Dr inż. Barbara Sokołowska IBPRS

Praca w „systemie jakości” /akredytacji od 1996

Współpraca z PCA od 2000

Współpraca z firmami szkoleniowymi: Omex, CE2, GFW, bioMerieux, Argenta, Merck

2005 Sympozjum Klubu POLLAB, Referat:

Porównania międzylaboratoryjne jako element zapewnienia jakości w badaniach mikrobiologicznych żywności (dot. walidacji metod oznaczania/wykrywania patogenów)

Przewodnik sterowania jakością badań, walidacji i szacowania niepewności mikrobiologicznych metod badania żywności. Wyd. Argenta Sp. z o.o., Warszawa, 2005

2005-2006 trzy częściowy cykl artykułów: Statystyka w mikrobiologii żywności, Laboratoria Aparatura Badania LAB

Walidacja metod mikrobiologicznych badania żywności. Wyd. Argenta Sp. z o.o., Warszawa, 2007

Niechęć laboratoriów do badania próbek

naturalnie zanieczyszczonych na etapie

walidacji/potwierdzenia

Dobór matryc

Dobór szczepów

Dobór poziomu kontaminacji

Nieznajomość norm/opisów metod badawczych

Niechęć do współpracy z pożywkarniami/

„lekceważenie” znaczenia jakości

i „możliwości analitycznych” pożywek

Zbytnie skupienie się na niepewności wyników

Badano świeży ser, mięso i suszony proszek jajeczny, na 4 różnych poziomach kontaminacji:

próbki negatywne, nie zawierające S. aureus

niski poziom 103 jtk S. aureus

średni poziom od 104 do 105 jtk S. aureus

wysoki poziom od 105 do 106 jtk S. aureus

RM około 5000 jtk S. aureus przygotowany przez RIVM (Holenderski Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego).

Dodatkowo próbki zawierały taki sam poziom S. epidermidis lub innych koagulazo-ujemnych szczepów Staphylococcus spp. Próbki zawierały naturalną mikroflorę.

parametr metoda r R

Ogólna liczba

drobnoustrojów

PN-EN ISO-

4833:2004 0,25 0,45

Liczba gronkowców

koagulazo-dodatnich

PN-EN ISO 6888-

1:2001 +A1:2004 0,28 0,43

Liczba gronkowców

koagulazo-dodatnich

PN-EN ISO 6888-

2:2001 +A1:2004 0,22 0,33

Liczba Bacillus cereus PN-EN ISO

7932:2005 0,29 0,42

Liczba Clostridium

perfringens

PN-EN ISO

7937:2005 0,21

0,25

0,26÷0,65

0,29÷0,72

Badano świeży ser, mięso i suszony proszek

jajeczny, o różnym poziomie zanieczyszczenia:

0 jtk L. monocytogenes w 25g

5-10 jtk L. monocytogenes w 25g

50-100 jtk L. monocytogenes w 25g

Każda badana próbka zawierała naturalną

mikroflorę oraz dodatkowo 50 – 100 jtk

L. innocua w 25 g

Parametr Wartości średnie

Specyficzność 97,4%

Czułość 85,2%

Powtarzalność 88,7%

Odtwarzalność 84,4%

Selektywność to zdolność metody alternatywnej do wykrycia

drobnoustroju docelowego spośród szerokiej gamy szczepów

Nieselektywność to brak zakłóceń ze strony odpowiednich

szczepów nie będących docelowymi w metodzie alternatywnej

Badania selektywności i nieselektywności wykonuje się dla

czystych szczepów bez dodatku próbek żywności

Należy wyselekcjonować co najmniej 50 szczepów z próbek żywności (30 w przypadku Salmonella)

Wykonać badania metodą alternatywną przy poziomie zanieczyszczenia 10-100 razy większym niż minimalny względny poziom wykrywalności metodą alternatywną

Należy wyselekcjonować co najmniej 30 szczepów powodujących zakłócenia ze szczepem docelowym i naturalnie występujących w materiałach żywnościowych włączonych w proces walidacji

Wykonać badania metodą alternatywną przy poziomie podobnym do największego oczekiwanego w użytych do walidacji kategoriach żywności; do hodowli można stosować pożywkę nieselektywną

Badać próbki naturalnie zanieczyszczone ewentualnie kontaminować na poziomie naturalnego zanieczyszczenia (najlepiej przez dodatek próbki naturalnie zanieczyszczonej)

Walidacja/potwierdzenie to proces

zakończony wystawieniem dokumentu

potwierdzającego przydatność metody do

danego/konkretnego zastosowania

Walidacja/potwierdzenie to także proces

ciągły

do laboratorium trafiają różne, nieznane próbki

zmienia się personel

niektóre metodyki wymagają stałego stosowania

szczepów odniesienia (np. w wykrywaniu

Campylobacter) lub walidacji (w badaniach

kosmetyków)

Metoda znormalizowana IFU No 12

Wymaga stosowania szczepów odniesienia Alicyclobacillus acidoterrestris (psujący soki) i Alicyclobacillus acidocaldarius (niepsujący) w każdej serii badań

Plusy stosowania Łatwe wykrycie efektu hamowania przez nową

matrycę (np. potwierdzenie wykonano pierwotnie dla zagęszczonego soku jabłkowego a do laboratorium trafia zagęszczony sok wiśniowy)

Minusy Koszty

Metoda znormalizowana PN-EN ISO 6579:2003

Stosunek masy próbki do pożywki namnażającej - zwp 1:10 ale w przypadku hamowania stosować większe rozcieńczenia – nawet 1:1000 (wg. PN-EN ISO 6887-4:2005)

P. 9.1.2.2 Uwaga: odczyn pH produktów żywnościowych kwaśnych i ukwaszanych jest bardziej stabilny jeżeli stosowana jest zwp o podwójnym stężeniu składników

Plusy stosowania szczepów odniesienia w serii badań Łatwe wykrycie efektu hamowania przez nową matrycę (np.

potwierdzenie wykonano pierwotnie dla soków: marchwiowych, jabłkowych i z buraków a do laboratorium trafiają owoce goji lub zagęszczony sok z aronii)

Minusy Koszty

Możliwość zanieczyszczenia krzyżowego

PRZYKŁADY

Metoda znormalizowana PN-ISO 15214:2004

p. 9.3 Uwaga: Z powodu możliwości wzrostu na

pożywce MRS drobnoustrojów innych niż bakterie

fermentacji mlekowej, dla niektórych produktów

może być konieczne potwierdzenie kolonii

prostymi metodami: barwienie metodą Grama

lub test na wytwarzanie katalazy

bakterie fermentacji mlekowej są katalazo-ujemne

drożdże są katalazo-dodatnie

p. 5.3.2.2 Jeżeli zachodzi ryzyko silnego

zanieczyszczenia produktu drożdżami należy

dodać do pożywki kwas sorbowy

Metoda znormalizowana PN-EN ISO 11290-1:1999

+ A1:2004

p. 9.4.4.1 Uwaga 1: niektóre szczepy będące w

stanie stresu wykazują bardzo słabą strefę (lub

jej nie wykazują), zwłaszcza szczepy poddane

stresującemu działaniu kwasu

p. 9.4.4.1 Uwaga 2: Niektóre szczepy L.

monocytogenes charakteryzują się słabą

aktywnością PIPLC. Takie szczepy wykrywane są,

gdy całkowity okres inkubacji jest dłuższy niż

wskazano, na przykład 4 dni. Niektóre z tych

szczepów mogą być chorobotwórcze

Metoda znormalizowana PN-ISO 7889:2007 + Ap1:2007

Nadaje się do jogurtów tradycyjnych zawierających tylko Lactobacillus delbrücki subsp. bulgaricus i Streptococcus salivarus subsp. thermophilus

Pożywki kMRS i M17 nie są selektywne i rosną na nich inne bakterie fermentacji mlekowej np.: Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus

Lactobacillus delbrücki subsp. bulgaricus nie rośnie na M17

Konieczne jest wykonywanie preparatów mikroskopowych dla rozróżnienia pałeczek od paciorkowców

Metoda znormalizowana PN-ISO 21527-2:2009

Zakres:

Do oznaczania liczby drożdży osmofilnych i

pleśni kserofilnych

Przykłady żywności:

- suszone owoce, ciastka, dżemy

- suszone mięsa i solone ryby

- ziarno zboża i produkty zbożowe, mąki

- orzechy, przyprawy i zioła

Zarówno pożywki jak i rozcieńczalniki

stosowane w oznaczaniu liczby drożdży

osmofilnych i pleśni kserofilnych powinny

mieć obniżoną aw

Wg PN-ISO 21527-2:2009 zaleca się stosować

rozcieńczalnik zawierający glicerol lub D-

glukozę w ilości 20% – 35% (stężenie masowe)

Jako baza 0,1% woda peptonowa (z

wyjątkiem przypadków określonego

przygotowania próbki)

Możliwy dodatek Tween 80

Dichloran (2,6-dichloro-4-nitroanilina)

Glicerol (18% objętościowo, 22% masowo)

Chloramfenikol

Opcjonalnie

Drugi antybiotyk: chlorowodorek

chlorotetracykliny

Sole mineralne: w celu wykształcenia

wszystkich cech morfologicznych

Posiew powierzchniowy

Jeżeli spodziewamy się obecności

Xeromyces bisporus czas inkubacji

wydłużamy do 10 dni

Wzrost w zakresie aw 0,96-0,61 z optimum 0,85

X. bisporus izolowano z lukrecji, suszonych

śliwek, tytoniu, suszonych daktyli, czekolady,

sosu czekoladowego, ciast zawierających

suszone owoce, pomadek, słodyczy z galaretką

Szczepy do oznaczania żyzności

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763

Eurotium rubrum ATCC 42690

Wallemia sebi ATCC 42694

Aspergillus restrictus ATCC 42693

Pożywka referencyjna – zwalidowana

Sabouraud

Klienci porównują ceny analiz

Klienci oczekują, że znakiem akredytacji

potwierdzono prawidłowość wykonywania

badania

Laboratoria podejmują się badań

i wydają opinie na tematy na których się nie

znają

Auditorzy podejmują się ocen badań na

których się nie znają