich nghi, phát triển,

cân bằng va tử vong. Ở giai đoan thich nghi va phát triển, nấm môc sẽ tim cách thich

nghi va tiết ra loai enzyme nao va sô lương bao nhiêu để có thể tôn tai va phát triển.

Theo thơi gian thi lương enzyme tiết ra sẽ tăng dân va đến môt mức đô ổn đinh, sau đó

sẽ giảm đi khi môi trương Minh dưỡng can kiệt dân.

3.2 Quy trinh thu nhân va tinh sạch

3.2.1 Thu nhân enzyme cellulase

Mẫu: enzyme cellulase từ nấm môc Asp. Niger.

Cân 5g chế phẩm ezyme thô pha với nước ty lệ 1:5 (5g enzyme với 25 ml

nước), dùng đũa thuy tinh khuấy đêu trong 20 phút rôi loc qua bông .

Đem dich loc ly tâm với tôc đô 3000 vòng/phút trong vòng 10 phút.

Thu dich chiết nằm ở phia trên, bỏ phân cặn phia dưới.

- Lấy 25ml dich chiết tua bằng côn lanh 96oC ty lệ 1:3 (25ml dich : 75 ml côn).

(Không sử dụng côn ở nhiệt đô thương vi có thể lam biến tinh va giảm hoat lực cua

enzyme).





- Lam lanh 30 phút.

- Dich chiết đươc ly tâm lân 2 cũng ở 3000 vòng/phút trong vòng 10 phút. Sau

ly tâm thu tua phia dưới (la protein) va tách bỏ lớp dung dich phia trên. Pha dich

enzyme thu đươc trong dung dich đệm acetate pH= 5=> nhằm đảm bảo quá trinh

biến tinh cua protein không xảy ra.

3.2.2 Tinh sach enzyme cellulase

Tinh sach enzyme nay bằng sắc ký loc gel. (chuẩn bi gel xem phụ lục).

Nguyên tắc: Sắc ký loc gel la ky thuât dùng để tách những phân tử có kich

thước, trong lương phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua côt gel.

Những phân tử kich thước đu nhỏ để lot vao bên trong lỗ gel sẽ bi tri hoãn va di


Lọc qua bôngThu dich chiết

Tủa bằng cồn (1:3)

Thu cặn tủa protein

Ly tâm 3000 vòng/phút (10’)

Lam lạnh 30phút

Pha với nước (tỷ lệ 1:5)

Chế phẩm enzyme

Khuấy 20 phút

Ly tâm 3000 vòng/phút (10’)

Chế phẩm enzyme thô

Côt sắc ký

Dung dich đệm pH=5

Chế phẩm enzyme




chuyển châm qua côt, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoai các

hat gel nên sẽ di chuyển nhanh va đươc giải hấp (thôi) ra khỏi côt sớm hơn các

phân tử nhỏ.

3.3 Phương pháp xác đinh hoạt tinh

Cơ chất dùng để xác đinh hoat đông cua hệ enzyme cellulase la cellulose không

tan như giấy loc, bôt cellulose tinh khiết… Tuy nhiên, do lương đương khử sinh ra

không tuyến tinh với lương enzyme trong phản ứng, nghĩa la lương enzyme tăng gấp

đôi sẽ không sinh ra lương đương khử gấp đôi trong cùng thơi gian phản ứng. Do đó ta

sử dụng cơ chất la dãn xuất cua cellulose tan trong nước như CMC, hay HEC để xác

đinh hoat tinh cua CMCase.

Với các cơ chất khác như giấy loc dùng xác đinh hoat tinh enzyme exocellulose.

Đơn vi đo hoạt tinh riêng cua cellulase la CU/mg (cellulase units)

Xác đinh ham lương protein theo phương pháp Bradford:





Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue-CBB)

sẽ hinh thanh hơp chất mau có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cương

đô mau ty lệ với nông đô protein trong dung dich.

Xác đinh ham lương đường khử theo phương pháp DNS:

Phương pháp dựa vao sự thuy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5.0 va 40oC. Lương đương khử sinh ra đươc cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS), mau sinh ra sau phản ứng đươc xác đinh bằng phương pháp so mau trên quang phổ kế ở bước sóng 540nm.





Chương 4: ƯNG DUNG CUA ENZYME CELLULASE TRONG SAN

XUÂT NHIÊN LIÊU SINH HOC BIOETHANOL

4.1 Giới thiệu vê nhiên liệu sinh học ethanol

Nhiên liệu sinh hoc (Biofuel hay Agrofuel) la sản phẩm cua quá trinh lên men

ki khi từ nấm men, đây la loai chất đôt tái tao sản xuất từ nguyên liệu đông thực vât.

Xăng-Ethanol (E) thông dụng nhất hiện nay trên thế giới vi dê dang biến chế từ

đương va tinh bôt.

Tất cả thực vât quang tổng hơp đêu có thể biến chế thanh xăng sinh hoc.

Cây nông phẩm chứa đương gôm mia, cu cải đương, sorgho-đương; nông

phẩm chứa tinh bôt gôm hat ngu côc như lúa mi, lúa, bắp, sorgho…; cu như khoai

tây, khoai mi, khoai lang.

Mia có hiệu quả kinh tế nhất vi cho năng xuất thân (khoảng 170-200 t/ha ở

Brazil, 80-100 t/ha ở Úc, Việt Nam khoảng 35-50 t/ha), biến chế ethanol thẳng từ

nước ép, bả mia dùng lam năng lương chay máy ép va chưng cất ethanol. Mia sản

xuất trung binh 15,500 lit ethanol/ha/năm, va cứ 1 tấn chất khô mia sản xuất đươc

438 lit ethanol. Brazil sản xuất ethanol chinh từ mia. Sorgho-đương hiện đươc ưa

chuông hơn mia ở môt sô vùng nhiệt đới khô han, có hiệu quả kinh tế hơn mia.

Sorgho-đương canh tác ở Hoa Kỳ cho 28,500 lit ethanol/ha/vụ 4 tháng.

Ngoai ra còn có các nguôn nguyên liệu khác để sản xuất xăng sinh hoc như:

Thực vât hoang dai: tảo (algae) nước ngot, tảo biển, lục binh (Eichornia

crassipes), cỏ Vetiver, cỏ voi (Elephant grass, Pennisetum purpureum, sản xuất

13,700 lit ethanol/ha/năm), lác (Cyperus), cỏ tranh (Imperata cylindrica),…





Phó sản thực vât từ sản xuất cây nông phẩm va cây ky nghệ: rơm ra, bả

mia, thân, gổ, mat cưa, trấu, hat cao su (sản xuất 217 kg dâu/ha/năm), hat bông vải

(sản xuất 273 kg dâu/ha/năm).

Giấy phế thải: 1 tấn giấy cu sản xuất khoảng 416 lit ethanol.

Rác thanh phô: 1 tấn rác sản xuất khoảng 227 lit ethanol.

Phế thải chuông trai gia súc: phân chuông (tao methane sinh hoc rôi chế

methanol).

Xăng sinh hoc ethanol (C2H5OH) 99.9% có thể chay đông cơ xe hơi chay bằng

xăng. Khi cháy, môt phân tử ethanol sinh môt nhiệt lương 1409 kJ.

Xăng pha với ethanol thải it khi nha kinh hơn xăng thương. Chẳng hang E85

thải 1 ppm khi NO2 trong khi xăng-cổ-sinh thải 9 ppm.

Trên nguyên tắc, bất cứ chất vât liệu sinh hoc nao chứa nhiêu Carbon, hoặc

dưới dang đương, tinh bôt, cellulose đêu có thể chế biến thanh ethanol, hoặc chứa

nhiêu acid béo đêu có thể chế biến diesel sinh hoc đươc. Thông thương nhất la từ

thực vât có khả năng quang tổng hơp – biến CO2 cua khi quyển thanh chất đương,

tinh bôt, cellulose, rôi protides, lipids, v.v. Trung binh cứ mỗi phân tử CO2 cây hấp

thụ va biến chế qua quang tổng hơp thanh sinh khôi chứa 114 kilocalories. Khó khăn

ky thuât hiện tai la lam sao biến toan thể năng lương C chứa trong sinh khôi thanh

xăng sinh hoc. Với ky thuât hiện nay (cổ điển), có 2 phương thức hữu hiệu:

Cho lên men (nhơ men va enzymes trong điêu kiện yếm khi) chất đương

(từ mia, cu cải đương, v.v.), tinh bôt [từ hat ngũ côc (bắp, lúa, lúa mi, v.v.) va cu

(khoai tây, khoai mi, v.v.)], hay cellulose để tao ra rươu Ethanol (CH3OH), Propanol

[CH3CH2CH2OH; (CH3)2CHOH] va Butanol (C4H10O).





Trich dâu từ thực vât giau chất dâu, hay mỡ từ đông vât (ép với áp suất

cao va nhiệt, hay bằng dung môi, hay phôi hơp cả hai).

Vê phương diện ky thuât (va kinh tế), chia lam 3 loai nguyên liệu:

Công nghệ xăng-sinh-hoc thế hệ 1: chế biến từ đương (mia, cu cải đương,

sorgho-đương) va tinh bôt cua nông phẩm (từ hat cua bắp, lúa mi, lúa, v.v., hay từ cu

như khoai tây, khoai mi, v.v.) để tao ethanol; hay từ dâu (cua hat dừa-dâu, đâu nanh,

đâu phông, v.v.) để biến chế diesel-sinh-hoc. Ky thuât đơn giản va kinh tế nhất.

Công nghệ xăng-sinh-hoc thế hệ 2: từ cellulose, chất xơ cua dư thừa thực

vât (rơm, ra, thân bắp, gổ, mat cưa, bả mia, v.v.), hay thực-vât-hoang (non-crop)

(như cỏ voi, vetiver, lục binh). Chẳng han, môt ha mia cho khoảng 25 tấn bả mia

(bagasse, xác mia sau khi ép), va mỗi tấn bả mia sản xuất 285 lit ethanol. Ky thuât

hiện nay chưa hoan hảo, hiệu năng còn kém, con men chưa hữu hiệu va giá đắt, chỉ

môt phân cellulose va lignin biến thanh ethanol, nên giá thanh sản xuất còn cao.

Công nghệ xăng-sinh-hoc thế hệ 3: từ tảo (algae), ky thuât đang phát triển.





4.2 Sơ đồ san xuất ethanol va thuyết minh quy trinh san xuất

4.2.1 Sơ đô quy trinh sản xuât


Phế phẩm nông nghiệp

Cellulose Hemicellulose Lignin

Tiên xử lý

Thuy phân

Hemicellulases

Cellulases

Đường hexoses va pentoses

Lignin

Hệ thông quản lý chất thải

Sản xuất năng lương

Năng lương điện

Cung cấp cho quá trinh tiên xử lý

Lên men

Bioethanol thô

S.cerevisiae

Bioethanol

Chưng cất và cho bay hơi

Cải tiến môi trương nuôi cấy

Tác nhân gây đôt biếnSinh vât chuyển gen

SSF

CBP




SSF: quá trinh thuy phân thanh các đương đơn giản va lên men đươc tiến hanh

trong môt thiết bi.

SHF: quá trinh thuy phân thanh các đương đơn giản va lên men đươc tiến hanh

đôc lâp trong những thiết bi khác nhau.

CBP: đông nhất bằng quá trinh sinh hoc

4.2.2 Thuyết minh quy trinh

Quy trinh đươc tiến hanh theo 4 bước:

Xử lý cơ hoc nguyên liệu.

Thuy phân cellulose thanh glucose.

Lên men glucose thanh ethanol.

Tách va tinh chế sản phẩm

4.2.2.1 Tiền xử lý

Bã mia la nguôn phế thải cua nganh công nghiệp sản xuất đương. Thanh phân cua

bã mia gôm 41% cellulose (C6H10O5)n, ngoai ra còn có lignin, pectin, hemicellulose va

phân đương còn dư.

Tiên xử lý lignocelluloses rất cân thiết vi nguyên liệu thuy phân không có quá

trinh tiên xử lý xảy ra rất châm va kết quả la cho hiệu suất tao ra sản phẩm không cao.

Môt vai phương pháp nhằm lam giảm kich thước nguyên liệu va giảm phân cellulose

kết tinh. Tiên xử lý nâng cao mức đô tiếp xúc giữa cellulose với enzyme, lam giảm

lương enzyme sử dụng do đó giảm vê giá thanh cua quy trinh. Có nhiêu phương pháp

tiên xử lý khác nhau có thể phân chia thanh 3 loai: hóa hoc (dùng axit hoặc kiêm),vât

lý kết hơp với hóa hoc (bằng cách xay xát kết hơp với sử dụng hơi nước) va tiên xử lý

bằng phương pháp sinh hoc sử dụng vi sinh vât. Trong tiên xử lý bằng phương pháp

hóa hoc sử dụng axit, hemicellulose sẽ la đôi tương tương tác chinh, ngươc lai quá





trinh tiên xử lý sử dụng kiêm chu yếu để loai bỏ lignin. Vi thế không nhất thiết chỉ sử

dụng môt phương pháp cho quá trinh tiên xử lý ma dựa vao thanh phân cua nguyên vât

liệu ma có môt phương pháp xử lý thich hơp.Nhiêu enzyme thuy phân cellulose từ nấm

lam việc ở pH axit yếu (4-5).

Tiên xử lý bằng phương pháp sinh hoc sử dụng vi sinh vât như dụng loai nấm như

Cyathus sp, Streptomyces viridosporus, Phelebia tremellosus, Pleurotus florida va

enzyme cua chúng dùng để khử lignin trong lignocelluloses nhằm giảm năng lương sử

dụng, tôi thiểu sản phẩm thải ra va tác đông đến môi trương.

Môt sô loai nấm đảm trắng có khả năng sử dụng lignin nhưng không lam giảm

lương mannan peroxide va laccase.

Trong bước xử lý cơ hoc, cân loai lignin trong nguyên liệu, chỉ còn lai thanh phân

cellulose, vi ligin la chất khó phân huy. Nếu còn sót lai trong nguyên liệu sẽ ảnh hưởng

năng suất cua quá trinh.

4.2.2.2 Thuy phân

Quá trinh nay gây tiêu tôn nhiêu chi phi trong giai đoan sản xuất côn. Sau

quá trinh tiên xử lý, cellulose va hemicelluloses đươc thuy phân tao ra các đương đơn

sử dụng enzyme cellulase va hemicellulase. Nhiêu loai nấm như Tricoderma,

Aspergillus, Penicilium… có thể sản xuất ra môt lương lớn cellulase ngoai bao va

hemicellulase. Những enzyme chiu nhiệt đô cao va pH thấp đươc ưu tiên sử dụng do

quá trinh tiên xử lý thương dùng axit va nhiệt đô. Hơn nữa, các enzyme chiu nhiệt có

vai đặc điểm thuân lơi như hoat tinh riêng cao va mức đô ổn đinh cao dùng cải tiến quá

trinh thuy phân. Cuôi cùng, nâng cao hiệu suất xúc tác cua enzyme tức la giảm lương

enzyme sử dụng. Những chung chiu nhiệt có enzyme hoat đông ở nhiệt đô rất cao trên

60oC va nhiệt đo phát triển tôi ưu la 35-55 oC. Hiện nay, bằng ky thuât di truyên, các

nha nghiên cứu đang hướng đến tao ra môt tổ hơp enzyme có thể thuy phân nguôn

nguyên liệu lignocellulose hiệu quả nhất. Bao gôm quá trinh:





Chuyển đổi cellulose: Cellulose la loai polysaccharide đông hinh đươc cấu -(1-

4) glycoside.-D-glucose thông qua liên kết thanh từ các đơn phân. Quá trinh thuy

phân bằng tổ hơp enzyme cellulase bao gôm -glucosidase tao ra -cellobiohydrolase

(exoglucanase), endoglucase va sản phẩm cuôi cùng la glucose.

Chuyển đổi hemicellulose: hemicellulose la thanh phân dôi dao nhất thứ 2 trong

nguôn nguyên liệu lignocellulose (25-30%). Hemicellulose la môt loai polymer di hinh

đươc tao bằng các đơn phân pentose (D-xylose, D-arabinose), đơn phân hexose (D-

mannose, D-glucose, D-galactose) va các acid đương. Xylan la thanh phân thương thấy

trong các thân gỗ cứng, tuy nhiên glucomanan lai la thanh phân chinh trong các loai

thực vât thân mêm. Tổ hơp enzyme để thuy phân hemicellulose cũng rất phức tap. Vi

dụ -xylanse, để thuy phân xylan thi tổ hơp enzyme cân thiết la endo-1,4-β -L-

arabinofuranosidase.-glucuronidase va -xylosidase.

Nguôn enzyme đươc sử dụng phổ biến hiện nay la từ Trichoderma reesei va

Aspergillus niger. Hiện nay, ngươi ta đang thay thế dân các hệ enzyme chiu nhiệt, chiu

các điêu kiện hóa hoc quá han. Hơn hết la các nghiên cứu vê phức hơp cellulosome cua

các vi khuẩn kỵ khi đang dân mở ra môt con đương mới nhằm tăng hiệu quả thuy phân

cua tổ hơp trên các loai nguyên liệu lignocellulose.

4.2.2.3 Lên men

Trong quá trinh lên men, sản phẩm sau quá trinh thuy phân bao gôm các monomer hexose ( glucose, mannose, galactose) hay pentose (xylan, arabinose) sẽ đươc lên men để tao ra các sản phẩm có giá tri như ethanol. Trong sô các sản phẩm thuy phân, glucose có ham lương cao nhất sau đó đến xylose va mannose va những đương khác có ty lệ thấp hơn.

S.cerevisiae la vi sinh vât lên men truyên thông sử dụng lên men ethanol từ tinh bôt trong quy mô công nghiệp. S.cerevisiae có nhiêu thuân lơi như đươc nghiên cứu từ lâu, hiệu suất lên men cao tuy nhiên S.cerevisiae có nhươc điểm la không thể sử dụng xylose lam nguôn cacbon để sinh trưởng hay len men. Do đó S.cerevisiae đươc cải tiến để có thể sử dụng cả 2 đương glucose va xylose. Hiện tai môt sô loai như S. Cerevisiea hay S. unvarum la giông có khả năng tao đô côn cao (12-13%), hay đặc biệt S. oviformis có khả năng tao đô côn 18% đặc biệt loai nấm men nay có khả năng lên men đươc rất nhiêu đương khác nhau như glucose, manose, saccharose, maltose va rafinose, tuy nhiên không có khả năng lên men galactose. Ngoai ra còn có Zymononas mobilis cũng thương đươc sử dụng trong quá trinh rươu hóa. Tuy nhiên cả Saccharomyces va





Zymononas sp đêu thiếu hoan toan khả năng chuyển hóa các loai đương pentose. Khuynh hướng biến đổi gen cua 2 giông nay nhằm giúp biểu hiện khả năng chuyển hóa 2 loai đương pentose phổ biến nhất la D-xylose, va L – arabinose cũng đã đươc phát triển nhiêu.

Gân đây, ngươi ta phát hiện thấy có môt sô loai nấm men như Pichia stipitis,

Candida shehatae va Pachyhysolen tannophillus la những chung có khả năng chuyển

hóa xylose manh va đã đươc dùng trong sản xuất ethanol. Trong đó P. stipilis lai nổi

bât bởi khả năng sản xuất ham lương côn cao va nhu câu dinh dưỡng cua chúng không

quá phức tap so với các giông nấm men khác.

Ngoai ra, các chung chiu nhiệt đô cao như G. thermoglucosidasius, T.mathranii

va T. saccharolyticum cũng đang đươc sử dụng. Quá trinh lên men côn cua chúng có

nhiêu lơi ich hơn các quá trinh chuyển hóa xảy ra ở nhiệt đô trung binh. Chúng có khả

năng lên men không chỉ đương pentose, hexose ma còn có khả năng lên men

cellobiose, thâm chi trong môt sô trương hơp những cơ chất polycarbonhydrate phức

tap như cellulose. Quá trinh lên men ở nhiệt đô cao giúp quá trinh thu hôi sản phẩm dê

dang hơn, bởi vi ethanol có chứa nước (aqueous ethanol) sẽ bôc hơi tai nhiệt đô 500C,

đông thơi giảm nông đô côn trong bôn lên men nhằm giảm thiểu ảnh hưởng ngươc lai

cua nông đô côn đến sự phát triển cua tế bao, từ đó giảm đươc chi phi sản xuất.

4.2.2.4 Chưng cât- khử nước

Quá trinh tách nước va tinh sach ethanol để đáp ứng đặc điểm ky thuât cua nhiên liệu.

4.3 Các thông sô ky thuât của hệ enzyme cellulase

Nhiệt đô: enzyme cellulase hoat đông trong khoảng nhiệt đô từ 45 đến 50oC,

nhiệt đô tôi ưu la 48oC.

pH: môi trương kiêm hoặc phosphoric acid, ở môi trương nay, cân quan sát pH

để tao môi trương thich hơp, cellulose đươc nở ra do đó sẽ bi phân giải rất nhanh.





4.4 Phương pháp xác đinh đường glucose sinh ra

Cân theo doi lương glucose sinh ra sau phản ứng. Glucose sau phản ứng có thể

xác đinh bằng phương pháp đo Iode theo ky thuât chuẩn đô ngươc.

Cách tiến hanh như sau:

Cho 1 thể tich chinh xác glucose tác dụng với 1 thể tich chinh xác (lấy dư) dung

dich I2 trong môi trương kiêm. Quá trinh oxy hoá diên ra theo phương trinh:

I2 + 2NaOH NaI + NaIO + H2O

CH2OH(CHOH)4-CHO +IO- CH2OH(CHOH)4-COOH + I-

Sau khi phản ứng xảy ra hoan toan, acid hoá môi trương bằng H2SO4 để Iode dư

dưới dang IO- chuyển vê lai I2. sau đó đinh lương I2 dư bằng dung dich chuẩn Na2S2O3.

Tinh kết quả % glucose như sau:

Trong đó:%G la glucose.

f: la hệ sô pha loãng dd C6H12O6 trước khi đinh lương.





Chương 5: KÊT LUÂN

Sự biến đổi phế liệu nông nghiệp thanh các nguôn nhiên liệu cụ thể la ethanol còn

la thách thức lớn cho các nha nghiên cứu va nha sản xuất. Các chung cân đươc cải tiến

để tăng cương tổng hơp tổ hơp enzyme thuy phân hiệu quả hay tăng cương khả năng

chuyển hóa nhiêu dang đương thanh ethanol bằng các ky thuât biến đổi gen, biến đổi

quá trinh trao đổi chất nên cân đươc phát triển để tao ra nguôn năng lương chi phi thấp

ma vẫn không ảnh hưởng đến môi trương trong tương lai.





PHỤ LỤC

1. Phương pháp xác đinh hoạt tinh enzyme cellulase bằng phương pháp

Bradford

1.1 Các bước tiến hành

Dung dich albumine 0.1mg/ml: cân chinh xác 10mg albumine pha trong 100ml

nước cất. Lắc đêu cho tan, giữ ở 20oC. Khi dùng pha loãng 100 lân, đươc dung dich

albumine có nông đô 0,01 mg/ml.

Dung dich thuôc thử Bradford:

o Coomassie Brilliant Blue: 0,001g

o Ethanol tuyệt đôi 4,7g

o Acid phosphoric 85%: 8,5g.

o Phẩm mau Coomassie Brilliant Blue đươc lam tan trong chai đựng có nắp,

bổ sung acid phosphoric 85% va chỉnh tới 100 ml bằng nước cất.

1.2 Quy trinh thực hiện

Lâp đương đương chuẩn Albumine(đương chuẩn protein):

Ham lương protein đươc khảo sát thông qua đương chuẩn albumin đươc lâp

trước với các nông đô từ 10-50µg/ml.

Để lâp đương chuẩn thi hoá chất đươc cho theo bảng sau (trong đó ông ĐC la

ông đôi chứng).





Bang: Các hoá chất dùng trong thi nghiệm lặp đương chuẩn Albumin

Ống ĐC 1 2 3 4 5

Nồng đô albumin (µg/ml) 0 10 20 30 40 50

Dung dich albumin (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5

Thuôc thử Comassie(ml) 2 2 2 2 2 2

Đo đô hấp thụ cua ông đôi chứng ở bước sóng 595nm, đưa vê 0. Sau đó đo đô

hấp thụ cua các ông còn lai. Từ đó xây dựng đươc đương chuẩn.

• Tiến hanh tương tự với mẫu, dựa vao đương chuẩn xác đinh lương protein có

trong mẫu.

2. Xác đinh lương đường khử đươc tạo ra bằng phương pháp DNS

2.1 Hóa chất Côn 96o

Sodium acetate(dùng lam chất đệm)CMC(dùng lam cơ chất)DNS(thuôc thử)Dung dich enzymeThiết bi: máy quang phổ.





2.2 Tiến hành thí nghiệm

Thực hiện môt loat 6 ông nghiệm theo bảng sau đây:

Ống nghiệm1 2 3 4 5

Đôi

chứng

Nồngđô glucose (mg/ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0

Vml Glucose (ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0

VH2O (ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 1

CMC 1% pH5 (ml) 1ml

Thuôc thử DNS (ml) 2ml

Lắc đêu các ông nghiệm nay, đem đun sôi cách thuy trong vòng 15 phút, lam

nguôi rôi đo ở bước sóng 540nm. Từ đó xây dựng đươc đương chuẩn.

Tiến hanh tương tự với mẫu, dựa vao đương chuẩn xác đinh lương protein có

trong mẫu.

Tinh toán:

Xác đinh hoat tinh cua enzyme:

CMCase CU =

Trong đó

+AT: đô hấp thụ cua dung dich có phản ứng enzyme.

+AB : đô hấp thụ cua dung dich không có phản ứng enzyme.





+1000: chuyển mg sang µg.

+Mglucose=180

+10: thơi gian phản ứng

+1: Thể tich dung dich enzyme( ml )

+V: thể tich dung dich mẫu (ml )

+F: đô tuyến tinh đươc tinh dựa vao đương chuẩn glucose.

F=(0,1/A1D1+0,2/A0D2+…+0,5/A0D5 )/5

Xác đinh ham lương cua protein:

X= ham lương (µg/ml) x đô pha loãng x thể tich

Xác đinh hoat tinh riêng cua enzyme cellulase:

HTR= (CU/mg)

3. Phương pháp tinh sạch enzyme cellulase bằng phương pháp sắc ki lọc gel

2.1 Chuẩn bi gel

Cân 4.4g gel khô (có thể nhiêu hơn môt chút để trừ hao phân thất thoát) cho vao

dung dich đệm acetate 50mM, pH5 thể tich bằng gấp đôi thể tich lớp nên gel cân dùng

cho môt côt.

Sau khi thể huyên phù đông nhất cua các hat gel hinh thanh, không khuấy, để ổn

đinh trong suôt quá trinh hydrate hoá.

Sau khi quá trinh hydrate hoá diên ra hoan tất, gan lớp nổi trên bê mặt, chuyển

dung dich trên vao binh hút chân không, khử khi trong dung dich trong khoảng 5-10

phút, thỉnh thoảng lắc nhe binh nhưng không đươc khuấy.





Thêm dung dich đệm để khử khi với thể tich gấp 2 lân thể tich lớp nên, lắc nhe.

Để gel ổn đinh cho đến khi 90-95% sô hat ổn đinh, gan hoặc loti lớp nổi trên bê mặt

bằng cách hút để loti các hat min. Lặp lai qua trinh 4 hoặc 5 lân để loai >90% hat min

lam cản trở quá trinh loc gel.

Đổ gel vao côt, đóng lỗ thoát cua côt va cho dung dich đệm lam đây 20% thể tich

côt. Tránh tao bot khi khi đổ gel vao va đảm bảo việc nhôi côt đêu.

Khi lớp nên trong côt đat từ 2-5cm, mở khoá đâu racha côt cho đến khi côt nap

đây gel. Khoá đâu ra cua côt va gắn flow adaptor. Mở khoá đâu ra cua côt va cho dung

dich đệm với thể tich gấp 2 lân thể tich lớp nên chảy qua môt lúc để diêu chỉnh tôc đô

dòng chảy.

Đóng đâu ra cua côt va điêu chỉnh flow adaptor xuông đến lớp nên gel.

Nap mẫu vao trên bê mặt lớp nên bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vao trên lớp nên

gel qua flow adaptor.

2.2 Chuẩn bi mâu

Mẫu chay sắc ký phải sach va hoa tan hoan toan trong dung dich.

2.3 Thu và xác đinh mâu tách được

Dich sau khi chay ra khỏi côt đươc cho vao 20 ông nghiệm, mỗi ông (phân đoan)

chứa 4ml. Tôc đô dòng chảy 4ml/6phút trong 1 ông.

Sau khi chay gel xong ta đem đi đo mât đô quang ở bước sóng 280 nm nhằm xác

đinh ông nao chứa ham lương cellulase cao va lam các bước xác đinh hoat tinh cua

enzyme cellulase đã đươc tinh sach trong các ông.





TAI LIÊU THAM KHAO

[1] PGS TS Nguyên Tiến Thắng. Giáo trinh công nghệ enzyme. ĐH. KTCN TP.HCM,

2010.

[2] Pham Quôc Thăng. Enzyme hoc.

[3] PGS TS Nguyên Tiến Thắng. Tai liệu hướng dẫn thực tâp mônCông nghệ enzyme

va protein. Viện sinh hoc nhiệt đới, 2010.

Tai liệu tiếng nước ngoai

[1] R.A. Nieves, C.I. Ehrman, W.S. Adney, R.T. Elander, and M.E. Himmel. Technical Communication: Survey and analysis of commercial cellulase preparations suitable for biomass conversion to ethanol. 1998.[2] Y.-H. Percival Zhang, Michael E. Himmel, Jonathan R. Mielenz. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. 2006.Website:[1] http://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_niger[2] http://cnx.org/content/m30247/latest/[3] http://cnx.org/content/m30247/latest/


http://cnx.org/content/m30247/latest/

http://cnx.org/content/m30247/latest/

http://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_niger

Documents

Bc CN Enz Hoan Chinh