1

CH 210Chromatography

By Supaporn Sangsrichan

2

ประวต 1906 Michael Tswett แยกสารท�สในพชดวยผงชอลค และวตถ

อ�นๆ เชน แปง น�าตาล polysacharides, sucrose, Indulin

1930s Lederer และกลมวจยอ�นๆ ไดทาการวเคราะห carotenoids, xanthophylls

1937 มหนงสอ Chromatography เลมแรก เขยนโดย ZechMeister

1940s Ion exchange partition and column chro. และ เร�มตนเทคนค gas chromatography

1950s มผลงานของ gas adsorption chr. และ gas liquid Chr. (partition)

partitioning of chromatography โดย Martin and Synge แหง the Wool Industries Research Association, Leeds, England ทาใหไดรบรางวล Nobel Prize สาขา Chemistry ในป 1952

มการพฒนา Paper & column chromatography

3

1960s พฒนาการใชงานของเทคนคโครมาโท-

กราฟ ในดาน เคม ชวเคม การแพทย เภสช ฯลฯ

1969 มเคร�อง HPLC ขายเปนคร �งแรก

มการพฒนาป� ม ชนดของอนภาคบรรจ และตวตรวจวดชนดตางๆ ทาให เทคนคน�เปนท�นยมใชงานไดกวางขวางกวา เทคนค GC

Tiselius (Sweden) ไดรบรางวล Nobel Prize จากงานดาน Electrophoresis

4

ความหมายของโครมาโทกราฟ

Chromatography = Chroma + Graphein ส การเขยน

chromatography ตามคาจากดความของ IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)

A method used primarily for the separation of components of a sample, in which the components are distributed between two phases, one of which is stationary phase, while the other moves in a definite direction

5

ความหมายของศพททางโครมาโทกราฟ

Stationary phase = เฟสคงท�

Mobile phase = เฟสเคล�อนท�

Elution = ขบวนการชะ พาสารออกจากคอลมน

Eluate = สารท�ถกชะ พาสารออกจากคอลมน

Eluent = สารท�ชะ พาสารออกจากคอลมน

Solid support = อนภาคของแขงท�ชวยยดเฟสคงท�ท�เปนของเหลว

Packings = อนภาคของแขงท�บรรจในคอลมน

Retention time = เวลาท�สารใชในคอลมน

6

การแบงชนดของโครมาโทกราฟ

chromatography

2

7Figure 1 Family tree of chromatographic methods.

Chromatography

Mobile phase

gas Super critical fluid

Liquid

Stationary phase

Solid(GSC)

Liquid(GLC)

Solid(SFC)

Liquid(SFC)

Solid(LC)

Liquid(LLC)

Micelles(MEKC)

Mechanism AdsorptionSize exclusion

Adsorptionpartition

Adsorption Adsorptionpartition

Adsorption(LSC)

Size Exclusion

(LSC)

IonExchange

(IEC)

Affinity(AC)

Bonded phase(BPC)

8

Figure 2 Applications of bonded phases in LC.

Bonded phase(BPC)

Liquid-Solid(LSC)

Size exclusion(SEC)

Reversed Phase(RPC)

Ion exchange(IEC)

Capillary Electrochromatography

(CEC)

Ion Suppression(ISC)

Ion Pair(IPC)

MetalComplexation

(MCC)

Micelles(LSC)

HydrophobicInteraction

(HIC)

9

ทฤษฎโครมาโทกราฟ (Chromatographic Theory)

โครมาโทกราฟ เปนวธแยกองคประกอบของสารผสม โดยอาศยความแตกตางของการกระจายขององคประกอบ ระหวาง 2 วฏภาค คอ วฏภาคคงท� (stationary phase )และวฏภาคเคล�อนท� (mobile phase )

Distribution Coefficient (Kd), Kd = คาคงท�ของการกระจายตว

โมเลกลของสารท�ถกแยกจะกระจายตวในระหวางเฟส 2 เฟส การกระจายตวน�ข�นกบคา สมประสทธ�ของการกระจายตว (Kd)

เฟสคงท� เฟสเคล�อนท�Kd

10

Liquid Chromatography1. Paper chromatography2. Thin layer chromatography3. Open column chromatography

1. ChromatographyLiquid chromatographyGas Chromatography

11

โครมาโทกราฟของเหลวแบบคอลมน(liquid column chromatography )

โครมาโทกราฟของเหลวแบบคอลมนแบงตามกลไกในการแยกสารได 4 แบบ คอ

1. Liquid liquid chromatography (LLC)(partition chromatography)

2. Liquid solid chromatography (LSC) (adsorption chromatography)

3. Ion-exchange chromatography

4. Exclusion chromatography

12

Paper Chromatograpgy

–แบงตามสถานะของเฟสท �งสองเปนโครมาโท

กราฟแบบ Liquid-liquid chromatography

–แบงตามกลไกการแยกคอ partition chromatography

•แบงไดอก 2 ชนด

–Normal phase chromatography

–Reversed phase chromatography

3

13

Normal phase chromatography

Stationary phase มความมข �วมากกวา mobile phase

Stationary phase : น�า ยดเกาะบนเย�อกระดาษ (6-12%)

Mobile phase: Solvent ท�มpolarity < น�า

Reversed phase chromatography

Stationary phase มความมข �วนอยกวา mobile phase

Stationary phase :นากระดาษมาอบไลน�าแลวชบดวยตวทาละลายอ�นๆ

Mobile phase: Solvent ท�ม polarity สงกวา st.ph.

วธทา

1. การ spot สาร ทาใหมขนาดเลกและเขมขน

2. การ Developing นากระดาษกรอง หรอ แผนTLC ท�มสารอย นามาใสลงในโถ Chamberท�มตวอลทท�อ �มตวของไอสารอย

– Ascending development

– Descending development

• 1-dimension

• 2-dimension

15

15

2-dimension PC, TLC

หมน90 °S1

S2

S1

16

3 Detection หลงจากการระเหยตวทาละลายใหแหงแลว สามารถตรวจวดตาแหนงของสารท�ถกแยกโดย

ดวยตาเปลา กรณท�สารมส

ฉายดวยรงส UV

ฉายดวยรงส IR

ฉายดวยรงส Fluorescent เกดสารเรองแสงข�น

ตรวจหาสาร Radio active

ทาปฏกรยากบสารอ�นๆท�ใหส อบดวยไอของไอโอดน

พน ninhydrin เพ�อตรวจหากรด amino

สาร AgNO3 เพ�อตรวจหา sugar

17

วธทา นากระดาษโครมาโทกราฟมาวดระยะหางจากขอบ

ประมาณ 1.5-2.0 ซม.

หยดสารละลายเปนจดเลกๆ

นากระดาษไปจมลงในตวทาละลาย(ระวงอยาใหตวทาละลายถกจดของสาร

ตวอยาง ) ปดฝาภาชนะท�งไวเปนเวลา ประมาณ 15-20นาท

ฝาปดภาชนะ

กระดาษตวทาละลายท�เคล�อนท�

ตวทาละลาย

18

นากระดาษออกมาแลวทาใหแหงวด

ระยะของตวทาละลายและสาร

ตวอยางทเคล�อนท�

นาคาท�ไดมาหาคา Rf ระยะทางทตวทาละลายเคล�อนท�

ระยะทางท�สารเคล�อนท�

4

19

Kd= Cs/Cm

สารท�เกดการแยกจะมคา Kd ท�แตกตางกนสงผลใหความสามารถในการเคล�อนท�ตางกน

การทาคณภาพวเคราะหโดยการเปรยบเทยบคา Rf หรอ คา (Rf)r ของสารตวอยางกบสารมาตรฐาน

(Rf)r : Relative retardation factor คาการหนวงสมพทธ

Rf = ระยะทางท�สารเคล�อนท�ได ระยะทางท�สารมาตรฐานเคล�อนท�

Rf = ระยะทางท�สารเคล�อนท�ได ระยะทางท�ตวทาละลายเคล�อนท�

Rf : Retardation factor

20

a=สารตวอยาง

b=สารมาตรฐาน

X= ระยะทางทตวทาละลายเคล�อนท�

Y= ระยะทางทสารตวอยางเคล�อนท�

Z= ระยะทางท�สารมาตรฐานเคล�อนท�

X

Z

ba

Y

Rf = X

Y

X

ZRf =

Z

X

X

Y

XZX

Y.(Rf)r =

Z

Y

Rf ของสารตวอยาง

Rf ของสารมาตรฐาน

Rf สมพทธ

21

สารท�มคา Rf มาก แสดงวาสารมคณสมบต

• สารเคล�อนท�ไดเรวหรอมาก

• สารถกดดซบไดนอย

• สารละลายไดด

สารมคา Rf นอย แสดงวาสารมคณสมบต

• สารเคล�อนไดชาหรอนอย

• สารถกดดซบไดมาก

• สารละลายไดนอย

สาร 2 ชนดมคา Rf ตางกน < 0.05 จะไมเกดการแยกข�น

22

สมบตของคา Rf • 1. ไมมหนวย• 2. หาไดจากการทดลองเทาน�น • 3. มคาไมเกน 1• 4. ข�นอยกบชนดของสารและชนดของตวทา

ละลาย• 5. เปนคาเฉพาะคาคงท�ของแตละสาร การวเคราะหสารเปนสารชนดเดยวกน ม

หลกการดงน�• 1. มสเดยวกน • 2. มคา Rf เทากน • 3. มระบบการทดลองเดยวกน

23

A B C D E FM

A,B,C,D, E, F = standard of known amount of compoundM= mixture of unknown

การทาปรมาณวเคราะห

24

ประโยชน

• ใชแยกสารท�มปรมาณนอยๆ ได ซ �งวธอ�นแยกไมได

• ใชแยกไดท �งสารมสและไมมส สารไมมสใช วเคราะหชนดของสารและหาปรมาณของสารผสม

• ใชทดลองความบรสทธ�ของสาร

• ใชทดลองหาเฟสเคล�อนท�ท�เหมาะสมกอนการทา HPLC

• ใชกบตวอยางมากๆได ในข �นตอน screening

5

25

Thin layer chromatography

• มหลกการและเทคนคคลาย Paper chromatography ทกประการ ตางกนตรง ชนดของเฟสคงท�

• เปนรปแบบหน�งของ plane chromatography

• เปนจดเร�มตนของการทา column chromatography เน�องจากการแยกเกดข�นเรว ระบบไมยงยาก สามารถทาไดบอยคร�ง

26

เฟสคงท� Stationary phase

เฟสคงท�สามารถเลอกไดหลายชนด เชน ทาใหเกดการแยกโดย adsorption, partition (normal phase, reversed phase), ion exchange size exclusion

Plate มขนาด 5x10, 10x20, 20x20cmความหนาของสารเคลอบ 200-250µm สาหรบอนภาคขนาด 20µm (หรอหนากวาสาหรบ Conventional plates)เกดการแยก ~200 จด ในเวลา 25 min ระยะทาง 12 cmสารอนทรย เชน cellulose powders, starch, sephadex, polyamides และ ion exchange resinสารอนนทรย เชน silica gel, alumina, glass powder และ diatomaceous earth

27

1. ใช capillary tube จด (spot) สารเขมขน 0.01-0.1%

2. หางจากขอบ 1-2cm 3. ขนาดจดสาร 5mm ใชทาคณภาพวเคราะห4. ขนาดจดสาร <5mm ใชทาปรมาณวเคราะห5. ใช Pt-iridium capillary tube ในการจด (spot)6. ใช automatic dispenser system ท�ควบคม

ปรมาตรไดแมนยา

1. การจดสาร

วธการวเคราะหดวยเทคนค TLC

28

29

30

Sample Application as SpotsCamag Linomat IV.

6

31

Sample Application as BandsCamag Nanomat.

32

1. ตองทาการระเหยตวทาละลายกอนทาการแยกสาร2. นาเพลตไปใสในภาชนะปด ภายในบรรจ mobile

phase ท�อ�มตวดวยไอสาร mobile phase (spot สารหามจมใน mobile phase)

3. mobile phase จะเคล�อนท�ผานเพลตดวยแรง capillary force (ในอตราไมคงท�, hyperbolicfunction) การเคล�อนท�ลดลงเม�อระยะทางเพ�มข�น

4. หลงจากตวทาละลายเคล�อนท�ไดประมาณ 2/3 เพลต หยดการ develop ตองทาการระเหยตวทาละลายกอนทาการตรวจวดสาร

2 Plate development

33

Chamber types used for conventional PPC. (A) Unsaturated N-chamber (1, rectangular chamber; 2, chromatographic plate; 3, mobile phase). (B) Saturated N-chamber (4, filter paper soaked with the mobile phase). (C) Unsaturated S-chamber (5, glass cover plate; 6, spacer). (D) Saturated S-chamber (7, facing chromatographic plate, soaked with the mobile phase; 8, second part of the mobile phase). (E) Ultra-micro chamber, a special variety of S-chamber (5, glass cover plate; 9, elastic inert material).

34

1. ถาสารมสมบต luminescence (สารอนทรย fluorescence, สารอนนทรย;phosphorescence phenomena) สามารถตรวจหาการเรองแสงของสารได

2. ใหเตมสาร fluorescence indicator ลงในสารเคลอบ เม�อสารท�ถกตรวจวดท�เปน non fluorescence จะเกดเปนจดจางๆ สารท�ใชเคลอบไดแก pyrene derivatives, fulorescein, morin, rhodamine B

3. พน strong oxidant เชน HNO3, KMnO4, H2SO4 จะเกดเปนจดสดา สาหรบสารอนทรย

3. Detection การตรวจหาตาแหนงของสารบนเพลต

35

4. พนสาร reagent ท�ทาปฏกรยาจาเพาะตอสาร เชน-NH2 ทาปฏกรยากบ ninhydrin-Phenol Fe(III)Cl3-reducing sugar Aniline phthalate-metal complex forming reagent

C

C

O

O

C

OH

OH

RNH2 C

C

O

O

C N

O

O

ninhydrin Blue reaction product

36

densitometer

Light path diagram of the TLC scanner. Key: 1, lamp selector; 2, entrance lens system; 3, monochromator entry slit; 4,monochromator grating; 5, mirror; 6, slit aperture disc; 7, lens system; 8, mirror; 9, beam splitter; 10, reference photomultiplier; 11,scanning object; 12, measuring photomultiplier; 13, photodiode (transmission).

7

37

Separation of pesticides in tap water on an HPTLC silica gel 60 plate by AMD. Multi-wavelength (six

wavelengths) evaluation permits resolution by optical means of fractions insufficiently separated. (Reprinted from Camag literature,

CAMAG, Muttenz, Switzerland.)

38

Open column chromatography

39

40

โครมาโทกราฟของเหลวแบบคอลมน(liquid column chromatography )

โครมาโทกราฟของเหลวแบบคอลมนแบงตามกลไกในการแยกสารได 4 แบบ คอ1. Liquid liquid chromatography (LLC)

(partition chromatography)

2. Liquid solid chromatography (LSC) (adsorption chromatography)

3. Ion-exchange chromatography

4. Exclusion chromatography

41

การแยกโดยโครมาโทกราฟแบบคอลมนแสดงการแยกของสารสองชนด

42

Mobile and Stationary phase

Mobile and Stationary phase

8

43

• ค.ศ. 1960 • ตวบรรจเปนของแขงท�ไมมรพรนเปนแกน เชน glass bead ~ 40 µm และเคลอบดวยแผนฟลมบางๆ(หนา 1-3 µm) • ของแขงมลกษณะเปนรพรน silica gel, alumina, resin หรอ polyamide

อนภาคบรรจ

• ค.ศ.1980 •อนภาคท�ใชบรรจอยในคอลมน คอ microparticulate ซ�งเปนท�นยมใชกนมากในปจจบน •เปนวสดท�บรรจใน guard column เพ�อใหทาหนาท�กรองส�งเจอปนออกจากสารละลายตวอยางและเฟสเคล�อนท�ท�จะผานเขาไปยงคอลมน ทาใหอายการใช งานของคอลมนยาวข�น

44

กลไกในการแยก (• = solute)(a) adsorption chromatography, (b) partition chromatography, (c) ion-exchange chromatography, (d) size exclusion chromatography, and (e) electrophoresis.

(a) (b) (c) (d)

(e)

45

การแลกเปล�ยนไอออน

การแลกเปล�ยนไอออน

46

วธการวเคราะหดวยคอลมนโครมาโทกราฟ

1. การเตรยมคอลมน• แพคคอลมนโดยทาเฟสคงท�ใหเปนสารแขวนลอย• เทลงในคอลมนท�ปดปลายดวยสาล หรอใยแกว• รอใหเฟสคงท�เรยงตวในคอลมน ใหมความสงตามตองการ• ระวง ตองใหมน�าบนผวหนาเฟสคงท�เลกนอย ตลอดเวลา

47

ตวดดซบท�เปนเฟสคงท�ในคอลมนโครมาโทกราฟแบบ นอรมลเฟส

AluminaMagnesiumCharcoalSilica gelCalcium oxideMagnesium carbonateCalcium carbonatePotassium carbonateSodium carbonateStarchCellulose

High polarity

Low polarity

Greatest adsorption

Least adsorption

48

Partial structure of alumina

9

49

Silica gel matrix structure

S i

OO

O

O

H

S iS i

O

O

H

O

50

ตวดดซบท�เปนเฟสคงท�ในคอลมนโครมาโทกราฟแบบ รเวอรสเฟส

•เปนการใชของแขงท�มโพลารตต�า เชน ผงยาง•ใชของแขงซบพอรทท�มของเหลว ท�ไมมโพลารตเคลอบ

* ระวง ตองใหมน�าบนผวหนาเฟสคงท�เลกนอย ตลอดเวลา*

51

2. ใสสารตวอยาง

โดยใชปเปตดดสารตวอยางแลวปลอยใกล เฟสคงท�มากท�สดโดยไมทาลายผวหนาคอลมนและไมตดขางคอลมน

สารตวอยางท�ใชมโพลารตตางกน ถาเปนนอรมลเฟสโครมาโทกราฟ สารท�มโพลารตสงจะอยในคอลมนไดนานท�สด

52

สารท�มฟงกชนนอลกรพตางๆมโพลารตตามลาดบน�

Organic acids (RCOOH), base (NH3, OH-)Alcohols (ROH), Thiol (RSH)Amines (RNH2) Nitro groups (RNO2)Aldehydes (RCHO), Ketones (RCOR)Esters (RCOOR’)Halides (RF, RCl, RBr, RI)Unsaturated hydrocarbons (R-C=C-R’)Saturated hydrocarbons (RCH2-CH2-R’)Perfluorocarbons (CnF2n+2)

High polarity

Low polarity

Longest retention time

Shortest retention time

53

3. ทาการอลท

เปนการเตมสารละลายท�มโพลารตท�เหมาะสมในการชะสารออกจากคอลมนในการชะสารตวอยางท�มโพลารตสงตองใชตวทาละลายท�มโพลารตสงดวย

สารผสมท�มโพลารตแตกตางกนกอาจใชสารชะหลายตวโดยท�เร �มจากตวท�มโพลารตต�ากอน

54

Eluting solvent

10

55

4. เกบสารตวอยาง

• เกบแบบ manual โดยเกบทละ 1-10 mL

• ใชเคร�องเกบ fraction collector

สามารถเกบตวอยางแบบถ�ได โดยไมตองเฝา

5. การวดปรมาณสารท�ออกจากคอลมน• วดโดย Optical method; UV, IR,

Fluorescence

• Electrochemical method; Voltametry, conductivity etc.

56

Fraction Collector

57

58

ขอเสยของ Open column chromatography

• การบรรจอนภาคบรรจ (packing particle)ทาได ชาและเสยเวลา

• ประสทธภาพการแยกต�า

• ตองเกบสารเปนสวนๆ ทาใหใชเวลานาน

ขอเสยของ Thin layer chromatography

• ทาเปนระบบอตโนมตไมได

• การทาซ�าไดผลไมคงท� (low reproducibility)

• ทาปรมาณวเคราะหไดไมด

• เหมาะกบการวเคราะห เตรยมสารเบ�องตน

59

Modern Liquid Chromatography

• มการพฒนาชนด วสดของอนภาคบรรจ

• มการพฒนาป� มหลายแบบ

• มการพฒนาตวตรวจวดหลายชนดข�น

ป คศ 1967 มการประดษฐ HPLC มาใชงานดานการวเคราะหนวคลโอไทด โดย Horvath

60

ขอดของ Modern Liquid Chromatography

• คอลมนท�ใชแยกมประสทธภาพมากข�น โดยสามารถเลอกชนดของเฟสคงท�และระบบของเฟสเคล�อนท�ท�เหมาะสมได

• ตวตรวจวดเปนแบบ non-destructive คอไมทาลายสาร

• คอลมนสามารถใชไดใหมได re-usable

• การวเคราะหเปนแบบอตโนมตได โดยเฉพาะข �นตอนนาสารเขาเคร�องวเคราะห

• มความถกตอง แมนยาสง

11

61

แกสโครมาโทกราฟ (Gas Chromatography)

62

Gas Chromatography (GC) เปนเทคนคการแยกสารพวกท�ม polarity ต�า สารตวอยางตองระเหยเปนแกสหรอไอ ณ จดฉดสาร carrier gas เปน mobile phase พาสารเขาส

คอลมนซ �งม stationary phase

ท�เปน liquid หรอ solid ทาหนาท�แยกสารและถกตรวจวดในสวนของดเทคเตอรตอไป

1. ถา stationary phase เปน active solid เรยกเทคนคน�วา Gas Solid Chromatography (GSC) กลไกการแยกแบบดดซบ (adsorption)

2. ถา stationary phase เปน liquid ท�เคลอบบางๆ บนผวของ inert granular solid support เทคนคน�เรยกวา Gas Liquid Chromatography (GLC) กลไกการแยกแบบแบงแยก (partition)

63

1. Gas Solid Chromatography (GSC)

• ใชหลกการ adsorption โดย stationary phase เปนของแขง ท�สามารถดดซบสารท�เปนแกสหรอไอท�ตองการแยกได ใชแยกสารท�มโมเลกลเลกๆ ท�สามารถเปล�ยนเปนแกสหรอไอ โดยม active solids (adsorptive particles) ท�บรรจอยในคอลมนเปน molecular sieves หรอ porous polymers, silica gel, alumina และ activated carbon

64

2. Gas Liquid Chromatography (GLC)

• ใชหลกการ partition สารผสมท�ตองการแยกอยในสภาพท�เปน แกส หรอไอ เม�อผานเขาสคอลมนจะแยกออกจากกนโดยความแตกตางในการกระจายตวอยใน mobile phase (carrier gas) และ stationary phase ท�เปนของเหลวท�เคลอบอยบนผวของ inert solid support

65

สวนประกอบสาคญของเคร�องแกสโครมาโทกราฟ (GC)

• สวนฉดสาร (Injector)

• เตาอบ (Oven)

• คอลมน (Column)

• ตวตรวจวดสญญาณ (Detector)

• ระบบบนทก และเกบขอมล (Recorder, Integrator)

• ผลท�ไดจะแสดงในรปของ โครมาโทแกรม (Chromatogram)

66

Gas Chromatograph

12

67

องคประกอบพ�นฐานของเคร�อง GC

Fan assisted thermostatically controlled oven

Detector

Computer

Sample injection syringe

Injection port

By pass valve

Gas cylinder

68

A Scheme of gas chromatography.

www.cubic.uni-koeln.de/.../metabolom.html

B Typical chromatogram of a cell extract of C. glutamicum.

69

คณสมบตของ Solid support

• inert

• ม large surface area

• regular shape หรอ uniform size

Solid support ท�นยมใชคอ celite หรออาจใช glass beads

70

แพค คอลมน

• Syringes

– Plunger-in-barrel (5-1000 L)

– plunger-in-needle (0.5 or 1 L) ดดสารเทาไรกไดจนถง 1 L

– 5 L syringe จายสารไดคร �งละ 0.3 L ได

Capillary Columns

อตราเรวของแกส สาหรบ 0.3 mm i.d. wall coatedopen-tubular (WCOT) ประมาณ <2 mL min-1

solvent 1 L มปรมาตร 0.5 mL ท� 250C จะเกดปญหา band broadening ตองมวธการฉดท�แตกตาง

71

Packed GC column

Capillary GC column

72Different Types of Small Bore Columns

13

73

Carrier gas• ทาหนาท�พา volatile component ในคอลมน มคณสมบต

inert ไมทาปฏกรยากบสารตวอยาง หรอ stationaryphase

• ทาหนาท�พา separated component ไปยง detector

แกสพาท�นยมโดยท�วไปไดแก ไนโตรเจน ไฮโดรเจน และฮเลยม

74

คณสมบตของ Carrier gas

• inert ไมทาปฏกรยากบสารท�ตองการแยกหรอ stationary phase

• มการแพรนอยและมน�าหนกโมเลกลต�า

• หางาย ราคาถก

• และมความบรสทธ�สง

• เหมาะกบระบบตรวจวดท�ใช

แกสพาท�ออกจากทอแกสควรทาใหบรสทธ� โดยผานทอท�บรรจดวย molecular sieve เพ�อชวยขจดไอน�าหรอไอน�ามน

75

Sampling Systems

• Gas Samples

– gas-tight syringes

– loop valves (0.1 to 10 mL)

• Solid Samples

• Liquid Samples 0-1L or diluted

• Vaporizing Injector

– injector temperature > bp components และอณหภม สงกวาอณหภม oven สงสด 50C

– injector temperature < อณหภมสงสด stationary phase ท�ทนได

76

การฉด• sample; liquid, gas, solid (solution, pyrolysis)

• Micro syringe แบบ liquid หรอ gas tight syringe

• Sample valve (reproducibility > 0.5%)

• Head space analysis (solid, liquid sample)

• Auto injector

• Autosampler

77

1) Injector

คอ สวนท�สารตวอยางจะถกฉดเขาสเคร�อง และระเหยเปน gas พรอมกบถกทาใหเปนเน�อเดยวกน กอนท�จะเขาส column อณหภมท�เหมาะสมของ injector ควรเปนอณหภมท�สงพอท�จะทาใหสาร ตวอยางสามารถระเหยไดแตตองไมถกทาใหสลายตว (decompose)

• Solvent ท�ใชละลายสารตวอยาง ไดแก ether, heptane หรอ methanol

• อณหภมของ injection port ตองสงพอท�จะทาใหสารตวอยางเกดการกลายเปนไอไดอยางรวดเรว แตตองไมทาใหสารตวอยางสลายตวและสงกวาอณหภมของคอลมน

78

2) Oven

คอ สวนท�ใชสาหรบบรรจ column เอาไว และเปนสวนท�ควบคมอณหภมของ column ใหเปล�ยนไปตามความเหมาะสมกบสารท�ถกฉด ซ�งอณหภมของ oven น�นจะสามารถปรบเปล�ยนได 2 แบบคอ

– isocratic temperature (isothermal)

– gradient temperature (program temperature)

ขอดของการทา gradient temperature คอสามารถใชกบสารตวอยางท�มจดเดอดกวาง (wide boiling range) และยงชวยลดเวลาในการวเคราะห (analysis time ) ลงไดอกดวย

14

79

Temperature programming

Isothermal at 45C

Isothermal at 145C

Programmed temp. at 30-180C

80

3) Detector

คอ สวนท�จะใชสาหรบตรวจวด องคประกอบท�มอยในสารตวอยาง ดวาสารท�เราสนใจน�นมปรมาณอยเทาไร ซ�งความสามารถของการตรวจวดน�นจะข�นอยกบชนดของ detector ท�เลอกใช

สวนประกอบท�สาคญของเคร�องแกสโครมาโทกราฟ คอ detector

detector จะทาการเปล�ยนเปนสญญาณทาง electronic กอนสงไปย งต วป ระมวลผล เพ�อ ท าการ เขยน เ ปนความสมพนธกบเวลาไดออกมาเปน chromatogram ดงน�นการเลอก detector จงตองทาใหเหมาะสมกบสารท�จะวเคราะห

81

สมบตของ Detector

• ความไวเพยงพอ

• เสถยรภาพและแมนยาสง

• ใหสญญาณสมพนธกบความเขมขนสารท�เปนเสนตรงในชวงกวาง

• อณหภมชวง RT - 400C อยางนอย

• เวลาตอบสนองเรว

• มความถกตอง นาเช�อถอ

• มความจาเพาะสง

• ไมทาลายสาร

82

Detector• general detector สามารถตรวจวดสารได

หลายๆ ประเภท • selective detector ซ�งจะสามารถเหน

เฉพาะสารท�มโครงสรางเฉพาะ, ม functional group หรอ atoms ท�จาเพาะเจาะจง

83

Detector ตรวจวดสารท�นยม1. Flame Ionization Detector FID 2. Thermal Conductivity Detector TCD 3. Flame Thermionic Detector

FTD 4. Flame Photometric Detector FPD 5. Electron Capture Detector ECD 6. Photoionization Detector PID 7. Electrolytic Conductivity Detector

ElCD 8. Mass Spectrometer MS 9. Pulsed Flame Photometric Detector

PFPD

84

Schematic diagram of a flame ionization detector for gas chromatography

15

85

1. Flame Ionization Detector (FID)

มคณลกษณะของ GC ดเทคเตอรในอดมคตแทบทกอยาง

หลกการ

การสนดาปไอของสารท�ออกมาจากคอลมนในเปลวไฟของไฮโดรเจนในอากาศหรอออกซเจนและวดไอออนท�เกดข�นจากองคประกอบของพคท�ออกจากคอลมนของ GC ปรมาณท�สามารถตรวจวด ต� าสด (minimum detectable quantity; MDQ) เทากบ 10-11 กรม และชวงของกราฟมาตรฐานท�เปนเสนตรงถง 107

สารประกอบหลายอยางท�ไมสามารถตรวจวดโดย FID เชน ไฮโดรเจน ไนโตรเจน น� า ไฮโดรเจนซลไฟด ซลเฟอรไดออกไซด แอมโมเนยและคารบอนไดออกไซด

สารประกอบไฮโดรคารบอนท�จะตรวจวดโดย FID ไดจะตองสามารถผานกระบวนการออกซเดชนได

86

2. Electron Capture Detector (ECD)

Detector ชนดน�เปน selective detector เฉพาะท�ใชวด Electrophilic compounds อยางเชน Halogens, Nitrates และ conjugated carbonyls องคประกอบหลกของ detector น�คอ 63Ni ซ �งจะให electrons เม�อมกระแสไฟฟาคงท� เม�อสารท�เปน electrophilic compounds เขาไปจบกบ electrons เปนผลใหมการเปล�ยนแปลงของกระแสในการวดสภาพไวสง แต linearity range แคบ

สมการท�เกดข�นในการวด Polychlorinated Biphenyls (PCB) โดยใช Nitrogen gas เปน Make-up gas

87

Schematic diagram of an electron capture detector for gas chromatography

+ve Electrode

-ve Electrode -Emitter

Carrier gas out

Carrier gas in

88

ลกษณะเปรยบเทยบของ GC ดเทคเตอรท�สาคญ

ดเทคเตอร หลกการ ความจาเพาะความวองไว

ชวงเสนตรง

เทอรมลคอนดกทวตดเทคเตอร (TCD)

วดความแตกตางของคาการนาความรอนของแกส

สนองตอบตอสารประกอบทกอยาง

10-10 104

เฟลมไอออนไนเซชนดเทคเตอร (FID)

เผาสารประกอบในเปลวไฟ H2 / O2 ท� 2000 องศาเซลเซยส

สนองตอบตอสารอนทรยท�สามารถถกออกซ

ไดส

10-12 107

อเลกตรอนแคพเจอรดเทคเตอร (ECD)

วดการเปล�ยนแปลงของกระแสอเลกตรอนท�เกดจากปฏกรยาจากสารประกอบอนทรยกบอเลกตรอน

ตอบสนองตอสารประกอบทกอยางท�ทาปฏกรยากบอเลกตรอน

10-14 103

(106 สาหรบ pulsed operati

on)

89

Properties of Some Gas ChromatographySelective Detectors

Detector Selectivity mode Approximation sensitivity (g)

ECD Affinity to low-energy electrons

10-13 – 10-14

Thermionic Nitrogen,

Phosphorous

10-12

10-13

Flame-photometric Sulpher 10-9

Electrolytic conductivity

Halogen compounds 10-11

Ultraviolet Aromatics 10-9

Photoionisation Partially enhanced

response to certain organic molecules as compared with FID (not truly selective)

10-11 – 10-12

การทาคณภาพวเคราะห

เพ�อวเคราะหสารตวอยางวาเปนสารอะไร มก�ชนดและเปนสารใดบาง

1. ใชคารเทนชนไทมของสารตวอยางกบสารมาตรฐาน แตสารตางชนดกนอาจ

ใหคารเทนชนไทมตรงกนกได อาจวเคราะหอกแตสภาวะการแยกตางกน เชน

คอลมน อณหภม อตราการไหล เปนตน

2. เทคนค spiking บอกวาพกไหนเปนของสารใดในสารผสมน�น โดยเตมสารสาร

น�นลงในสารตวอยาง ถาโครมาโทแกรมท�ไดมพกใดท�มพ�นท�ใตพก หรอความ

สงเพ�มข �นแสดงวา พกน�นเปนของสารท�เราเตมลงไป (known compound)

16

91

Quantitative Applications

• พ�นท�ใตพค หรอความสงของพคในการทาคณภาพวเคราะห โดยเทยบกบสารมาตรฐาน

– External standard

– Standard addition

– Area normalisation

ใชในการวเคราะหทางส�งแวดลอม ทางการแพทย ชวเคม การ พสจณหลกฐาน อาหาร หองปฏบตการปโตรเคม

High Performance Liquid Chromatography

เทคนคโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง

93

การทางาน

HPLC เปนเทคนคแยกสารผสมโดยใชเคร�อสบแรงดนสง (high pressure pump) สบของเหลวหรอตวทาละลายซ�งทาหนาท�เปนวฏภาคเคล�อนท� (mobile Phase) พาสารตวอยางท�ถกฉดเขาทางชองฉดสาร (injector) เคล�อนท�ผานอนภาคท�เปนวฏภาคคงท� (stationary phase ) ซ�งบรรจอยในคอลมน (column)

สารผสมเคล�อนท�ผานคอลมนแลวจะถกแยกออกมาในเวลาท�ตางกน ผานเขาสเคร�องตรวจวด (detector) สญญาณท�ตรวจวดไดซ �งอยในรปสญญาณไฟฟาตามเวลาและปรมาณของสารแตละตวท�ตรวจวดได โดยสญญาณจะถกสงไปยงเคร�องบนทกสญญาณแสดงผลออกมาเปนโครมาโทแกรม (chromatogram) ประกอบดวยพค (peaks) ของสารท�เปนองคประกอบของสารผสม

94

สวนประกอบตาง ๆ ของเคร�องมอ HPLC

Mobile phasereservior

Pump

Pressure gauge

Filter

Pressure sensor

Sample injector

Analytical column

Guard column

Detector

Waste

Data systemRecorder

95แผนภาพสวนประกอบตาง ๆ ของเคร�องมอ HPLC

96

การเตรยมโมบายเฟส

• เลอกใช ‘HPLC grade’ หรอคณภาพใกลเคยง

• อาจมการผสมดวยอตราสวนตางๆ หรอเตมบฟเฟอร หรอปรบพเอช

• ตองมการกรองกอนดวยเมมเบรนขนาด 0.5 or 0.8 m filter

• โมบายเฟสตองมการกาจดแกสกอน โดยเฉพาะตวทาละลายท�มข �วสง (น�า สารละลายบฟเฟอร) เน�องจากอากาศละลายไดงาย),

17

97

ภาชนะท�บรรจเฟสเคล�อนท� (mobile phase reservoir)

• เปนขวดสาหรบใสตวทาละลายท�ใชเปนเฟสเคล�อนท� มขนาดประมาณ 1 ลตร

• อาจมอปกรณท�ใชในการไลอากาศท�ละลายอย เชน ออกซเจน (degasser)

98

การอลท

• Isocratic elution เปนการใชสารละลายท�เหมาะสมเพยงตวเดยวตลอดการชะ อาจจะใช เวลานานในการแยก และหรอพกจะมหาง

• Gradient elution โดยทาการโปรแกรมตวทาละลาย คอ การผสมตวทาละลาย (>) 2 ชนด

99

Isocratic vs Gradient

100

อปกรณสาหรบฉดสารตวอยาง (sample introduction devices)

การผานสารตวอยางเขาไปยงคอลมนควรจะอยในลกษณะท�เปนแถบท�แคบมากท�สดเทาท�จะเปนไปได

วธการนยมใช

microsampling valve

microsyringe ฉดสารตวอยางผาน septum

101

CAPILLARY TUBING

• Capillaries (o.d. outer diameter) ขนาด 1/16 น�ว (1.6 mm) เปนท�นยมใชกบคอลมนท�มเสนผาศนยกลางภายใน ขนาด 0.17, 0.25, 0.50 และ 1.0mm

102

ระบบของป� ม (pumping system)

ใน HPLC มความตานทานการไหลของเฟสเคล�อนท�ท�จะไหลผานคอลมนซ �งมอนภาคขนาดเลกบรรจอย ความตานทานจะมากเม�อใชอนภาคเลกๆ และคอลมนมขนาดเลกดวย จงจาเปนท�จะตองใชป� มความดนท�สงดนเฟสเคล�อนท�ใหสามารถไหลได

18

103

หลกการเลอก pumping system• ป� มและสวนประกอบทาดวยวสดท�ทนทานตอการสกกรอน

ดวยตวทาละลายตางๆ ท �งน�รวมท �งทอ fitting และ flow cell เชน ทาดวยเหลกไรสนมคณภาพสง inert polymers เชน polytetrafluoroethylene (PTFE)

• สามารถป� มวฏภาคเคล�อนท�ท�มปรมาณมาก ๆ ไดอยางตอเน�องโดยไมมการขดของ

• ใหความดนไดถง 4,000 – 6,000 psi • ควบคมอตราการไหลไดระดบต�าจนถง 3 มลลลตรตอนาท

เปนอยางนอยและคงท�• ความคลาดเคล�อนของการควบคมการไหลตองไมเกน 1-2

%• มปรมาตรภายในต�าเพ�อความสะดวกและรวดเรวในการ

เปล�ยนวฏภาคเคล�อนท�• ไมมพลส (pulse) หรอมตวท�ใชลดพลส (pulse damper)

104

ชนดของป� ม

• mechanical pump เปนป� มท�ควบคมให อตราการไหลของเฟสเคล�อนท�มคาคงท�

• pneumatic pump เปนป� มท�ควบคมให ความดนของเฟสเคล�อนท�มคาคงท�

105

Syringe pump และ Constant displacement pump

ป� มชนดน�มลกษณะเปนกระบอกสบ (cylinder) ซ�งบรรจตวทาละลายไวแลว มกานสบ (plunger) ซ�งจะเคล�อนท�แบบสกร (screw) ผานกลองเกยร (gear box) โดยม step เปนตวควบคมอตราการไหลของวฏภาคเคล�อนท�โดยจะไปทาใหกานสบเคล�อนท�เรวหรอชาลง

106

ป�มแบบชกลกสบ (reciprocating pumps)

ป� มชนดน�เปนท�นยมใชกนมาก กานสบป� มท�จะเคล�อนท�เขาออกตลอดเวลาการทางาน เม�อลกสบ เคล�อนท� เข าจะ เ ปนการดนวฏภาคเคล�อนท�ใหเขาสคอลมน และเคล�อนท�ออกนอกจะดงเอาวฏภาคเคล�อนท�จาก reservoir เขาสลกสบผาน check valve แสดงดงรปเปนการควบคมการเคล�อนท�กระทาไดโดยการปรบอตราเรวของการชกลกสบผานมอเตอร และคอมพวเตอร

107

108

19

109

reciprocating pumps

ขอด

• มปรมาตรภายในต�า ทาใหการเปล�ยนแปลงตวทาละลายหรอวฏภาคเคล�อนท�ไดงาย

• การสงวฏภาคเคล�อนท�จะอยในลกษณะตอเน�อง

• อตราการไหลของวฏภาคเคล�อนท�คงท�ดโดยไมตองคานงถง back pressure ของคอลมน

ขอเสย

• เกดพลสข �นทาใหความไวของดเทคเตอรบางชนดมขอจากด

• ตองม pulse damper

• ปรมาตรของระบบระหวางป� มกบคอลมนเพ�มข�น

• เกดความยงยากในการเปล�ยนตวทาละลาย

• ไมเหมาะในการทา gradient elution

110

เคร�องตรวจวด (detector)

111

สมบตของเคร�องตรวจวด (detector)

• มสภาพไวสง และใหสญญาณตอบรบ (response) ท�คาดคะเนได

• ใหสญญาณตอบรบไดกบสารทกชนด• ไมมผลตอการเปล�ยนแปลงของอณหภมและ

อตราเรวของการไหลของเฟสเคล�อนท�• เช�อถอไดและงายตอการใชงาน• ความสมพนธของความเขมขนและสญญาณตอบรบ

ของเคร�องตรวจวดควรมสภาพ • เชงเสน (linearity) ในชวงกวาง• ใหขอมลเก�ยวกบคณภาพวเคราะหสาหรบพคท�

ตองการตรวจสอบ

112

ชนดของเคร�องตรวจวดในเคร�องโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง

• แบบ bulk property หรอ general detector เปนการวดการเปล�ยนแปลงคณสมบตทางกายภาพของเฟสเคล�อนท�รวมกบของตวถกละลาย เชน refractive index เปนตน

• แบบ solute property หรอ selective detectors เปนการวดการเปล�ยนแปลงของตวถกละลายเพยงอยางเดยวเทาน�น เชน UV-Vis, fluorescence เปนตน

113

Noise

114

Detection Limit

20

115

Linear detector range

116

Cell Volume

• ปรมาตรของดเทคเตอรตองมคาต�า เพ�อปองกน peak broadening ตองมคาต�ากวา 10% ปรมาตรท�ชะพคทแคบท�สด ปรมาตรมาตรฐานคอ 8 l ถานอยกวาน�จะมผลตอ detection limit

• ปรมาตร < 8 สาหรบ micro-HPLC

117

Liquid

Light

Window Gasket

UV flow cell

118

Performance of LC detectors

LC detectortype LOD

(mass)

gradient Temp. sensitivity

Flow sens.

UV s 100 pg-1 ng Yes Low No

Fluorescence s 1-10 pg Yes Low No

Electrochemical s 10 pg-1 ng No 1.5%/C Yes

RI Gen. 100 ng-1 ug No 10-4/C No

Conductivity s 500 pg-1ngNo 2%/C

Yes

Mass Spect. s 100 pg-1 ng Yes None No

FT-IR s 1 ug Yes Low No

119

อลตราไวโอเลต ดเทคเตอร (Ultraviolet detector)

• สามารถวดแสงไดในชวงความยาวคล�น 190 - 800 nm

• มโมโนโครเมเตอรสาหรบเลอกความยาวคล�น

• สามารถใชตรวจหาสารตวอยางไดท�วไป

• เหมาะสมกบ gradient elution

• ตวทาละลายชนดตางๆ ท�นามาใชเปนเฟสเคล�อนท� (mobile phase) จะไมดดกลนแสงอลตราไวโอเลต

• วเคราะหหาสารท�มปรมาณนอยๆได

• ขนาด 1-10 L เพ�อลด extra-column band broadening

120

สารท�ดดกลนแสงยว

• double bond adjacent to an atom with a lone electron pair, X=Y–Z (เชน vinyl ether);

• bromine, iodine or sulphur;

• a carbonyl group, C=O; a nitro group NO2;

• two conjugated double bonds, X=X-X=X;

• an aromatic ring;

• inorganic ions: Br-, I-, NO3-, NO2

-

21

121

UV detector

• ยว-วสเบล ดเทคเตอร 3 ชนดท�นยมใช ไดแก– 1. Fixed-wavelength UV detector

– 2. Variable UV-Vis detector

– 3. Photodiode-array detector (PDA)

122

1. Fixed-wavelength UV detector

ประกอบดวย flow-through cell และแหลงกาเนดแสง โดยทาเปนลาแสงดวยเลนสท�ทาดวยควอทซใหแสงผานเซลลของสารละลายมาตรฐานและสารตวอยาง แสงท�ผานออกมาจะผานการกรองดวยฟลเตอร จงผานไปยงโฟโตเซลล หรอโฟโตไดโอด 2 ตว

• ดเทคเตอรแบบ Fixed-wavelength แทบไมใชกนแลว หลอดกาเนดแสงใช mercury (254 nm), cadmium (229 nm), และ zinc lamps (214 nm)

123

2. Variable UV-Vis detector

• แหลงกาเนดแสงประกอบดวย D2 และ W lamps

• Deuterium lamps ใหแสงแบบตอเน�อง (-340 nm,

• Tungsten–halogen ใหแสงชวง near-UV และ visible (340–850 nm) มกใชรวมกบหลอดดวท�เรยม

• มโมโนโครเมเตอร เพ�อใชสาหรบเลอกความยาวคล�นตามท�ตองการได

124

3. Photodiode-array detector (PDA)

เปน solid state detector ประกอบดวยโฟโตไดโอดจานวนมาก สามาถวดแสงไดหลายๆ ความยาวคล�นได ในขณะเดยวกน

ระบบทางเดนของแสงจะเปนแบบยอนแสง “ Reverse Option” คอแสงจากแหลงกาเนดหรอจากหลอดยวจะผานไปยง flow-through cell กอนท�จะนาไปยงโมโนโครเตอรหรอเกรตตง

เม�อแสงท�ตกกระทบบนเกรตตงจะกระจายออกเปนความยาวคล�นตางๆกอนตกกระทบบนแผงของโฟโตไดโอด

scan 1msec/spectrum

125

HPLC-UV ท�วไป

126

Principle of a diode array detector.

22

127

ลกษณะของสเปกตรมท�ไดจากการเขยน 3 มต ระหวางการดดกลน ความยาวคล�น และเวลา

128

129

Ion-Exchange Chromatography

By Supaporn Sangsrichan

130

Ion-Exchange Chromatography

• บทนา

• หลกการ

• สมบตของ ion exchangers

• ผลของ mobile phase

• การประยกตใชงาน

131

Ion-Exchange Chromatography

• Ion-exchange chromatography ถกใชในการแยกกรดอะมโน ต �งแตป 1956.

• เทยบไดกบ classical column chromatography ท�ใช silica หรอ alumina แตบรรจเรซน หรอ เจลท�ใชมขนาดใหญ ความดนต�า การแยกสารท�ซบซอนใช

เวลานานหลายวน ดงน�นจงมการพฒนาการแยกท�ให ความรวดเรว คอ HPLC และมการพฒนาเฟสคงท�มากมาย รวมถง ion-exchange chromatography

132

IEC

• เทคนคท�ใชสาหรบแยกสารประกอบท�มประจ สารประกอบท�แตกตวเ ปนไอออนได เชน สารอนทรยท�เปนกรดหรอเบส และสารประกอบท�สามารถเกดอนตรกรยากบ ionic groups

23

133

หลกการ

Ion-Exchange Chromatography เฟสคงท�จะม side-chain ท�ประกอบดวยฟงกชนนลกรปท�มประจ เฟสเคล�อนท�สวนใหญจะประกอบดวย counter ion ซ�งกคอ ไอออนท�มประจตรงขามกนกบ ionic group ท�อยบนผวของอนภาคท�ใช เปน ion-exchanger และ counter ion น�จะอยในสภาวะท�สมดลกบประจท�อยบน resin ในลกษณะของ ion pair

134

สมดลท�เกด

X+ + R-Y+ Y+ + R-X+

Cation exchange:

X- + R+Y- Y- + R+X-

Anion exchange:

X = ไอออนตวอยาง

Y = counter ion

R = exchanger

135

เฟสคงท�

• สารอนนทรย เชน sodium aluminosilicate, montmorillonite

• สารสงเคราะห เชน Zirconium

• copolymerization

• เรซนท�มรพรน ควบคมไดดวย %cross linking (1-12%, 8% นยมใช)

136

CH = CH2

X

styrene

+ Y

Para - Divinylbenzene

-CH — CH2 — CH — CH2 — CH — CH2 — CH -

-CH — CH2 — CH — CH2 — CH — CH2 — CH -

สารโพลเมอรท�สงเคราะหไดจากการทาโพลเมอรไรซ ท�นยมใชคอเรซนท�เตรยมจากการโพลเมอรสารสไตรนกบไดไวนลเบนซน

CH = CH2

CH = CH2

137

สามารถแบงเรซนตามคณสมบตของหมธาตท�ใสเขาไปได 2 ชนด

1 ชนดแลกเปล�ยนแคทไอออน (cation exchange)

คอเรซนชนดท�มหมธาตท�เปนกรดอยในวงอะโรมาตก เตรยมไดโดยนากรดซลฟรก + โพลเมอรของ styrene และ divinylbenzen หม SO3H ดงรป

-CH — CH2 — CH — CH2 -

-CH — CH2 — CH — CH -

SO3- H+

SO3- H+

SO3- H+

-CH — CH2 — CH — CH2 -

138

2 ชนดแลกเปล�ยนไอออนลบ (Anion Exchange)

คอเรซนชนดท�มหมธาตท�เปนเบสอยในวงอะโรมาตก เตรยมโดยทาปฏกรยาเคมระหวางหมของเบสกบโพลเมอรกบไดไวนลเบนซนท�ถกทาคลอโรเมทลเลตแลว

N(CH3)3+OH-

N(CH3)3+OH-

N(CH3)3+OH-

N(CH3)3+OH-

N(CH3)3+OH-

N(CH3)3+OH-

24

139

Cation exchanger

140

การหาสภาวะท�เหมาะสม

• ชนดของ ion exchanger,

• pH ของ mobile phase,

• ionic strength (ความเขมขน) ของ mobile phase

• ชนดของ counter ions ใน mobile phase

141

สมบตของ ION EXCHANGERS

• ion exchangers ท�มใชสวนใหญมช�อยอ ตวแลกเปล�ยนประจท�นยมใชแสดงดงตาราง

• 4 ชนดแรกเปนคายอท�บอกถงชนดของการแลกเปล�ยนประจ

• ช�อยอสวนท�เหลอสมพนธกบหมฟงกชนตางๆ

• หมฟงกชนจะเช�อมตอกบเรซนท�เปนสารอนทรย เชน styrene–divinylbenzene หรอ ผวซลกา

142

คายอท�ใชกบตวแลกเปล�ยนไอออน

Abbreviation Meaning Type

SAX Strong anion exchanger

WAX Weak anion exchanger

SCX Strong cation exchanger

WCX Weak cation exchanger

AE Aminoethyl –CH2–CH2–NH3+ WAX

CM Carboxymethyl –CH2–COO- WCX

DEA Diethylamine –NH(CH2–CH3)2+ WAX

DEAE Diethylaminoethyl –CH2–CH2–NH(CH2–CH3)2+ WAX

DMAE Dimethylaminoethanol –O–CH2–CH2–NH(CH3)2+ WAX

PEI Polyethyleneimine –(NH–CH2–CH2–)n–NH3+ WAX

QA Quaternary amine –NR3+ (R :CH3) SAX

QAE Quaternary aminoethyl –CH2–CH2–N(CH2–CH3)3+ SAX

SA Sulphonic acid –SO3- SCX

143

(a) cation exchanger ท�ไมแตกตวเปนไอออน(b) cation exchanger ท�แตกตวเปนไอออนท �งหมด(c) cation exchanger ท�แตกตวเปนไอออนบางสวน

(a)

(b)

(c)

144

Exchange capacity of a weak cation exchanger with pKa 4.2 (left) and

of a weak anion exchanger with pKa 9.0 (right).

25

145

ส�งท�มผลทาใหเรซนมความประพฤตตางกน

1. ขนาดของเรซน

2. Degree of cross – linking

3. Strength of functional group

4. Number of functional group

146

1. ขนาดของเรซน มผลตออตราเรวในการแลกเปล�ยนไอออนและการซมผานของสารละลายออกจากคอลมน

2. Degree of cross – linking จะมผลทาใหเรซนมความแขง มการพองตว และมขนาดรตางๆ กน

3. Strength of functional group มผลตอคาสมประสทธ�ของการกระจายของไอออนระหวางเรซนกบสารละลาย

4. Number of functional group มผลทาใหเรซนมความจตางๆ กน

147

กฎการเลอก (Selectivity rules)

Ion Exchange Chromatography สามารถแยกไอออนหรอโมเลกลได เน�องจากประจไอออนหรอโมเลกลท�มประจตางกนจงใชเวลาอยในคอลมนตางกนท �งน�ข �นอยกบ

1. ชนดของเรซน

2. ชนดของหมฟงกชน

3. เฟสเคล�อนท�หรอตวอลท

148

ความสามารถดงดดระหวางเรซนกบไอออน สามารถคานวณไดจากกฎของคลอมบ

q(ion) คอ ประจของไอออน

q(resin) คอ ประจของไอออน

r คอ ระยะหางของประจท �งสอง

2sin

221

r

qq

r

qqF

reion

149

1. ในสารละลายน�าท�มความเขมขนของไอออนต�าๆ ไอออนท�มประจสงกวาจะแลกเปล�ยนไอออนกบเรซนไดดกวา

2. ไอออนท�มประจเทากนในสารละลายน�าท�มความเขมขนต�า ไอออนท�ถกน�าไฮเดรทไดนอยกวาจะแลกเปล�ยนไอออนกบเรซนไดดกวา

3. เรซนท�มองศาเช�อมโยงตางกน จะทาใหเกดการเลอกได

4. ความเขมขนสงๆ ความแตกตางของการเลอกไอออนท�มประจตางกนจะลดลง

สรปกฎเกณฑสาหรบควบคมการประพฤต

ของไอออนในการแลกเปล�ยนของเรซนดงน�

150

5. ไอออนของสารอนทรยท�มน�าหนกโมเลกลสงๆ หรอสารประกอบเชงชอนของโลหะตางๆ ท�เปนแอนไอออนสามารถแลกเปล�ยนไอออนไดด

6. ท�อณหภมสงๆ ในสารละลายท�ไมใชน�าหรอสารละลายท�มความเขมขนสงๆ การแลกเปล�ยนไอออนท�มประจเหมอนกนไมเพ�มข�นเม�อเพ�มอะตอมมกนมเบอร

26

151แผนภาพแสดงเคร�องมอสาหรบเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ

Mobile phase

reservoir

pump Injector

Separatingcolumn

Stripping column

ConductivitydetectorReadout

152

การประยกตใชงาน

153

Separation of lanthanides by cation exchange. (Reproduced bypermission of Vieweg Publishing from A. Mazzucotelli, A. Dadone, R. Frache and F. Baffi, Chromatographia, 15, 697 (1982).) Conditions: column, 25cm4mm i.d.; stationary phase, Partisil SCX, 10 mm; mobile phase, 1.2 ml min-1 2-hydroxyisobutyric acid in water, gradient from 0.03 to 0.07 M; visible-range detector, 520nm, after derivatization with 4-(pyridylazo)-resorcinol.

154

• Separation of nucleotides and related compounds by anion exchange. (Reproduced by permission of Vieweg Publishing from D. Perrett, Chromatographia,16, 211 (1982).)

• Conditions: stationary phase, APS-Hypersil, 5 mm; mobile phase, A=0.04M KH2PO4 (pH 2.9), B=0.5M KH2PO4 +0.8M KCl (pH 2.9), linear gradient from A to B in 13 min; UV detector, 254 nm