Diagnóstico de Laboratorio

de Malaria o Paludismo Dra. Mercedes Subirats

S. Microbiología. H. Carlos III

Dra. Rocío Martínez

S. Microbiología. H. U. Puerta de Hierro-Majadahonda

Paludismo

Existen 4+1 tipos de Plasmodium que

preferentemente afectan al Humano

• Plasmodium falciparum

• Plasmodium vivax

• Plasmodium ovale

• Plasmodium malariae

• +1: Plasmodium knowlesi (parásito del

mono que aparece en zonas boscosas

de Sudeste asiático)

Fiebre Paludismo = Malaria

Toda fiebre en un paciente

procedente del Trópico es

PALUDISMO mientras no

se demuestre lo contrario

La principal enfermedad del viajero y

del inmigrante procedente de países tropicales

Nos llaman de Urgencias:

“ Tenemos un paciente que acaba de llegar de

Guinea con fiebre y parece una pielonefritis.

Os enviamos una orina para cultivo”

Nuestra respuesta:

1. “Vale, de acuerdo”

2. “Vale, pero enviarnos también una gota

gruesa para descartar malaria”

La existencia de un proceso que

justifique la fiebre NO EXCLUYE EL

PALUDISMO

Diagnóstico parasitológico

• Diagnóstico directo

– Muestra: sangre periférica

• Tinción de Giemsa o Field de la gota gruesa y

extensión o frotis fino

– Visualización del parásito

– Identificación de la especie

– Cuantificación de la parasitemia

– Monitorización del tratamiento

• Técnicas de diagnóstico rápido: Inmunocromatografía

• Técnicas de biología molecular: PCR

• Diagnóstico indirecto: Serología

Diagnóstico

El diagnóstico en nuestro medio actualmente se

basa en el uso combinado y secuencial de:

Pruebas rápidas de detección de antígenos proteicos

del parásito

Gota gruesa y extensión que permiten la

visualización del parásito teñido con una coloración

de Romanowsky (Giemsa, Field…)

Recogida de la muestra

• ¿Cuándo?

– Extracción durante el pico febril

• ¿Cómo?

– Digitopunción

– Venopunción, tubo con EDTA (= Hemograma).

• Gota gruesa: mayor sensibilidad

– Sangre con EDTA: Extenderla lo suficiente

para poder ver a través de ella las manecillas

del reloj.

– Sangre capilar: Extenderla durante 1 minuto

para eliminar la fibrina.

– Dejar secar 30 minutos antes de teñir.

• Extensión: diagnóstico de especie

Diagnóstico microscópico

El “gold standard” es la Gota Gruesa.

Ventajas • Sensibilidad: detección 5-50 parásitos/µl (gota gruesa)

• Especificidad: eficaz al dar la especie y fase del ciclo (extensión)

• Clínicamente es útil la información: cuantificación de de parasitemia, especie y fase del ciclo

• Control del tratamiento (ojo: gametocitos sólo)

• Es barato

Inconvenientes • Require cursos de entrenamiento y experiencia

• Requiere un buen microscopio y tinciones

Tinción de Field

A B B

A

Solución A

Solución B

(se diluye a

1/5 para la

extensión)

AGUA pH 7’2

¿Cómo distinguimos las distintas

especies? • Hematíe parasitado

– Tamaño

– Presencia de granulaciones

– Existencia de infecciones múltiples

• Características del trofozoito – Tamaño, forma y número de parásitos

– Número de núcleos por anillo

• Características del esquizonte – Tamaño y forma

– Número y disposición de los merozoitos

– Forma y distribución del pigmento palúdico

• Características de los gametocitos – Tamaño y forma

– Forma y distribución del pigmento palúdico

P. knowlesi

Y un poco de Geografía

Pv

P. falciparum

Aspecto de los hematíes:

Tamaño normal

Manchas de Maurer

Infecciones múltiples frecuentes

Infecta tanto los hematíes jóvenes como viejos.

Parasitemia puede ser >>2%

Trofozoitos:

Anillos jóvenes pequeños, delicados

1/6 del diámetro del hematíe

Frecuentemente con gránulos dobles de

cromatina

Algunos anillos en el borde del hematíe, forma

“accolé”

P. falciparum

Gametocitos:

Alargados o en forma de media luna o banana

Esquizontes: sólo en malaria cerebral

6-32 merozoitos (promedio 24)

Estadios encontrados en sangre periférica:

Anillos y/o gametocitos

Los pre-esquizontes y esquizontes se

desarrollan en los microcapilares

No se observan en sangre periférica

excepto en infecciones graves

Gota gruesa

Esquizontes de P falciparum secuestrados en

la microcirculación cerebral

Paludismo grave: P falciparum con

esquizontes

P. malariae

Aspecto de los hematíes:

Tamaño normal o disminuido

Infecta a hematíes viejos.

Parasitemia normalmente < 1%

Raramente se observan puntos o manchas

de Ziemann

Trofozoitos:

Redondeados, compactos con citoplasma

denso, cromatina grande

Formas características:

Formas en “ojo de pájaro”

Trofozoitos en banda o acintados

P. malariae

Esquizontes:

6-12 merozoitos (promedio 8)

Esquizontes “en roseta” con el pigmento

palúdico en el centro

Gametocitos:

Redondo u ovalado, compacto. Casi ocupa

todo el hematíe

Estadios encontrados en sangre periférica:

Todos los estadios

Suelen observarse pocas formas “en anillo” o

gametocitos

P. malariae

P. vivax

Aspecto de los hematíes:

Tamaño aumentado o normal

Infecta hematíes jóvenes (reticulocitos).

Parasitemia normalmente <2%

Punteado de Schüffner: Punteado fino,

distribución uniforme en todo el hematíe

Presente en todos los estadios excepto formas

anulares iniciales

Trofozoitos:

Citoplasma irregular, anillo grueso ameboide,

aspecto difuso, irregular

Basofilia punctata

No hay parasito

No confundir

P. vivax

Esquizontes:

12-24 merozoitos (promedio 16).

Ocupa casi todo el hematíe

Gametocitos:

Redondo u ovalado. Casi ocupa todo el hematíe

Estadios encontrados en sangre periférica:

Todos los estadios

Amplia gama de fases visibles en un frotis

P. vivax

P. ovale

Aspecto de los hematíes:

Tamaño aumentado

Algunos hematíes infectados son ovales y/o

desflecados

Infecta hematíes jóvenes (reticulocitos).

Parasitemia normalmente < 2%

Punteado de Schüffner

Trofozoitos:

Redondeados, compactos, a veces ligeramente

ameboides

Los trofozoitos en desarrollo tienen una gran

masa cromatínica

P. ovale

Esquizontes:

6-14 merozoitos (promedio 8) rodeando al

pigmento malárico

Gametocitos:

Redondo u ovalado. Casi ocupa todo el

hematíe

Estadios encontrados en sangre

periférica:

Todos los estadios se pueden ver.

SINCRONIZACIÓN DE FASES: Todos son

trofozoítos o son esquizontes o son

gametocitos.

Se desincronizan cuando 2% parasitemia

Pre-esquizonte de P ovale

Gametocitos

Trofozoitos

Esquizontes

P. knowlesi

Aspecto de los hematíes:

Tamaño normal o disminuido

No son raras las infecciones múltiples

Trofozoito:

Anillos jóvenes pequeños, delicados

1 o 2 puntos grandes de cromatina

Ocasionalmente, anillos en el borde del

hematíe, forma “accolé”

Trofozoito maduro:

Redondeados, compactos con

citoplasma denso y cromatina grande

Ocasionalmente trofozoitos en banda o

acintados

Gametocitos

Trofozoitos

Esquizontes

P. knowlesi

Esquizontes:

Hasta 16 merozoitos

Esquizontes “en roseta” con el pigmento

palúdico en el centro

Gametocitos:

Redondo u ovalado, compacto. Casi ocupa

todo el hematíe

Estadios encontrados en sangre

periférica:

Todos los estadios

P. knowlesi

• Trofozoito joven o anillo semejante al de

P. falciparum

P. knowlesi P. falciparum

P. knowlesi • Trofozoito maduro, esquizonte y

gametocitos semejantes a P. malariae

P. knowlesi

P. malariae

Trofozoitos

P. vivax

P. falciparum P. malariae

P. ovale

Esquizontes

P. vivax

P. falciparum P. malariae

P. ovale

Gametocitos

P. vivax

P. falciparum P. malariae

P. ovale

Cálculo de la parasitemia

Calcular el porcentaje de hematíes parasitados (frotis):

1. Con el objetivo de inmersión, seleccionar un área de la extensión fina con una densidad aproximada de 250 hematíes/campo.

2. Contar el número de hematíes parasitados en 8 campos.

3. Dividir por 20 para calcular el porcentaje (%) de hematíes parasitados.

Inmunocromatografía

Principio

Contiene anticuerpos monoclonales frente a antígenos especificos del Plasmodium

Diferencian P falciparum del resto de las especies, algunas diferencian P. vivax, pero no pueden diferenciar entre las demás

Antígenos de Paludismo detectados:

Enzimas metabólicas que se encuentran en todas las especies:

1. pLactato deshidrogenasa (pLDH)

2. Aldolasa

Proteína Rica en Histidina 2 (HRP 2) se encuentra sólo

en P falciparum

Inmunocromatografía

• Ventajas:

Fáciles de realizar

Rápidas

No precisan microscopio

No precisan personal entrenado

Útiles en el diagnóstico en gestantes debido al secuestro placentario de los parásitos (HRP-2)

• Desventajas:

Falso N si parasitemia baja

No miden la parasitemia

Bien para P. falciparum. Cuidado con otras especies

No distinguen la especie

Persisten(+) tras infección aguda y tras tratamiento

Falso P con factor reumatoide

Precio

Evitar humedad (Tª 2-30ºC)

Negativo Pl. no falciparum Pl. falciparum o

infección mixta

RESULTADOS

pLDH

o

Aldolasa

HRP 2

Inmunocromatografía RDT (rapid test diagnosis)

PCR

Ventajas:

5 parásitos / µl

(0,0001%)

Identificación de

especie

Mutaciones de

resistencia

S y E ~ 100%

Inconvenientes:

Precio

Laboriosa

Resultado en horas

No distingue entre parásitos viables y no viables

Infecciones mixtas, monitorizar respuesta al tratamiento

y diagnóstico temprano de fallo terapéutico

OTRAS TÉCNICAS

SEROLOGÍA:

Baja S

Anticuerpos detectables años tras infección

Uso en bancos de sangre y estudios epidemiológicos

IFI: títulos >1/1320: infección aguda

QBC:

Centrifugación capilar

Tinción con fluorescencia del DNA parasitario

S: 88-98% E: 58-90%

No da especie

Microscopio de fluorescencia

Trofozoitos

Esquizontes: 16-23

Gametocitos: 24-25

http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Malaria.htm

Gracias