Upload
others
View
3
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
ĐẶT VẤN ĐỀ PHƢƠNG PHÁP/ KẾT QUẢ
MỤC TIÊU
TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN
PHƢƠNG PHÁP/ KẾT QUẢ
Phân lập vi khuẩn từ một số chủng tuyến trùng EPN nguồn gốc Việt Nam.
Khảo sát vi khuẩn phân lập và định danh.
Khảo sát độc lực của các chủng phân lập trên sâu khoang Spodoptera litura.
Vật liệu
Tuyến trùng Steinernema guangdongense XT và Heterorhabditis indica CP 16 do TS. Nguyễn Ngọc Châu, Viện Sinh thái Tài
nguyên Sinh vật VN cung cấp.
Ấu trùng sâu khoang Spodoptera litura được nuôi trên thức ăn nhân tạo (Nguyễn Thị Hai và nnk, 2013).
HỘI NGHỊ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TOÀN QUỐC KHU VỰC PHÍA NAM LẦN III - 2013
Nguyễn Hoài Hương*, Nguyễn Hoàng Anh Kha, Nguyễn Hiếu Dân, Nguyễn Thị Hai
Đại học Công nghệ TP. HCM
Tiểu ban: Công nghệ Vi sinh
Mã số báo cáo: P1-16
TÓM TẮT Hai chủng vi khuẩn được phân lập từ tuyến trùng diệt sâu (EPN) Steinernema guangdongense XT và Heterorhabditis indica CP16 giải phóng từ xác sâu (Spodoptera litura). Kết quả định danh bằng phương pháp nuôi cấy cũng như giải trình tự gene
rDNA 16S cho thấy chúng đều thuộc loài Serratia marcescens. Độc lực của các chủng vi khuẩn này trên Spodoptera litura cũng được khảo sát bằng phương pháp cho ăn và tiêm vào xoang máu. Kết quả cho thấy độc lực của các vi khuẩn tương tự như
vi khuẩn cộng sinh của tuyến trùng diệt sâu.
Từ khóa: giải trình tự gene rRNA 16S, độc lực trên sâu, tiêm xoang máu, tuyến trùng EPN, vi khuẩn cộng sinh.
Hình 3. Vai trò của VKCS: cộng sinh với tuyến
trùng và gây bệnh côn trùng (Goodrich-Blair, 2007) Hình 1. Vòng đời của EPN trong cơ
thể côn trùng và trong đất (Herbert et
al., 2007)
Hình 2. Ấu trùng
cảm nhiễm IJ chứa
khoảng 200 vi
khuẩn/IJ
(Steinernema
carpocapsae (trái),
Heterorhabditis
bacteriophora (phải)
Tuyến trùng gây bệnh côn trùng (EPN) ở pha IJ (ấu trùng cảm nhiễm) chứa vi khuẩn cộng sinh (VKCS) khi xâm nhập côn trùng
(miệng, hậu môn, lỗ thở), phóng thích VKCS vào xoang máu, diệt côn trùng, enzyme VKCS phân hủy xác côn trùng làm thức ăn
nuôi EPN (hình 1, 2, 3).
VKCS tuyến trùng EPN được khám phá cho đến nay bao gồm:
Xenorhabdus spp. cộng sinh Steinernema spp.
Photorhabdus luminescence cộng sinh Heterorhabditis spp. (Akhurst RJ. et al., 1980).
Serratia nematodiphia cộng sinh Heterorhabditidoides chongmingensis (Zhang CX. et al., 2008).
Serratia marcescens cộng sinh Caenorhabditis briggsae (Abebe E. et al., 2010).
Chúng tổng hợp nhiều enzyme protease, lipase, chitinase, protein độc và hợp chất thứ cấp. Bên cạnh nghiên cứu sản xuất EPN
chứa VKCS làm tác nhân trừ sâu sinh học, nghiên cứu khai thác riêng các VKCS của tuyến trùng cũng được quan tâm.
Giải trình tự gene rRNA 16S của các chủng phân lập và định danh
Chủng phân lập
SS1 (từ S.
guangdongense
XT)
SH1 (từ H. indica
CP16)
Kích thƣớc khuẩn lạc
trên nutrient agar, mm 1,5 – 2,0 2,5 – 3,0
Trạng thái khuẩn lạc/
màu sắc Nhớt/ đỏ Nhớt/ đỏ
Gram - -
Hình thái Que ngắn Que ngắn
Di động + +
TSI Glc+, Lac/Suc+,
H2S, sinh hơi-
Glc+, Lac/Suc+, H2S,
sinh hơi-
Lên men lactose - -
Indol, H2S - -
Catalase + +
Khử nitrate + +
Lipase trên thạch
Tween 20, CaCl2 + +
Protease trên thạch
gelatine + +
Protease trên thạch
casein + +
Chitinase trên thạch
1% dung dịch keo
chitin
+ +
Hình 5. Cây phát sinh loài được thiết lập theo giải
thuật NJ (neighbor joining) xác định mối quan hệ giữa
các chủng phân lập SS1 và SH1 với các chủng Serratia
spp. và vi khuẩn cộng sinh tuyến trùng truyền thống
theo Suzuki et al., 1996 (trong ngoặc đơn là mã số truy
cập trên http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
Hình 8. Thí nghiệm tiêm trực tiếp tế bào các chủng phân lập
vào sâu khoang Spodoptera litura. A, E) Sâu khoang chết do
tuyến trùng H. CP16 và S. XT ; B, F) Sâu khoang chết sau khi
tiêm SH1 và SS1; C,G) Chủng SH1 và SS1 phân lập từ H.
CP16 và S. XT và từ sâu chết do tiêm vi khuẩn trên thạch
NBTA ; D, H) Khả năng di động của SH1 và SS1 trên thạch NA.
Phân lập vi khuẩn từ tuyến trùng Steinernema guangdongense XT và
Heterohabditis indica CP16
Hai chủng SS1 và SH1 tình cờ được phân lập từ tuyến trùng EPN nguồn gốc Việt Nam Steinernema guangdongense XT và
Heterorhabditis indica CP 16. Khảo sát hình thái khuẩn lạc, thử nghiệm sinh lý và sinh hóa cho thấy các chủng này không phải là vi
khuẩn cộng sinh tuyến trùng truyền thống Xenorhabdus spp. và Photorhabdus luminescens. Giải mã trình tự gene rRNA 16S khẳng
định các chủng phân lập thuộc loài Serratia marcescens. Khả năng diệt sâu ở nồng độ thấp trong thời gian ngắn và dấu hiệu sâu chết
sau thử nghiệm vi khuẩn bằng phương pháp tiêm trực tiếp vào xoang máu và cho ăn cho thấy các chủng này có thể liên quan đến
hoạt lực diệt sâu của tuyến trùng nguồn phân lập của chúng. Những nghiên cứu tiếp theo đang tiến hành nhằm xác định mối quan hệ
giữa các vi khuẩn này và tuyến trùng, cũng như hoạt tính sinh học của các sản phẩm trao đổi chất khác của chúng .
* 475A Điện Biên Phủ, P. 25, Q. BT, E-mail: [email protected]
Hình 4. Khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào của SS1
(ABCD) và SH1 (EFGH); A, E : Hoạt tính lipase trên thạch
Tween 20 và CaCl2; B,F : Hoạt tính phân giải gelatin; C, G : hoạt
tính phân giải casein; D, F : hoạt tính phân giải chitin.
Bảng 1. Bảng tóm tắt đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa các
chủng phân lập
Phản ứng PCR:
Mồi 16S-F: AGA GTT TGA TCC
TGG CTC AG và 16S-R: ACG
GCT ACC TTG TTA CGA CTT
Chu kỳ luân nhiệt: 1 chu kỳ
95oC/5 phút và 40 chu kỳ gồm
94oC/30giây, 56oC/30 giây;
72oC/1 phút; cuối cùng 1 chu kỳ
72oC/10phút.
Giải trình tự trên máy 3130
Genetic Analyzer (Applied
Biosystems) do Cty Nam Khoa
Biotek thực hiện.
(KF534509)
(KF534508)
So sánh trên GENBANK:
SH1 trùng SS1 99,8%,
Serratia marcescens 99,7-
100%, S. nematodiphia
99,6%, S. entomophila
96,7%, Photorhabdus spp.
và Xenorhabdus spp. 89-
90%, cho thấy hai chủng
SH1 và SS1 có thể xếp vào
loài Serratia marcescens.
Tái phân lập vi khuẩn từ sâu chết thu đƣợc các vi
khuẩn đƣa vào, đặc trƣng ở màu đỏ của prodigiosin,
một hợp chất thứ cấp của S. marcescens. Cần làm rõ
vai trò SS1 và SH1 đối với EPN, hội sinh
(commensalism) hay tƣơng hỗ (mutualism) và nghiên
cứu ứng dụng chúng trong bảo vệ thực vật.
Độc lực của vi khuẩn phân lập trên sâu
Sau 30 giờ gần 100% sâu chết ở nồng độ 23 cfu
SH1/sâu và 43 cfu SS1/sâu (hình 6). Tiêm châu
chấu với E.coli K-12 HB101 > 106 cfu/con, tỉ lệ
chết chỉ là 5% sau 72 giờ (Khan & Goldsworthy,
2007). Tiêm S. nematodiphia DZ0503SBS1 vào
Galleria mellonella, LD50 = 50 tế bào/con sau 48
giờ (Zhang et al., 2008).
SS1 và SH1 đều có hoạt lực diệt sâu mạnh.
Trên thức ăn nhân tạo 12 cfu/mm2 SH1 và 22 cfu/mm2 SS1 gây sâu chết 50% sau 110 giờ. Trên lá thầu dầu ở
nồng độ tƣơng đƣơng (16,97 cfu/mm2 SH1) sâu chết 70% sau 110 giờ (hình 7). Dấu hiệu sâu chết là bụng
sâu chuyển sang màu đỏ, giống khi tiêm vi khuẩn, cũng giống trƣờng hợp sâu khoang chết do EPN nguồn
phân lập của các vi khuẩn này (hình 8).
Hình 7. Tỷ lệ chết của sâu
khoang khi A, B) SS1 và SH1
nhiễm trên bề mặt thức ăn
nhân tạo, C) SH1 nhiễm trên
bề mặt lá thầu dầu.
Hình 6. Tỷ lệ chết của sâu khoang Spodoptera litura khi tiêm S. marcescens SH1 (A) và
S. marcescens SS1 (B) vào xoang máu
Điểm khác biệt cơ bản giữa VK phân lập và Xenorhabdus spp. và Photorhabdus spp. (VKCS truyền thống của
Steinernema spp. và Heterorhabditis spp.) thể hiện ở hình thái, màu sắc khuẩn lạc, catalase+, khử nitrate+. Điểm giống
nhau quan trọng là ở hoạt tính enzyme và khả năng di động.
Abebe E, Jumba M, Bonner K, Gray V, Morris K, Thomas WK., 2010. An entomopathogenic Caenorhabditis briggs.. J Exp Biol., 213: 3223-
3229.
Akhurst R., Boemare N., 2006. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes, 6. Springer Science and
Business Media LLC Prokaryotes, 451-494.
Goodrich-Blair H, Clarke DJ., 2007. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol
Microbiol. 64:260-268.
Herbert EE & Goodrich-Blair H (2007). Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nature Reviews Microbiology, 5, 634–646.
Nguyễn Thị Hai, Nguyễn Thị Ngọc Hạnh, Nguyễn Ngọc Phong, Lê Thị Tiền, Hồ Hoàng Đăng Khoa, 2013. Xác định phổ ký chủ và khả năng
phòng trừ sâu hại của tuyến trùng Heterorhabditis indica CP16 và Steinernema guangdongense XT. Hội nghị CNSH toàn quốc lần III-2013 ngày
22.11.2013, P1-22.
Zhang C. X., Yang S. Y., Xu M. X., Sun J., Liu H., Kan F., Sun J., Lai R., Zhang K. Y., 2008. Serratia nematodiphila sp. nov., associated
symbiotically with the entomopathogenic nematode Heterorhabditidoides chongmingensis (Rhabditida: Rhabditidae), Int J Syst Evol Microbiol, 59:
1603-1638.