결핵항원특이항체를이용한결핵조기진단용항체단백질칩개발

Development of antibody-based protein array system usingM. tuberculosis-specific antibody for early detection of

tuberculosis

주관연구기관 : 부산대학교산학협력단 직인

A080854

보건복지부

1. 겉표지 앞면( )

보건의료기술진흥사업Health & Medical Technology R&D Program

1. 이보고서는보건복지부에서지원한보건의료기술진흥사업의최종보고서입니다.

2. 이보고서내용을발표할때에는반드시보건복지부에서지원한보건의료기술진흥사업의연구결과임을밝혀야합니다.

A0808

54

결핵항

원특이

항체를

이용한

결핵 조

기 진단

용항체

단백질

칩개발

보 건복 지가 족부

1. 겉표지 측면( , 뒷면)

제출문

제 1세부과제명 : 진단용항체단백질칩개발및임상적유용성평가

부산대학교( 산학협력단 장철훈/ )

제 2 세부과제명 : 결핵의조기진단을위한항원특이항체개발

충남대학교 김화중( / )

보건복지부장관귀하

이보고서를 결핵항원' 특이항체를이용한결핵조기진단용항체단백질칩개발 (A080854)' 과제의최종보고서로

제출합니다.

2010. 04. 30

주관연구기관 : 부산대학교산학협력단

주관연구책임자 : 장철훈

직인

직인

2. 제출문

과제고유번호 A080854 총연구기간 2008/05/01 ~ 2010/03/31

연구사업명 보건의료연구개발사업

보건산업기술분류 대분류 기초 및 임상의학 중분류기능유전체학 및

단백체학소분류

기타 기능유전체학

및 단백체학

관련기술

연구단계 개발 실용화대상여부 실용화

연구과제명

국문 결핵항원 특이 항체를 이용한 결핵 조기 진단용 항체 단백질 칩 개발

영문Development of antibody-based protein array system using M.

tuberculosis-specific antibody for early detection of tuberculosis주관연구기관 부산대학교 산학협력단

주관 연구책임자소속기관명 부산대학교 소속부서 진단검사의학교실

성명 장철훈 직위 부교수

세부과제현황

세부과제 세부과제명 세부기관명 연구책임자

1 진단용 항체 단백질 칩 개발 및 임상적 유용성 평가 부산대학교 산학협력단 장철훈

2 결핵의 조기진단을 위한 항원특이 항체개발 충남대학교 김화중

최종보고서 평가 면제 신여부 □ 매출액 초과달성 ■ 논문실적SCI 달성 중개연구만( 해당)

최종보고서 비공개 승인 신청 여부 ■ 비공개 승인 신청기간( : 2010/05/01 ~ 2012/04/30)

색인어한글 결핵균 진단용 항원 진단용 항체 항체 파아지 표면 기술 단백질 칩

영문 Mycobacterium tuberculosis diagnostic antigen diagnostic antibody phage antibody display Protein Chip

보고서 요약서

3. 보고서 요약서

과제요약1. 다수의 목표 항원 발굴 완료

용도:① 다양한 병적 상황 진단용 단백질 칩 제작에 이용내용:② 결핵균 특이 항원 결핵균( 배양액 Ag, BCG 배양액 Ag, 환자 소변 Ag, 조직액 과Ag) 잠복결핵 특

이 항원종류:Ag85,③ CFP-10, ESAT-6, MTB12, 16 kDa Ag, CysA2Ag 외 종17

2. 항원 특이 항체 개발 완료방법① 및 특성 인간항체: 파지 라이브러리를 이용한 재조합 단일클론 항체종류② : anti-Ag85, anti-CFP-10 , anti-16 kDa Ag 항체의 단클론파지와 whole lgG

3. 진단용 항체 단백질 칩 시제품 개발 완료자성① 나노 파티클을 이용한 특이 항원 선택적 추출 분리

에SPR② 금나노 입자 처리된 표면과 LOC 이용 칩 시제품 개발결핵③ 진단용 스트립 타입의 레피트 키트 시제품 개발

4. 진단용 항체 단백질 칩의 임상적 유용성 평가용 임상검체 확보 및 일부 시험 진행

연구과제명 결핵항원 특이 항체를 이용한 결핵 조기 진단용 항체 단백질 칩 개발

주관연구기관 부산대학교 산학협력단 주관연구책임자 장철훈

참여기업 주 진인( )

총연구기간 2008/05/01 ~ 2010/03/31

1. 다수의 목표 항원 발굴 완료

① 결핵균 배양액 특이 항원 정제 : Ag85 complex, CFP-10, ESAT-6, MTB12

② 잠복결핵 특이 항원 정제 : 항원의16-kDa 재조합 단백 정제

③ 결핵균 배양액 보다 BCG 배양액에 다량 존재하는 개의7 새로운 단백 동정 및 이중 개4 항원의 재조합단백 정제

④ 결핵균 세포막 존재 항원 : 개의3 단백 동정 및 이중 Rv0815c(CysA2) 재조합 단백 정제

➡ 진단적 유의성이 높은 항원

⑤ 결핵환자 urine : 개의7 단백 동정

2. 항원 특이 항체 개발 완료

① 차의3-4 panning, monphage 분리, 결합력 분석, 항체서열분석, whole IgG 항체로의 전환, 단클론항체 발현 및 정제 과정을 통해 Ag85complex 항원에 대한 whole 항체를IgG 생산하여 정제

② 항원에CFP-10 대한 종의6 상이한 단클론파지 확보, 종의2 whole IgG 생산, 종의1 항체 정제

③ 16-kDa 항원에 대한 종의10 상이한 단클론파지 확보, 종의4 whole IgG 생산

3. 진단용 항체 단백질 칩 시제품 개발 완료

① 자성 나노 파티클을 이용한 특이 항원의 선택적 추출 분리

: 자성 나노 파티클은 외부 자기장에 매우 민감하게 반응하므로 이를 이용하여 자기 나노 파티클의 표면에 항체를 부착, 시료의 측정에 필요한 항원을 선택적으로 분리

② 항체 단백질 칩 제작을 위한 고감도 칩 표면 처리 기술 개선

: 을SPR 이용한 칩표면 단백질 항체( ) 자가집합(Self Assembly) 고정화 공정 실시간 정밀 검증

③ 미세유체역학 과(Microfluidics) 을LOC(Lab-On-a-Chip) 이용한 고감도 진단시스템 개발

: 로PDMS 제작된 마이크로 채널 및 반응 챔버와 금박막이 도포된 와Glass 접합한 SPR 진단 칩 & 금나노입자를 이용한 결핵 진단용 진단 칩 제작

④ 결핵 진단용 스트립 타입의 레피트 키트 시제품 개발

4. 진단용 항체 단백질 칩의 임상적 유용성 평가용 임상검체 확보 및 일부 시험 진행

① 개200 임상 검체 확보 : AFB 염색 양성 환자의 소변

② 확보된 임상 검체를 이용한 진단용 항체 단백질 칩 시제품의 임상 시험 일부 진행

요 약 문

4. 요약문 한글( )

TitleDevelopment of antibody-based protein array system using M.

tuberculosis-specific antibody for early detection of tuberculosis

Institute PNU-RUIC Project Leader Chulhun Chang

Associated

CompanyGeneIn

Project Period 2008/05/01 ~ 2010/03/31

1. Development of target antigens for TB diagnosis

① Purification of the Ag85 complex, CFP-10, ESAT-6, and MTB12 which are abundantly expressedand early secreted in M. tuberculosis-culture filtrate.

② Purification of 16-kDa recombinant protein which are expressed in latency condition of MTB.

③ Identification of more abundantly expressed 7 proteins in MTB-CF than BCG-CF.

④ Identification and serologic characterization of seroreactive three proteins presented inmembrane fraction of MTB.

⑤ Identification of MTB 7 proteins presented in urine of TB patients.

2. Development of antigen specific antibodies

① Production and purification of whole IgG against Ag85 complex.

② Isolation of six monophage antibodies against CFP-10 antigens, two monophages wereconverted into whole IgG form, one of them were produced and purified as a IgG.

③ Isolation of ten monophage antibodies against 16-kDa antigens, four monophages wereproduced as a whole IgG form.

3. Development of prototype of diagnostic antibody chip

① Selective isolation of TB-specific Ag using Ab-tagged magnetic nanoparticle

② Stabilization of surface treatment method to increase sensitivity of antibody chip

: protein self assembly on the surface of SPR based protein chip

③ High sensitive diagnostic system using microfluidics and LOC (Lab-On-a-Chip)

: PDMS microchannel chamber, gold coated glass, SPR chip, & gold nanoparticle

④ prototype of rapid kit ; strip type

4. Clinical evaluation of diagnostic antibody chip using clinical samples

① 200 clinical samples from urin of AFB positive TB patients

② To start test experiments of SPR antibody chip and prototype of rapid kit using spike samplesand clinical samples

SUMMARY

5. 요약문 영문( )

6.1 총괄연구개발과제의 연구성과 실적 및 향후 계획

성과목표연구성과 실적 최종연구종료

년후2 계획연구성과 실적 달성도(%)

2 1 50 0

0 0 0 0

0 1 100 0

2 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

2 1 50 0

0 0 0 0

1 0 0 0

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0 0 0 0

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0 4 100 0

0 1 100 0

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0 0 0 0

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0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

0 200 100 0

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

연구성과 유형

1.

연구

학술( )

성과

가 연구논문.

국외등재학술지SCI(E)

비등재학술지SCI(E)

국내등재학술지SCI(E)

비등재학술지SCI(E)

2.

개발

산업( )

성과

가 지적재산권.

국제출원

국제등록

국내출원

국내등록

나 제품개발.시제품개발

상품화출시

다 공정개발.신공정개발

기존공정개선

라 신보건의료기.

술개발

신보건의료기술개발

기존보건의료기술개선

마 기술이전.국외

국내

바 사업화.

3.

기타

성과

가 인력지원.

학사

석사

박사

기타

나 장 단기. ․연구지원

장기

단기

다 기술료. 징수직전년도 징수액

당해년도 징수액

라 산업기술인력. 양성 성과

마 학술회의. 개최

바 기술무역. 성과

사 인력교류. 성과외국 연구자 유치

해외 파견

아 국제협력. 기반

MOU 체결

수요조사

공동연구

자 경제사회.

파급효과

산업지원 성과

고용창출 성과

차 임상연구자원. 확보

카 임상시험실시.

타 진료지침개발.

파 품목.

승인

인증

허가

6. 연구 성과 실적 및 향후 계획

종합성과현황

6.3.1 연구논문

순번

구분SCI(E)

여부

저자

구분논문명 학술지명 게재일 IF

세부

표기

병기

표기

1 국내 SCI 공동저자

A Possible Merge of FRET

and SPR Sensing System for

Highly Accurate and

Selective Immunosensing

BULLETIN OF

THE KOREAN

CHEMICAL

SOCIETY

2009/12/30 1.257 1

2 국외 SCI 공동저자

CysA2: A candidate

serodiagnostic marker for

Mycobacterium tuberculosis

infection

RESPIROLOGY 2010/03/19 1.849 2

합계 2 건

6.3 연구성과 유형별 세부 내역

6.3.2 지적재산권

순번

구분출원/

등록출원인 출원국 지적재산권명

출원

등록 일( )

출원/

등록번호

세부

표기

1 국내 출원충남대학교

산학협력단대한민국

M. 투버쿨로시스 진단용 조성물 및

이를 이용한 진단방법2009/10/14

10-2009-009

75082

합계 1

6.3.8 인력지원 성과

▶ 인력지원 성과는 해당 연구개발과제에 참여하여 학사, 석사, 박사 학위 등을 취득한 인력배출 성과를 의미함.

▶ 전산으로 입력만 하는 성과임. 출력물로 출력되지는 않음

▶ 학술연구 또는 산업기술 습득을 목적으내 국내외 연수에 지원한 실적을 입력하되, 단순 학회 참석 등은제외

▶ 전산으로 입력만 하는 성과임. 출력물로 출력되지는 않음

6.3.9 장 단기․ 연수지원 성과

6.3.17 임상연구자원 확보성과

자원유형 세포 혈액 조직 체액 뇨한국인질병관련

신규유전자DNA 영상자료 역학자료

제 1 세부 0 0 0 0 200 0 0 0 0

7. 참여연구원 현황표

세부소속

기관명성명 직급

전공 및 학위

구분학위 연도 전공 학교

참여연구원1 부산대학교 의학전문대학원 김철민

참여연구원1 부산대학교 김경천

참여연구원1 부산대학교 고광락

세부책임자1양산부산대학교병원

진단검사의학과장철훈

참여연구원1 부산대학교 이재범

참여연구원1 주 진인( ) 송은실

참여연구원1 주 진인( ) 김현주

참여연구원1 부산대학교 의과대학 박미영

참여연구원1 부산대학교 박승만

참여연구원1 부산대학교 김현동

참여연구원1 부산대학교 김종욱

참여연구원1 부산대학교 김인주

참여연구원1 부산대학교 김윤희

참여연구원1 부산대학교 김윤기

참여연구원1 부산대학교 김성훈

참여연구원1 부산대학교 박지민

참여연구원1 부산대학교코타모브쇼루

크

참여연구원1 부산대학교 의과대학 최고은

참여연구원1 부산대학교병원 조선아

참여연구원1 부산대학교 이승재

참여연구원1 주 진인( ) 이상엽

참여연구원1 부산대학교 손방방

참여연구원1 주 진인( ) 박혜경

참여연구원2 한국교원대학교 박용남

참여연구원2 한국교원대학교 신현철

세부책임자2 충남대학교 의과대학 김화중

참여연구원2 한국교원대학교 이은미

참여연구원2 충남대학교 강현배

참여연구원2 한국교원대학교 서민지

참여연구원2 충남대학교 의과대학 신아름

참여연구원2 충남대학교 의과대학 엄선호

참여연구원2 충남대학교 김광욱

********

총괄연구과제 연구결과II.

연구개발과제의 배경 및 필요성1.

결핵 진단법이 획기적으로 개선되어야 하는 이유□

결핵은• 연간 만명의 신환자가 발생800 하고 매년 만명이 사망200 하는 만성감염질환으로

전 세계적인 심각한 보건문제임.

• 전 세계인구 1/3인 억 명 정도가 결핵에 감염되어 있으며20 약 천여 만 명의 활동성 결6

핵환자가 있음.

결핵과 중복감염자는 천 백만명이며 전 세계 사망자 명중 명은 결핵으로 사HIV 1 5 AIDS 3 1•

망하고 있음.

국내 결핵사망률 년도 한국주요사망원인통계 은(2005 )• 인구 만명당 명으로10 5.5 번째 사12

망원인임.

가입 개국 중OECD 30• 결핵사망률이 위1 로 매일 명이 사망하며 이는 일본의 배 미7.4 3.9 ,

국의 배 임23 .

년도 국내 전염발생건수 통계는 결핵발생건수가 명으로2006 35,361• 국내 전염병발생건수

의 60%를 차지

우리나라 전염병 발생 통계Fig. 1.1

국가적인 결핵관리 사업에도 불구하고 국민생명을 위협□

최근까지의 우리나라 결핵관리사업은 주로 보건소를 통한 환자관리에 치중되어 왔고 진•

단법 개발이나 백신 개발과 같은 기반연구에 대한 투자는 등한시 하였음.

우리나라는 지난 여 년간 국가 결핵관리 사업 추진결과 결핵사망률이 크게 감소하였고50•

만명당 결핵사망률이 년 명 년 명(10 1980 30 ->2000 7.3 ),

흉부 엑스선상 활동성 결핵환자수가 년도 명에서 년도 천명으로 감- 1965 1,249 2005 169

소함.

그러나- 최근 년 동안5 신환자 발생률이 매년 명 정도로35,000 감소하지 않고 있음.

특히 대와 노인층에서 많이 발생하는 차 함수적 모형인20 3• 후진국형 결핵환자 분포양상

을 나타내고 있음.

외국인 노동자의 증가 고령화 사회로의 급격한 전환은 우리나라 결핵문제가 더욱 심각,•

해질 수 있는 요인임.

결핵은 화학요법으로 잘 치유되며 효과적으로 관리되고 있다는 생각에• 결핵의 위험성이

간과되고 있음.

연도별 결핵환자 및 사망자 추이Fig.1.2

결핵의 효과적인 퇴치전략□

결핵의 근본적인 퇴치를 위해서는 를 대체할 수 있는BCG• 백신개발이나 새로운 항결핵제

개발이지만 연구하기가 어렵고 기간도 오래 걸리며 많은 연구비를 필요로 함, , .

따라서 일차결핵이 적합한 화학요법제로 개월간 치료하면 잘 치유되는 감염질환임을 감6•

안하면 가장 효율적인 결핵관리 전략은 활동성 결핵환자를 조기에 발견하여 치료함으로

써 결핵의 전파를 차단하는 것임.

효과적 조기 결핵 진단법의 부재□

현재 결핵의 확진법은 세균학적인 방법이지만 도말검사는 민감도가 낮고 배양(40-60%),•

검사는 주가 필요하기 때문에 조기 진단에 적합하지 않음 아래 표 참고4-8 ( ).

과 같은 분자 생물학적인 방법은 신속하게 진단할 수 있는 방법이지만 폐외결핵이나PCR•

도말음성인 가검물 경우는 민감도가 떨어지고 가격이 비싸 다수를 대상으로 하는 건강검

진에 적용할 수 없음.

최근 개발된 검사는 결핵피부반응검사보다 특이도가 높다고 알려져 있지만 아직IFN-• γ

민감도 측면에서 다양한 결과가 보고되고 있어 국내에서는 그 유용성이 명확히 입증되지

않았음.

특히,• 검사는 활동성 결핵의 진단 능력은 높지 않으며 잠복 결핵 혹은 결핵환자IFN- ,γ

접촉자 검사에 주로 이용되고 있음.

• 혈청 항체를 측정하는 면역학적 방법은 신속하고 경제적이지만 세균학적 진단방법을 대

체할 수 있을 정도의 민감도가 낮고 과거 감염을 구분할 수 없어, 임상의사들에게 외면

받고 있음.

기존 결핵 검사법의 장 단점Table. 1.1

진단법 장점 단점 특이사항

세균학적

방법

도말검사 빠르고 간편함• 민감도가 낮음•

배양검사 특이적이고 민감도가 높음• 기간이 오래 걸림 주(4~8 )•

Gold

Standard

BACTEC

또는

MGIT

배양기간을 주로 단축2~3•

고가의 장비 필요함•

기간이 오래 걸림 주(2~5 )•

단가 비쌈 완제품 수입( )•

분자생물학적 방법

매우 높은 민감도•

빠르고 균종을 구분할 수,•

있고 약제내성여부를,

예측할 수 있음

정도관리가 필요•

고가의 장비가 필요하고•

가격이 비쌈

폐외결핵 도말음성인 경우,•

민감도가 낮음

대규모

선별검사에

사용 불가

면역학적

방법

항체 측정

쉽고 간편하고 경제적임•

다수를 대상으로 하는•

건강검진에 적용할 수 있음

민감도 낮음•

과거 감염과 현증을 구분못함•

특이도 낮음( )

다수의

진단 Marker

개발이 필요IFN-γ

측정

잠복결핵진단에 적용• 활동성 결핵 진단 민감도 낮음•

값이 비쌈 완제품 수입( )•

이상적인 결핵 조기 진단법 개발 방향□

현재 다수를 대상으로 하는 결핵검진은 흉부방사선 촬영에 의존하고 있음.•

촬영기기의 필요성과 비용적인 측면에서 효율성이 떨어짐- .

따라서 형간염 진단과 같이 결핵을 면역학적인 검사로 진단할 수 있다면 가장 이상- B

적임.

Fig.1.3 Ideal TB diagnostic methods

가장 이상적인 진단 방법:•

신속하고 경제적이며 복잡한 기구나 시설이 필요 없고 누구나 쉽게 할 수 있어야- ,

함.

이러한 조건을 가장 잘 충족하는 방법은 항원이나 항체를 측정하는 면역학적 방법임- .

또한 이들 방법은 객담을 잘 받을 수 없는 소아환자 도말검사에서 음성인 경우와 폐- ,

외결핵의 진단에 보다 적합함.

항체를 측정하는 방법•

가장 큰 제한점은 결핵항원에 대한 항체 반응이 환자의 면역 환경에 따라 다양한 반-

응을 나타내기 때문에 만족할 만한 민감도를 얻지 못하고 있음.

실제 단일 항원 또는 몇 개의 항원을 조합한 상품화된 진단 키트의 민감도는 전체적-

으로 특이도는 로 연구자에 따라 다양함15~89%, 50~100% (Steingart KR et al, PLOS

medicine, 4:1041, 2007).

민감도와 특이도가 높은 새로운 진단법 개발을 위해 현재에도 혈청학적 진단법 개발-

에 대한 연구는 기반 연구인 항원 탐색부터 키트 개발에 이르기까지 활발히 수행되

고 있지만 결핵항원계가 복잡하기 때문에 유의성 있는 진단 항원을 탐색하기가 매우

어려움.

혈청학적 방법의 근본적인 또 하나의 단점은 비활동성 결핵과 활동성 결핵을 구분할-

수 없다는 것임.

특히 양성인 경우 면역반응의 저하로 항체 양성률이 낮음- HIV .

결핵항원을 측정하는 방법•

혈액이나 조직액에서 직접 결핵항원의 검출은 현증감염의 직접적인 증거가 될 수 있-

음.

감염초기에는 항체가 많이 형성되지 않기 때문에 항원검출이 조기진단에 보다 적합- .

특히 감염 유무에 영향을 받지 않고 도말검사 음성인 결핵 진단에 유용할 수 있- HIV

음.

뇌척수액 결핵성 수막염 가래 소변 혈청 등에서 결핵항원을 나 방- ( ), , , ELISA dot-blot

법으로 항원을 검출하여 진단적인 유의성을 보고한 연구논문이 다수임(Cho SN,

그러나 실제 항원을 검출하는 상품화된 진단키트가 개Yonsei Med J, 48:347, 2007).

발되어 있지 않음.

단점은 비특이적인 위양성이 나올 수 있고 기본적으로 조직액내에 항원의 존- ,① ②

재가 극미량이기 때문에 민감도가 낮고 항원을 검출하기위한 특이항체를 생산하, ③

기 어렵고 조직액에 따라 비특이적으로 항원검출을 저해하는 요인을 제거하기위, ④

한 복잡한 샘플처리가 필요함 예 소변인 경우 높은 삼투압( , ).

□ 결핵항원 검출 방법에 의한 조기 진단법의 개발의 문제점과 해결 전략

임상에서 쓸 수 있는 항원검출 진단법을 개발하기위해서는 민감도와 특이도가 높은 고감•

도 진단 시스템 개발이 필수적임.

특히 기존의 검출방법의 민감도를 혁신적으로 개선하는 개발이 필요detection system•

함.

항원검출 방법의 문제점과 개선 전략Fig.1.4

국내외 기술개발 현황2.□ 단백질 칩의 기술 동향

국내외 기술동향•

국내외 기술 동향Fig.1.5

년대 말 사에서 플라즈몬 공명현상으로 이용한 바이오센서 개발을 시초로- 1980 Biacore

칩과 단백질 칩에 대한 가능성을 제시하였고 이후고 단백질 칩 제작 기술 분석DNA , ,

기술 응용 기술이 연구개발 되어 상용화 되고 있음, .

국내의 경우 년대부터 학계 연구계 및 산업계를 중심으로 빠르게 단백질 칩 원- 2000 ,

천기술 확보를 위한 다양한 시도와 연구개발이 진행되고 있음.

향후 전망•

기능 단백질체학 연구를 위한 새로운 방법론을 개발하기 위해 활발한 연구개발이 진-

행 중이며 이러한 개발을 통해 단백질 칩의 넓은 응용범, Breakthrough Technology

위와 신속한 결과도출이라는 장점으로 생명공학분야의 발전을 기대할 수 있음 출. (

처 한국과학기술정보연구원 단백질칩: , 2006TCI Report, , 18-19:80, 2006)

결핵 진단의 기술 동향□

국내외 기술동향• ․결핵 진단의 체외검사에서 국내 의료기술은 염색 시약 제조 자동염색기 개발 및 판- ,

매 배양검사에 이용되는 고체배지의 제조 및 판매 검사 키트의 제조 및 판매, , PCR

등의 수준이며 국내 업체가 차지하는 시장 규모는 미미함, .

결핵 진단을 위한 체외검사는 주로 항산균 도말검사 배양검사 검사 혈청- , , IFN- ,γ

항체검사 검사가 있음, PCR .

그 중 배양 검사가 현재까지 로 알려져 있으나 액체배지를 사용해도- gold standard ,

도말 양성 환자 균이 많이 배출되는 환자 에서 일 이상 걸리고 있음( ) 10 .

도말 검사는 신속하나 민감도가 낮고 비결핵항산균을 구분할 수 없음- , .

혈청 항체검사는 민감도가 낮을 뿐만 아니라 과거 감염자에게도 양성이 나오므로 논-

외임.

검사는 잠복 결핵을 진단하는 데 유용하나 활동성 결핵의 진단 능력은 아직- IFN- ,γ

까지 확실하지 않음.

검사는 현재까지 알려진 검사 중 높은 민감도와 특이도 신속성 비결핵항산균- PCR , ,

구분능력 등에서 우수함.

향후 전망•

검사 수준의 민감도와 특이도를 가지는 항원 검사가 개발된다면 결핵 진단 시장- PCR ,

의 혁명적인 변화가 예상됨 예 레지오넬라 소변항원 검출 키트의 개발로 레지오. ( :

넬라 폐렴의 진단이 매우 쉬워짐)

현재 결핵 다발국가에서 환자 검출율을 높이기 위하여 에서는 도말검사의 교육에- WHO

엄청난 비용을 쓰고 있음

현재의 기술의 발달로 객담 소변 등의 가검물에서 결핵균 특이 항원을 검출- IT, BT , ,

하는 기법이 향후 년 내에 도말 검사를 대치할 수 있는 수준으로 개발될 것으로 예5

상됨.

본 연구 과제의 목표도 면역학적 방법으로 결핵균 특이항원을 검출하여 현증의 활동-

성 결핵을 진단하는 키트 개발을 목표로 하고 있음

결핵 관련 의료 시장 특성□

전 세계적으로 결핵환자의 발생 비율은 의료 기술의 발달에도 불구하고 지속적으로 신,•

규 환자가 발생되고 있으며 우리나라의 경우도 앞서 예시하였듯이 감소율이 정체한 상,

태임.

지역별 결핵환자 발생비율Fig.1.6 , 2006~2015

Fig. 1.7 The gap between estimated and notified cases

또한 결핵 진단의 특성상 확인된 환자보다는 확인되지 않는 추측 환자가 더욱 많음.•

결핵 진단 시장 규모□

년을 기준으로2006• 결핵진단 시험의 시장 규모는 약 억불10 이며 대부분이 결핵 검출과,

동정에 대한 부분임. (WHO, Diagnostics for tuberculosis-Global demand and market

potential, 60:203, 2006)

결핵 진단 시장 규모Fig. 1.8

또한 세계보건기구에서 발간한 에서 확인할 수“The Global plan to STOP TB 2006-2015"•

있듯이 결핵 환자의 조기 진단과 단기 치료를 통해 결핵을 퇴치하고자 하는 운동을 진행

하고 있음 즉. 조기 진단의 기회가 더욱 많아질 것이며 그로 인해, 지속적인 시장 확대

가 예상됨.

우리 나라의 경우 환자를 조기에 발견하기 위한 검진활동의 일환으로,• 결핵환자 발견“

사업 을 지속적으로 실시” 하고 있어 일정한 진단 시장 규모가 지속될 것으로 예상됨 질.(

병관리본부 질병관리백서, 2006 ,113:530, 2007)

진단용 단백질 칩 관련 시장 규모□

국내 시장 규모 한국과학기술정보연구원 단백질 칩( , 2006 TCI Report- , 51:80, 2006)•

국내 단백질 칩 시장은 연구용 목적으로 병원 연구소 대학 등에서 일부 판매되고- , ,

있으나 본격적인 시장은 형성하지 못하고 있음, .

해외의 일부 단백질 칩 제조회사가 국내대리업체를 통해 단백질 칩을 판매하고 분석-

서비스를 실시하고 있고 이들 업체가 판매하는 단백질 칩의 가격은 일반적으로, 10

만원 수준이며 칩 위의 단백질 컨텐츠의 종류나 수에 따라서 칩의 가격이 변0 200 ,～

동됨.

공식적인 자료는 없으나 연구용 단백질 칩의 판매와 분석서비스 등을 포함하여 최대- ,

억원 정도로 추정됨30 .

비교적 장기적인 시장전망치를 제시한 의 시장 성장율을 적용- Freedonia Group. Inc.

하여 년 국내 단백질 칩 시장은 억원으로 예상함2013 527 .

해외 시장 규모•

전체 바이오칩 시장에서 단백질 칩이 차지하는 규모는 미비한 실정이나 의 성장- 43.5%

률을 보이며 급성장중임.

각 조시기관마다 단백질 칩 예상시장 규모는 차이를 보이나 공통적으로 빠른 성장세- ,

를 보일 것이라는 의견은 일치하고 있음.

단백질 칩 세계 시장 현황 및 전망Table. 1.2

미국 단백질 칩의 용도별 시장현황 및 예측Table. 1.3

연구개발과제의 추진체계3.

전체적인 연구추진 체계 및 세부 과제간 역할 분담□

제1세부

임상 평가

단백질 칩

임상 검체 처리 및 잠재적 Rapid assay kit

단백질 칩 표면처리

임상 검체 확보

진단적 가치 임상적 평가

상용화 모델 제안 및 검증

부산대 나노메디칼학과고광락 교수

임상시험장철훈 교수

자성 나노 파티클 이용특이 항원 선택적 추출

부산대 나노메디칼학과이재범 교수

LOC 칩 개발부산대 기계공학과

김경천 교수

제2세부

단백질칩 제작

㈜ 진인

최종 목표 달성을 위한 핵심사항□

세부 과제간 물리적 기능적 연계성을 반영하여 효율적 연구 협력 체계 구축• ․물리적 연계성-

제 세부과제 구성원은 모두 부산대학교 연구진으로 구성1∙

제 세부과제 구성원은 모두 대전 지역 연구진으로 구성2∙

기능적 연계성-

제 세부과제는 제작과 임상시험으로 구성되어 제품의 개선에 신속한 협력1 HW∙

제 세부과제 구성원은 에 해당하는 개발의 기초연구로서 긴밀한 협력2 SW Ag-Ab∙

기존 제품과의 차별화 위한• 핵심 기술 개발 추가를 위하여 해당 분야 최고 전문가 참여

제 세부과제의 이재범교수와 고광락 교수는- 1 나노기술 전문가로서 참여하여 원천 기

술 제공

제 세부과제의 김경천 교수는 산자부지원 센터장으로서- 1 MEMS 센터의 기술MEMS 전격

지원

연구 결과의 단기간 내 상용화를 위하여 진단용 전문 바이오벤처기업인 주 진DNAchip ( )•

인이 연구 초기부터 참여하여 제작 기술 지원microarray

• 검출하고자 하는 항원의 선별과 그에 해당되는 특이항체 개발

제 차년도 초기 기존 연구에서 확보하고 있는 등의 항체를 타 연구자에게 제- 1 : Ag85

공하여 모든 참여 연구원이 자신의 임무를 진행할 수 있도록 함

제 차년도 후기 본 연구에서 도출되는 새로운 항원이 추가되어 다양성 확보- 1 :

체액에 고농도로 존재하는 결핵 항원의 분석 및 정제•

배양액내로 조기에 분비되고 결핵균에만 존재하는 항원 선별기준을 적용하여 수많은- ,

결핵항원 중에서 목표항원 선택

• phage display에 의한 항체개발

항원 인식 부위를 제외한 나머지 구조가 동일한 재조합 항체를 이용하여 단백질 칩을-

제작

약• 억 종의 다양성1000 을 확보한 최고 수준의 파지항체 라이브러리

결핵환자의 임상검체 확보•

연구개발수행 내용 및 결과4.

결핵의 조기진단에 가장 적합한 다수의 목표 결핵 항원 발굴 완료4.1

기존 항원 또는 결핵균 배양액내 다량 존재하는 목표항원 발굴□

결핵균 배양액으로부터 항원과 항원을 고전적인 생화학native antigen 85 complex MTB12•

적 방법으로 정제함 항원은 종류의 항원으로 구성(Ag85 complex Ag85A, Ag85B, Ag85C 3

되어 있는 면역 활성이 높은 항원으로서 배양액내로 조기에 분비되는 항원임).

에는 존재하지 않고 결핵균에만 존재하는 와 단백은 잠복결핵진단을 위BCG CFP-10 ESAT-6•

한 에 사용되는 항원임 본 연구에서도 에 존재하지 않는 항원IFN- release assay . BCGγ

이기 때문에 목표항원으로 적합하기 때문에 해당 유전자가 삽입된 발현벡터를 이pET28a

용하여 대장균에서 유전자 재조합 단백질을 정제함.

결핵항원 검출에 많이 사용된 목표항원인 은 사LAM (lipoarabinomannan) Nacalai Tesque•

로부터 구입하였음.

Fig. 1.1 Preparation of MTB antigens

잠복결핵 진단을 위한 목표 항원 정제□

현재 잠복결핵진단은 를 이용한 와 를 이용한 세포매PPD tuberculin test IFN- release• γ

개검사 이용.

잠복결핵감염과 유사한• in vitro조건은 낮은 산소분압 또는 조건 등에서의 배양과acid

같이 여러 가지 조건이 있지만 본 연구자는 잠복결핵상태와 상태로 배양하는, standing

것과 유사하다는 연구보고를 바탕으로 단순히 과 상태로 배양하여 얻은shaking standing

균을 초음파로 파쇄한 균체항원을 전기영동으로 분석하였음 (Fig. 1.2).

조건에서 배양된 결핵균에서 항원이 유의하게 증가되었음을 확인하였고standing 16-kDa•

이들 항원 분획을 로 분리하고 로 으로 확인한2-DE anti-16 kDa antibody immunoblotting

결과 단백임을 확인하였음 는HspX (Rv2031c) . HspX in vitro 잠복결핵 조건인 저 산소분

압 상태 또는 에서 증가하는 단백으로 보고된바 있음 등stationary phase (Yuan . 1998).

항체개발을 위해서 에 대한 유전자 재조합단백질을 대장균에서 생산하여 정제하16-kDa•

였음.

Fig. 1.2 CB(Coomassie blue) stain

배양액내 분비항원 및 결핵 특이항원 동정□

항원검출을 통한 진단용 항원으로 적합한 후보항원은 분비항원이면서 에는 존재하지BCG•

않는 결핵균 특이 항원이 이상적임.

현재 에는 없고 결핵균에만 존재하는 항원으로 가장 대표적인 항원은 과BCG CFP-10•

항원임 두 개의 항원은 본 연구에서 재조합 단백질을 정제하여 준비하였음 다ESAT-6 . .

양한 항원의 확보가 중요하기 때문에 에 비해 결핵균 배양액내에서 유의하게 발현이BCG

증가된 단백질을 동정하고자 하였음.

결핵균과 배양액내 존재하는 항원을 단순히 분리하여 비교하면 결핵균 배양액에BCG 2-DE•

다량 존재하는 항원으로 항원 항원 배양액에 다량 존재Ag85 complex, 38-kDa , CFP-10 , BCG

하는 항원이 동정됨MPB70 .

결핵균과 배양액 항원 비교Fig. 1.3 BCG

서로 다르게 발현되는 다양한 항원을 동정하기 위해서 배양액을 분획화하여 분석을 시도•

하였음 아래 그림과 같이 결핵균 배양액 을 로. (CFP) ammonium sulfate(AS) 0-50%, 50-80%

분획으로 나눈 후에 최종적으로 개의 분획으로 나누었음 즉5 . 분획50% AS 은 hydrophobic

에 가하여 가 첨가된 로의 통과interaction chromatography 1M ammonium sulfate 50mM PB

분획 와 로의 용출분획으로 분획화를 실시함(pass), 50 mM PB 1mM PB . 분획50-80% AS 은

로 통과 분획 과 로 용출된 분획으로hydroxylapatite (HAT) chromatography (pass) 0.5M PB

분획화를 실시하여 각각을 전기영동으로 확인하였음 각 분획에 대하여. anti-mouse

로 한 결과 은 결핵균배양액의 분획의CFP-10 antibody immunoblotting CFP-10 50% AS HIC

분획에 존재함을 확인 할 수 있었음 따라서 특정의 결핵단백질이 효과적으로 분획pass .

화 되었음을 확인함.

Fig. 1.4 일차획분 후 결핵균 배양액 과 배양액의 항원비교(Rv CFP) BCG

상기과정을 통해 분획화된 각각의 분획을 로 분리하여 비교분석하여 결핵균2-DE (H37Rv)•

과 에 제한적으로 다량 존재하는 항원을 로 동정하였음BCG LC-MS/MS .

Fig. 1.5 H37Rv vs BCG2-DE

를 통해 동정된 단백을 정리하면 아래 표와 같음 개의 단백을 동정하였으며LC-MS/MS . 12•

는 항원으로 본 과제에서 단백을 정제한 항원임 모든 단백의 유전자는H5 38-kDa native .

발현백터에 클로닝하여 대장균에서 발현됨을 확인하였음 이중pET28a . H1, H4, H5, H6,

단백은 유전자재조합단백의 정제를 성공하였음H7 .

Table. 1.1 Identification of aboudantly expressed proteins in MTB-CF

결핵균 세포막에 존재하는 단백동정과 특성분석□

결핵균 세포막에 존재하는 단백은 숙주면역계에 노출될 확률이 높을 뿐만 아니라 혈액이•

나 조직액으로 유리될 가능성이 높기 때문에 배양액을 로 시간 원심분리한100,000 x g 4

후 침전물을 얻어 로 부유하였음 이를 로 분리하여 혈청학적인 반응성이 높은PBS . 2-DE

항원을 선택하여 로 동정하였음LC-MS/MS .

에 의한 결핵균 세포막에 존재하는 단백 분리Fig. 1.6 2D

발현 양상Fig. 1.7 CysA2(Rv0815c)

상기 종류의 동정된 단백 중에서 를 선택하여 유전자 재조합단백질을 제3 CysA2(Rv0815c)•

조하였음 혈청학적인 진단적인 유의성을 과 비교하여 평가하. Ag85, CFP-10, HspX, PstS1

였음 혈청 항체는 로 측정하였음 상품화된 혈청학적인 진단키트에 사용되고 있는. ELISA .

두 항원인 와 과 동일한 민감도와 특이도를 나타내었음 특히 는 도말HspX PstS1 . PstS1 AFB

음성 환자에서 민감도가 낮다는데 문제가 있는데 는 이러한 단점을 보완할 수 있, CysA2

었음 종류의 항원인 를 조합하여 항체를 측정하는 경우 의 보. 3 HspX, PstS1, CysA2 CysA2

완 효과가 가장 높았음 이러한 특성연구를 통해서 가 진단키트 개발에 사용될 수. CysA2

있는 새로운 후보항원임을 발견함.

Table. 1.2 Sensitivities and specifities of each of the five antigens and the antigen

mixtures using sera from 150 tuberculosis patients and 115 healthy control subjects.

결핵환자 에 존재하는 결핵 항원동정urine□

소변으로부터 결핵항원을 검출하여 결핵을 진단할 수 있다면 획기적인 방법이 될 것임.•

본 연구는 항체개발을 위한 중요한 목표항원 중의 하나로 활동성 결핵환자 소변에 존재

하는 결핵항원을 설정하였음 건강인 소변과 활동성 결핵환자의 소변을 약 배 농축하고. 5

로 투석하여 로 분리함 탐색을 위한 일차항체는 결핵균배양액을 에 면PBS SDS-PAGE . mouse

역하여 얻은 항체를 이용하였음 또한 로 분리하여 과 을 통. 2-DE immunoblot silver stain

해 비교분석하여 유의성이 있는 나 은 로 동정하였음band spot LC-MS/MS .

Fig. 1.8 2-D analysis of urine from tuberculosis patients

를 통해 결핵환자 내에 존재하는 개의 결핵단백을 동정하였고 이중LC-MS/MS urine 7 ,•

의 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 재조합단백질을 정제하였음Rv3280(AccD5) pET28a .

Fig. 1.9 Mtb proteins identified in urine

인간항체 파지 라이브러리를 이용한 항원특이 항체 개발과 생산4.2

항원에 대한 파아지 항체개발Ag85 complex (p85)□

파아지 라이브러리 분석Fig. 1.10

항원은 배양액내로 조기에 분비되는 항원이며 양적으로도 풍부하기 때문에Ag85(p85) ,•

일차적으로 이들 항원에 대한 항체를 개발하기로 함 항원에 대한 파아지 항체는 이. Ag85

전에 보고된 바가 없어 최초의 항체임 인간항체 파아지 라이브러리를 이용하여 항. - p85

원에 대한 항체 제작의 과정은 다음과 같이 진행함 에 항원을. Immunotube p85 10 g/mlμ

의 농도로 를 코팅하였음 코팅된 항원 에 라이브러리를 반응시켜 초기 결합 파아2ml . p85

지를 선별하는 에서 투여된 라이브러리 내의 파아지의 총수는 약Biopanning 2X1013 가cfu

사용됨 비특이적 파아지의 세척과정 회 후 남아있는 파아지를 대장균주에. 10 XL-1blue

감염시켜 파아지를 증폭한 후 차 를 얻었음 라이브러리를 이용한 항원1 sub-library . sub-

파아지 반응 및 검색 과정을 번을 반복하며 매 회 를 준비하였고 이 라이- 4 sub-library ,

브러리 내의 파아지 수를 분석하였음.

각 회의 에서 얻어진 라이브러리로부터 제작된 파아지들이 에 나타내는 결1~4 panning p85•

합력을 방법으로 분석함 에서 를 코팅하고 파아지를 가하였ELISA . sandwich ELISA p85 ,

음 결과에서 보여지 듯 매 시 얻어진 라이브러리로부터 얻어진 파아지의 수는. , panning

유사하게 나타났고 회색 막대 이중 에 특이적으로 결합성을 보이는 파아지는( ) p85

사이클이 경과됨에 따라 증가됨을 알 수 있음 오랜지색 막대 이는 파아지 집panning ( ).

단에서 에 결합을 할 수 있는 파아지의 상대 비율이 매 사이클을 반복함에p85 panning

따라 증가하고 있음을 보여줌.

차 이후 파아지 집단의 에 대한 는 추가적으로 크게 증가하지 않았으므로4 p85 affinity•

우리는 차 에서 얻어진 파아지 집단을 이용하여 파아지 항체를 분리4 panning monoclonal

하였음.

총 파아지수 중 이상이 에 결합력을 보였음 에 대한 결합력의 비교는60% p85 . p85 ELISA•

에서 나타난 값의 비교로 알 수 있음 얻어진 들이 의 어느 에OD . monophage p85 subunit

결합하고 있는지를 알아보기 위하여 를 이루는 두 과 각각 결합시켜p85 subunit p32/p33

본 결과 에 선별적으로 결합하고 에는 결합하지 않고 있음을 보여줌p32 p33 subunit .

를 통한 에 대한 결합력 비교Fig. 1.11 ELISA p85

들의 특성을 분석하기 위하여 각 들의 를 추출하고monophage monoclone phagemid BstI•

을 통하여 을 실시하였음 이것은 각 클론들의 서열이 제한digestion DNA fingerprinting .

효소 처리시 보이는 절편들의 비교로 유사성을 비교하기 위하여 사용됨 각 의 정확. scFv

한 서열비교를 위하여 각 클론들의 서열분석을 실시함 아래 그림과 같이 클론들이 모두.

동일한 종의 항체서열을 가지고 있음을 보여주어 결과적으로 종의 항체가 얻어졌음을, 1

보여줌.

Table. 1.3 Grouping of anti-p85 Mono Phage

• 항체제작Anti-p85 whole IgG : 얻어진 항체의 서열을 이용하여 인간scFv IgG Heavy

및 발현벡터에 삽입하기 위하여 각 가변chain Light chain Heavy chain / Light chain

영역을 특이적 를 사용하여 증폭함 각 과 가변영역을primer . Heavy chain Light chain

또는 를 이용하여 절단하고 동일한 제한효소를 이용하여 절단한SfiI/NheI SfiI/BglII

벡터 와 에 삽입함 제한효소로 절단한 벡터는 다음과 같음pIGHV pIGLV . .

(A)

(B)

을 절한한 후 삽입 을 절한한 후 삽입Fig. 1.12 (A) SfiI/BglII p85LC , (B) SfiI/NheI p85HC

• 단클론 항체의 발현 및 정제Anti-p85 및 발현벡터에 도입된: Heavy chain Light chain

항체서열을 확인 후 형 항체를 완성하기 위하여 각 발현 벡터를 세포에, whole IgG HEK293

함 형질도입된 세포로부터 발현 분비된 항체를 얻기 위하여 세co-transfection . HEK293 -

포배양액을 매 일 마다 회수하고 약 를 배 농축한 후3 500ml 10 Protein-A bead

를 이용하여 항체를 정제함 된 항(sepharose; Pharmacia) (Lane7, 8). Elution anti-p85

체 약 는 투석 후 에 보관하였음 얻어진 항체는 및 을( 10ml) -20C . SDS-PAGE silver stain

이용하여 확인하였음 항체의 양은 방법을 이용하여 정량하였다 약 의. bradford . 1.4mg

항체를 총 의 배양액으로부터 확보하였음500ml .

Fig. 1.13 A 단클론 항체의 발현 및 정제nti-p85

생산된 항체의 항원 결합성은 및 을 이용하여anti-p85 monoclonal ELISA western blot•

검증함 결과에서 보듯이 항체는 에서 분리된 을 특이적으로 인식하. SDS-PAGE p30 subunit

였음 또한 방법으로는 항체를 약 배 배 희석할 시에도 을 나타. ELISA 3000 -15000 signal

냄.

Fig. 1.14 항체의 항원 결합성 분석anti-p85 monoclonal

항원에 대한 항체 개발CFP-10□

은 결핵균에만 존재하는 항원이며 도한 배양액내 다량 존재하기 때문에 항체개발CFP-10•

을 위한 번째 목표항원으로 결정함 항체 개발의 과정과 유사한 과정을2 . p85 panning

항체 개발에서도 사용함 차 후 얻어진 파아지의 에 포함된CFP-10 . 3 panning sub-library

개별 파아지들을 로 분리한 후 각각의 의 에 대한 결합력을 측monophage monophage CFP-10

정함.

<CFP-10 ELISA> <c-myc ELISA>

Fig. 1.15 항원에 대한 항체 개발CFP-10

개의 단클론을 선택하여 분석한 결과 높은 비율로 에 결합하는 항체들이 확인되96 CFP-10•

었음 이중 시그널이 강한 종의 서열을 분석하였음 각 의 항원인. monophage 65 . monophage

식부위의 서열을 분석한 결과 종의 항체가 확인이 되었음 각 들의 서열과 종6 . monophage

류는 다음의 도표와 같이 다양한 항체가 확보되어 목표치보다 많은 항체 확보에 성공하

였음.

Table. 1.4 의 종류Monophage

Fig. 1.16 항체 서열분석 예시Group 1

• 항체의 결합력 분석6 group monoclone 각 그룹의 단클론 항체들을 제조한 후 항원:

의 농도를 로부터 씩 희석하여 코팅한 후 항체로 검출을 하였음(CFP-10) 1ug/ml 1/5 .

법에 의한 항원 검출은 약 희석 항원 농도로는 까지 정량적 검ELISA 1/3125 ( 350pg/ml)

출이 되었으며 이 가장 뛰어난 결합력을 나타내었음, group3, group4, group6 .

• 형 전환Anti-CFP10 whole IgG 항체개발과 동일한 방법으로 실시함 약술하면 얻어진: p85 .

항체의 서열을 이용하여 인간 및 발현벡터에 삽입하scFv IgG Heavy chain Light chain

기 위하여 각 가변영역을 특이적 를 사용하여 증폭하고Heavy chain/Light chain primer ,

또는 를 이용하여 절단하고 동일한 제한효소를 이용하여 절단한SfiI/NheI SfiI/BglII

벡터 와 에 삽입함pIGHV pIGLV .

• 단클론 항체의 발현 및 정제Anti-CFP10 항체로부터의 항원 인식성 비교로 가장: phage

우수한 종의 항체 를 대상으로 단클론 항체 생산에 투입하였음2 group2, group3 . Heavy

및 발현벡터에 도입된 항체서열을 확인 후 형 항체를 완성chain Light chain whole IgG

하기 위하여 각 발현 벡터를 세포에 하였음 형질도입된HEK293 co-transfection . HEK293

세포로부터 발현 분비된 항체를 얻기 위하여 세포배양액을 매 일 마다 회수하여 얻은- 3

세포배양액 약 을 하여 약 로 농축한 후500ml Ultra-filtration (millipore) 50ml

를 이용하여 항체를 결합 후 을 이용한Protein-A bead (sepharose; Pharmacia) glycin

을 실시하였음 된 항체 약 는 투석 후elution (Lane7, 8). Elution anti-CFP10 ( 10ml) -20C

에 보관하였음 얻어진 항체는 및 을 이용하여 확인하였음 항체. SDS-PAGE silver stain .

의 양은 방법을 이용하여 정량하였다 약 의 항체를 총 의 배양액으로bradford . 3mg 500ml

부터 확보하였음.

Fig. 1.17 A 단클론 항체의 발현 및 정제nti-CFP10

의 항원인식성 검증 항원을 로 로 전Anti-CFP10 (group2) : CFP10 10-100ng/well SDS-PAGE•

기영동 한 후 를 이용하여 을 실anti-CFP10 monoclonal antibody (group2) western blot

시하였음 실험 결과 는 항원을. anti-CFP10 monoclonal antibody (group2) CFP10 25-100ng

구간에서 잘 검출하고 있음을 알 수 있음.

항원에 대한 항체개발16-kDa□

에 항원을 의 농도로 총 를 코Immunotube 16-kDa 10 g/ml 2ml ( 20 g in Coating buffer)• μ μ

팅하여 라이브러리로부터 항원에 결합하는 파아지를 선별함 비특이적 파아지의 세척과.

정 회 후 남아있는 파아지를 대장균주에 감염시켜 파아지를 증폭한 후 차10 XL-1blue 1

를 얻었음 라이브러리를 이용한 항원 파아지 반응 및 검색 과정을 번sub-library . sub- - 4

을 반복하며 매 회 를 준비하였고 이 라이브러리 내의 파아지수를 분석하였sub-library ,

음.

Fig. 1.18 항원에 대한 항체개발16-kDa

항원에 결합한 항체를 회수하여 를 에 대하여 실시하였16-kDa phage phage-ELISA 16-kDa•

음 항원과 항체를 농도를 코팅한 에 차 차. 16-kDa anti-myc 1 g/ml ELISA plate 1 ~3μ

에서 얻어진 항체를 원액 까지 희석하여 결합성을 확인함 특히 차panning phage- ~1/1000 . 1

으로부터 차 이 진행됨에 따라 에 결합하는 항체가 되는panning 3 panning 16-kDa enrich

것을 확인함.

차 에서 얻어진 파아지 집단을 이용하여 파아지 항체를 분리하였음4 panning monoclonal .•

의 분리는 파아지미드를 가지고 있는 차 파아지 라이브러리 로부터Monoclone 3 (XL1 blue)

약 개의 를 취하고 개별적으로 파아지를 발현시켜 배양액에서 파아지를 수확하100 colony

였음.

의 에 대한 실험 결과 이들 들의 는 를 인식하는Monophage 16-kDa ELISA phage 88% 16-kDa•

항체를 표면에 가지고 있는 것을 확인할 수 있으며 그중 정도는 인식력이 매우 높, 50%

은 것으로 분석되었음 항원을 강하게 인식하는 항체를 발현하는 클론. 16kDa monophage

종을 선별하여 항체서열을 분석함 항체 서열결과 종의 상이한 항체들을 확보하였50 . 10

음 총 종의 항체서열 중 가장 결합력이 높은 개의 항체를 선별하여 전환. 10 4 whole IgG

을 위한 을 실시하였음cloning .

Fig. 1.19 항체서열 분석 예시

• 형 전환Anti-16-KDa whole IgG : 얻어진 항체의 서열을 이용하여 인간scFv IgG Heavy

및 발현벡터에 삽입하기 위하여 각 가변영chain Light chain Heavy chain/Light chain

역을 특이적 를 사용하여 증폭함 각 과 가변영역을primer . Heavy chain Light cahin

또는 를 이용하여 절단하고 동일한 제한효소를 이용하여 절단한SfiI/NheI SfiI/BglII

벡터 와 에 삽입함 준비된 와 를 한 후 에pIGHV pIGLV . insert vector Ligation XL-1 blue

형질도입한 후 얻어진 콜로니로부터 가 에 잘 들어갔는지를 알아보기 위하insert vector

여 을 수행하여 확인함 실험 결과 과 의 가변영역은colony-PCR . Heavy chain Light chain

벡터들에 잘 삽입이 되었음을 확인할 수 있음IgG .

• 단클론 항체의 발현 및 정제anti-16-kDa 항체로부터의 항원 인식성 비교로 가장: phage

우수한 종의 항체 를 대상으로 단클론 항체 생산에 투4 group3, group4, group6, group8

입하였음 형 항체를 완성하기 위하여 각 발현 벡터를 세포에. Whole IgG HEK293

하였다 형질도입된 세포로부터 발현 분비된 항체를 얻기 위하여co-transfection . HEK293 -

세포배양액을 매 일 마다 회수하였음 배양액 내에 항원 를 인식하는 항체가3 . (16-kDa)

잘 생산되고 있는지 알아보기 위하여 세포 배양액을 이용하여 미정제 을( ) western blot

실시하였다 배양액 를 전기영동하고 에 후. 30 l , PVDF membrane transfer anti-humanμ

를 이용하여 항체 발현 양을 확인하였고 실험결과 종의Fc-HRP , 4 anti-16kDa monoclonal

항체가 모두 잘 발현되고 있음을 확인할 수 있다 회수된 세포배양액 약 을. 500ml

하여 약 로 농축한 후Ultra-filtration (millipore) 50ml Protein-A bead (sepharose;

를 이용하여 항체를 정제하였음Pharmacia) .

Fig. 1.20 항체와 항체의 항원검출능력Anti-CFP-10 Anti-Ag85

항체와 항체의 항원검출능력Anti-CFP-10 Anti-Ag85□

항원 검출능력은 로 측정함 항체는 배로 항체sandwich ELISA . Anti-CFP-10 2000 , Anti-Ag85•

는 배로 에 희석하여 에 부착하고 후에 해당 항500 coating buffer ELISA plate , blocking

원을 첨가하여 반응시킴 검출항체는 본 교실에서 보관중인 항체와. rabbit anti-CFP-10

항체를 각각 사용하였음 항체를 로 사용rabbit anti-Ag85 . Anti-CFP-10 capture antibody

할 때 더 낮은 농도를 검출할 수 있음을 확인할 수 있었음.

Fig. 1.21 로 측정한 항체와 항체의 항원검출능력sandwich ELISA Anti-CFP-10 Anti-Ag85

결핵 진단 항원 항체개발 연구결과 요약 및 고찰-□

항원 검출을 통한 결핵진단법을 개발하기위해서는 개개의 항원에 대한 높은 결합력을 갖•

는 단일클론항체의 확보가 가장 중요함 따라서 일차적으로 진단목적에 적합한 다양한.

항원을 발굴하고 각각의 항원에 대한 항체를 방법을 통해 개발하는 것임phage display .

연구결과를 요약하면 다음과 같다.

기존항원 또는 결핵균 배양액에 다량 존재하는 항원인 와 를 결핵- Ag85 complex MTB12

균 배양액으로부터 직접 정제하였고 과 항원은 재조합단백질을 생산하CFP-10 ESAT-6

고 정제하였음.

잠복결핵조건에서 발현이 증가되는 항원에 대한 유전자 재조합단백질을 생산하- 16-kDa

고 정제하였음.

결핵균배양액과 배양액을 다단계분획과 분석을 통해 결핵균배양액에 풍부히- BCG 2-DE

존재하는 개의 단백10 (Rv1074, Rv0363c, Rv2780, Rv3803c, Rv3841, Rv0934, Rv0462,

과 배양액에 더 많이 존재하는 개의 단백Rv2882c, Rv2889c, Rv3628) BCG 3 (Rv3525c,

을 동정하였고 이중 항Rv1827, MBP70) , Rv0363c, Rv3841, Rv0934, Rv0462, Rv2882c

원에 대한 유전자 재조합단백질을 정제하였고 단백을 배양액으로부native MBP70 BCG

터 정제하였음.

결핵균세포막에 존재하는 항원 중에서 세포 면역원성이 높은 종류의 단백- B 3 (Rv1074,

을 동정함 단백에 대한 유전자재조합단백질을 정Rv0815c, Rv0831c) . Rv0815c(CysA2)

제하여 혈청학적인 특성을 분석한 결과 진단적인 유의성이 매우 높은 항원임을 규명

함.

결핵환자 에 존재하는 개의 단백- urine 7 (Rv0252, Rv3292, Rv3280, Rv255c, Rv0384c,

을 동정하였고 에 대한 재조합단백질을 정제하였음Rv0869c, Rv2524c) , Rv3280 .

파지항체개발은 차의 과정과 분리 결합력분석 항체서열분석- 3-4 panning , monphage , , ,

항체로의 전환 단클론항체 발현 및 정제 과정을 통해 항원에whole IgG , Ag85complex

대한 항체를 생산하여 정제함whole IgG .

항원에 대한 종의 상이한 단클론을 확보하였고 종의 를 생산하고- CFP-10 6 , 2 whole IgG

종의 항체를 정제함1 .

항원에 대한 종의 상이한 단클론을 확보하였고 종의 를 생산하- 16-kDa 10 , 4 whole IgG

였음.

개발된 항체를 항체로 사용하여 항원검출능력을 로 측정한 결과capture sandwich ELISA•

현재 의 조건에서는 수준임 그러나 검출조건을 조정하면 수준의 항원을 검출할g . ngμ

수 있을 것으로 생각되며 제 세부과제에서 개발한 새로운 검출시스템을 도입하면 수준1 pg

의 항원을 검출할 수 있다고 생각됨 또한 개발된 항체는 특이적으로 결핵균 배양액에서.

만 존재하는 항원과 항원을 검출하였음CFP-10 Ag85 .

를 이용한 고감도 진단 항체 단백질 칩 개발4.3 LOC

미세유체역학 과 을 이용한 고감도 진단시스템 개발(Microfluidics) LOC (Lab-On-a-Chip)□

을 이용한 진단 칩 제작을 위한 채널 설계SPR (Surface Plasmon Resonance)•

기법을 이용한 진단 칩 제작을 위하여 공정을 적용하여 시료 이송을 위한 마- SPR MEMS

이크로채널 및 진단 칩을 설계 함SPR (Fig. 1.22).

(a) Top view of SPR chip (b) Side view of SPR chip

진단 칩 구상도 및 세부 설계도Fig. 1.22 SPR

공정을 위한 제작하고 이를 이용하여- MEMS Photo Mask , Deep RIE, Gold Patterning,

등 여러 공정을 거쳐 마이크로 채널 제작Anodic Bonding MEMS (Fig. 1.23).

공정을 위한 채널 전산 설계도면Fig. 1.23 MEMS

챔버의 형상은 육각형 형상과 채널폭은 로 총 개의 마이크로 채널 완- 200,400,600 9㎛

성(Fig. 1.24)

공정을 이용하여 완성된 진단 칩Fig. 1.24 MEMS SPR

제작된 진단 칩을 이용한 항원항체 검출 테스트 및 진단 칩 성능평가SPR BSA• ․공정을 이용하여 제작된 진단 칩을 사용하여 반응 검출 테스트 수행- MEMS SPR BSA

(Fig. 1.25).

진단 칩을 이용한 반응 검출 실험 개요도Fig. 1.25 SPR BSA .

테스트 결과- , ProlinkerTM를 이용한 검출 실험에서 진단 칩이 정상적으로 작BSA SPR

동하는 것을 확인하였음(Fig. 1.26).

하지만 금 박막이 있는 반응 챔버 내의 유동이 균일하지 못한 점과- ProlinkerTM에 사

용되는 클로로포름(CHCl3 에 의한 접합에서의 누수 등 몇 가지 문제점 발견) Port .

이러한 문제점들 중 진단 칩의 정밀도에 영향을 주는 것들을 개선한 두 번째- SPR SPR

진단 칩 설계.

(a) SPR chip sensitivity of BSA detection (b) SPR angle shift( )Δθ

진단 칩을 이용한 반응 검출 테스트 결과Fig. 1.26 SPR BSA

미세유체역학 및 전산유체역학을 이용한 새로운 진단 칩 설계SPR .•

기존의 진단 칩의 반응챔버에 대한 전산해석을 수행한 결과 챔버 출구에서의 병- SPR ,

목현상으로 인해 출구 위아래로 재순환 유동이 발생하고 상대적으로 중앙으로 유동,

이 집중되는 것을 확인(Fig. 1.27).

이러한 유동집중현상 및 재순환 유동현상을 없애기 위해 새로운 형태의 반응챔버 및-

마이크로 채널 설계 수행.

새롭게 설계된 마이크로 채널 및 반응챔버에 대한 전산해석을 수행한 결과 유동이- ,

반응챔버 내부에 고르게 분포되고 재순환영역이 발생하지 않는 것을 확인(Fig.

1.28).

를 이용하여 새롭게 제작된 채널 제작하기 위한 몰드를 미세가공을 통해 제작- PDMS .

제작한 몰드를 이용하여 채널을 제작하였으며 제작된 채널의 내부유동을- PDMS , PDMS

기법을 적용하여 측정-PIV(Particle Image Velocimetry) .μ

반응 챔버 내부를 총 여섯 구역으로 나누어 각 구역에서 장의 이미지를 획득하였- 2000

으며 획득된 이미지는 부산대학교 김경천 교수 연구실에서 직접 개발한 프, PIV-ACE

로그램을 사용하여 과정을 거쳐 순간속도장 및interrogation, Validation, ensemble

평균속도장을 추출(Fig. 1.29 (a)).

얻어진 평균속도장을 적절히 겹쳐 전체 반응챔버에 대한 평균속도장 추출- (Fig 1.29

(b)).

전산해석을 통해 얻은 평균속도장과 측정을 통해 얻어진 평균속도장이 유사함- -PIVμ

을 확인(Fig. 1.30).

로 제작된 마이크로 채널 및 반응챔버와 금박막이 도포된 와 접합하여 새로- PDMS Glass

운 진단 칩 제작SPR (Fig. 1.31).

기존 진단 칩 내부의 유동장 구역에서의 속도(a) SPR (b) A-A'

기존의 진단 칩에 대한 전산해석Fig. 1.27 SPR

새롭게 설계 된 진단 칩 내부 유동장 구역에서의 속도(1) SPR (2) a,b

새롭게 설계 된 진단 칩에 대한 전산해석Fig. 1.28 SPR

(a) - PIV measurement of SPR channel (b) Combination of whole 6 sectorμ

기법을 이용한 반응챔버 내부 유동 가시화Fig. 1.29 -PIVμ

(a) Velocity field by - PIV measurement (b) Velocity field by CFD analysisμ

기법을 이용한 반응챔버 내부 유동 가시화Fig. 1.30 -PIVμ

채널과 금박막이 도포된 를 접합하여 제작한 진단 칩Fig. 1.31 PDMS Glass SPR

금 나노 입자를 이용한 진단 칩 설계•

나노 단위의 금 입자는 육안으로 확인할 수 있는 정도의 붉은 빛을 발하며 이를 이- ,

용하여 항원항체 반응 여부를 확인 하고자 함.

금 나노입자가 결합된 항원을 반응 챔버에 고정된 항체와 반응시켜 반응챔버의 색변- ,

화로 항원항체 반응여부를 검출.

가지 다른 항체를 각각 검출할 수 있도록 하나의 진단 칩에 세 개의 반응챔버를 설- 3

계하였으며 전산해석을 통하여 내부 유동이 균일한지 검토하였음, (Fig. 1.32).

를 이용하여 설계된 칩을 제작하기 위한 몰드를 미세가공을 통해 제작- PDMS (Fig.

1.33).

제작된 몰드와 를 이용하여 결핵 진단용 진단 칩 제작- PDMS .

사각형태의 진단 칩 설계 구형형태의 진단 칩 설계(1) (2)

금 나노입자를 이용한 진단 칩에 대한 전산해석Fig. 1.32

금 나노입자 진단 칩 체널 몰드 로 제작된 금 나노진단 칩(a) (b) PDMS

미세가공과 로 제작된 금 나노입자 진단 칩Fig. 1.33 PDMS

전기화학적 방법을 이용한 고감도 진단시스템 개발□

변화에 민감한 폴리머와 반응을 이용한 전기화학적 변화 측정pH Urea-Urease•

의 반응 결과물로- Urea-Urease NH3가 생성되는데, NH3는 대표적인 염기성 물질로서 반

응 후 시액의 가 상승함pH .

사의 폴리머는 생물학적으로 안전하고 변화에 민감하며 항체를 고정- EUDRAGIT S100 , pH

할 수 있어 의공학 연구에 많이 사용되고 있음.

본 연구에서는 반응과 폴리머의 항체고정 기능 및 민감도를 이- Urea-Urease S100 pH

용하여 항원항체 반응여부를 검출하고자 함.

항원항체 반응이 일어났을 경우 반응의 결과물로 생성된- Urea-Urease NH3로 인해 pH

가 상승하고 이상에서 붕괴되는 폴리머의 특성으로 인해 반응이 일어나, pH 7.5 S100

가 상승하면 폴리머가 붕괴되고 시액과 전극사이의 이온 투과량이 증가 함 이로pH , .

인해 임피던스가 감소하는 결과를 얻을 수 있음(Fig. 1.34).

에 나와 있는 전극의 부분에 를 도포하- Fig. 1.35 Interdigitated comb S100 polymer

고 그 위에 특이항체를 고정함 가 된 항체를 항원에 접, . Urease conjugated second

합시킨 후 폴리머에 접합된 특이항체와 반응시키면 측정 준비가 완료 됨, S100 .

측정 준비 된 전극을 가 들어있는 시액에 담구고 임피던스 측정 장비를 이용하- Urea ,

여 임피던스의 변화를 측정함.

폴리머의 변화에 따른 민감도를 확인하는 기초실험 수행 실험결과- S100 pH (Fig. 1.36

위로 올라갈수록 임피던스가 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있음pH 7.5 .

하지만 폴리머 코팅조건 수립 폴리머 위 항체고정 공정 수립 등 각 단계별 실- S100 ,

험 조건을 정량화하는데 시간이 많이 소요됨.

현재 항원 항체 농도 변화에 따른 임피던스 출력 신호의 변화를 확인하고 있으며- , ,

향후 지속적인 연구가 필요할 것으로 보임.

전극 폴리머를 이용한 항원항체 반응 진단 개념도Fig. 1.34 Interdigitated , S100

전극 설계도면 실제 제작된 전극(a) Interdigitated (b) Interdigitated

전극 설계 및 제작Fig. 1.35 Interdigiated

-20000 0 20000 40000 60000 80000 100000120000140000160000180000

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

Nyquist pH 5.1

pH 6.0

pH 6.5

pH 7.0

pH 7.25

pH 7.5

pH 8.0

pH 8.5

pH 9.0

Z im

Z re

0 50000 100000 150000

0

-20000

-40000

-60000

-80000

-100000

-120000

Bode plot pH 5.1

pH 6.0

pH 6.5

pH 7.0

pH 7.25

pH 7.5

pH 8.0

pH 8.5

pH 9.0

Imp

eda

nce

Frequency Hz

(a) Nyquist plot (b) Bode plot

변화에 따른 폴리머 임피던스 측정Fig. 1.36 pH S100

자성 나노 파티클의 선택적 추출4.4

자성 나노파티클을 이용한 전처리 및 선택적 추출 기술□

연구방법•

자성 나노파티클은 높은 생체적합성과 합성방법이 용이한- Fe3O4 를 바이오(Magnetite)

연구에 사용하고 있으며 이를 정도의 분포로 합성하였음, ~20nm .

는 합성된- A Fe3O4 나노파티클이 외부 자성에 반응하여 유리병 벽에 모여있는 모습이

며 이미지를 통해 나노파티클의 평균 크기가 정도의 분포를 가진 폴리, SEM(B) ~20nm

크리스탈임을 확인 하였음.

자성 나노파티클 의 표면에 항체 를 형광 나노파티클 에 항원- (MP) (antibody-AB) (FP)

를 부착하여 형광분광분석을 실시하였음(antigen-AG) .

자성 나노파티클을 이용한 전처리Fig. 1.37

그래프 상의 는 가 부착된 원래의 형광분포이고 는 와 가 서로- (D) a AG FP , b AG-FP AB-MP

공존할 때의 형광분포를 보여주며 약간의 세기 감소와 넓은 분포의 성향은 나노입,

자의 농도가 증가하면서 나노입자끼리의 충돌현상이 발생하고 와 의 반응에 의, AG AB

한 뭉침 현상으로 생긴 것으로 분석되었음 이는 적합한 실험조건을 찾는다면 해결.

가능할 것으로 예상됨.

또한 자성 나노 파티클은 외부 자기장에 매우 민감하게 반응하므로 이를 이용하여 자-

기 나노 파티클의 표면에 항체를 부착 시료의 측정에 필요한 항원을 선택적으로 분,

리 가능함.

자성 나노파티클 합성과 바이오 활성물질 부착에 의한 안정성 확보•

의 약 알카리성 수용액을 이용해 나노 파티클을 합성하는 공정에- pH7~9 ~10nm Ferrite

H2O2를 첨가하여 나노 파티클의 표면을 약간 산화시켜 Fe(OH)2를 얻는 방법을 사용함

으로써 장기간의 안정성을 확보할 계획임.

- H2O2가 첨가된 후 완전히 제거되지 못할 경우 바이오 활성 물질을 약화시킬 가능성이

있으나 오히려 이나 처럼 혹은 그의 관련물질이 있을 때, Avidin Biotin Peroxidases

더 활성을 보이는 바이오 물질을 사용할 때는 유용하게 쓰일 수 있음.

바이오 활성물질을 자성 나노 파티클과 연결하기 위해 화학물질- , (Si(OET)3(CH2)3NH2

을 사용해 자성 나노 파티클을 만듦 아민기는 항체 또는 단백질의Amino-modified . ,

작용기와 간단한 를 사용해 결합시킬 수 있음Carboxylic Chemistry .

또는 를 사용해 자성 나노 파티클의 결합기를 그룹으로 변- Glutaraldehyde Carboxylic

경하여 엔자임의 그룹과 연결할 수도 있음 이는 바이오 결합 실험 중에 가장Amine .

적합한 조건을 찾기 위한 다양성을 확보할 수 있다는 면에서 의미가 큼.

Fig. 1.38 H2O2를 사용한 Fe(OH2 로부터 자성을 띤 나노파티클의 합성)

자성 나노파티클은 외부자기장에 매우 민감하게 반응하므로 이를 이용해 자기 나노파-

티클의 표면에 항체를 부착 시료의 측정에 필요한 항원을 선택적으로 분리함, .

비색계 나노파티클 합성과 바이오 활성물질 부착에 의한 안정성 확보•

금 염인- HAuCl4 3H․ 2 과 의 혼합물에O sodium citrate NaBH4를 첨가하여 환원법을 통해

금나노입자를 제작함.

방법을 통해서 금나노입자의 표면이 바이오물질과 결합할 수 있도록 활성킴- EDC/NHS .

이 때 에 대한 안정성을 확보하기 위해서 생체적합성을 갖는 폴리머인pH

를 코팅함polyethylene glycol(PEG) .

표면이 활성된 금 나노입자에 항체를 부착시킴으로서 바이오 활성을 갖는 금나노입자-

를 제작함.

항체로 표면처리 된 금나노입자의 제작방법Fig. 1.39

항원 항체 반응에 따른 항원의 선택적 추출-•

바이오 나노입자에 결핵 항원을 첨가하여 분간 흔들어 섞어주어 항원 항체 반응을- 30 -

유도한 후 외부 자장을 걸어주어 자기영동을 진행시킨 후 자외선 가시광선 분광기를/

이용하여 항원의 유무를 진단함.

고감도 칩 처리 기술 개선4.5

분석장비를 이용한 정량분석SPR□

연구 방법•

폐결핵을 진단하는 기술은 년대에 개발된 이래 새로운 방법이 개발되지 않고 현- 1960

재도 동일한 방법을 사용함 이를 개선하기 위하여 바이러스 균이 아닌 결핵. urine

항원 검출에 초점을 맞추었고 항원 항체 결합을 측정하기에 적합한, - Surface

분광기를 도입하였음Plasmon Resonance(SPR) .

측정에 사용되는 칩은 항원 처리 과정에 앞서 몇 가지 처리과정을 거쳐야 함 먼- SPR .

저 기판위에 라는 화합물을 증착 시킨 후 결핵 항체를gold calix[4]arene(Cal-4) ,

고정시킬 수 있는 를 결합시킴 의 다른 활성화 부분을 억제시키기Protein A . Cal-4

위하여 를 처리한 다음 항체를 고정함 항체를 고정시키Bovine Serum Albumin(BSA) .

는 과정까지의 모든 단계는 장비에 장착하기 전에 칩 표면에 방법을self-assembly

통해 미리 처리하며 항원은 분광기의 채널에 흘려주어 농도별 민감도를 측정, SPR

함.

를 대상으로 한 실험 결과 농도 에서 평균적으로 의 이동이- hIgG 200ng/ml 300RU peak

나타났으며 최소 에서 의 값이 나타났지만 이는 정확한 값으로 판별하20ng/ml 20RU ,

는데 어려움이 있기 때문에 평균적으로 이상의 값에서 안정적으로 항체를50ng/ml

검출할 수 있는 것으로 판단하였음 분광기와 마찬가지로 항원 항체 결합을 관. SPR -

찰하는 대표적인 장비로 가 있음ELISA .

측정을 위한 칩 표면 처리Fig. 1.40 SPR

의 민감도가 최소 수 까지 가능한 것을 고려해 볼 때 비교적 민감도가 낮- ELISA pg/ml

다고 할 수 있으나 장비의 구성이 간단하고 표지를 위하여 사용되는 추가적인 형광,

및 항원 필요하지 않다는 데 장점이 있음 또한 전 처리만 끝낸다면 항원의 검출 여.

부 자체는 분 이내에 결과를 관측 할 수 있고 한 번 사용한 칩을 폐기하지 않고50 ,

차례 더 재사용이 가능함 이는 초기 발병을 잡아내면서 낮은 가격에 공급이 가4-5 .

능하다는 것을 의미함.

연구 결과•

항원을 처리하기 전에 장비에 연결된 프로그램에서 보여주는 정보창은 측정되는- SPR

값을 차 함수로 피팅하여 나타내며 의 경우 대략적으로SPR angle 2 , bare gold

의 값을 나타냄 고정되는 물질과 항체 항원 점차 골드 표면에 결합을20000RU(=20) . ,

함에 따라 그래프의 값이 오른쪽으로 이동하는데 이때의 값 변화를 프로SPR angle

그램 상에서 보여줌.

값 변화Fig. 1.41 SPR angle

실험에서는 와 의 결합을 살펴보았으며 반복 실험을 통해 분석한 결과- hIgG anti-hIgG ,

이상의 값과 이하의 값에서는 선형성을 관찰 할 수 없었는데 이는1ug/ml 20ng/ml ,

골드 표면에 증착된 항체와의 결합을 통해서 항원의 존재여부를 판별하는 장비의 특

성으로 인해 생기는 문제로 판단됨 그러나 의 구간에서는 당 의 변. 20ng-1ug 1ng 1RU

화를 보이며 높은 선형성을 보이고 있으며 의 농도에서 항원의 결합력이, 200ng/ml

가장 높게 나타남.

0 200 400 600 800 1000

0

200

400

600

800

1000

Ang

le s

hift (R

U)

amount of antigen (ng/ml)

와 의 결합력의 변화Fig. 1.42 hIgG anti-hIgG

또한 온도와 주변 진동에 대한 민감도가 높아서 그에 따른 값의 변화가 컸는데 이는- ,

외부의 영향이 많은 일상생활에서 큰 문제가 될 수 있으므로 지속적으로 개선해 나,

아가야할 점으로 생각됨.

계속적으로 을 기준으로 항원을 투입한 경우 차 차로 갈수록 의 값이- 100ng/ml 2 , 3 RU

지속적으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었음 이는 항원의 결합 자리가 계속적으로.

줄어들기 때문에 나타나는 현상으로 완전히 없애기는 힘듬.

분석장비를 이용한 정량분석Fig. 1.43 SPR

그러나 낮은 농도에서 높은 농도 순으로 항원을 투입할 경우 이러한 현상이 완화시킬-

수는 있음 항원 항체 결합을 보는 기존의 장비들과의 차이점으로 재사용성을 제시. -

하였는데 초기 감염환자의 항체가 심하지 않은 상태라고 가정한다면 민감도와는 별,

개의 문제로 칩의 경우에는 최소 회 이상 사용이 가능하다는 결론을 내릴 수SPR 3

있음 값 싼 회성 장비를 여러번 사용할 수 있으므로 큰 경제적 효과를 거둘 수 있. 1

을 것임.

결핵 진단용 스트립 테스트 칩 개발 및 제작4-6 (Strip)

결핵 항원과의 반응을 위한 진단용 테스트 칩 내부 스트립 설계□

은 결핵 진단용 테스트 칩의 스트립 내부 구성을 나타낸다Fig. 1.44 .•

나이트로셀룰로즈 멤브레인의 좌우에는 검출에 이용될 검체의 흡수 및 이동을 위해 흡수•

패드와 싱크패드를 부착하였으며 흡수패드에 유입된 검체는 나이트로셀룰로즈 멤브레인,

뒤에 부착된 싱크패드의 흡수력에 의해 싱크패드 방향으로 흐르게 된다 나이트로셀룰로.

즈 멤브레인에는 검출하고자 하는 특이항원에 대한 항체를 미리 고정해 두고 검체의 이,

송을 확인하기 위해 대조선 도 함께 배치하였다 제작한 진단용 스트립의(Control line) .

나이트로셀룰로즈 멤브레인의 검사선 영역에는 개발된 특이항체를 코팅하였고 대조선,

부분에는 를 코팅하였다Anti-IgG (Fig. 1.45).

결핵 진단용 스트립 테스트 칩 외부 케이스 설계 및 제작□

결핵 항원 검출을 위한 내부 스트립을 보호하기 위한 외부 케이스를 설계 제작하였다, .•

전산설계프로그램을 사용하여 외부케이스를 설계하여 도면을 제작하였으며(Fig. 1.46),

기계 미세가공 방법 중 하나인 선반과 밀링 공정으로 부산대학교 경량부품가공센터NC NC

에 의뢰하여 금형을 제작하고 플라스틱 사출방식으로 외부 케이스를 제작하였다, (Fig.

1.47).

결핵 진단용 스트립 테스트 칩의 진단 원리 및 순서□

흡수패드 외부 케이스의 검체 유입구 에 진단을 위한 검체 를 유입하면 싱크패드에( ) (50 )• ㎕

의해 특이항체가 코팅되어있는 나이트로셀룰로즈 멤브레인 방향으로 검체가 흐르게 되

고 검체 내 존재하는 특이항원은 항체와 반응하게 된다 반응이 일어난 스트립의 흡수, .

패드에 시약 을 유입하여 나이트로셀룰로즈 멤브레인을 새척해 준 후NaCl/EDTA (50 ) ,㎕

다시 우레아제 가 접합된 항체 를 흘려준다 스트립의 흡수패드에(Urease) (50 ) .㎕

시약 을 다시 한 번 유입하여 나이트로셀룰로즈 멤브레인을 새척해 준NaCl/EDTA (50 )㎕

후 요소 가 들어있는 페놀레드 지시약 을 흡수패드를 통해, (Urea) (Phenol Red, PR) (100 )㎕

유입시킨다 유입된 지시약에 포함되어 있는 요소 와 검사선에 고정된 항체 항원. (Urea) - -

항체에 접합되어 있는 우레아제 가 반응하면(Urease) NH3가 생성되어 변화가 일어나pH

며 이러한 변화는 지시약에 의해 붉은 색으로 발색되게 된다 검사선과 대조선 모, pH PR .

두 붉은 빛이 발색되면 결핵 항원이 검출된 것이며 대조선만 발색되었을 경우에는 결핵,

항원이 존재하지 않음을 의미한다 만약 두 선 모두 발색이 되지 않거나 발색되는 위치. ,

가 모호할 경우 재검사가 필요하다.

결핵 진단용 칩 내부 스트립 구성Fig. 1.44

결핵항원 진단 칩의 내부 스트립 제작 방법Fig. 1.45

결핵 진단용 칩 외부 케이스 전산설계도면Fig. 1.46

최종 제작된 결핵 진단용 테스트 칩Fig. 1.47

결핵 진단 항체 단백질 칩의 임상적 유용성 평가4.7

임상 검체 확보□

다양한 병기의 검체를 이용하여 조기 진단에 최적인 항원 항체 발굴-•

임상적으로 결핵으로 확정되기 전의 호흡기 환자로부터 활동성 폐결핵 환자에 이르기-

까지 다양한 임상병기의 환자를 총 례 확보함200

제 세부 과제에서 도출된 항원 항체를 실제 임상 병기 환자를 대상으로 하여 환자 샘- 2

플로 실험.

우선 기존 진단 결과가 알려진 활동성 결핵 환자 또는 정상인을 대상으로 시제품 수-

준의 단백질 칩을 평가하여 실험적 개선에 정보제공.

시제품 및 최종 제품에 대해서는 로 검사를 실시하여 임상적 유용성 평가- blind-test

음성대조군 결핵의심군 치료전 환자군 치료중 혹은 치료종결 환자군 등 각 군별로( , , ,

최소 명 이상의 환자 유래 검체 이용100 )

식약청 승인 획득 목적의 임상 시험 기준 확립-

을 이용한 평가spiked urine□

정상인의 소변에 발굴한 항원 과 를 첨가한 이용하여 검사 시행CFP-10 Ag85 spiked urine•

발굴된 항원의 반응성 확인•

Specimen no. Antigen Reaction1 CFP-10 Positive2 CFP-10 Positive3 CFP-10 Positive4 CFP-10 Positive5 CFP-10 Positive6 Ag85 Positive7 Ag85 Positive8 Ag85 Positive9 Ag85 Positive10 Ag85 Positive

다음 단계로 항원의 농도에 따른 검출 한계 즉 반응의 민감도 시험중, .•

기존의 진단법과 비교 연구를 통한 임상적 유용성 및 적응 대상 환자 군 파악•

부산경남 지역의 개 대학병원에서 독립적으로 기존의 검사 방법 도말염색 배양- 6 ( , ,

과 병행하여 호흡기 검체 및 소변을 이용한 비교 평가PCR)

임상적 유용성을 기반으로 한 최종 상용화 모델 제시□

표준 균주 배양 검체 배양액 로 정량 정성 시험 시행( )•

개발된 항원 항체를 전부 탑재한 단백질 칩에 대한 임상적 평가를 근거로 진단적 활용-•

가치가 최고로 판단되는 항원 항체 도출-

상기 을 이용한 민감도의 측정과 함께 임상 검체를 이용한 평가를 진행하고spiked urine•

있으며 시제품 공급 에 따라 실험을 계속 진행중, .

목표달성도 및 관련분야 기여도5.

총괄연구개발과제의 목표달성도5.1.

구분 연구목표 연구개발 수행내용가중치

(%)

평가

기준

성과

실적

자체

평가(%)

총괄

연구

과제

결핵의 조기진단에 가장 적합한

환자 조직액에 존재하는 결핵항

원 발굴

목표 결핵항원 선별 25 개10 개21 25

인간항체 파지 라이브러리를 이

용한 항원특이 항체 개발과 생산

파지 항체 라이브러리를 통

한 항원 특이 항체 개발25 개12 개17 25

를 이용한 고감도 진단 항체LOC

단백질 칩 개발진단용 항체 단백질 칩 개발 25 개1 개1 25

결핵 진단 항체 단백질 칩의 임

상적 유용성 평가

진단용 항체 단백질 칩의 임

상적 유용성 평가25 례100 례10 25

계 100 100

제1

세부

과제

임상 검체 확보 임상 검체 확보 환자수( ) 20 100 200 20

진단용 단백질 칩 시제품 개발

항원의 선택적 추출법 확립

논문( )10 편1 - 0

고감도 칩 표면 처리 기술

개선 완성 논문( )10 편1 편1 10

고감도 진단시스템 시제품

개발10 개1 개1 10

진단용 단백질 칩의 임상적 유용

성 평가임상시험 환자 수( ) 25 100 100 25

진단용 단백질 칩 완성

최종 상용화 모델 제시-

국외 등재 학술지- SCI

국내특허출원-

25

개1

편1

건1

개1

편1

건1

25

계 100 90

제2

세부

과제

진단적인 목적에 가장 적합한 목

표항원 발굴

기존 항원 및 결핵균 배양-

액내 종:4

잠복결핵 종- : 1

배양액 종- BCG : 3

결핵균 세포막 종- : 3

결핵환자 종- urine : 5

25 개10 개21 25

항원 특이항체 개발종의 항원특이 파지항체17

개발25 개12 개17 25

항체의 특이성 검증 및 생산종의 항체 생산4 whole IgG

및 정제35 종4 종4 35

계 100 100

관련분야 기여도5.2.

기술적 측면□

• 기존 진단법 비용적 측면에서 비효율적-

현재 다수를 대상으로 하는 결핵검진은 흉부방사선 촬영에 의존하고 있어 비용적인-

측면에서 효율성이 떨어짐.

면역학적 방법을 이용하는 진단방법은 현재까지 개발되어 상용된 도구 중 유용성 경- ,

제성 및 정확성을 갖춘 최고의 방법 중 하나로서 병원균 진단 방법으로 보편화됨.

동시 진단을 신속하게 할 수 있는 기반 기술 구축TB & NTM .•

인간 항체 라이브러리 구축에 의해 항체 기반의 항원 검출이 중요한 인체 질환에•

광범위하게 이용될 수 있는 기반 확보.

암 성인병 등 주요 질환에 단백질 또는 다른 항원 마커가 명확할 경우 효율적인- ,

항체 개발 시스템을 이용하여 항체만 공급하여 새로운 진단 키트 개발 속도가 매우

빨라 질 수 있음.

경제적 측면□

• 결핵 퇴치를 위한 범국가적 노력의 극대화로 경제적 이익 발생

조기진단을 통한 조기치료를 목표로 하는 결핵환자 발견사업 에서 볼 수 있듯이- “ ”

결핵 및 비결핵 마이코박테리아를 조기에 진단하는 것이 결핵 관리의 핵심.

세계보건기구에서 펼치고 있는 결핵 관리 역시 조기 진단을 통한 조기 치료 를 목- “ ”

적으로 진행되고 있으며 이러한 조기 진단에 대한 연구 활성화를 위해 다양한 방법,

으로 연구를 지원하고 있음.

따라서 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 신속 진단을 통해 조기에 발견하여 치료함-

으로써 직접적인 의료비 및 사회적인 비용 절감은 물론이고 무형적인 경제적 이득,

을 가질 수 있음.

진단을 위해 이용되는 생화학적 분자생물학적 방법에 있어 사용되는 대부분의TB & NTM ,•

기자재 시약 진단도구들은 수입에 의존, , .

본 과제를 통해 개발된 항체의 상용화를 통해 이를 대체할 수 있음- .

진단의 지연으로 초래되는 많은 사회적인 비용 절감 국가 경제 발전에TB & NTM .• ⇒

기여할 것으로 예상.

경쟁력있는 신속 진단 도구로 상업화하여 세계 상품 으로 성장할 수TB & NTM “ No.1 ”•

있음.

사회적 측면□

• 보건 의료 산업 활성화에 기여/

결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 속속 진단이 오랫동안 의존하던 생화학적인 방법을-

형 간염검사와 유사한 개념으로 전환시킬 수 있는 계기가 될 수 있음B .

결핵 및 비결핵 마이코박테리아 진단과 유사한 전염병 관리를 위한 성공적인 모델로-

서 관련 산업의 활성화에 기여.

타 연구개발과의 차별성□

마이코박테리아 감염증과 관련하여 이루어진 연구는 대부분 결핵 진단에 대한 것임.•

비결핵균에 의한 감염도 점차 증가 추세에 있어 이 둘을 동시에 신속 정확하게 진단

가능한 기술의 연구가 필요.

항원 항체를 이용한 면역학적 진단 연구 또한 결핵 진단을 목적으로 진행되어 왔으며,• ㆍ

항원을 이용한 상용제품은 일부 있으나 민감도와 특이도에 대한 신뢰도가 낮으며, ,

항체를 이용한 결핵 진단 제품은 없는 실정임.

대표적인 조기 진단 방법인 방사선학적 조직학적 방법으로는 비결핵균을 감별할 수• ㆍ

없으며 현재 분자생물학적인 방법 법 으로 통해서 대부분 이루어지고 있음, (PCR ) .

법에 의한 진단은 결핵균과 비결핵균 감별은 가능하나 비결핵균 동정은 불가능함PCR .•

항원 항체를 이용한 면역학적 진단방법은 현재까지 개발된 도구 중 유용성 경제성 및,• ㆍ

정확성을 갖춘 최고의 방법 중 하나로서 병원균 진단 방법으로 많이 연구되고 있으나

마이코박테리아 감염증 진단에 있어 상용화될 만큼 충분한 특이도와 민감도를 갖추지

못하고 있음.

향후 연구 성과 추진 계획6.

연구 결과의 논문 투고 계획6-1

제 세부과제의 항원의 선택적 추출법에 관한 연구와 기술 확립은 완료 상태이고 현재1•

논문 투고 준비중.

연구 결과를 이용한 후속 연구 계획6-2

제 세부과제 진단용 항체 단백질 칩 개발 및 임상적 유용성 평가1 -□

개발 제품의 임상적 유용성 평가 및 식약청 인허가를 위한 대규모 임상 시험 필요.•

례 이상(1000 )

과제 종료 이후에도 지속적인 임상 검체 수집과 임상적 유용성 평가 필요•

본 과제의 과제 책임자가 소속된 부산대학교병원 뿐만 아니라 마산 결핵 병원 인제- ,

대학교병원등 외부기관과의 협력을 통해서 대규모 임상 시험 계획중.

제 세부과제 결핵의 조기 진단을 위한 항원 특이 항체 개발2 -□

년간의 연구를 통해 다양한 후보항원을 확보할 수 있었고 신개념의 고친화 파지항체를2•

개발할 수 있었음 확보된 항원이 배양액에서 발견되기는 하지만 실제로 환자 조직액에.

서 발견될 가능성을 예측할 수 없기 때문에 실제로 에 존재하는 결핵항원을 동정까urine

지는 하였지만 재조합단백질 생산이 늦어지는 관계로 항체개발까지는 진행하지 못함.

기존 연구에서 소변으로 이 배출된다는 보고에 따라 에 대한 파지항체를 개발하고LAM LAM•

자 하였으나 당지질항원인 관계로 에 고정이 되지 않아 파지항체를 검색할 수Immunotube

없었음.

항후 이들 연구를 계속 수행하여 결핵진단 단백질 칩에 사용될 수 있는 새로운 후보 항•

원 항체를 발굴하여 개발 기술을 지속적으로 업그레이드 함- .

연구 결과의 사업화 계획6-3

결핵항원 특이 항체를 이용한 결핵 조기 진단용 단백질 레피드 키트□

가제( : CombiRapid TB Pro)

현재 표준물질과 일부 임상 검체를 이용하여 검증한 결과 진단 제품으로써의 성공 가, ,•

능성이 보임.

임상 시험 규모를 확대하여 시제품의 성능을 검증하고 개선 필요.•

진단 제품의 판매를 위해서 식약청 품목 허가가 필요(KFDA) .•

가제 의 식약청 인허가 준비 약 개월 소요 예상: CombiRapid TB Pro (KFDA) : 6•

기준 및 시험방법 제품의 품질관리 기준 심사:∙

안전성 유효성 심사 임상 시험 성적서 제출:∙

식약청 인허가 업무 흐름도-

연구개발결과의 파급효과7.

기술적 파급효과7.1.

결핵 진단법의 획기적으로 개선으로 결핵의 전파가 효과적으로 차단되는 계기 확보□

결핵은• 연간 만명의 신환자가 발생과800 매년 만명의 사망200 을 획기적으로 줄일 수 있

음.

전 세계 사망자 명중 명은 결핵으로 사망하고 있으므로 관리에 획기적 전환AIDS 3 1 AIDS•

기 제공.

결핵의 신속 진단이 수십년간 도말 검사에 의존하던 것을 형간염검사 등 다른 감염검사B•

와 같은 개념의 새로운 진단법으로 바꾸는 계기가 될 것임.

결핵다발국가에 본 검사법을 저비용으로 공급할 수 있는 상황이 되면 전세계적인 결핵•

감소 추세를 훨씬 앞당길 수 있을 것임.

경제산업적 파급효과7.2. ‧가장 경제적인 결핵 퇴치전략 가동으로□ 의료비 절감과 결핵 관리 성공 달성

결핵의 근본적인 퇴치를 위해서는 를 대체할 수 있는BCG• 백신개발이나 새로운 항결핵제

개발이지만 연구하기가 어렵고 기간도 오래 걸리며 많은 연구비를 필요로 하므로 뚜렷, ,

한 성과가 있기까지는 많은 기간이 소요될 것임.

따라서 일차결핵이 적합한 화학요법제로 개월간 치료하면 잘 치유되는 감염질환임을 감6•

안하면 가장 효율적인 결핵관리 전략은 활동성 결핵환자를 조기에 발견하여 치료함으로

써 결핵의 전파를 차단하는 것임.

전염병 관리를 위한 진단용 단백질 칩의 성공적 모델 제시로 관련 분야 산업화 연구 활성□

화

결핵을 대상으로 개발되는 진단용 단백질 칩의 성공은 전염병 관리에 중요한 주요 세균•

성 질환 진단용 칩으로 신속히 확대 될 것임

세계적인 산업 경쟁력의 특성화 분야 확보로• 의료 수출의 효자 탄생

사회적 파급효과7.3.

국가적인 결핵관리 사업의 목표 달성으로 선진국형 보건 관리 완성□

외국인 노동자의 증가 고령화 사회로의 급격한 전환에 동반되는 결핵문제의 해결 가능,•

• 북한의 심각한 결핵을 효과적으로 관리하여 통일 비용 부담 격감 가능

연구개발결과의 활용계획8.

연구개발결과의 활용계획 및 추가연구의 필요성8.1.

관련분야 연구 개발에 활용 방안□

본 과제에서 발굴되는 항체가 다양한 임상 병기의 다양한 환경 하에서 진단적인 가치를•

가지는 정도를 정성 정량적으로 평가하여 병기에 따라 임상적인 유의성을 제공해주는 항

원을 확보

임상 병기 특이적인 진단을 가능하게 해주므로 환자의 치료와 예후에 귀중한 임상 정-

보 제공

강력한 특이 항체가 발견되면 로 단독 개발의 가능성이 높음rapid assay•

신속 간편 진단 로서 개발되어 광범위한 임상적용이 가능한 조기진단 탄생의- kit kit

가능성이 있음

유사 임상을 보이는 호흡기 또는 기타 인체 감염 질환의 항체를 추가로 탑제하여•

시키면 종합 진단 로 발전할 가능성이 있음version-up kit

타 분야 연구개발에 활용 방안□

항체 기반의 항원 검출이 중요한 인체질환에 광범위하게 이용될 수 있는 기반을 확보하•

게 됨

암 성인병 등 주요 질환에 단백질 또는 다른 항원 마커가 명확할 경우 효율적인 항- ,

체개발 시스템을 이용하여 항체만 공급하여 새로운 진단 개발의 속도가 매우 빨kit

라 질 수 있음

사업화 기업화 목표 달성도 및 계획8.2. ( )

산업화 방안□

기술이전 및 제품화 방안•

기술이전을 받을 기업인 주 진인은 부산대학교가 함께 투자한 학교기업으로서 부산- ( )

대학교주관의 연구 결과를 기술 이전받아 상품화한 경험을 가지고 있고 이에 따르,

는 행정적 경제적 절차와 의무와 권리 대하여 충분히 이해하고 있으므로 최단시간,

내의 상업화가 가능함.

초기부터 참여 회사가 공동연구의 제품화 부분에 참여하고 있으므로 연구 종료와 동-

시에 식약청 승인을 위한 절차를 시작하거나 거의 근접한 수준의 연구 결과물을 확

보 할 수 있을 것으로 봄.

주 진인은 주관기관인 부산대학교 산학협력단으로 부터 기술 이전 절차를 거쳐 사업- ( )

화를 진행함.

국제화 방안•

부산대학교 산학협력단의 국제 협력 체계를 활용하여 미국 일본 및 유럽으로의 진출- ,

을 고려함

국제적인 인증 등 경비 발생 부분은 전적으로 회사에 일임하여 진행하도록 함-

사업화 수준8.3.

사업화 실시 기업□ 주 진인: ( )

사업화 기술명□

결핵항원 특이 항체를 이용한 결핵 조기 진단용 단백질 칩•

결핵항원 특이 항체를 이용한 결핵 조기 진단용 단백질 레피드 키트•

제품의 주요 내용□

결핵항원 특이 항체를 이용한 결핵 조기 진단용 단백질 칩•

결핵 특이적 항원에 대한 항체를 이용하여 나노바이오 기술 적용된 결핵 진단용a. MEMS

단백질 칩 면역분석센서( )

나노표면처리와 나노파티클 가공 기술을 이용한 결핵 진단용 항체 단백질 칩b.

결핵항원 특이 항체를 이용한 결핵 조기 진단용 단백질 레피드 키트•

특이항원 항체에 면역크로마토그래피 원리 적용한 레피드 키a. - (immunochromatographic)

트

제품의 용도□ 결핵 항원 특이 항체를 이용한 결핵 조기 진단:

사업화 결과의 수준□

결핵항원 특이 항체를 이용한 결핵 조기 진단용 단백질 칩•

기술확보 프로토타입: &

당초 예상보다 많은 후보 항원 항체를 발굴함으로써 최적의 항원 항체 선별에 시간이- - -

지체됨.

현재 대략의 제품 구상을 끝난 상태라 프로토 타입을 개발한 상태이나 제품으로의- ,

가능성을 짐작하기에는 아직 미흡한 상태임.

향후 표준물질을 이용한 제품의 성능평가와 임상 시험을 거쳐 기술의 개선과 검증- ,

과정을 거쳐 제품 개발 완료 예정임.

결핵항원 특이 항체를 이용한 결핵 조기 진단용 단백질 레피드 키트•

기술확보 프로토타입: &

현재 표준물질과 일부 임상 검체를 이용하여 검증한 결과 진단 제품으로써의 성공- , ,

가능성이 보임.

임상 시험 규모를 확대하여 시제품의 성능을 검증하고 개선 필요- .

사업화 자금 조달 계획□

자금 확보 방안 정부 국책자금 약 억원- R&D ( ) : 5

년 중소기업 산학연협력 지원 사업 지원 계획2011

자기자본 확보 방안 운전자금 약 억원- ( ) : 10

신주발행 제 자배정방식- 3

사업화 시기 년 하반기 예상: 2012□

연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보9.

바이오칩의 검출과정에 나노기술이 접목된 나노바이오칩□

은 칩의 검출과정에서 현재까지 많이 사용되고 있는 형광이나 전기화학적 방법Mirkin DNA•

과는 다른 금 나노입자 를 사용하는 방법 제시(gold nanoparticle)

고체 기질 표면에 프로브 올리고뉴클레오티드 를 붙인- (probe oligonucleotide)(12mer)

후 이와 혼성화를 할 수 있는 타게트 올리고뉴클레오티드(target oligonucleotide)

와 이 타게트 의 여분의 말단과 혼성화 할 수 있는 올리고뉴클레오티(27mer) (target)

드 가 붙어있는 크기의 금 나노입자를 동시에 혼성화 시킴(15mer) 13 nm .(Fig. 1.48)

육안으로도 혼성화의 여부를 알 수 있으며 이 기질을 용액에 담근 후- silver(I)

를 표면에서 환원시켰을 때 혼성화를 감지할 수 있는 감도가 형광을 사silver gold

용하였을 때 보다 약 배 정도 증가함을 보임100 .

을 이용하여 혼성화를 감지하는 모식도Fig. 1.48 Gold nanoparticle .

금 나노입자가 크기에 따라 서로 다른 색을 낼 수 있음에 착안하여 다른 종류의 올리-

고뉴클레오티드를 서로 다른 크기의 금 나노입자에 붙인 후 혼성화를 검출하는 방법

을 개발 (Fig. 1.49)

두 종류의 서로다른크기 와 를 갖는Fig. 1. 49 (50nm 100nm)

을 이용해 혼성화를 검출하는 모식도gold nanoparticle .

금 나노입자를 이용한 칩의 검출방법은 기존의 방법과는 완전히 다른 새로운 방- DNA

법을 제시한 것으로 나노기술이 칩의 검출분야에 적용된 좋은 예DNA

• Lab on a Chip

미국과 유럽에서 주로 연구되고 있는 기술로서 미국의 경우 이 분야의 신기술이 곧바-

로 벤처기업으로 연결되어 등 몇 개의 기Caliper Technologies, Aclara Bioscience

업들이 각자 독창적인 기술을 바탕으로 설립

년에 설립되어 이 분야에서 가장 선도적인 기업 현재 시장 점유율- Caliper : 1995 . 1

위이며 년 이후에도 가장 많은 특허를 출원 을 사용하여 핵98 . microfluidic system

산의 염기서열을 밝히는 기술에 관한 특허들로서 의 응용에 가까운 특Lab on a Chip

허임.

년 이후 출원된 주요 해외 특허로는 에서 타겟 핵산 염기서열- 98 Caliper Technologies

의 상대적인 위치를 측정하는 특허인 호와microfluidic system US 6,107,044

에서 핵산의 염기서열을 측정하는 기술에 관한 특허인microfluidic system US

호를 각각 출원 등록6,406,893 .

에서는 다공성 고분자에 마이크로 채널을 갖는 특허인- Motorola microfluidic device

호 등록US 6,361,958 .

역시 관련 특허를 출원하고 있으며 주요 특허로는- Affymetrix Lab on a Chip US

호의 와6,197,595 Miniatured integrated nucleic acid diagnostic device US

호의 에서 개스 버블을 조작하는 방법과 같이6,326,211 microfluidic device Lab on

시스템에 관한 특허들을 등록a Chip .

III.제 세부 연구과제 연구결과1

제 세부 연구과제 연구결과1

세부연구과제명 진단용 항체 단백질 칩 개발 및 임상적 유용성 평가:

세부연구책임자 장철훈 부산대학교 의학전문대학원 진단검사의학: / /

연구개발과제의 목표1.

을 이용한 고감도 진단 항체 단백질 칩 개발- LOC(Lab-On-a-Chip)

결핵 진단 항체 단백질 칩의 임상적 유용성 평가-

연구배경 및 필요성1.1

새로운 결핵 진단 기술 개발의 필요성□

의료기술의 발전에도 불구하고 국 내외 결핵 환자는 지속적으로 발생되고 있으며 결핵, ,• •

관리를 위한 최선의 방법을 조기 진단과 단기 치료로 두고 있음.

현재까지 결핵 진단을 위해 사용되고 있는 진단 방법은 약 여 가지이며 일반적으로 가10•

장 많이 사용되고 있는 진단방법은 로 세계보건기구 의smear microscopy WHO( ) “STOP TB

에서도 확인할 수 있듯이 진단 확대를 통한 결핵관리를 위한 도구로서2006-2015"(WHO)

를 선택하고 있음”smear microscopy” .

진단 방법 장점 한계

환자

방문

횟수

소요

시간

Radiographic

Methods

편리함•

높은 민간도•

단 미감염자( , HIV )

신속함•

비특이성•

상대적으로 높은 비용•

특별한 장치가 필요•

감염자의 경우 낮은 신뢰HIV•

회11

시간

Smear

Microscopy

대부분의 감염 진단•

높은 특이도•

저렴한 비용•

폭넓게 사용됨•

시험장소 유지의 어려움•

숙련된 기술자 필요•

감염자 어린이 폐외결핵환자HIV , ,•

에서의 낮은 민감도

약제내성과 약제민감도를MTB•

구별하지 못함

환자가 여러 번 방문해야 함.•

회2~32

시간

Culture

높은 민감도•

준 정량화•

종 규명가능•

약제 감수성시험 가능•

보통 주소요2~6•

특별한 시설과 숙련공 필요•회2~3

2~6

주

Nucleic Acid

Amplification

수 시간 내 결과 확인•

높은 특이성•

높은 민감성•

다양한 검체 사용가능•

고가이며 복잡함,•

현장 조건에의 낮은 특이성•회1

2~5

시간

Serology

보다 간단함Smear Microscopy•

높은 음성 예측값•

시간 내 결과 활용1•

상대적으로 저렴•

민감도의 제한•

활성 전후 구분 불가•

와 구분 불가M.T MOTT•

회1 분15

Phage Assay신속한 결과 확인 객담( )•

복잡한 장비 불필요•

기술 숙련 필요•

객담으로만 가능•회1

48~72

시간

그러나 진단에서의 특이성 민감성 소요시간 가격 등의 요소를 고려하면 만족할 만한, , ,•

결핵 진단법은 개발되지 않고 있으며 오히려 에서는, WHO "Diagnostics for

발간을 통해Tuberculosis-Global demand and market potential" "Sputum Smear

를 대체할 수 있는 진단법 개발을 위한 가이드라인을 제시 하여Microscopy" (78-80:203)

새로운 진단법 개발을 장려하고 있음.

새로운 결핵 진단법 개발 전략□

국 내외에 보고된 항체검출에 의한 결핵의 혈청 진단방법은 활동성 폐결핵에 대하여 민• •

감도는 약 내외 특이도는 정도임70% , 90~95%

특이도의 경우 향상시킬 수 있는 여지는 있으나 비활동성 결핵 비폐결핵 등을 진단- , ,

하는데 한계가 있어 상용화 시도는 없고 항원검출에 의한 결핵의 진단방법은 최근,

에 일부 연구가 진행되고 있음.

항원특이 항체 개발을 위해 다양한 형태의 결핵 검체를 확보 제공하고, ,• 개발된 항원특

이 항체의 면역학적 유용성을 자기조립 단분자막이 코팅된 기질상에 부착하여 검출 항원

과 반응결과를 실시간으로 평가함으로써 결핵 진단용 항원특이 항체의 민감도와 특이도

를 높임.

• 항체에 의한 항원 검출의 민감도와 특이도를 높이기 위하여 항원에 대한 항체의 특이도

를 높이는 기본적인 기술개발과 병행하여 특이 항체에 공급되는 항원이 포함된 검체의

최적 상태 즉 특이, 항체와 반응될 소지가 있는 다른 종류의 항원 단백질 등을 제거하,

는 정제 기술 비특이적 결합 방지( )이 필요함.

나노파티클 표면에 바이오 기능성 물질을 부착하여 매우 낮은 농도에서 박테리아 항체,•

항원 단백질 등과 같은 표적물질을 효과적으로 추출하여 분리해 내는, 선택적 추출 기술

은 항원 검출의 민감도와 특이도를 높일 수 있음.

마그네틱 비드를 이용한 바이오칩Fig. 2.1

일차항체가 고정된 마그네틱 비드 주입 마그네틱비드 고정 시료주입 항원 항원의 특이(a) (b) (c) ( ) (d)

적 결합 이차항체 주입 이차항체의 특이적 결합 및 전기신호 검출 마그네틱비드 세척(e) (f) (g)

결핵 진단용 특이 항체를 포함한 여러 종류의 항체가 부착된 자성 나노파티클을 다단으,•

로 구성하여 진단하고자 하는 검체를 순차적인 정제 추출함으로써 최종적으로 결핵진단

용 특이항체에 대한 항원을 검출할 수 있음 이러한. 복합 정제 추출 공정은 바이오 MEMS

기술을 적용함으로써 구현이 가능함.

새로운 결핵 진단 기술 개발에 나노기술 도입의 필요성□

나노 바이오 를 이용한 바이오 칩 제조 기술의 발전은MEMS• 질병 진단을 위한 새로운 연

구 도구로서 많은 기회를 제공하고 있음

바이오칩의 종류Fig. 2.2

마이크로어레이칩 마이크로플루이딕칩 층류현상을 이용한 아래(a) , (b) , (c) H-filter( )>

맹준호 정보과학회지 제 권 제 호( , 26 1 , 2008)外

나노 바이오 기술의 기존 연구의 제한점MEMS□

나노 바이오 소재의 상존하는 어려움은 나노파티클의 크기를 정확히 조절하여 뭉침현상,•

없이 수용액에서 합성하는 것임 최근 은 에서 나노파티클을. Saito et al., 90 Ferrite℃

Fe(OH)2를 사용하여 수용액상에서 합성하였고 와 는, Oh Perex et al., Fe2+, Fe3+의 수용액

을 사용하여 상온에서 합성하였음.

그러나 이 방법은• 정도의 조건에서만 합성을 할 수 있기 때문에 바이오pH 10~12 Alkali

소재로의 직접적인 이용에는 한계가 있음 또한 최근 의. Tokyo Institue of Technlogy

는 바이오 조건 즉Tada et al., , 의 약 알칼리성 수용액을 이용해pH7~9 ~10nm Ferrite

나노파티클을 합성하였으나 이 방법은 나노파티클의 장기간의 안정성에 문제가 발생함, .

연구목표1.2

최종목표1.2.1

임상 병기 특이적 항체를 이용한 결핵 조기 진단용 항체 단백질 칩 개발□

결핵 특이적 항원에 대한 항체를 이용하여 나노바이오 기술이 적용된MEMS• 결핵 진단용

단백질 칩 면역분석센서( )을 개발

나노표면처리와 나노파티클 가공 기술을 이용하여 결핵 진단용 항체 단백질 칩을 개발•

임상 시험을 통하여 진단용 단백질 칩의 임상적 유용성 평가•

항체 단백질 칩 개발을 위한□ 세부 목표 구성

진단용 항체 단백질 칩 개발•

자성 나노 파티클을 이용한 특이 항원의 선택적 추출-

항체 단백질 칩 제작을 위한 고감도 칩 표면 처리 기술 개선-

미세유체역학 과 기술이 적용된 고감도 진단- (Microfluidics) MEMS LOC(Lab-On-a-Chip)

시스템 개발

진단용 항체 단백질 칩 임상적 유용성 평가•

결핵 환자 또는 결핵으로 추정되는 환자로 부터 임상 가검물을 확보하여 진단적 유용-

성 평가

임상적 유용성에 근거하여 진단용 단백질 침의 최종 상용화 모델 제안-

연차별 목표 및 내용1.2.2

연차별 목표 및 내용 총괄□

구분 목표 주요 연구개발 내용

년차1

년(’08 )

임상 검체 확보임상시험을 위한 다양한 병기의 검체 확보•

공동연구자를 위한 임상 검체 제공•

진단용 단백질 칩 시제품 개발

자성 나노 파티클을 이용한 특이 항원의 선택적•

추출

항체 단백질 칩 제작을 위한 고감도 칩 표면 처•

리 기술 개선

미세유체역학과 를 이용한 고감도 진단시스LOC•

템 시제품 개발

년차2

년(’09 )

진단용 단백질 칩의 임상적 유

용성 평가

다양한 병기의 검체를 이용하여 조기 진단 에•

최적인 항원 항체 발굴-

임상적 유용성에 기반 한 최종 상용화 모델 제•

시

진단용 단백질 칩 완성최적의 표면처리 및 고감도 칩 완성•

시제품을 최종 상용화 모델로 완성•

연구개발과제의 추진체계2.

구분

총 연구기간 년 년(’08 ’09 )～

년차1 년차21/4 2/4 3/4 4/4 1/4 2/4 3/4 4/4

제

1

세

부

다양한 병기의 결핵환자 검체 확보

자성 나노 파티클을 이용한 특이 항원의

선택적 추출법 개발

고감도 칩 표면 처리 기술 개선

을 이용한LOC(Lab-On-a-Chip)

고감도 진단 칩 시스템 개발

기술 집적에 의한 단백질 칩 시제품 개발

단백질 칩 시제품 상용화 모델

임상시험에 의한 진단적 유용성 평가

연구개발수행 내용 및 결과3.

임상검체 확보3.1

확보된 검체는 다음과 같음 검체목록의 화면 프린트( )□

확보된 검체의 검체별 개수□

결핵 검사가 의뢰된 검체로 검사 후 잔여 검체를 확보하여 보관하고 있는 검체•

결핵으로 확진된 환자의 소변 양성 환자 유래의 소변 개(Sputum AFB Smear ) : 200•

목표 대비 확보된 검체수의 비율: 100%□

진단용 항체 단백질 칩 시제품 개발3.2

자성 나노파티클을 이용한 전처리 및 선택적 추출 기술□

연구방법•

자성 나노파티클은 높은 생체적합성과 합성방법이 용이한- Fe3O4 를 바이오(Magnetite)

연구에 사용하고 있으며 이를 정도의 분포로 합성하였음, ~20nm .

는 합성된- A Fe3O4 나노파티클이 외부 자성에 반응하여 유리병 벽에 모여있는 모습이

며 이미지를 통해 나노파티클의 평균 크기가 정도의 분포를 가진 폴리, SEM(B) ~20nm

크리스탈임을 확인 하였음.

자성 나노파티클 의 표면에 항체 를 형광 나노파티클 에 항원- (MP) (antibody-AB) (FP)

를 부착하여 형광분광분석을 실시하였음(antigen-AG) .

그래프 상의 는 가 부착된 원래의 형광분포이고 는 와 가 서로- (D) a AG FP , b AG-FP AB-MP

공존할 때의 형광분포를 보여주며 약간의 세기 감소와 넓은 분포의 성향은 나노입,

자의 농도가 증가하면서 나노입자끼리의 충돌현상이 발생하고 와 의 반응에 의, AG AB

한 뭉침 현상으로 생긴 것으로 분석되었음 이는 적합한 실험조건을 찾는다면 해결.

가능할 것으로 예상됨.

또한 자성 나노 파티클은 외부 자기장에 매우 민감하게 반응하므로 이를 이용하여 자-

기 나노 파티클의 표면에 항체를 부착 시료의 측정에 필요한 항원을 선택적으로 분,

리 가능함.

효과적 전처리 방법 개발•

첫 단계에서는 단가가 낮고 쉽게 구입할 수 있는 항원 항체 예- , - ( , IgG,

등 를 이용해 전처리 방법을 효과적으로 개발Streptavidin, HRP, ) .

분광기 등 다른 분석 장비와 비교 분석을 통해 전처리 방법의 효율성을- FT-IR , HPLC

평가.

Fig. 2.3 자성 나노파티클을 이용한 전처리

최소한 가지 이상의 다른 항원물질을 같이 분포시켜 특정 항원을 정확하게 추출해- 3

낼 수 있는 능력 평가.

자성 나노파티클 합성과 바이오 활성물질 부착에 의한 안정성 확보•

의 약 알카리성 수용액을 이용해 나노 파티클을 합성하는 공정에- pH7~9 ~10nm Ferrite

H2O2를 첨가하여 나노 파티클의 표면을 약간 산화시켜 Fe(OH)2를 얻는 방법을 사용함

으로써 장기간의 안정성을 확보할 계획임.

- H2O2가 첨가된 후 완전히 제거되지 못할 경우 바이오 활성 물질을 약화시킬 가능성이

있으나 오히려 이나 처럼 혹은 그의 관련물질이 있을 때, Avidin Biotin Peroxidase

더 활성을 보이는 바이오 물질을 사용할 때는 유용하게 쓰일 수 있음.

바이오 활성물질을 자성 나노 파티클과 연결하기 위해 화학물질- , (Si(OET)3(CH2)3NH2

을 사용해 자성 나노 파티클을 만듦 아민기는 항체 또는 단백질의Amino-modified . ,

작용기와 간단한 를 사용해 결합시킬 수 있음Carboxylic Chemistry .

또는 를 사용해 자성 나노 파티클의 결합기를 그룹으로 변- Glutaraldehyde Carboxylic

경하여 엔자임의 그룹과 연결할 수도 있음 이는 바이오 결합 실험 중에 가장Amine .

적합한 조건을 찾기 위한 다양성을 확보할 수 있다는 면에서 의미가 큼.

Fig. 2.4 H2O2를 사용한 Fe(OH2 로부터 자성을 띤 나노파티클의 합성)

자성 나노파티클과 바이오활성 물질과의 공유결합 모식도Fig. 2.5 Amino-functionalized

자성 나노파티클은 외부자기장에 매우 민감하게 반응하므로 이를 이용해 자기 나노파-

티클의 표면에 항체를 부착 시료의 측정에 필요한 항원을 선택적으로 분리함, .

비색계 나노파티클 합성과 바이오 활성물질 부착에 의한 안정성 확보•

금 염인- HAuCl4 3H․ 2 과 의 혼합물에O sodium citrate NaBH4를 첨가하여 환원법을 통해

금나노입자를 제작함.

방법을 통해서 금나노입자의 표면이 바이오물질과 결합할 수 있도록 활성시- EDC/NHS

킴 이때 에 대한 안정성을 확보하기 위해서 생체적합성을 갖는 폴리머인. pH

를 코팅함polyethylene glycol(PEG) .

표면이 활성된 금 나노입자에 항체를 부착시킴으로서 바이오 활성을 갖는 금나노입자-

를 제작함.

항체로 표면처리 된 금나노입자의 제작방법Fig. 2.6

항원 항체 반응에 따른 항원의 선택적 추출-•

바이오 나노입자에 결핵 항원을 첨가하여 분간 흔들어 섞어주어 항원 항체 반응을- 30 -

유도한 후 외부 자장을 걸어주어 자기영동을 진행시킨 후 자외선 가시광선 분광기를/

이용하여 항원의 유무를 진단함.

연구 결과•

자기영동에 따른 항원 검출 스펙트럼Fig. 2.7

항원이 있는 반응 용기는 항원 항체 반응이 일어났기 때문에 금나노입자와 자성나노- -

입자가 샌드위치 구조체를 이루고 자기영동이 진행되어 에서 사이에500 nm 550 nm

걸쳐서 금나노입자의 흡광도가 측정되지 않지만 항원이 존재하지 않는 반응 용기는,

항원 항체 반응이 일어나지 않기 때문에 자성 나노입자만 침전되어 금나노입자의 흡-

광도가 에서 사이에 걸쳐서 측정됨500 nm 550 nm .

스펙트럼의 피크가 매끄럽지 못한 이유는 반응용기의 재질이 일반 유리면서 그 모양-

이 둥글기 때문임 하지만 일반 유리의 반응용기를 이용해도 충분히 흡광도를 측정.

할 수 있는 것으로 확인됨.

항체의 대량생산 계획□

대장균을 이용한 생산•

항체의 목적이 항원과 결합시킴으로서 바이오센서로 이용하고자 하는 경우에는 굳이-

부위가 있을 필요 없음 이러한 경우 대신에 와 같은 항체단편을 사용하Fc . IgG Fab

는 경우가 여러모로 유리 탄수화물화 부위가 필요 없을 경우 대장. (glycosylation)

균을 이용하여 저렴한 비용으로 대량생산이 가능 이때 주의할 사항으로는 대장균에.

서의 항체 발현시 필요한 신호 펩타이드를 포함하므로 를 대장균에서 발현시키려Fab

면 신호 펩타이드가 절단된 정확한 아미노산서열로서 생산될 수 있도록 디자인되어

야 함 대장균의 경우 고농도배양이 가능하며 유도물질에 의한 발현유도나 성장속. ,

도에 기인하여 발현되는 프로모터의 성질을 이용하여 과발현을 유도 할 수 있음.

세포를 이용한 생산CHO (chinese hamster ovary)•

탄수화물화 부위가 포함된 전체 를 사용하여야 하는 경우에는 반- (glycosylation) IgG

드시 동물세포주에서 항체를 발현시켜야 함 항체의 생산에는 일반적으로 포유동물.

에서 유래한 세포주를 사용하는데 인간에서 만들어진 항체와 비교해 볼 때 탄수화물

의 구조에 약간의 차이는 있지만 활성도면에서는 큰 차이가 없음 포유동물 세포주.

중에서 가장 널리 이용되고 있고 항체를 발현하기 용이한 것이 세포주임CHO . CMV

프로모터를 이용한 발현시스템이 널리 사용되고 있음.

Fig. 2.8 항체의 구성요소를 나타낸 모식도

고감도 칩 표면 처리 기술 개선3.3

분석장비를 이용한 정량분석SPR□

연구 방법•

폐결핵은- Mycobacterium tuberculosis 로 불리는 결핵균이 유발하는 질병으로 주(TB) ,

로 개발도상국에서 높은 발병률을 보이고 있음 우리나라의 경우 발병률은 낮은 편.

이나 중장년층과 고령층에 보균자가 많으며 북한은 주민의 가 이 질병균을 가지, 70%

고 있음 그럼에도 불구하고 폐결핵을 진단하는 기술은 년대에 개발된 이래 새. 1960

로운 방법이 개발되지 않고 현재도 동일한 방법을 사용함 이를 개선하기 위하여 바.

이러스 균이 아닌 결핵 항원 검출에 초점을 맞추었고 항원 항체 결합을 측정urine , -

하기에 적합한 분광기를 도입하였음Surface Plasmon Resonance(SPR) .

측정에 사용되는 칩은 항원 처리 과정에 앞서 몇 가지 처리과정을 거쳐야 함 먼- SPR .

저 기판위에 라는 화합물을 증착 시킨 후 결핵 항체를gold calix[4]arene(Cal-4) ,

고정시킬 수 있는 를 결합시킴 의 다른 활성화 부분을 억제시키기Protein A . Cal-4

위하여 를 처리한 다음 항체를 고정함 항체를 고정시키Bovine Serum Albumin(BSA) .

는 과정까지의 모든 단계는 장비에 장착하기 전에 칩 표면에 방법을self-assembly

통해 미리 처리하며 항원은 분광기의 채널에 흘려주어 농도별 민감도를 측정, SPR

함.

Fig. 2.9 측정을 위한 칩 표면 처리SPR

를 대상으로 한 실험 결과 농도 에서 평균적으로 의 이동이- hIgG 200ng/ml 300RU peak

나타났으며 최소 에서 의 값이 나타났지만 이는 정확한 값으로 판별하20ng/ml 20RU ,

는데 어려움이 있기 때문에 평균적으로 이상의 값에서 안정적으로 항체를50ng/ml

검출할 수 있는 것으로 판단하였음 분광기와 마찬가지로 항원 항체 결합을 관. SPR -

찰하는 대표적인 장비로 가 있음ELISA .

의 민감도가 최소 수 까지 가능한 것을 고려해 볼 때 비교적 민감도가 낮- ELISA pg/ml

다고 할 수 있으나 장비의 구성이 간단하고 표지를 위하여 사용되는 추가적인 형광,

및 항원 필요하지 않다는 데 장점이 있음 또한 전 처리만 끝낸다면 항원의 검출 여.

부 자체는 분 이내에 결과를 관측 할 수 있고 한 번 사용한 칩을 폐기하지 않고50 ,

차례 더 재사용이 가능함 이는 초기 발병을 잡아내면서 낮은 가격에 공급이 가4-5 .

능하다는 것을 의미함.

연구 내용•

시약및재료-

는Protein A, chloroform, methanol(MeOH), anti-hIgG, hIgG, BSA, PBS Sigma

의 제품을 사용하였고 는Aldrich (St. Louis, MO, USA) , Prolinker-Cr5B (Cal-4)

의 제품을 사용함Proteogen(Seoul, Korea) .

처리- Cal-4

먼저 을cal-4 CHCl3에 충분히 녹인 후 의 용액 를 만든 다음 을 첨가하100mM 100ul MeOH

여 최종적으로 와MeOH CHCl3가 로 혼합된 용액 을 만듬 이 혼합 용액에1:9 1ml . SPR

의 표면이 닿도록 하여 시간 동안 상온에서 처리함 처리가 끝난bare gold chip 2 .

은chip CHCl3 의 용액에서 분간 번의 세척 과정을 거침:MeOH(1:99) 15 2 .

- Incubation

실험에 사용하기 위해서는 여러 물질을 위에 고정을 시켜야 하는데 물질을 용cal-4 ,

해시킨 버퍼 용액에서 전처리 과정을 거친 후 분간 회에 걸쳐 세척을 하는 동PBS 10 2

일한 과정을 반복함 먼저 이 녹아있는 용액 을 만들어 분. Protein A 500ug PBS 1ml 30

간 처리하고 이 녹아 있는 용액 에 시간, Anti-hIgG 150ug PBS 1ml 1 , Bovine Serum

의 용액에 분 순서로 진행함 최종적으로 만들어진 칩은 질소Albumin(BSA) 3% PBS 30 .

가스로 수분을 완전히 제거한 뒤 장비에 장착됨SPR .

- Flow method

펌프로 유속을 으로 조절한 뒤 을 관찰하여 안정화 될 때까지 기Injet 50ul/min peak

다림 이 과정을 거치면서 에 결합하지 못한 물질들이 떨어지고 점차적으로 항원. chip

에 결합하기 위한 최적의 상태가 만들어짐 이 안정해지면 적은 농도 별로 항원. Peak

을 주입하고 의 변화를 관찰함 항원 주입 후 다음 농도의 항원을 넣기 전에, peak . ,

버퍼를 충분히 흘려주어 이미 에 결합한 항원이 다음 의 변화에 영향이PBS chip peak

미치지 않도록 함 온도나 외부 진동의 변화 튜브 내에 발생하는 기포 등에 의해. ,

이 불규칙적으로 변하기는 하지만 외부의 영향을 제거하고 나면 안정된 값을 얻peak

을 수 있음.

연구 결과•

항원을 처리하기 전에 장비에 연결된 프로그램에서 보여주는 정보창은 측정되는- SPR

값을 차 함수로 피팅하여 나타내며 의 경우 대략적으로SPR angle 2 , bare gold

의 값을 나타냄 고정되는 물질과 항체 항원 점차 골드 표면에 결합을20000RU(=20) . ,

함에 따라 그래프의 값이 오른쪽으로 이동하는데 이때의 값 변화를 프로그SPR angle

램 상에서 보여줌.

값 변화Fig. 2.10 SPR angle

실험에서는 와 의 결합을 살펴보았으며 반복 실험을 통해 분석한 결과- hIgG anti-hIgG ,

이상의 값과 이하의 값에서는 선형성을 관찰 할 수 없었는데 이는1ug/ml 20ng/ml ,

골드 표면에 증착된 항체와의 결합을 통해서 항원의 존재여부를 판별하는 장비의 특

성으로 인해 생기는 문제로 판단됨 그러나 의 구간에서는 당 의 변. 20ng-1ug 1ng 1RU

화를 보이며 높은 선형성을 보이고 있으며 의 농도에서 항원의 결합력이, 200ng/ml

가장 높게 나타남.

0 200 400 600 800 1000

0

200

400

600

800

1000

Ang

le s

hift (R

U)

amount of antigen (ng/ml)

와 의 결합력의 변화Fig. 2.11 hIgG anti-hIgG

또한 온도와 주변 진동에 대한 민감도가 높아서 그에 따른 값의 변화가 컸는데 이는- ,

외부의 영향이 많은 일상생활에서 큰 문제가 될 수 있으므로 지속적으로 개선해 나,

아가야할 점으로 생각됨.

계속적으로 을 기준으로 항원을 투입한 경우 차 차로 갈수록 의 값이- 100ng/ml 2 , 3 RU

지속적으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었음 이는 항원의 결합 자리가 계속적으로.

줄어들기 때문에 나타나는 현상으로 완전히 없애기는 힘듦.

Fig. 2.12 분석장비를 이용한 정량분석SPR

그러나 낮은 농도에서 높은 농도 순으로 항원을 투입할 경우 이러한 현상이 완화시킬-

수는 있음 항원 항체 결합을 보는 기존의 장비들과의 차이점으로 재사용성을 제시. -

하였는데 초기 감염환자의 항체가 심하지 않은 상태라고 가정한다면 민감도와는 별,

개의 문제로 칩의 경우에는 최소 회 이상 사용이 가능하다는 결론을 내릴 수SPR 3

있음 값 싼 회성 장비를 여러 차례 사용할 수 있으므로 큰 경제적 효과를 거둘 수. 1

있을 것임.

향후 실험•

현재 폐결핵 초기에 나타나는 관련 항체 등을 장비에서 검출하는- Ag-85, CFP-10 SPR

실험을 진행 중에 있으며 실제적으로 항체에 결합하는 항원을 정량화 하여 최종적으

로 폐결핵 환자의 에서 채취한 샘플로 진단까지 할 수 있도록 하는 데에 목표urine

를 두고 있음.

이를 위해 장비를 개발한 사와 긴밀한 협동 관계를 유지하고 있으며 이후 장- K-mac ,

비의 감도를 높이기 위해 다양한 조건 하에서 최적화 상태를 찾고 있음.

장비에 관련된 기술은 장비에서 항원을 테스트하는 과정을 제외하고는 모든 과- SPR

정이 외부에서 처리되므로 충분히 산업화 될 가능성이 있고 측정 방법이 민간인을, ,

대상으로 사용되기에도 용이함 그렇기 때문에 단계 별로 측정에 관한 시스템을. SPR

구축한 후 에 대한 신뢰성 있는 데이터를 제작 이에 관련하여 논문을 게재하기, SPR ,

위해 준비중임.

을 이용한 고감도 진단 칩 시스템 개발3.4 LOC(Lab-On-a-Chip)

미세유체역학 과 을 이용한 고감도 진단시스템 개발(Microfluidics) LOC (Lab-On-a-Chip)□

마이크로채널을 이용한 시료이송을 위한 최적화 설계를 위한 전산해석 수행•

마이크로채널을 이용한 진단 칩 설계를 위해 마이크로채널의 모세력에 의한 시료이송-

에 대한 전산해석을 수행하였음 (Fig 2.13).

전산해석 결과 가로 세로 의 마이크로 채널에 시료를 이송시키는데- , 1mm X 20mm 0.23

초의 시간이 소요됨.

마이크로채널의 모세력에 의한 시료 이송 전산해석Fig 2.13

를 이용한 시료이송을 위한 최적화 설계를 위한 전산해석 수행Fiber•

를 이용한 진단 칩 설계를 위해 기공성 구조 내에서의 시료이송에 대한 전산해- Fiber

석을 수행하였음.

채널 내부를 기공성 구조로 하였으며 전산해석 조건은- , Porosity 0.5, Contact angle

로 지정하여 줌0°, Kozeny constant 0.2 .

전산해석 결과 가로 세로 의 에 시료를 이송시키는데 초의 시간이- , 1cm X 20cm Fiber 12

소요됨(Fig 2.14).

의 에 의한 이송 전산해석Fig 2.14 Fiber Capillary force

을 이용한 진단 칩 제작을 위한 채널 설계SPR (Surface Plasmon Resonance)•

기법을 이용한 진단 칩 제작을 위하여 공정을 적용하여 시료 이송을 위한 마- SPR MEMS

이크로채널 및 진단 칩을 설계 함SPR (Fig 2.15).

공정을 위한 제작하고 이를 이용하여- MEMS Photo Mask , Deep RIE, Gold Patterning,

등 여러 공정을 거쳐 마이크로 채널 제작Anodic Bonding MEMS (Fig. 2.16).

챔버의 형상은 육각형 형상과 채널폭은 로 총 개의 마이크로 채널 완- 200,400,600 9㎛

성(Fig. 2.17)

(a) Top view of SPR chip (b) Side view of SPR chip진단 칩 구상도 및 세부 설계도Fig. 2.15 SPR

공정을 위한 채널 전산 설계도면Fig. 2.16 MEMS

공정을 이용하여 완성된 진단 칩Fig. 2.17 MEMS SPR

제작된 진단 칩을 이용한 항원항체 검출 테스트 및 진단 칩 성능평가SPR BSA• ․공정을 이용하여 제작된 진단 칩을 사용하여 반응 검출 테스트 수행- MEMS SPR BSA

(Fig. 2.18).

에 상술되어 있는 실험 단계를 거쳐 반응 테스트 진행- Fig. 2.19 BSA .

테스트 결과- , ProlinkerTM를 이용한 검출 실험에서 진단 칩이 정상적으로 작BSA SPR

동하는 것을 확인하였음(Fig. 2.20).

하지만 금 박막이 있는 반응 챔버 내의 유동이 균일하지 못한 점과- ProlinkerTM에 사

용되는 클로로포름(CHCl3 에 의한 접합에서의 누수 등 몇 가지 문제점 발견) Port .

이러한 문제점들 중 진단 칩의 정밀도에 영향을 주는 것들을 개선한 두 번째- SPR SPR

진단 칩 설계.

진단 칩을 이용한 반응 검출 실험 개요도Fig. 2.18 SPR BSA .

진단 칩을 이용한 반응 검출을 위한 실험 단계Fig. 2.19 SPR BSA

(a) SPR chip sensitivity of BSA detection (b) SPR angle shift( )Δθ진단 칩을 이용한 반응 검출 테스트 결과Fig. 2.20 SPR BSA

미세유체역학 및 전산유체역학을 이용한 새로운 진단 칩 설계SPR .•

기존의 진단 칩의 반응챔버에 대한 전산해석을 수행한 결과 챔버 출구에서의 병- SPR ,

목현상으로 인해 출구 위아래로 재순환 유동이 발생하고 상대적으로 중앙으로 유동,

이 집중되는 것을 확인(Fig. 2.21).

이러한 유동집중현상 및 재순환 유동현상을 없애기 위해 새로운 형태의 반응챔버 및-

마이크로 채널 설계 수행.

새롭게 설계된 마이크로 채널 및 반응챔버에 대한 전산해석을 수행한 결과 유동이- ,

반응챔버 내부에 고르게 분포되고 재순환영역이 발생하지 않는 것을 확인(Fig

2.22).

를 이용하여 새롭게 제작된 채널 제작하기 위한 몰드를 미세가공을 통해 제작- PDMS

(Fig. 2.23).

제작한 몰드를 이용하여 채널을 제작하였으며 제작된 채널의 내부유동을- PDMS , PDMS

기법을 적용하여 측정-PIV(Particle Image Velocimetry) .μ

반응 챔버 내부를 총 여섯 구역으로 나누어 각 구역에서 장의 이미지를 획득하였- 2000

으며 획득된 이미지는 부산대학교 김경천 교수 연구실에서 직접 개발한 프, PIV-ACE

로그램을 사용하여 과정을 거쳐 순간속도장 및interrogation, Validation, ensemble

평균속도장을 추출(Fig. 2.24 (a)).

얻어진 평균속도장을 적절히 겹쳐 전체 반응챔버에 대한 평균속도장 추출- (Fig 2.24

(b)).

전산해석을 통해 얻은 평균속도장과 측정을 통해 얻어진 평균속도장이 유사함- -PIVμ

을 확인(Fig. 2.25).

로 제작된 마이크로 채널 및 반응챔버와 금박막이 도포된 와 접합하여 새로- PDMS Glass

운 진단 칩 제작SPR (Fig. 2.26).

기존 진단 칩 내부의 유동장(a) SPR 구역에서의 속도(b) A-A'기존의 진단 칩에 대한 전산해석Fig. 2.21 SPR

새롭게 설계 된 진단 칩 내부 유동장(1) SPR 구역에서의 속도(2) a,b새롭게 설계 된 진단 칩에 대한 전산해석Fig. 2.22 SPR

미세가공을 통해 제작된 채널 몰드Fig. 2.23 SPR

(a) - PIV measurement of SPR channelμ (b) Combination of whole 6 sector기법을 이용한 반응챔버 내부 유동 가시화Fig. 2.24 -PIVμ

(a) Velocity field by - PIV measurementμ (b) Velocity field by CFD analysis기법을 이용한 반응챔버 내부 유동 가시화Fig. 2.25 -PIVμ

채널과 금박막이 도포된 를 접합하여 제작한 진단 칩Fig. 2.26 PDMS Glass SPR

금 나노 입자를 이용한 진단 칩 설계•

나노 단위의 금 입자는 육안으로 확인할 수 있는 정도의 붉은 빛을 발하며 이를 이- ,

용하여 항원항체 반응 여부를 확인 하고자 함.

금 나노입자가 결합된 항원을 반응챔버에 고정된 항체와 반응시켜 반응챔버의 색변- ,

화로 항원항체 반응여부를 검출.

가지 다른 항체를 각각 검출할 수 있도록 하나의 진단 칩에 세 개의 반응챔버를 설- 3

계하였으며 전산해석을 통하여 내부 유동이 균일한지 검토하였음, (Fig. 2.27).

를 이용하여 설계된 칩을 제작하기 위한 몰드를 미세가공을 통해 제작- PDMS (Fig.

2.28).

제작된 몰드와 를 이용하여 결핵 진단용 진단 칩 제작- PDMS .

사각형태의 진단 칩 설계(1) 구형형태의 진단 칩 설계(2)금 나노입자를 이용한 진단 칩에 대한 전산해석Fig. 2.27

금 나노입자 진단 칩 체널 몰드(a) 로 제작된 금 나노진단 칩(b) PDMS미세가공과 로 제작된 금 나노입자 진단 칩Fig. 2.28 PDMS

전기화학적 방법을 이용한 고감도 진단시스템 개발□

변화에 민감한 폴리머와 반응을 이용한 전기화학적 변화 측정pH Urea-Urease•

의 반응 결과물로- Urea-Urease NH3가 생성되는데, NH3는 대표적인 염기성 물질로서 반

응 후 시액의 가 상승함pH .

사의 폴리머는 생물학적으로 안전하고 변화에 민감하며 항체를 고정- EUDRAGIT S100 , pH

할 수 있어 의공학 연구에 많이 사용되고 있음.

본 연구에서는 반응과 폴리머의 항체고정 기능 및 민감도를 이- Urea-Urease S100 pH

용하여 항원항체 반응여부를 검출하고자 함.

항원항체 반응이 일어났을 경우 반응의 결과물로 생성된- Urea-Urease NH3로 인해 pH

가 상승하고 이상에서 붕괴되는 폴리머의 특성으로 인해 반응이 일어나, pH 7.5 S100

가 상승하면 폴리머가 붕괴되고 시액과 전극사이의 이온 투과량이 증가 함 이로pH , .

인해 임피던스가 감소하는 결과를 얻을 수 있음(Fig 2.29).

에 나와 있는 전극의 부분에 를 도포하- Fig. 2.30 Interdigitated comb S100 polymer

고 그 위에 특이항체를 고정함 가 된 항체를 항원에 접, . Urease conjugated second

합시킨 후 폴리머에 접합된 특이항체와 반응시키면 측정 준비가 완료 됨, S100 .

측정 준비 된 전극을 가 들어있는 시액에 담구고 임피던스 측정 장비를 이용하- Urea ,

여 임피던스의 변화를 측정함.

폴리머의 변화에 따른 민감도를 확인하는 기초실험 수행 실험결- S100 pH (Fig.2.31).

과 위로 올라갈수록 임피던스가 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있음pH 7.5 .

하지만 폴리머 코팅조건 수립 폴리머 위 항체고정 공정 수립 등 각 단계별 실- S100 ,

험 조건을 정량화하는데 시간이 많이 소요됨.

현재 항원 항체 농도 변화에 따른 임피던스 출력 신호의 변화를 확인하고 있으며- , ,

향후 지속적인 연구가 필요할 것으로 보임.

전극 폴리머를 이용한 항원항체 반응 진단 개념도Fig. 2.29 Interdigitated , S100

전극 설계도면(a) Interdigitated 실제 제작된 전극(b) Interdigitated전극 설계 및 제작Fig. 2.30 Interdigiated

-20000 0 20000 40000 60000 80000 100000120000140000160000180000

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

Nyquist pH 5.1

pH 6.0

pH 6.5

pH 7.0

pH 7.25

pH 7.5

pH 8.0

pH 8.5

pH 9.0

Z im

Z re

0 50000 100000 150000

0

-20000

-40000

-60000

-80000

-100000

-120000

Bode plot pH 5.1

pH 6.0

pH 6.5

pH 7.0

pH 7.25

pH 7.5

pH 8.0

pH 8.5

pH 9.0

Imp

eda

nce

Frequency Hz

(a) Nyquist plot (b) Bode plot변화에 따른 폴리머 임피던스 측정Fig. 2.31 pH S100

결핵 진단용 스트립 테스트 칩 개발 및 제작3-5 (Strip)

결핵 항원과의 반응을 위한 진단용 테스트 칩 내부 스트립 설계□

은 결핵 진단용 테스트 칩의 스트립 내부 구성을 나타낸다Fig. 2.32 .•

나이트로셀룰로즈 멤브레인의 좌우에는 검출에 이용될 검체의 흡수 및 이동을 위해 흡수•

패드와 싱크패드를 부착하였으며 흡수패드에 유입된 검체는 나이트로셀룰로즈 멤브레인,

뒤에 부착된 싱크패드의 흡수력에 의해 싱크패드 방향으로 흐르게 된다 나이트로셀룰로즈.

멤브레인에는 검출하고자 하는 특이항원에 대한 항체를 미리 고정해 두고 검체의 이송을,

확인하기 위해 대조선 도 함께 배치하였다 제작한 진단용 스트립의 나이트(Control line) .

로셀룰로즈 멤브레인의 검사선 영역에는 개발된 특이항체를 코팅하였고 대조선 부분에는,

를 코팅하였다Anti-IgG (Fig. 2.33).

결핵 진단용 스트립 테스트 칩 외부 케이스 설계 및 제작□

결핵 항원 검출을 위한 내부 스트립을 보호하기 위한 외부 케이스를 설계 제작하였다, .•

전산설계프로그램을 사용하여 외부케이스를 설계하여 도면을 제작하였으며 기(Fig. 2.34),

계 미세가공 방법 중 하나인 선반과 밀링 공정으로 부산대학교 경량부품가공센터에 의NC NC

뢰하여 금형을 제작하고 플라스틱 사출방식으로 외부 케이스를 제작하였다, (Fig. 2.35).

결핵 진단용 스트립 테스트 칩의 진단 원리 및 순서□

흡수패드 외부 케이스의 검체 유입구 에 진단을 위한 검체 를 유입하면 싱크패드에( ) (50 )• ㎕

의해 특이항체가 코팅되어있는 나이트로셀룰로즈 멤브레인 방향으로 검체가 흐르게 되고,

검체 내 존재하는 특이항원은 항체와 반응하게 된다 반응이 일어난 스트립의 흡수패드에.

시약 을 유입하여 나이트로셀룰로즈 멤브레인을 새척해 준 후 다시 우레NaCl/EDTA (50 ) ,㎕

아제 가 접합된 항체 를 흘려준다 스트립의 흡수패드에 시약(Urease) (50 ) . NaCl/EDTA (50㎕

을 다시 한 번 유입하여 나이트로셀룰로즈 멤브레인을 새척해 준 후 요소 가 들) , (Urea)㎕

어있는 페놀레드 지시약 을 흡수패드를 통해 유입시킨다 유입된(Phenol Red, PR) (100 ) .㎕

지시약에 포함되어 있는 요소 와 검사선에 고정된 항체 항원 항체에 접합되어 있는(Urea) - -

우레아제 가 반응하면(Urease) NH3가 생성되어 변화가 일어나며 이러한 변화는 지pH , pH PR

시약에 의해 붉은 색으로 발색되게 된다 검사선과 대조선 모두 붉은 빛이 발색되면 결핵.

항원이 검출된 것이며 대조선만 발색되었을 경우에는 결핵항원이 존재하지 않음을 의미한,

다 만약 두 선 모두 발색이 되지 않거나 발색되는 위치가 모호할 경우 재검사가 필요하. ,

다.

결핵 진단용 칩 내부 스트립 구성Fig. 2.32

결핵항원 진단 칩의 내부 스트립 제작 방법Fig. 2.33

결핵 진단용 칩 외부 케이스 전산설계도면Fig. 2.34

최종 제작된 결핵 진단용 테스트 칩Fig. 2.35

진단용 단백질 칩의 임상적 유용성 평가3-6

임상 검체 확보□

다양한 병기의 검체를 이용하여 조기 진단에 최적인 항원 항체 발굴-•

임상적으로 결핵으로 확정되기 전의 호흡기 환자로부터 활동성 폐결핵 환자에 이르기-

까지 다양한 임상병기의 환자를 총 례 확보함200

제 세부 과제에서 도출된 항원 항체를 실제 임상 병기 환자를 대상으로 하여 환자 샘- 2

플로 실험.

우선 기존 진단 결과가 알려진 활동성 결핵 환자 또는 정상인을 대상으로 시제품 수-

준의 단백질 칩을 평가하여 실험적 개선에 정보제공.

시제품 및 최종 제품에 대해서는 로 검사를 실시하여 임상적 유용성 평가- blind-test

음성대조군 결핵의심군 치료전 환자군 치료중 혹은 치료종결 환자군 등 각 군별로( , , ,

최소 명 이상의 환자 유래 검체 이용100 )

식약청 승인 획득 목적의 임상 시험 기준 확립-

을 이용한 평가spiked urine□

정상인의 소변에 발굴한 항원 과 를 첨가한 이용하여 검사 시행CFP-10 Ag85 spiked urine•

발굴된 항원의 반응성 확인•

Specimen no. Antigen Reaction1 CFP-10 Positive2 CFP-10 Positive3 CFP-10 Positive4 CFP-10 Positive5 CFP-10 Positive6 Ag85 Positive7 Ag85 Positive8 Ag85 Positive9 Ag85 Positive10 Ag85 Positive

다음 단계로 항원의 농도에 따른 검출 한계 즉 반응의 민감도 시험중, .•

기존의 진단법과 비교 연구를 통한 임상적 유용성 및 적응 대상 환자 군 파악•

부산경남 지역의 개 대학병원에서 독립적으로 기존의 검사 방법 도말염색 배양- 6 ( , ,

과 병행하여 호흡기 검체 및 소변을 이용한 비교 평가PCR)

임상적 유용성을 기반으로 한 최종 상용화 모델 제시□

표준 균주 배양 검체 배양액 로 정량 정성 시험 시행( )•

개발된 항원 항체를 전부 탑재한 단백질 칩에 대한 임상적 평가를 근거로 진단적 활용-•

가치가 최고로 판단되는 항원 항체 도출-

상기 을 이용한 민감도의 측정과 함께 임상 검체를 이용한 평가를 진행하고spiked urine•

있으며 시제품 공급 에 따라 실험을 계속 진행중, .

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IV.제 세부 연구과제 연구결과2

제 세부 연구과제 연구결과2

세부연구과제명 결핵의 조기진단을 위한 항원특이 항체개발:

세부연구책임자 김화중 충남대학교 의과대학 미생물학: / /

연구개발과제의 목표1.

진단적인 목적에 가장 적합한 목표항원 발굴-

결핵환자 조직액에 존재하는 결핵항원 발굴-

인간항체 파지 라이브러리를 이용한 항원 특이 항체 개발과 생산-

연구배경 및 필요성1.1

결핵관리를 위한 조기 진단의 중요성□

전 인구의 약 이상이 결핵에 잠복감염 되어 있고 평생 동안 이들1/3 (latent infection) ,•

감염자의 는 활동성 결핵으로 재활성화 됨 또한 이들 감염자가 에 감염되는 경5-10% . HIV

우 매년 에서 활동성 결핵환자가 됨 활동성 결핵의 발병 시 많은 경우 증상이 뚜렷10% .

하지 않기 때문에 주위 사람에게 균을 계속 퍼뜨리게 됨.

년도를 기준으로 우리나라 선상 활동성 결핵환자는 약 천명 도말양성 환자는2006 X 155 ,•

약 만 명으로 예상되며 이는 최근 년간 큰 변화가 없었음 따라서2 5 . 유병률을 현격하게

감소시키기 위해서는 새로운 조기진단법 개발이 필요하고 또한 이 방법은 다수를 대상으

로 하는 건강검진에도 적용할 수 있어야 함.

결핵성수막염은 중증의 질환으로 빠른 화학요법이 예후와 직결되어 있음 그러나 뇌척수.•

액에서 결핵균을 발견할 확률이 매우 낮고 대부분 임상적으로 진단하고 치료를 시작하기

때문에 조기진단법 개발이 반드시 필요한 실정임.

노인인구의 급격한 증가와 외국인 노동자의 증가 및 증가 가능성은 결핵이 더욱 심AIDS•

각해질 수 있는 요인임. 따라서 형간염 진단처럼 결핵을 건강검진을 통해 쉽게 스크리B

닝 할 수 있는 면역학적 진단법 개발이 필요함.

• 결론적으로 감염성이 있는 환자를 조기에 색출하여 치료함으로써 결핵의 전파를 차단하

는 방법이 결핵관리의 가장 효과적인 방법임.

적합한 조기 진단법 개발 전략□

Fig. 3.1 Early diagnistic methods for TB

결핵의 확진방법인 세균학적 방법인 도말검사는 민감도가 너무 낮고 배양검사는 조기진•

단에 적합하지 않기 때문에 이를 대체할 수 있는 방법 개발은 연구자의 중요 관심사항

임.

• 분자생물학적 방법:

신속하게 결과를 알 수 있고 항산균 종을 구별할 수 있고 항결핵제 내성과 관련 있- , ,

는 유전자 돌연변이도 확인할 수 있다는 장점 때문에 많은 종류의 진단 키트가 개발

되어 있음.

그러나 가격이 비싸기 다수를 대상으로 하는 건강검진에 적용할 수 없고 또한 필드에-

사용할 수 없음.

• 를 측정하는 방법IFN-γ 은 결핵이 매우 드문 나라에서 잠복결핵 진단에 적용하고 있으나

국내에서는 유용성이 명확히 입증되지 않았음.

• 항체나 항원을 측정하는 면역학적 방법은 쉽고 간편하고 필드에서 누구나 쉽게 적용할, ,

수 있는 장점이 있음 그러나 현재까지 임상에서 받아들여질 만큼 충분한 특이도와 민감.

도를 높이지 못하고 있음.

• 항체를 측정하는 몇 종의 혈청학적 진단 키트가 개발되었지만 민감도면에서 서로 편차가

많고 결정적으로는 현증감염과 과거감염의 간접적인 증거일 뿐인 경우가 많음 즉 비활.

동성결핵과 활동성결핵을 쉽게 구분할 수 없음.

따라서• 결핵항원을 직접 검출하여 진단하는 방법이 현증결핵을 진단하는데 보다 적합한

방법임 문제는 항원을 검출하기위해서는 적합한 특이항체 개발이 선결과제임. .

결핵항원 측정방법과 항체개발 연구 동향 및 기존 연구의 제한점□

환자 조직액에서 결핵특이 항원의 측정은 현증감염의 직접적인 증거가 될 수 있지만 민•

감도가 낮고 비특이적으로 위양성이 나올 수 있음.

항체를 측정하는 몇 종의 혈청학적 결핵 진단키트가 개발되어 상용화되었지만• 항원을 검

출하는 진단키트는 개발되어 있지 않음.

현재까지 결핵항원 측정과 관련된 주요 연구보고를 정리하면 아래 표와 같다.•

Table. 3.1 Detetction of M. tuberculosis antigen in clinical samples for TB diagnosis

상기 논문과 같이 현재까지 몇 종의 항원에 대해서만 연구되었음 뇌척수액에서 민감도.•

는 특이도는 수준 이였으며 객담에서는 민감도가 특이도가50-90%, 80-100% , 71-91%,

수준 이였음91-100% .

특히 흥미로운 점은 결핵균 세포벽에 존재하는 이 환자 소변에lipoarabinomannan (LAM)•

서 검출된다는 사실임 소변은 검체 체취가 쉽고 다루기가 편리한 여러 장점을 갖고 있.

음 따라서. 소변에서 결핵항원을 검출하여 진단할 수 있다면 혁신적인 연구개발이 될 것

임 결핵환자의 소변에서 의 검출은 민감도가 였으며 건강인에서도 가 검. LAM 74-93% 4-13%

출되었음.

항체는 생물학적 시스템에서 지금까지 알려진 어떠한 물질보다도 특이성 및 결합성이 우•

수하여 치료제 및 진단제로서의 뛰어난 잠재성을 가지고 있음. 기존의 진단 시스템에서

항체는 이미 널리 사용되고 있는데 이 항체들은 대부분 동물의 면역화를 통하여 얻어진,

것임 동물의 면역화를 통하여 단클론 항체를 얻는 기술은 특이항체를 얻기까지 시간이.

많이 걸리며 많은 양의 항원을 필요로 함 또한 노동력 집약적인 과정이란 단점과 동물.

을 사육관리 하는 등의 비용 윤리적 문제점을 가짐, .

항원검출 방법과 항체개발 관련 기존 연구의 제한점•

조직액에서 단지 몇 종의 항원에 대한 검출만이 시도된- 근본적인 이유는 항원검출용

항체 개발이 쉽지 않기 때문임. 우선 항원을 동물에 면역하여 항체를 얻고 다시 항

원에 특이적인 항체만을 분리 정제해야 됨. 따라서 일정한 특이도와 결합력을 갖는

항체를 대량 생산하는데 한계가 있었기 때문임.

따라서- 만약 특정항원에 대한 항체개발을 쉽게 할 수 있다면 여러 항원을 동시에 검

출하는 단백질 칩 개념의 진단키드가 개발될 수 있음.

민감도를 높이기 위해서는 검출방법에 대한 새로운 접근 방법이 필요함 검체의 물리- .

화학적 특성과 검체 자체에 존재하는 비특이적 인자 때문에 항원이 존재하더라도 검

출되지 않는 경우가 있을 수 있음 이러한 비특이적 간섭요인을 제거하기위해서 검.

체를 복잡하게 처리하는 과정을 거치게 되는데 이러한 경우 개발되더라도 필드에서

사용하는데 제약요인이 될 수 있음.

과 같은 항원은 결핵균 뿐만 아니라 다양한 항산균에도 존재하기 때문에 특이도가- LAM

낮을 수 있음 따라서 특이도를 높이기 위해서는 결핵균에 존재하는 특이 항원을 검.

출해야 됨.

신개념의 진단용 파지 항체개발(phage)□

년대와 년대 재조합을 위시한 분자생물학의 눈부신 발전과 이를 토대로 한 바이80 90 DNA•

오텍 기술 인간 게놈 프로젝트의 등의 연구로 인간 유전체의 전모가 밝혀지게 되었으며,

이들 기술이 항체분야에 접목되어 인간항체 자체를 제조할 수 있는 기술들이 개발됨.

인간항체 제조기술은 두 가지로 대별할 수 있는데 인간항체 유전자 집단 전체를 갖(1)•

고 있는 마우스의 개발로써 마우스 자체 항체유전자 집단 전체를 제거한 후 대신 인간

항체 유전자 집단을 치환시킨 마우스의 제조 기술이고 항체의 유전자를transgenic , (2)

파지의 표면에 발현시킬 수 있는 항체 파지 표면발현 기술 (phage antibody display)임.

후자의 기술이 라이브러리 제조 기술과 접목되어 거대한 항체 라이브러리 제조가cDNA ,

가능하게 되었음. 현재 기술로 억 종류이상의 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러1,000

리의 제조가 가능하며 이렇게 제조된 라이브러리를 이용하여 비교적 간단하게 실험실에

서 항원 특이적 인간항체를 검색해 내는 것도 가능하게 되었음.

최근 의 성과로 질병과 관련된 유전자 및 단백질 발현 정보가 제공Human Genome Project•

되면서 신약개발은 물론 조기진단과 같은 영역은 매우 중요하며, 소량의 단백질도 검출

해 낼 수 있는 고 친화력 및 고 민감도의 진단방법이 필요함 이러한 목적을 달성하기위.

해서는 진단에 사용하고 있는 항체의 성능의 개선이 필수적임 현재의 사용되는 항체의.

한계를 뛰어넘기 위해서는 신개념의 항체의 개발이 필요하며 성공 시에는 현재의 진단,

분야의 한계를 뛰어넘어 도약할 수 있는 계기가 됨.

를 이용한 인간항체 개발은 기존의 하이브리도마 방법을 이용하는 동물항phage display•

체에 비하여 많은 장점을 갖는데 항원이 생체 내에서 한 경우 항원의, toxic , epitope

이 너무 작거나 면역성이 낮은 경우 방법은 유일한 해결방법이 됨phage .

를 이용하여 검색된 항체는 완전인간항체 로 진단phage display (fully-human antibody)•

용 항체 치료용 항체 등 다용도로 적용이 가능함 특히 치료용 항체를 목적으로 할 경, .

우 동물 항체의 경우 인간화 과정을 필요로 하며 항원결합성 및 특이성이 높은 항체를,

얻기 위하여 추가적인 과정이 필요함 방법을 이용할 시 인affinity maturation . phage

간화 과정이 필요하지 않으며 일반적으로 매우 높은 결합성을 갖는 항체 를, (Kd ~1 nM)

얻을 수 있음.

인간항체 라이브러리를 이용한 신개념 진단용 항체개발은 기존의 항체기술의 단점을 상•

당부분 보완하여 신속하고 경제적인 항체 확보를 가능하게 함. 본 연구에서는 항원인식

및 검출을 파지 항체를 직접 이용함으로써 진단용 항체를 얻기까지의 시간을 단축하고

강한 시그널을 얻을 수 있는 기술 개발을 목적으로 하였으며 파지 항체를 단백질 검출,

에 직접 사용한 예 및 선행특허는 없음.

- 기존의 방법EIA 에서 사용되는 항원 특이적 차 항체는 차 항체가 결합하는 에(Ag) 1 2

피톱이 보통 개 존재하며 그 결과 신호를 만드는 차 항체 개가 결합하고 차 항1 , 2 1 2

체에 융합된 에 의해서 신호가 발생됨HRP .

Ag

Conventional EIA

Ag

1차 항체

2차

항체

-HR

P2

차항

체-H

RP

Ag

Ag

1차 항체

2차

항체

-HR

P2

차항

체-H

RP

Signal detection

에피톱

Fig. 3.2 항원 특이적 항체의 신호발생 기전(Ag)

신규 바이오 나노입자 파지항체- : 신규 바이오 나노입자 파지항체 는 가지 면에서 기( ) 2

존의 항체보다 혁신적인 장점을 갖고 있는데 첫째는 항원에 대한 결합부위가 기존

항체 개보다 많은 개를 갖고 있음 이는 결합부위의 친화력이 획기적2 5-6 (Fig. 3.3).

으로 증가될 수 있음을 의미함 둘째는 기존의 항체의 경우 차 항체에 대한 에피톱. 2

아래그림의 녹색부위 이 개에 인대 비해 바이오 나노입자 파지항체 는 수천 개가( ) 1 ( )

될 수 있으며 이러한 특징은 신호증폭의 획기적인 개선을 의미함, . 종합적으로 바이

오 나노입자 파지항체 는 적은수의 항원에 대해서도 감지가 가능한 고 효율의 진단( )

용 항체가 될 수 있음.

파아지항원결합

부위

AgAgAgAgAg

Ag

Ag

1차 항체

에피톱

에피톱A) B)

Fig. 기존 바이오 나노입자 파지항체3.3 (A),

신규 바이오 나노입자 파지항체(B)

결핵항원 검출과 관련된 타 연구와의 차별성□

• 항원검출을 통한 진단법 개발에 핵심연구는 다양한 결핵항원 확보와 각각에 해당되는 항

원특이 항체 개발임.

• 목표항원의 우선순위는 기존에 알려진 결핵항원 중 항원성이 높은 항원과native BCG①

에는 존재하지 않는 항원 결핵균 배양액 중에 초기에 분비되며 양적으로 풍부한 항, ②

원 에는 존재하지 않고 결핵균에만 존재하는 항원임 가능한 많은 후보항원을 선, BCG .③

택하여 본 연구의 최종목표인 단백질 칩 개념의 진단법개발을 위한 기반연구를 수행하고

자함.

Fig. 목표항원 선택 기준3.4

기존연구에서 수행하지 않았던 목표항원 탐색방법으로 결핵성수막염환자의 뇌척수액과•

결핵환자의 소변의 항원을 로 분석하고 항결핵균 항체로 분석함으로써 환자의 조직2-DE

액에 존재하는 항원을 동정하여 목표항원으로 설정함.

항체개발은 기존에 동물에 면역하여 얻는 대신에 신개념의 에 의해 다양한phage display•

특이 항체를 개발하고자 함.

연구목표1.2

최종목표1.2.1

환자 조직내에서 결핵항원을 검출하기위한 조기 진단법을 개발하기 위해서 다수의 목표항원

을 발굴하고 각 항원에 대한 항원 특이 항체를 개발하여 고감도 진단시스템 개발에 제공하고

자 함.

진단적인 목적에 가장 적합한 목표 항원 발굴•

결핵환자 조직액에 존재하는 결핵항원 발굴•

인간항체 라이브러리를 이용한 항원특이 항체개발•

개발된 항체의 특이성 검증 및 생산•

연차별 목표1.2.2

구분 목표 주요 연구개발 내용

년차1년(’08 )

• 진단적인 목적에 가장 적

합한 목표 항원 발굴

기존의 항원 중에서 목표항원 선별•

배양액내로 초기에 분비되는 주요 결핵항•

원 동정

결핵균 특이항원 동정•

선별된 항원의 제조와 특성규명•

항원특이 항체개발•

파지 항체 라이브러리를 이용한 항원 특이•

적 항체 검색 항원당 최소 종( 3 )항체의 서열 및 특성 분석•

항체 최적화 필요시( )•

년차2년(’09 )

결핵환자 조직액에 존재•

하는 결핵항원 발굴

결핵환자 조직액의 분석과 결핵항원 동정•

조직액내에서 동정된 항원의 특성 규명•

항체의 특이성 검증 및•

생산

파지 항체의 전환 또는(scFv whole IgG)•

및 항체 제조 정제,최종 항체의 결합력 분석•

임상검체를 이용한 검출능력 확인•

연구개발과제의 추진체계2.

전체적인 연구추진 체계□

추진일정□

구분

총 연구기간 년 년(’08 ’09 )～

년차1 년차21/4 2/4 3/4 4/4 1/4 2/4 3/4 4/4

제

2

세

부

기존의 항원 중에서 목표항원 선별

초기에 분비되는 주요 결핵항원 동정

결핵균 특이항원 동정

선별된 항원의 제조와 특성규명

결핵환자 조직액의 분석과 결핵항원 동

정과 특성규명

항원특이 항체개발

개발된 항체의 특이성 검증 및 생산

연구개발수행 내용 및 결과3.

기존의 항원 중에서 목표 항원 선별3.1

기존 항원 또는 결핵균 배양액내 다량 존재하는 목표항원 준비□

결핵항원 분석과 정제를 위한 결핵균 배양액과 균체 준비 결핵균: (• M. tuberculosis

과H37Rv) M. bovis 을 배지에 주간 표면 배양하여 배양액과 균BCG Tokyo strain Sauton 6

체를 수집함 배양액은 와 로 균체를 제고한 후 배 농축하. 1.2 0.2 membrane filter 10㎛ ㎛

여 사용하였음.

항원정제 본 교실에서 기 확립된 방법에 따라 결핵균배양액Native antigen 85 complex :•

로부터(CF) anion-exchange chromatography, ammonium sulfate precipitation,

를 적용하여 결핵균 배양액내 가장 풍부한 항원hydrophobic interaction chromatography

인 를 정제함 아래 그림의Ag85 complex ( Ag85 complex).

에는 존재하지 않고 결핵균에만 존재하는 단백인 와 단백은 잠복결핵진BCG CFP-10 ESAT-6•

단을 위한 에 사용되는 항원임 본 연구에서도 이들 두 항원은IFN- release assay . BCGγ

에 존재하지 않는 항원으로 목표항원으로 적합하기 때문에 해당 유전자가 삽입된 pET28a

발현벡터를 이용하여 대장균에서 유전자재조합단백질을 제조하였음 그림 의( 3.5

과recombinant CFP-10 recombinant ESAT-6).

본 연구실에서 정제법을 확립한 항원을 결핵균 배양액에서 정제함 항원은MTB12 . MTB12•

항원과 함께 결핵균배양액내로 조기에 분비되는 항원임 그림 의Ag85 complex ( 3.5 native

MTB12).

결핵항원 검출에 많이 사용된 목표항원인 은 사LAM (lipoarabinomannan) Nacalai Tesque•

로부터 구입하였음.

Fig. 3.5 Preparation of MTB antigens

초기에 분비되는 주요 결핵항원 동정3.2

잠복결핵 진단을 위한 목표항원 검색과 항원제조□

전 세계 인구의 이 잠복결핵에 감염자임 현재 잠복결핵진단은 를 이용한1/3 . PPD•

와 를 이용한 세포매개검사를 이용하고 있음 잠복결핵감tuberculin test IFN- release .γ

염과 유사한 in vitro조건은 낮은 산소분압 또는 조건 등과 같은 여러 조건이 적용acid

되고 있지만 본 연구자는 잠복결핵상태가 상태로 배양하는 것과 유사하다는, standing

연구보고를 바탕으로 단순히 과 상태로 배양하여 균을 초음파로 파쇄하shaking standing

여 얻은 균체항원을 전기영동으로 분석하였음 아래그림 흥{ CB(Coomassie blue) stain}.

미롭게도 조건에서 배양된 결핵균에서 항원이 유의하게 증가되었음을 확standing 16-kDa

인하였고 이들 항원 분획을 로 분리하고 로 으, 2-DE anti-16 kDa antibody immunoblotting

로 확인한 결과 단백임을 확인하였음 는HspX (Rv2031c) . HspX in vitro 잠복결핵결핵 조

건인 저산소분압 상태 또는 에서 증가하는 단백으로 보고된바 있음stationary phase

등 항체개발을 위해서 에 대한 유전자 재조합단백질을 대장균에서(Yuan . 1998). 16-kDa

생산하여 정제하였음.

Fig. 3.6 CB(Coomassie blue) stain

결핵균 특이 항원 동정3.3

배양액내 분비항원 및 결핵 특이항원 동정□

항원검출을 통한 진단용 항원으로 적합한 항원은 분비항원이면서 에는 존재하지 않는BCG•

결핵균 특이 항원이 이상적임 현재 에는 없고 결핵균에만 존재하는 항원으로 가장. BCG

대표적인 항원은 과 항원임 두 개의 항원은 본 연구에서 재조합단백을 정CFP-10 ESAT-6 .

제하여 준비하였음 다양한 항원의 확보가 중요하기 때문에 에 비해 결핵균 배양액내. BCG

에서 유의하게 발현이 증가된 단백을 동정하고자 하였음.

아래 그림은 결핵균과 를 주 와 주 간 배양하여 로 비교한 결BCG 6 (LT-CF) 2 (ST-CF) SDS-PAGE•

과임 흥미로운 은 연세대학교 프로테움 연구센터에 의뢰하여 로 동정하였. spot LC-MS/MS

음 항원은 종류의 항원으로 구성되어 있는데. Ag85 complex Ag85A, Ag85B, Ag85C 3 Ag85B

가 결핵균 배양액내에서 유의하게 증가되어 있었음 또한 은 결핵균 배양액에만. CFP-10

존재함을 확인함 배양액에만 존재하는 항원으로는 으로 배양액내 가장. BCG MPB70 BCG

한 항원임 단백은 또한 에서dominant . ppiA(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A) BCG

만 발현함을 알 수 있었음.

Fig. 3.7 결핵균과 배양액 항원 비교BCG

와 결핵균 배양액을 단순히 로 비교분석한 결과 동정할 수 있는 항원의 수가 한BCG 2-DE•

계가 있었음 따라서 배양액을 에 가한 후 통과분. hydroxylapatite (HAT) chromatography

획 와 로 용출한 분획으로 나누어 비교분석(pass), 5 mM PB(phosphate buffer) 500 mM PB

을 실시함 아래 그림과 같이 각각 개의 분획으로 나누고 분석한 결과 유의항원. 3 2-DE ,

을 동정하기위해서는 분획화가 더 필요함을 확인하였음.

Fig. 분획 후 결핵균 배양액 과 배양액의 항원 비교3.8 HAT (Rv CFP) BCG

따라서 보다 세밀한 분획화를 위해서 아래 그림과 같이 결핵균 배양액 을(CFP) ammonium•

로 분획으로 나눈 후에 최종적으로 개의 분획으로 나누었음sulfate(AS) 0-50%, 50-80% 5 .

즉 분획50% AS 은 에 가하여hydrophobic interaction chromatography 1M ammonium

가 첨가된 의 통과 분획 와 의 용출분획으로 분획sulfate 50mM PB (pass), 50 mM PB 1mM PB

화를 실시함. 분획50-80% AS 은 에 흡착되지 않고hydroxylapatite (HAT) chromatography

통과되는 분획 과 로 용출된 분획으로 분획화를 실시하여 각각을 전기영동(pass) 0.5M PB

으로 획인 하였음 각 분획에 대하여 로 한. anti-mouse CFP-10 antibody immunoblotting

결과 은 결핵균배양액의 분획의 분획에 존재함을 확인 할 수 있었CFP-10 50% AS HIC pass

음 따라서 특정의 결핵단백질이 효과적으로 분획화 되었음을 확인함. .

Fig. 일차 분획 후 결핵균 배양액 과3.9 (Rv CFP) 배양액의 항원비교BCG

Fig. 결핵균 배양액에 존재하는 결핵 특이 항원 동정3.10

상기의 개의 분획을 결핵균과 배양액을 비교하면 결핵균에만 유의하게 다량 존재하6 BCG•

는 개 항원을 동정하여 아래 그림에 표기하였음 각 분획에서 항5 . Ag85 complex, 38kDa

원 항원을 로 표기하였음 배양액에 존재하는 과 항원을, MPB70 1,2,3,4 . BCG MPB70 Ag85

법을 추가하여 정제하였으며 결핵균 배양액내에서는ion-exchange chromatography , Ag85

항원과 항원도 정제하였음38-kDa .

상기 그림에서 단백을 동정하기 위해서 로 분리H1, K1, K2 ion-exchange chromatography•

하여 해당 단백이 존재하는 분획을 모아 로 분석하여 해당 을 로 동정2-DE spot LC-MS/MS

하였음.

Fig. 항원의 부분정제와 에 의한 항원 분리3.11 2-DE

상기과정을 통해 분획화된 각각의 분획을 로 분리하고 비교분석하여 결핵균2-DE (H37Rv)•

과 에 제한적으로 다량 존재하는 항원을 로 동정하였음BCG LC-MS/MS .

Fig. 3.12 H37Rv vs BCG 2-DE (pH4-7, 200ug protein, 15% gel)

Fig. 3.13 H37Rv vs BCG 2-DE (pH4-7, 200ug protein, 15% gel)

를 통해 동정된 단백을 정리하면 아래 표와 같음 개의 단백을 동정하였으며LC-MS/MS . 12•

는 항원으로 본 과제에서 단백을 정제한 항원임 모든 단백의 유전자는H5 38-kDa native .

발현백터에 클로닝하여 대장균에서 발현됨을 확인하였음 이중pET28a . H1, H4, H5, H6,

단백은 유전자재조합단백의 정제를 성공하였음H7 .

Table. 3.2 Identification of abundantly expressed proteins in MTB-CF

선별된 항원의 제조와 특성규명3.4

결핵균 세포막에 존재하는 단백동정과 특성분석□

결핵균 세포막에 존재하는 단백은 숙주면역계에 노출될 확률이 높을 뿐만아니라 혈액이•

나 조직액으로 유리될 가능성이 높기 때문에 배양액을 로 시간 원심분리한100,000 x g 4

후 침전물을 얻어 로 부유하였음 이를 로 분리하고 분석으로 혈청학PBS . 2-DE immunoblot

적인 반응성이 높은 항원을 선택하여 로 동정하였음LC-MS/MS .

Fig. 3.14 에 의한 결핵균 세포막에 존재하는 단백 분리2D

상기 종류의 동정된 단백 중에서 를 선택하여 유전자재조합단백질을 제3 CysA2(Rv0815c)•

조하였음 혈청학적 진단적인 유의성을 과 비교하여 평가하였. Ag85, CFP-10, HspX, PstS1

음 혈청 항체가는 로 측정하였음 상품화된 혈청학적 진단키트에 사용되고 있는. ELISA .

두 항원인 와 과도 동일한 민감도와 특이도를 나타내었음 특히 은 도HspX PstS1 . PstS1 AFB

말 음성환자에서 민감도가 낮은 문제가 있는데 는 이러한 단점을 보완할 수 있었, CysA2

음 종류의 항원인 를 조합하여 항체가를 측정하는 경우 의 보. 3 HspX, PstS1, CysA2 CysA2

완 효과가 가장 높았음 이러한 특성연구를 통해서 가 진단키트 개발에 사용될 수. CysA2

있는 새로운 후보항원임을 발견함.

Fig. 3.15 발현 양상CysA2(Rv0815c)

항원이 면역계에 노출된다는 사실은 조직이나 혈액에 유리될 가능성이 높기 때문에CysA2•

본 연구과제의 진단적인 목적에 적합한 목표항원이 될 수 있다고 생각됨.

Table. 3.3 Sensitivities and specifities of each of the five antigens and the antigen

mixtures using sera from 150 tuberculosis patients and 115 healthy control subjects

결핵환자 조직액의 분석과 결핵항원 동정과 특성 규명3.5

결핵환자 에 존재하는 결핵 항원동정urine□

소변으로부터 결핵항원을 검출하여 결핵을 진단할 수 있다면 획기적인 방법이 될 것임.•

본 연구는 항체개발을 위한 중요한 목표항원 중의 하나로 활동성 결핵환자 소변에 존재

하는 결핵항원을 설정하였음 건강인 소변과 활동성 결핵환자의 소변을 약 배 농축하고. 5

로 투석하여 로 분리함 탐색을 위한 일차항체는 결핵균배양액을 에 면PBS SDS-PAGE . mouse

역하여 얻은 항체를 이용하였음 흥미롭게도 결핵환자 소변에서만 반응하는 를 확인. band

하였음 총 개의 를 잘라 를 의뢰하였음. 4 band LC-MS/MS .

결핵환자 에 존재하는 결핵항원 동정Fig. 3.16 Urine

결핵환자 을 로 분리한 후에 항결핵균 항체로 을 실시하여 반응하는urine 2-DE immunoblot•

을 잘라서 분석을 통해 동정하였음spot LC-MS/MS .

Fig. 3.17 2-DE analysis of urine from tuberculosis patients

를 통해 결핵환자 내에 존재하는 개의 결핵단백을 동정하였고 이중LC-MS/MS urine 7 ,•

의 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 재조합단백질을 정제하였음Rv3280(AccD5) pET28a .

Fig. 3.18 Mtb proteins identified in urine and Purified rRv3280

항원특이 항체개발3.6

항원에 대한 파아지항체 검색Ag85 complex (p85)□

항원은 배양액내로 조기에 분비되는 항원이며 양적으로도 풍부하기 때문에Ag85(p85) ,•

일차적으로 이 항원에 대한 항체를 개발하기로 결정함 항원에 대한 파아지 항체는. Ag85

이전에 보고된 바가 없어 최초의 항체임. 인간항체 파아지 라이브러리- 를 이용하여 p85

항원에 대한 항체 제작 과정은 다음과 같이 진행함 에 항원을. Immunotube p85 10 g/mlμ

의 농도 을 코팅하였음 코팅된 항원 에 라이브러리를 반응시켜 초기 결합 파아, 2ml . p85

지를 선별하는 에서 투여된 라이브러리 내의 파아지의 총수는 약Biopanning 2X1013 가cfu

사용됨 비특이적 파아지의 세척과정 회 후 남아있는 파아지를 대장균주에. 10 XL-1blue

감염시켜 파아지를 증폭한 후 차 를 얻었음 라이브러리를 이용한 항원1 sub-library . sub-

파아지 반응 및 검색 과정을 번을 반복하며 매 회 를 준비하였고 이 라이- 4 sub-library ,

브러리 내의 파아지수를 분석하였음 회의 과정에서의 파아지수는 오른쪽의.1~4 panning

그림과 같이 얻어짐.

각 회의 에서 얻어진 라이브러리로부터 제작된 파아지들이 에 나타내는 결1~4 panning p85•

합력을 방법으로 분석함 에서 를 코팅하고 파아지를 가하였ELISA . sandwich ELISA p85 ,

음 결합된 파아지는 차항체 를 결합시킨후. 2 (anti-M13-HRP) OPD/H2O2 을 가한substrate

후 파장에서의 시그널을 분석하였음 이때 에 특이적으로 결합하는 파아지의490nm . p85

수와 전체 파아지의 수를 상대적으로 비교하기 위하여 모든 파아지가 발현하고 있는 재

조합 를 이용하여 의 분석 값과 비교하였음 결과에서 보여지 듯 매C-myc tag myc-ELISA . ,

시 얻어진 라이브러리로부터 얻어진 파아지의 수는 유사하게 나타났고 회색 막panning (

대 이중 에 특이적으로 결합성을 보이는 파아지는 사이클이 경과됨에 따라) p85 panning

증가됨을 알 수 있음 오랜지색 막대 이는 파아지 집단에서 에 결합을 할 수 있는( ). p85

파아지의 상대 비율이 매 사이클을 반복함에 따라 증가하고 있음을 보여줌panning .

파아지 라이브러리 분석Fig. 3.19

차 이후 파아지 집단의 에 대한 는 추가적으로 크게 증가하지 않았으므로4 p85 affinity•

우리는 차 에서 얻어진 파아지 집단을 이용하여 파아지 항체를 분4 panniing monoclonal

리하였음 의 분리는 파아지미드를 가지고 있는 차 파아지 라이브러리. monoclone 4 (XL1

로부터약 개의 를 취하고 개별적으로 파아지를 발현시켜 배양액에서 파아blue) 40 colony

지를 수확하였음 개별 생산된 파아지들에 대한 는 와 에 대하. monophage ELISA p85 c-myc

여 실시하였음 좌측은 에 대한 이고 우측은 동일한 들을. p85 monophage ELISA , monophage

에 대하여 분석된 사진임c-myc ELISA .

와 에 대한Fig. 3.20 p85 c-myc monophage ELISA

총 파아지 중 이상이 에 결합력을 보였음 에 대한 결합력의 비교는 에60% p85 . p85 ELISA•

서 나타난 값의 비교로 알 수 있음 얻어진 들이 의 어느 에 결OD . monophage p85 subunit

합하고 있는지를 알아보기 위하여 를 이루는 두 과 각각 결합시켜 본p85 subunit p32/p33

결과 에 선별적으로 결합하고 에는 결합하지 않고 있음을 보여줌p32 p33 subunit .

Fig. 3.21 를 통한 에 대한 결합력 비교ELISA p85

들의 특성을 분석하기 위하여 각 들의 를 추출하고Monophage monoclone phagemid BstI•

을 통하여 을 실시하였음 이것은 각 클론들의 서열이 제한digestion DNA fingerprinting .

효소 처리 시 보이는 절편들의 비교로 유사성을 비교하기 위하여 사용됨 각 의 정. scFv

확한 서열비교를 위하여 각 클론들의 서열분석을 실시함 아래 그림과 같이 클론들이 모.

두 동일한 종의 항체서열을 가지고 있음을 보여주어 결과적으로 종의 항체가 얻어졌음, 1

을 보여줌 본 과제에서 종의 항체를 이용하여 항원을 감지할 수 있으므로 목표는 달성. 1

하였음.

Fig. 3.22 DNA fingerprinting

Table. 3.4 Grouping of anti-p85 Mono Phage

현재 확보된 인간항체 의 서열은 다음과 같음 항체의 특성을 분석하기 위anti-p85 scFv .•

하여 를 희석하여 코팅한 조건에서 클론이 항원을 잘 결합하는지를 알아보았p85 p85-B1

음 상대적 비교를 하기 위하여 상용화된 항체와 비교하였을 때 항원을 약. anti-myc

배 희석시 약 까지 항원을 잘 결합하는 것을 보여주고 있음1/3125 ( 640pg/ml) p85 . scFv

항체는 항원인식부위를 하나 가지고 있으므로 항원인식부위가 개인 항체를2 whole IgG

제조할 경우 항원에 대한 결합력을 훨씬 향상시킬 수 있음p85 .

Fig. 3.23 Amino acid sequence of anti-p85

클론의 항원 결합력 비교Fig. 3.24 p85-B1

항체제작Anti-p85 whole IgG□

얻어진 항체의 서열을 이용하여 인간 및 발현벡터에scFv IgG Heavy chain Light chain•

삽입하기 위하여 각 가변영역을 특이적 를 사용하여 증Heavy chain/Light chain primer

폭함 이 실험에 사용된 의 서열과 증폭된 는 다음과 같음. primer insert .

가변영역의 증폭을 위한 의 서열과 증폭된Fig. 3.25 Heavy chain/Light chain primer insert

각 과 가변영역을 또는 를 이용하여 절단Heavy chain Light chain SfiI/NheI SfiI/BglII•

하고 동일한 제한효소를 이용하여 절단한 벡터 와 에 삽입함 제한효소로 절pIGHV pIGLV .

단한 벡터는 다음과 같음.

을 절한한 후 삽입Fig. 3.26 (A) SfiI/BglII p85LC ,

을 절한한 후 삽입(B) SfiI/NheI p85HC

준비된 와 를 한 후 에 형질도입한 후 얻어진 콜로니로insert vector Ligation XL-1 blue•

부터 가 에 잘 들어갔는지를 알아보기 위하여 을 수행하여 확인insert vector colony-PCR

함.

• 단클론 항체의 발현 및 정제anti-p85 및 발현벡터에 도입된: Heavy chain Light chain

항체서열을 확인 후 형 항체를 완성하기 위하여 각 발현 벡터를 세포에whole IgG HEK293

함 형질도입된 세포로부터 발현 분비된 항체를 얻기 위하여 세포co-transfection . HEK293 -

배양액을 매 일 마다 회수하고 약 를 배 농축한 후3 500ml 10 Protein-A bead (sepharose;

를 이용하여 항체를 정제함 된 항체 약 는Pharmacia) (Lane7, 8). Elution anti-p85 ( 10ml)

투석 후 에 보관하였음 얻어진 항체는 및 을 이용하여 확인-20C . SDS-PAGE silver stain

하였음 항체의 양은 방법을 이용하여 정량하였다 약 의 항체를 총. bradford . 1.4mg

의 배양액으로부터 확보하였음500ml .

단클론 항체의 발현 및 정제Fig. 3.27 Anti-p85

생산된 항체의 항원 결합성은 및 을 이용하여anti-p85 monoclonal ELISA Western blot•

검증함 결과에서 보듯이 항체는 에서 분리된 을 특이적으로 인식하. SDS-PAGE p30 subunit

였음 또한 방법으로는 항체를 약 배 배 희석할 시에도 을 나타. ELISA 3000 -15000 signal

냄.

항체의 항원 결합성 분석Fig. 3.28 anti-p85 monoclonal

항원에 대한 항체개발CFP-10□

은 결핵균에만 존재하는 항원이며 도한 배양액내 다량 존재하기 때문에 항체개발CFP-10•

을 위한 번째 목표항원으로 결정함 항체 개발의 과정과 유사한 과정을2 . p85 panning

항체 개발에서도 사용함 회의 과정 후 제조한 로부터 제CFP-10 . 1~3 panning sub-library

조한 파아지 항체 가 항원을 인식하는지 여부를 확인하기 위하여(polyclones) CFP-10

항원 또는 항체를 코팅한 에 제조된 파아지를 반응시키고CFP-10 anit-myc plate ELISA

분석을 실시함 가해진 파아지항체의 수를 나타내는 분석치는 유사하게 나타나고 있. myc

으며 이 파아지항체들이 에 대하여 보이는 결합력은 회 에서 급격히 증, CFP-10 4 panning

가함을 알 수 있음 차 에서 높은 결합력을 보이고 있어 차 은 진행하. 3 panning 4 panning

지 않음.

항원 또는 항체의 횟수에 따른 결합력 변화Fig. 3.29 CFP-10 anit-myc panning

차 후 얻어진 파아지의 에 포함된 개별 파아지들을 로 분3 panning sub-library monophage•

리한 후 각각의 의 에 대한 결합력을 측정함monophage CFP-10 .

<CFP-10 ELISA> <c-myc ELISA>

Fig. 3.30 항원에 대한 항체 개발CFP-10

개의 단클론을 선택하여 분석한 결과 높은 비율로 에 결합하는 항체들이 확인되96 CFP-10•

었음 이중 시그널이 강한 종의 서열을 분석하였음 각 의 항원인. monophage 65 . monophage

식부위의 서열을 분석한 결과 종의 항체가 확인이 되었음 각 들의 서열과 종6 . monophage

류는 다음의 도표와 같음 얻어진 항체들은 특이적 과 에서 유래. heavy chain light chain

한 것이 나타나고 있어 본 실험에는 다양한 항체가 확보되어 목표치보다 많은 항체 확보

에 성공하였음.

의 종류Table. 3.5 Monophage

Fig. 3.31 항체 서열분석Group 1

Fig. 3.32 항체 서열분석Group 2

Fig. 3.33 항체 서열분석Group 3

Fig.34 항체 서열분석Group 4

Fig.35 항체 서열분석Group 5

Fig. 3.36 항체 서열분석Group 6

항체의 결합력 분석 각 그룹의 단클론 항체들을 제조한 후 항원6 group monoclone :•

의 농도를 로부터 씩 희석하여 코팅한 후 항체로 검출을 하였음(CFP-10) 1 g/ml 1/5 .μ

법에 의한 항원 검출은 약 희석 항원 농도로는 까지 정량적 검ELISA 1/3125 ( 350pg/ml)

출이 되었으며 이 가장 뛰어난 결합력을 나타내었음, group3, group4, group6 .

항체의 결합력 분석Fig. 3.37 6 group monoclone

• 형 전환Anti-CFP10 whole IgG 얻어진 항체의 서열을 이용하여 인간: scFv IgG Heavy

및 발현벡터에 삽입하기 위하여 각 가변chain Light chain Heavy chain / Light chain

영역을 특이적 를 사용하여 증폭함 이 실험에 사용된 의 서열은 도표 내에primer . primer

표시되어 있음 해당 서열을 이용하여 증폭하여 를 준비함 각. primer insert . Heavy

과 가변영역을 또는 를 이용하여 절단하고 동일chain Light cahin SfiI/NheI SfiI/BglII

한 제한효소를 이용하여 절단한 벡터 와 에 삽입함 제한효소로 절단한 벡터pIGHV pIGLV .

는 다음과 같음 준비된 와 를 한 후 에 형질도입한 후. insert vector Ligation XL-1 blue

얻어진 콜로니로부터 가 에 잘 들어갔는지를 알아보기 위하여 을insert vector colony-PCR

수행하여 확인함 실험 결과 과 의 가변영역은 벡터들에 잘. Heavy chain Light chain IgG

삽입이 되었음을 확인할 수 있음.

을 절한한 후 삽입Fig. 3.38 SfiI/NheI CFP10HC ,

을 절한한 후 삽입Fig. 3.39 SfiI/BglII CFP10LC

• 단클론 항체의 발현 및 정제anti-CFP10 항체로부터의 항원 인식성 비교로 가장: phage

우수한 종의 항체 를 대상으로 단클론 항체 생산에 투입하였음2 group2, group3 . Heavy

및 발현벡터에 도입된 항체서열을 확인 후 형 항체를 완성chain Light chain whole IgG

하기 위하여 각 발현 벡터를 세포에 하였음 형질도입된HEK293 co-transfection . HEK293

세포로부터 발현 분비된 항체를 얻기 위하여 세포배양액을 매 일 마다 회수하여 얻은- 3

세포배양액 약 을 하여 약 로 농축한 후500ml Ultra-filtration (millipore) 50ml

를 이용하여 항체를 결합 후 을 이용한Protein-A bead (sepharose; Pharmacia) glycin

을 실시하였음 된 항체 약 는 투석 후elution (Lane7, 8). Elution anti-CFP10 ( 10ml) -20C

에 보관하였음 얻어진 항체는 및 을 이용하여 확인하였음 항체. SDS-PAGE silver stain .

의 양은 방법을 이용하여 정량하였다 약 의 항체를 총 의 배양액으로bradford . 3mg 500ml

부터 확보하였음.

단클론 항체의 발현 및 정제Fig. 3.40 Anti-CFP10

의 항원 인식성 검증 항원을 로 로 전anti-CFP10(group2) : CFP10 10-100ng/well SDS-PAGE•

기영동 한 후 를 이용하여 을 실anti-CFP10 monoclonal antibody (group2) western blot

시하였음 실험 결과 는 항원을. anti-CFP10 monoclonal antibody (group2) CFP10 25-100ng

구간에서 잘 검출하고 있음을 알 수 있음.

의 항원 인식성 검증Fig. 3.41 anti-CFP10(group2)

에 대한 특이 항체개발LAM□

항원에 대한 항체는 결합력이 강한 항체가 얻어지지 않아 실패하였음 일반적LAM phage .•

항원과 달리 은 당지질로 본 실험에서 사용한 등에 전혀 고정이 되지 않LAM Immunotube

는 이유로 항체가 얻어지지 않은 것으로 판단됨phage .

항원에 대한 항체를 대신하여 도 다른 항원인 에 대한 항체 개밯로 수정하여LAM 16-kDa•

진행함.

항원에 대한 특이 항체개발16-kDa□

에 항원을 의 농도로 총 를 코Immunotube 16-kDa 10 g/ml 2ml ( 20 g in Coating buffer)• μ μ

팅하였음 이들 에 라이브러리를 반응시켜 초기 결합 파아지를 선별하는. tube Biopanning

에서 투여된 라이브러리 내의 파아지의 총수는 약 1.5X1013 가 사용됨 비특이적 파아cfu .

지의 세척과정 회 후 남아있는 파아지를 대장균주에 감염시켜 파아지를 증폭10 XL-1blue

한 후 차 를 얻었음 라이브러리를 이용한 항원 파아지 반응 및 검색1 sub-library . sub- -

과정을 번을 반복하며 매 회 를 준비하였고 이 라이브러리 내의 파아지수4 sub-library ,

를 분석하였음.

회의 과정에서의 파아지 수는 다음과 같이 얻어짐1~3 panning .•

항원에 결합한 항체를 회수하여 를 에 대하여 실시하였16-kDa phage phage-ELISA 16-kDa•

음 항원과 항체를 농도를 코팅한 에 차 차. 16-kDa anti-myc 1 g/ml ELISA plate 1 ~3μ

에서 얻어진 항체를 원액 까지 희석하여 결합성을 확인함 특히 차panning phage- ~1/1000 . 1

으로부터 차 이 진행됨에 따라 에 결합하는 항체가 되는panning 3 panning 16-kDa enrich

것이 확인됨.

Fig. 3.42 항원에 대한 항체개발을 위한16-kDa ELISA

분리 차 에서 얻어진 파아지 집단의 항원에 대한anti-16kDa Monophage : 3 panning 16-kDa•

는 매우 높았으므로 차 에서 얻어진 파아지 집단을 이용하여affinity 4 panning

파아지 항체를 분리하였음 의 분리는 파아지미드를 가지고 있는monoclonal . Monoclone 3

차 파아지 라이브러리 로부터약 개의 를 취하고 개별적으로 파아지(XL1 blue) 100 colony

를 발현시켜 배양액에서 파아지를 수확하였음 개별 생산된 파아지들에 대한. monophage

는 와 에 대하여 실시하였음ELISA 16kDa c-myc .

의 에 대한 실험 결과 이들 들의 는 를 인식하는Monophage 16-kDa ELISA phage 88% 16-kDa•

항체를 표면에 가지고 있는 것을 확인할 수 있으며 그중 정도는 인식력이 매우 높, 50%

은 것으로 분석되었음 결과는 개의 개별 발현된 항체를 좌측 혹. 95 monophage 16-kDa ( )

은 항체 우측 을 코팅한 에 가하고 차 항체로는 단anti-myc ( ) ELISA plate 2 anti-M13-HRP

클론 항체를 사용하고 로 발색한 사진임, OPD .

의 와 항체에 대한 인식Fig. 3.43 Monophage 16-kDa anti-myc

항원을 강하게 인식하는 항체를 발현하는 클론 종을 선별하여 항체16-kDa monophage 50•

서열을 분석함 항체 서열결과 종의 상이한 항체들을 확보하였음 총 종의 항체서열. 10 . 10

중 가장 결합력이 높은 개의 항체를 선별하여 전환을 위한 을 실시하4 whole IgG cloning

였음 얻어진 항체가 포함하는 서열과 해당 서열의 및. Heavy chain Light chain gene

의 는 다음과 같다cluster ID .

항체서열 분석Fig. 3.44

• 형 전환anti-16-KDa whole IgG : 얻어진 항체의 서열을 이용하여 인간scFv IgG Heavy

및 발현벡터에 삽입하기 위하여 각 가변영chain Light chain Heavy chain/Light chain

역을 특이적 를 사용하여 증폭함 이 실험에 사용된 의 서열은 도표 내에primer . primer

표시되어 있음 해당 서열을 이용하여 증폭하여 를 준비함 각. primer insert . Heavy

과 가변영역을 또는 를 이용하여 절단하고 동일chain Light cahin SfiI/NheI SfiI/BglII

한 제한효소를 이용하여 절단한 벡터 와 에 삽입함 제한효소로 절단한 벡터pIGHV pIGLV .

는 다음과 같음 준비된 와 를 한 후 에 형질도입한 후. insert vector Ligation XL-1 blue

얻어진 콜로니로부터 가 에 잘 들어갔는지를 알아보기 위하여 을insert vector colony-PCR

수행하여 확인함 실험 결과 과 의 가변영역은 벡터들에 잘. Heavy chain Light chain IgG

삽입이 되었음을 확인할 수 있음.

을 절한한 후 삽입Fig. 3.45 SfiI/NheI 16KDaHC

을 절한한 후 삽입Fig. 3.46 SfiI/Balll 16KDaLC

• 단클론 항체의 발현 및 정제anti-16-kDa 항체로부터의 항원 인식성 비교로 가장: phage

우수한 종의 항체 를 대상으로 단클론 항체 생산에 투4 group3, group4, group6, group8

입하였음 및 발현벡터에 도입된 항체서열을 확인 후. Heavy chain Light chain whole

형 항체를 완성하기 위하여 각 발현 벡터를 세포에 하였다IgG HEK293 co-transfection .

형질도입된 세포로부터 발현 분비된 항체를 얻기 위하여 세포배양액을 매 일 마HEK293 - 3

다 회수하였다 배양액 내에 항원 를 인식하는 항체가 잘 생산되고 있는지 알아. (16-kDa)

보기 위하여 세포 배양액을 이용하여 을 실시하였다 배양액 를 전기western blot . 30 lμ

영동하고 에 후 를 이용하여 항체 발현양을, PVDF membrane transfer anti-human Fc-HRP

확인하였고 실험결과 종의 항체가 모두 잘 발현되고 있음을, 4 anti-16-kDa monoclonal

확인할 수 있다 회수된 세포배양액 약 을 하여 약. 500ml Ultra-filtration (millipore)

로 농축한 후 를 이용하여 항체를 정제하였50ml Protein-A bead (sepharose; Pharmacia)

다.

항체와 항체의 항원검출능력Fig. 3.47 Anti-CFP-10 Anti-Ag85

개발된 항체의 특이성 검증 및 생산3.7

항체와 항체의 항원검출능력Anti-CFP-10 Anti-Ag85□

항원 검출능력은 로 측정함 항체는 배로 항체sandwich ELISA . Anti-CFP-10 2000 , Anti-Ag85•

는 배로 에 희석하여 에 부착하고 후에 해당 항500 coating buffer ELISA plate , blocking

원을 첨가하여 반응시킴 검출항체는 본 교실에서 보관중인 항체와. rabbit anti-CFP-10

항체를 각각 사용하였음 항체를 로 사용rabbit anti-Ag85 . Anti-CFP-10 capture antibody

할 때 더 낮은 농도를 검출할 수 있음을 확인할 수 있었음.

로 측정한 항체와 항체의 항원검출능력Fig. 3.48 sandwich ELISA Anti-CFP-10 Anti-Ag85

검출조건을 확립하면 수준의 항원을 검출할 수 있을 것으로 생각되며 제 세부과제에ng , 1•

서 개발한 새로운 검출시스템을 도입하면 수준의 항원을 검출할 수 있다고 생각됨pg .

개발한 항체의 특이성을 측정하기위해서 를 비롯한 미코박테리아BCG, M. avium complex•

의 배양액에 존재하는 항원을 검출한 결과 특이적으로 결핵균 배양액에서만 항원CFP-10

과 항원이 검출되었음Ag85 .

Table. 3.6 Specificity of antibodies in antigen detection

MycobacteriaELISA OD value for

Anti-Ag85 complex Anti-CFP-10

M. tuberculosis CF 0.3403 0.2359

M. avium CF 0.0607 0.0557

M. kansasii CF 0.0667 0.0427

M. bovis BCG CF 0.0858 0.0369

M. intracelullare CF 0.0789 0.0583

M. abscessus CF 0.0631 0.0380

연구결론 및 고찰3.8

항원 검출을 통한 결핵진단법을 개발하기위해서는 개개의 항원에 대한 높은 결합력을 갖•

는 단일클론항체의 확보가 가장 큰 관건임 본 세부과제에서는 일차적으로 진단목적에.

적합한 다양한 항원을 발굴하는 것임 또한 발굴된 항원 중 가장 가능성이 높은 항원에.

대한 항체를 방법을 통해 개발하는 것임 연구결과를 요약하면 다음과 같phage display .

다.

기존항원 또는 결핵균 배양액에 다량 존재하는 항원인 와 를 결핵- Ag85 complex MTB12

균 배양액으로부터 직접 정제하였고 과 항원은 재조합단백을 생산하고CFP-10 ESAT-6

정제하였음.

잠복결핵조건에서 발현이 증가되는 항원에 대한 유전자 재조합단백을 생산하고- 16-kDa

정제하였음.

결핵균배양액과 배양액을 다단계분획과 분석을 통해 결핵균배양액에 풍부히- BCG 2-DE

존재하는 개의 단백10 (Rv1074, Rv0363c, Rv2780, Rv3803c, Rv3841, Rv0934, Rv0462,

과 배양액에 더 많이 존재하는 개의 단백Rv2882c, Rv2889c, Rv3628) BCG 3 (Rv3525c,

을 동정하였고 이중 항Rv1827, MBP70) , Rv0363c, Rv3841, Rv0934, Rv0462, Rv2882c

원에 대한 유전자재조합단백을 정제하였고 단백은 배양액으로부터, native MBP70 BCG

정제하였음.

결핵균세포막에 존재하는 항원 중에서 세포 면역원성이 높은 종류의 단백- B 3 (Rv1074,

을 동정함 단백에 대한 유전자재조합단백을 정제Rv0815c, Rv0831c) . Rv0815c(CysA2)

하여 혈청학적인 특성을 분석한 결과 진단적인 유의성이 매우 높은 항원임을 규명

함.

결핵환자 에 존재하는 개의 단백- urine 7 (Rv0252, Rv3292, Rv3280, Rv255c, Rv0384c,

을 동정하였고 에 대한 재조합단백을 정제하였음Rv0869c, Rv2524c) , Rv3280 .

파지항체개발은 차의 과정과 분리 결합력분석 항체서열분석- 3-4 panning , monphage , , ,

항체로의 전환 단클론항체 발현 및 정제 과정을 통해 항원에whole IgG , Ag85complex

대한 항체를 생산하여 정제함whole IgG .

항원에 대한 종의 상이한 단클론파지를 확보하였고 종의 를 생산- CFP-10 6 , 2 whole IgG

하고 종의 항체를 정제함1 .

항원에 대한 종의 상이한 단클론파지를 확보하였고 종의 를 생- 16-kDa 10 , 4 whole IgG

산하였음.

개발된 항체를 항체로 사용하여 항원검출능력을 로 측정한 결과capture sandwich ELISA•

현재 의 조건에서는 수준임 그러나 검출조건을 확립하면 수준의 항원을 검출할g . ngμ

수 있을 것으로 생각되며 제 세부과제에서 개발한 새로운 검출시스템을 도입하면 수준1 pg

의 항원을 검출할 수 있다고 생각됨 또한 개발된 항체는 특이적으로 결핵균 배양액에서.

만 존재하는 항원과 항원을 검출하였음CFP-10 Ag85 .

참고문헌4.

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is required for growth in macrophages. Proc. Natl Acad Sci USA, 95:9578-9583,1998.

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8. Hamasur B et al., Rapid detetction of tuberculosis by detection of mycobacterial

lipoarabinomannan in urine. J Microbiol Method 45:41-52, 2001.

9. Mudaliar AV et al., Detection of 65 kD heat shock protein in cerebrospinal fluid of

tuberculous meningitis patients. BMC nerology 6:34, 2006.

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innovative and alternative approach of antigen discovery of useful microbial

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11. Mukherjee S et al., Potential serolgical use of a recombinant protein that is a

replica of a Mycobacterium tuberculosis protein found in the urine of infected mice.

Clin Diagn Lab Immunol, 11: 280-286, 2004.

IV. 첨 부 서 류

양식[ 2 ]

최종보고서 평가 면제요청서 중개연구 논문성과 달성( )

과제번호 A080854

과제명 결핵항원 특이 항체를 이용한 결핵 조기 진단용 항체 단백질 칩 개발

주관연구책임자 장 철 훈 주관연구기관 부산대학교 산학협력단

총연구기간 총 년 개월2008. 05. 01 2010. 03. 31 ( 1 11 )∼

상기 과제는 중개연구지원과제로 주관연구책임자가 총 연구기간내 혹은 논문SCI SCI(E)

을 편이상 게재한 경우에2 해당하여 최종보고서 평가 면제 를 신청하오니 조치하여,「 」

주시기 바랍니다.

년 월 일2010 4 30

주관연구책임자 장 철 훈 인: ( )

주관연구기관 부산대학교 산학협력단 직인: ( )

한국보건산업진흥원장 귀하

양식[ 3 ]

최종보고서 비공개 승인요청서

고유번호 A080854

연구과제명 결핵항원 특이 항체를 이용한 결핵 조기 진단용 항체 단백질 칩 개발

연구기관 부산대학교 산학협력단 연구책임자 장 철 훈

참여기업 주 진인( )

비공개 요청기간 년 개월2008. 05. 01. 2010. 03. 31. ( 1 11 )∼

비공개 요청 내용

특허 출원된 투버쿨로시스 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 내용M.

비공개 요청사유

본 과제의 연구 결과로 국내 특허 출원▪

출원번호- : 10-2009-0097508

발명의 명칭 투버쿨로시스 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법- : M.

향후 해외 특허 출원 계획 중 임.▪

시제춤의 제품화에 있어 본 연구 결과는 영업 비밀에 해당되므로 비공개를 요청함.▪

상기과제의 연구내용과 관련사항을 비공개를 요청하고자 신청하오니 조치하여 주시기 바랍니다, .

년 월 일2010 04 30

주관연구책임자 장 철 훈 인: ( )

주관연구기관 부산대학교 산학협력단 직인: ( )

한국보건산업진흥원장 귀하