Upload
others
View
19
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
i
GAMBARAN SENSITIVITAS BERBAGAI ANTIBIOTIK DAN
PROFIL PLASMID Escherichia coli ISOLAT AIR SUMUR
GALI DESA NGEMPLAK KABUPATEN PATI
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat menyelesaikan
Pendidikan Diploma IV Kesehatan
Program Studi Analis Kesehatan
Proposal Skripsi
Analis Kesehatan
Diajukan Oleh
Erla Farikatun Nisa
G1C012017
PROGRAM STUDI DIV ANALIS KESEHATAN
FAKULTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAHSEMARANG
2016
httplibunimusacid
iv
GAMBARAN SENSITIVITAS BERBAGAI ANTIBIOTIK DAN PROFIL
PLASMID Escherichia coli ISOLAT AIR SUMUR GALI
DESA NGEMPLAK KABUPATEN PATI
Erla Farikatun Nisa1 Sri Darmawati2 Muhammad Evy Prastiyanto3
1Program Studi D IV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Semarang2Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang3Laboratorium Bakteriologi Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang
ABSTRAK
Pemberian antibiotik merupakan cara pencegahan atau pengobatan untukmenghambat pertumbuhan bakteri seringnya penggunaan antibiotik secara terusmenerus dapat menimbulkan terjadinya resistensi bakteri terhadap antibiotikDNA Plasmid yang dimiliki oleh bakteri dapat mempengaruhi sifat resistensibakteri terhadap antibiotik Tujuan penelitian ini untuk mengetahui gambaransensitivitas E coli terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid E coli isolat airsumur gali asal Desa Ngemplak Kabupaten Pati Metode uji sensitivitas bakteriyang digunakan adalah metode Kirby-Bauer dengan empat jenis antibiotik(kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan ampisilin) dan metode isolasiPlasmid menggunakan metode lisis alkali Hasil uji sensitivitas dari 10 strain Ecoli menunjukkan hasil sensitif terhadap antibiotik kloramfenikol dansiprofloksasin pada antibiotik gentamisin terdapat empat strain dengan hasilresisten (SG04C SG07C SG08C SG09C) dan 10 strain E coli menunjukkanresistensi pada antibiotik ampisilin Plasmid hasil isolasi dari 10 strain E colimenunjukkan empat strain E coli memiliki plasmid 8000 bp dan enam strain yanglainnya memiliki plasmid 5000 bp yang masing ndash masing strain E colimempunyai satu jenis plasmid
Kata kunci Escherichia coli profil plasmid sensitivitas antibiotik
httplibunimusacid
iv
describe the sensitivity of Escherichia coli to various antibiotics and plasmidprofiles of E coli isolates from the village water wells Ngemplak Pati regency
Erla Farikatun Nisa1 Sri Darmawati2 Muhammad Evy Prastiyanto3
1Program Studi D IV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Semarang2Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang3Laboratorium Bakteriologi Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang
ABSTRACT
Giving antibiotics is a way of prevention or treatment to inhibit the growth of bacteria
the frequent use of antibiotics continuously may cause the occurrence of bacterial
resistance to antibiotics Plasmid DNA possessed by the bacterium may affect the nature
of bacterial resistance to antibiotics The purpose of this study to describe the sensitivity
of E coli to various antibiotics and plasmid profiles of E coli isolates from the village
water wells Ngemplak Pati regency Bacterial sensitivity test method is the method of
Kirby-Bauer dengan four types of antibiotics (chloramphenicol ciprofloxacin gentamicin
and ampicillin) and the plasmid isolation method using the alkali lysis method The test
results of 10 strain E coli shows the results of sensitivity to the antibiotic
chloramphenicol and ciprofloxacin the antibiotic gentamicin with the results there are
four strains resistant (SG04C SG07C SG08C SG09C) and 10 strain E coli showed
resistance to the antibiotic ampicillin Plasmid isolated from 10 strain E coli showed four
strainE coli plasmid of 8000 bp and six other strains had a 5000 bp plasmid that each ndash
each strain strain E coli has one type of plasmid
Keywords Escherichia coli Plasmid profile Antibiotic sensitivity
httplibunimusacid
iv
Kata Pengantar
Assalammuarsquolaikum warohmatullahi wabarokatuh
Segala puji syukur atas kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan
segala rahmat hidayah dan Inayah-Nya Sholawat dan salam kepada
junjungan kita Baginda Rasulullah SAW beserta keluarga dan para Sahabat-
Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir yang berjudul
ldquoGambaran Sensitivitas Berbagai Antibiotik dan Profil Plasmid Escherichia
coli Isolat Air Sumur Gali Desa Ngemplak Kabupaten Patirdquo
Penyusunan skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk
menyelesaikan pendidikan Diploma IV Analis Kesehatan di Universitas
Muhammadiyah Semarang 2016
Penulis menyadari bahwa terselesaikannya tugas akhir ini tidak lepas
dari bimbingan dukungan dan bantuan dari berbagai pihak Oleh karena itu
pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terimakasih
kepada
1 Ibu Dr Sri Darmawati MSi selaku dosen pembimbing I beserta Bapak M
Evy Prastiyanto MSc selaku dosen pembimbing II yang telah
memberikan bimbingan arahan izin penelitian kritik dan saran serta
memotivasi selama penyusunan skripsi
2 Ibu Dra Sri Sinto Dewi MSi Med selaku Ketua Program Studi D IV
Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang
httplibunimusacid
iv
3 Bapak Suhari Ibu Sumiyati dan keluarga tercinta yang telah memberikan
doa dukungan moral dan material
Penulis menyadari masih banyak ketidak sempurnaan dan kekurangan
dalam penulisan tugas akhir ini Penulis mengharapkan kritik dan saran yang
membangun Semoga proposal penelitian ini dapat bermanfaat bagi para
pembaca Amin
Wassalammuarsquolaikum warohmatullahi wabarokatuh
Semarang September 2016
Erla Farikatun Nisa
G1C012017
httplibunimusacid
iv
DAFTAR ISIHalaman
HALAMAN JUDUL iHALAMAN PERSETUJUAN iiHALAMAN PENGESAHAN iiiABSTRAK ivSURAT PERNYATAAN ORIGINALITAS viKATA PENGANTARviiDAFTAR ISI ixDAFTAR TABEL xiDAFTAR GAMBARxiiDAFTAR LAMPIRAN xiiBAB I PENDAHULUAN 1
11 Latar Belakang 112 Rumusan Masalah 313 Tujuan Penelitian 414 Manfaat Penelitian 415 Orisinalitas Penelitian 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 621 Sumur Gali disekitar Limbah Tepung Tapioka Kabupaten Pati 622 Escherichia coli 7221 Morfologi Escherichia coli 8222 Patogenitas Escherichia coli 923 Uji Sensitivitas Bakteri 1024 Resistensi Escherichia coli Terhadap Antibiotik1125 DNA Plasmid 1226 Elektroforesis Gel Agarosa 1327 Kerangka Teori 15
BAB III METODE PENELITIAN 1631 Desain Penelitian 1632 Variabel Penelitian1633 Definisi Operasional 1634 Populasi dan Sampel Penelitian 1635 Alat dan Bahan17351 Alat 17352 Bahan 1736 Cara Kerja 17361 Uji Sensitivitas Bakteri 17362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli18363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli 1937 Alur Penelitian 2038 Teknik Pengumpulan Data2039 Pengolahan Data dan Analisis Data 20310 Waktu dan Tempat Penelitian 213101 Tempat Penelitian 21
httplibunimusacid
iv
3102 Waktu Penelitian 21311 Skema Uji Sensitivitas 22312 Skema Isolasi DNA Plasmid23313 Skema Separasi DNA Plasmid25
BAB IV PEMBAHASAN2641 Hasil Penelitian 26411 Hasil Uji Sensitivitas26412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid E coli 2742 Pembahasan28
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 3351 Kesimpulan 3352 Saran 33
DAFTAR PUSTAKALAMPIRAN
httplibunimusacid
iv
DAFTAR TABEL
HalamanTabel 1 Orisinalitas Penelitian 5Tabel 2 Standart Hasil Uji Sensitivitas 10Tabel 3 Definisi Operasional 26Tabel 4 Hasil Uji Sensitivitas E coli terhadap Antibiotik 28
httplibunimusacid
iv
DAFTAR GAMBAR
Nomor HalamanGambar 1 Gambar Plasmid Pada Sel Bakteri 12Gambar 2 Skema Kerangka Teori 15Gambar 3 Alur Penelitian 20Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas 22Gambar 5 Skema Isolasi DNA Plasmid 23Gambar 6 Skema Separasi DNA Plasmid 25Gambar 7 Hasil Elektroforesis Agarosa DNA Plasmid 27
httplibunimusacid
iv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran HalamanLampiran 1 Pembuatan Media 38Lampiran 2 Gambar Penelitian 41
httplibunimusacid
iv
BAB I
PENDAHULUAN
11 Latar Belakang
Air merupakan kebutuhan pokok yang tidak dapat dipisahkan dalam
kehidupan manusia Air dimanfaatkan manusia untuk kebutuhan hidup salah
satunya kebutuhan rumah tangga dan industri Penyediaan air bersih sekarang ini
menjadi prioritas dalam perbaikan derajat kesehatan masyarakat Seiring
meningkatnya kepadatan penduduk dan pesatnya pembangunan maka kebutuhan
air pun semakin meningkat sehingga dituntut tersedianya air yang sehat yang
meliputi pengawasan dan penetapan kualitas air untuk berbagai kebutuhan dan
kehidupan manusia yang bertujuan untuk menjamin tercapainya air minum
maupun air bersih yang memenuhi syarat kesehatan bagi masyarakat (Alwi amp
Maulina 2012) Masih banyak masyarakat yang memanfaatkan air sumur gali
untuk kebutuhan hidupnya yang masih belum jelas kualitasnya untuk
mengetahui kualitas air perlu dilakukan pemeriksaan berdasarkan sifat fisika
kimia maupun biologi
Adanya bakteri Coliform dalam air merupakan salah satu indikator
mikrobiologi yang dapat menentukan kualitas air Coliform merupakan bakteri
yang terkandung dalam jumlah banyak pada kotoran manusia dan hewan (Fadilah
et al 2014) Menurut Peraturan Menteri Kesehatan
No492MENKESPerIV2010 dan No907MENKESSKVII2002 Syarat
kualitas air bersih yang dapat digunakan sehari-hari memiliki standar maksimum
total bakteri Coliform yaitu 0 AMP100 mL air sehingga adanya Coliform dalam
httplibunimusacid
iv
air menunjukkan bahwa air tersebut sudah tercemar Bakteri Coliform tidak dapat
menimbulkan penyakit tertentu secara langsung tetapi semakin tinggi
kontaminasi bakteri ini maka resiko adanya bakteri lain yang dapat menimbulkan
gangguan kesehatan semakin tinggi (Alwi amp Maulina 2012)
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati terdapat pabrik
tepung tapioka yang banyak menghasilkan limbah salah satunya limbah cair yang
dialirkan ke sungai dan pemukiman penduduk Kandungan dari limbah cair yang
merupakan proses dari produksi pembuatan tepung tapioka tersebut adalah bahan
organik yang meliputi karbohidrat lemak serat dan protein (Robby et al 2013)
Kandungan limbah cair tersebut merupakan nutrient bagi bakteri yang dapat
menyebabkan suburnya pertumbuhan bakteri antara lain Coliform kemungkinan
adanya Coliform dalam air dapat ditemukan di sumber air yang dipakai untuk
keperluan rumah tangga seperti sumur gali atau sungai yang ada disekitar limbah
tersebut (Munfiah et al 2013)
Salah satu bakteri dari kelompok Coliform adalah Escherichia coli (E
coli) E coli merupakan anggota dari famili Enterobactericeae yang berbentuk
batang bersifat gram negatif dan dalam keadaan normal berada di usus manusia
Ecoli menjadi patogen jika mencapai jaringan di luar habitat normalnnya
(Winarno 2008) Manusia dapat terinfeksi E coli karena makan dan minum yang
terkontaminasi bakteri tersebut sehingga dapat menyebabkan diare dan kram pada
abdomen (Juliantina 2008) Infeksi yang disebabkan E coli dapat dihambat
pertumbuhannya dengan pemberian antibiotik
httplibunimusacid
iv
Menurut penelitian (Martha amp Tejasari 2014) saat ini diketahui banyak
resistensi E coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik seperti antibiotik
ampisilin 100 siprofloksasin 7419 kloramphenikol 2903 dan gentamisin
3226 hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik
Selain itu bakteri gram negatif seperti E coli menghasilkan plasmid yang dapat
memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat
menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al 2010)
Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik
dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan
kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga
berubah sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E coli isolat air sumur
gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E coli
12 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan
bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid
Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
13 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai
antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
GAMBARAN SENSITIVITAS BERBAGAI ANTIBIOTIK DAN PROFIL
PLASMID Escherichia coli ISOLAT AIR SUMUR GALI
DESA NGEMPLAK KABUPATEN PATI
Erla Farikatun Nisa1 Sri Darmawati2 Muhammad Evy Prastiyanto3
1Program Studi D IV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Semarang2Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang3Laboratorium Bakteriologi Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang
ABSTRAK
Pemberian antibiotik merupakan cara pencegahan atau pengobatan untukmenghambat pertumbuhan bakteri seringnya penggunaan antibiotik secara terusmenerus dapat menimbulkan terjadinya resistensi bakteri terhadap antibiotikDNA Plasmid yang dimiliki oleh bakteri dapat mempengaruhi sifat resistensibakteri terhadap antibiotik Tujuan penelitian ini untuk mengetahui gambaransensitivitas E coli terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid E coli isolat airsumur gali asal Desa Ngemplak Kabupaten Pati Metode uji sensitivitas bakteriyang digunakan adalah metode Kirby-Bauer dengan empat jenis antibiotik(kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan ampisilin) dan metode isolasiPlasmid menggunakan metode lisis alkali Hasil uji sensitivitas dari 10 strain Ecoli menunjukkan hasil sensitif terhadap antibiotik kloramfenikol dansiprofloksasin pada antibiotik gentamisin terdapat empat strain dengan hasilresisten (SG04C SG07C SG08C SG09C) dan 10 strain E coli menunjukkanresistensi pada antibiotik ampisilin Plasmid hasil isolasi dari 10 strain E colimenunjukkan empat strain E coli memiliki plasmid 8000 bp dan enam strain yanglainnya memiliki plasmid 5000 bp yang masing ndash masing strain E colimempunyai satu jenis plasmid
Kata kunci Escherichia coli profil plasmid sensitivitas antibiotik
httplibunimusacid
iv
describe the sensitivity of Escherichia coli to various antibiotics and plasmidprofiles of E coli isolates from the village water wells Ngemplak Pati regency
Erla Farikatun Nisa1 Sri Darmawati2 Muhammad Evy Prastiyanto3
1Program Studi D IV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Semarang2Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang3Laboratorium Bakteriologi Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang
ABSTRACT
Giving antibiotics is a way of prevention or treatment to inhibit the growth of bacteria
the frequent use of antibiotics continuously may cause the occurrence of bacterial
resistance to antibiotics Plasmid DNA possessed by the bacterium may affect the nature
of bacterial resistance to antibiotics The purpose of this study to describe the sensitivity
of E coli to various antibiotics and plasmid profiles of E coli isolates from the village
water wells Ngemplak Pati regency Bacterial sensitivity test method is the method of
Kirby-Bauer dengan four types of antibiotics (chloramphenicol ciprofloxacin gentamicin
and ampicillin) and the plasmid isolation method using the alkali lysis method The test
results of 10 strain E coli shows the results of sensitivity to the antibiotic
chloramphenicol and ciprofloxacin the antibiotic gentamicin with the results there are
four strains resistant (SG04C SG07C SG08C SG09C) and 10 strain E coli showed
resistance to the antibiotic ampicillin Plasmid isolated from 10 strain E coli showed four
strainE coli plasmid of 8000 bp and six other strains had a 5000 bp plasmid that each ndash
each strain strain E coli has one type of plasmid
Keywords Escherichia coli Plasmid profile Antibiotic sensitivity
httplibunimusacid
iv
Kata Pengantar
Assalammuarsquolaikum warohmatullahi wabarokatuh
Segala puji syukur atas kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan
segala rahmat hidayah dan Inayah-Nya Sholawat dan salam kepada
junjungan kita Baginda Rasulullah SAW beserta keluarga dan para Sahabat-
Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir yang berjudul
ldquoGambaran Sensitivitas Berbagai Antibiotik dan Profil Plasmid Escherichia
coli Isolat Air Sumur Gali Desa Ngemplak Kabupaten Patirdquo
Penyusunan skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk
menyelesaikan pendidikan Diploma IV Analis Kesehatan di Universitas
Muhammadiyah Semarang 2016
Penulis menyadari bahwa terselesaikannya tugas akhir ini tidak lepas
dari bimbingan dukungan dan bantuan dari berbagai pihak Oleh karena itu
pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terimakasih
kepada
1 Ibu Dr Sri Darmawati MSi selaku dosen pembimbing I beserta Bapak M
Evy Prastiyanto MSc selaku dosen pembimbing II yang telah
memberikan bimbingan arahan izin penelitian kritik dan saran serta
memotivasi selama penyusunan skripsi
2 Ibu Dra Sri Sinto Dewi MSi Med selaku Ketua Program Studi D IV
Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang
httplibunimusacid
iv
3 Bapak Suhari Ibu Sumiyati dan keluarga tercinta yang telah memberikan
doa dukungan moral dan material
Penulis menyadari masih banyak ketidak sempurnaan dan kekurangan
dalam penulisan tugas akhir ini Penulis mengharapkan kritik dan saran yang
membangun Semoga proposal penelitian ini dapat bermanfaat bagi para
pembaca Amin
Wassalammuarsquolaikum warohmatullahi wabarokatuh
Semarang September 2016
Erla Farikatun Nisa
G1C012017
httplibunimusacid
iv
DAFTAR ISIHalaman
HALAMAN JUDUL iHALAMAN PERSETUJUAN iiHALAMAN PENGESAHAN iiiABSTRAK ivSURAT PERNYATAAN ORIGINALITAS viKATA PENGANTARviiDAFTAR ISI ixDAFTAR TABEL xiDAFTAR GAMBARxiiDAFTAR LAMPIRAN xiiBAB I PENDAHULUAN 1
11 Latar Belakang 112 Rumusan Masalah 313 Tujuan Penelitian 414 Manfaat Penelitian 415 Orisinalitas Penelitian 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 621 Sumur Gali disekitar Limbah Tepung Tapioka Kabupaten Pati 622 Escherichia coli 7221 Morfologi Escherichia coli 8222 Patogenitas Escherichia coli 923 Uji Sensitivitas Bakteri 1024 Resistensi Escherichia coli Terhadap Antibiotik1125 DNA Plasmid 1226 Elektroforesis Gel Agarosa 1327 Kerangka Teori 15
BAB III METODE PENELITIAN 1631 Desain Penelitian 1632 Variabel Penelitian1633 Definisi Operasional 1634 Populasi dan Sampel Penelitian 1635 Alat dan Bahan17351 Alat 17352 Bahan 1736 Cara Kerja 17361 Uji Sensitivitas Bakteri 17362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli18363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli 1937 Alur Penelitian 2038 Teknik Pengumpulan Data2039 Pengolahan Data dan Analisis Data 20310 Waktu dan Tempat Penelitian 213101 Tempat Penelitian 21
httplibunimusacid
iv
3102 Waktu Penelitian 21311 Skema Uji Sensitivitas 22312 Skema Isolasi DNA Plasmid23313 Skema Separasi DNA Plasmid25
BAB IV PEMBAHASAN2641 Hasil Penelitian 26411 Hasil Uji Sensitivitas26412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid E coli 2742 Pembahasan28
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 3351 Kesimpulan 3352 Saran 33
DAFTAR PUSTAKALAMPIRAN
httplibunimusacid
iv
DAFTAR TABEL
HalamanTabel 1 Orisinalitas Penelitian 5Tabel 2 Standart Hasil Uji Sensitivitas 10Tabel 3 Definisi Operasional 26Tabel 4 Hasil Uji Sensitivitas E coli terhadap Antibiotik 28
httplibunimusacid
iv
DAFTAR GAMBAR
Nomor HalamanGambar 1 Gambar Plasmid Pada Sel Bakteri 12Gambar 2 Skema Kerangka Teori 15Gambar 3 Alur Penelitian 20Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas 22Gambar 5 Skema Isolasi DNA Plasmid 23Gambar 6 Skema Separasi DNA Plasmid 25Gambar 7 Hasil Elektroforesis Agarosa DNA Plasmid 27
httplibunimusacid
iv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran HalamanLampiran 1 Pembuatan Media 38Lampiran 2 Gambar Penelitian 41
httplibunimusacid
iv
BAB I
PENDAHULUAN
11 Latar Belakang
Air merupakan kebutuhan pokok yang tidak dapat dipisahkan dalam
kehidupan manusia Air dimanfaatkan manusia untuk kebutuhan hidup salah
satunya kebutuhan rumah tangga dan industri Penyediaan air bersih sekarang ini
menjadi prioritas dalam perbaikan derajat kesehatan masyarakat Seiring
meningkatnya kepadatan penduduk dan pesatnya pembangunan maka kebutuhan
air pun semakin meningkat sehingga dituntut tersedianya air yang sehat yang
meliputi pengawasan dan penetapan kualitas air untuk berbagai kebutuhan dan
kehidupan manusia yang bertujuan untuk menjamin tercapainya air minum
maupun air bersih yang memenuhi syarat kesehatan bagi masyarakat (Alwi amp
Maulina 2012) Masih banyak masyarakat yang memanfaatkan air sumur gali
untuk kebutuhan hidupnya yang masih belum jelas kualitasnya untuk
mengetahui kualitas air perlu dilakukan pemeriksaan berdasarkan sifat fisika
kimia maupun biologi
Adanya bakteri Coliform dalam air merupakan salah satu indikator
mikrobiologi yang dapat menentukan kualitas air Coliform merupakan bakteri
yang terkandung dalam jumlah banyak pada kotoran manusia dan hewan (Fadilah
et al 2014) Menurut Peraturan Menteri Kesehatan
No492MENKESPerIV2010 dan No907MENKESSKVII2002 Syarat
kualitas air bersih yang dapat digunakan sehari-hari memiliki standar maksimum
total bakteri Coliform yaitu 0 AMP100 mL air sehingga adanya Coliform dalam
httplibunimusacid
iv
air menunjukkan bahwa air tersebut sudah tercemar Bakteri Coliform tidak dapat
menimbulkan penyakit tertentu secara langsung tetapi semakin tinggi
kontaminasi bakteri ini maka resiko adanya bakteri lain yang dapat menimbulkan
gangguan kesehatan semakin tinggi (Alwi amp Maulina 2012)
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati terdapat pabrik
tepung tapioka yang banyak menghasilkan limbah salah satunya limbah cair yang
dialirkan ke sungai dan pemukiman penduduk Kandungan dari limbah cair yang
merupakan proses dari produksi pembuatan tepung tapioka tersebut adalah bahan
organik yang meliputi karbohidrat lemak serat dan protein (Robby et al 2013)
Kandungan limbah cair tersebut merupakan nutrient bagi bakteri yang dapat
menyebabkan suburnya pertumbuhan bakteri antara lain Coliform kemungkinan
adanya Coliform dalam air dapat ditemukan di sumber air yang dipakai untuk
keperluan rumah tangga seperti sumur gali atau sungai yang ada disekitar limbah
tersebut (Munfiah et al 2013)
Salah satu bakteri dari kelompok Coliform adalah Escherichia coli (E
coli) E coli merupakan anggota dari famili Enterobactericeae yang berbentuk
batang bersifat gram negatif dan dalam keadaan normal berada di usus manusia
Ecoli menjadi patogen jika mencapai jaringan di luar habitat normalnnya
(Winarno 2008) Manusia dapat terinfeksi E coli karena makan dan minum yang
terkontaminasi bakteri tersebut sehingga dapat menyebabkan diare dan kram pada
abdomen (Juliantina 2008) Infeksi yang disebabkan E coli dapat dihambat
pertumbuhannya dengan pemberian antibiotik
httplibunimusacid
iv
Menurut penelitian (Martha amp Tejasari 2014) saat ini diketahui banyak
resistensi E coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik seperti antibiotik
ampisilin 100 siprofloksasin 7419 kloramphenikol 2903 dan gentamisin
3226 hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik
Selain itu bakteri gram negatif seperti E coli menghasilkan plasmid yang dapat
memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat
menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al 2010)
Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik
dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan
kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga
berubah sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E coli isolat air sumur
gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E coli
12 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan
bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid
Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
13 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai
antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
describe the sensitivity of Escherichia coli to various antibiotics and plasmidprofiles of E coli isolates from the village water wells Ngemplak Pati regency
Erla Farikatun Nisa1 Sri Darmawati2 Muhammad Evy Prastiyanto3
1Program Studi D IV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Semarang2Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang3Laboratorium Bakteriologi Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang
ABSTRACT
Giving antibiotics is a way of prevention or treatment to inhibit the growth of bacteria
the frequent use of antibiotics continuously may cause the occurrence of bacterial
resistance to antibiotics Plasmid DNA possessed by the bacterium may affect the nature
of bacterial resistance to antibiotics The purpose of this study to describe the sensitivity
of E coli to various antibiotics and plasmid profiles of E coli isolates from the village
water wells Ngemplak Pati regency Bacterial sensitivity test method is the method of
Kirby-Bauer dengan four types of antibiotics (chloramphenicol ciprofloxacin gentamicin
and ampicillin) and the plasmid isolation method using the alkali lysis method The test
results of 10 strain E coli shows the results of sensitivity to the antibiotic
chloramphenicol and ciprofloxacin the antibiotic gentamicin with the results there are
four strains resistant (SG04C SG07C SG08C SG09C) and 10 strain E coli showed
resistance to the antibiotic ampicillin Plasmid isolated from 10 strain E coli showed four
strainE coli plasmid of 8000 bp and six other strains had a 5000 bp plasmid that each ndash
each strain strain E coli has one type of plasmid
Keywords Escherichia coli Plasmid profile Antibiotic sensitivity
httplibunimusacid
iv
Kata Pengantar
Assalammuarsquolaikum warohmatullahi wabarokatuh
Segala puji syukur atas kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan
segala rahmat hidayah dan Inayah-Nya Sholawat dan salam kepada
junjungan kita Baginda Rasulullah SAW beserta keluarga dan para Sahabat-
Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir yang berjudul
ldquoGambaran Sensitivitas Berbagai Antibiotik dan Profil Plasmid Escherichia
coli Isolat Air Sumur Gali Desa Ngemplak Kabupaten Patirdquo
Penyusunan skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk
menyelesaikan pendidikan Diploma IV Analis Kesehatan di Universitas
Muhammadiyah Semarang 2016
Penulis menyadari bahwa terselesaikannya tugas akhir ini tidak lepas
dari bimbingan dukungan dan bantuan dari berbagai pihak Oleh karena itu
pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terimakasih
kepada
1 Ibu Dr Sri Darmawati MSi selaku dosen pembimbing I beserta Bapak M
Evy Prastiyanto MSc selaku dosen pembimbing II yang telah
memberikan bimbingan arahan izin penelitian kritik dan saran serta
memotivasi selama penyusunan skripsi
2 Ibu Dra Sri Sinto Dewi MSi Med selaku Ketua Program Studi D IV
Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang
httplibunimusacid
iv
3 Bapak Suhari Ibu Sumiyati dan keluarga tercinta yang telah memberikan
doa dukungan moral dan material
Penulis menyadari masih banyak ketidak sempurnaan dan kekurangan
dalam penulisan tugas akhir ini Penulis mengharapkan kritik dan saran yang
membangun Semoga proposal penelitian ini dapat bermanfaat bagi para
pembaca Amin
Wassalammuarsquolaikum warohmatullahi wabarokatuh
Semarang September 2016
Erla Farikatun Nisa
G1C012017
httplibunimusacid
iv
DAFTAR ISIHalaman
HALAMAN JUDUL iHALAMAN PERSETUJUAN iiHALAMAN PENGESAHAN iiiABSTRAK ivSURAT PERNYATAAN ORIGINALITAS viKATA PENGANTARviiDAFTAR ISI ixDAFTAR TABEL xiDAFTAR GAMBARxiiDAFTAR LAMPIRAN xiiBAB I PENDAHULUAN 1
11 Latar Belakang 112 Rumusan Masalah 313 Tujuan Penelitian 414 Manfaat Penelitian 415 Orisinalitas Penelitian 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 621 Sumur Gali disekitar Limbah Tepung Tapioka Kabupaten Pati 622 Escherichia coli 7221 Morfologi Escherichia coli 8222 Patogenitas Escherichia coli 923 Uji Sensitivitas Bakteri 1024 Resistensi Escherichia coli Terhadap Antibiotik1125 DNA Plasmid 1226 Elektroforesis Gel Agarosa 1327 Kerangka Teori 15
BAB III METODE PENELITIAN 1631 Desain Penelitian 1632 Variabel Penelitian1633 Definisi Operasional 1634 Populasi dan Sampel Penelitian 1635 Alat dan Bahan17351 Alat 17352 Bahan 1736 Cara Kerja 17361 Uji Sensitivitas Bakteri 17362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli18363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli 1937 Alur Penelitian 2038 Teknik Pengumpulan Data2039 Pengolahan Data dan Analisis Data 20310 Waktu dan Tempat Penelitian 213101 Tempat Penelitian 21
httplibunimusacid
iv
3102 Waktu Penelitian 21311 Skema Uji Sensitivitas 22312 Skema Isolasi DNA Plasmid23313 Skema Separasi DNA Plasmid25
BAB IV PEMBAHASAN2641 Hasil Penelitian 26411 Hasil Uji Sensitivitas26412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid E coli 2742 Pembahasan28
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 3351 Kesimpulan 3352 Saran 33
DAFTAR PUSTAKALAMPIRAN
httplibunimusacid
iv
DAFTAR TABEL
HalamanTabel 1 Orisinalitas Penelitian 5Tabel 2 Standart Hasil Uji Sensitivitas 10Tabel 3 Definisi Operasional 26Tabel 4 Hasil Uji Sensitivitas E coli terhadap Antibiotik 28
httplibunimusacid
iv
DAFTAR GAMBAR
Nomor HalamanGambar 1 Gambar Plasmid Pada Sel Bakteri 12Gambar 2 Skema Kerangka Teori 15Gambar 3 Alur Penelitian 20Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas 22Gambar 5 Skema Isolasi DNA Plasmid 23Gambar 6 Skema Separasi DNA Plasmid 25Gambar 7 Hasil Elektroforesis Agarosa DNA Plasmid 27
httplibunimusacid
iv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran HalamanLampiran 1 Pembuatan Media 38Lampiran 2 Gambar Penelitian 41
httplibunimusacid
iv
BAB I
PENDAHULUAN
11 Latar Belakang
Air merupakan kebutuhan pokok yang tidak dapat dipisahkan dalam
kehidupan manusia Air dimanfaatkan manusia untuk kebutuhan hidup salah
satunya kebutuhan rumah tangga dan industri Penyediaan air bersih sekarang ini
menjadi prioritas dalam perbaikan derajat kesehatan masyarakat Seiring
meningkatnya kepadatan penduduk dan pesatnya pembangunan maka kebutuhan
air pun semakin meningkat sehingga dituntut tersedianya air yang sehat yang
meliputi pengawasan dan penetapan kualitas air untuk berbagai kebutuhan dan
kehidupan manusia yang bertujuan untuk menjamin tercapainya air minum
maupun air bersih yang memenuhi syarat kesehatan bagi masyarakat (Alwi amp
Maulina 2012) Masih banyak masyarakat yang memanfaatkan air sumur gali
untuk kebutuhan hidupnya yang masih belum jelas kualitasnya untuk
mengetahui kualitas air perlu dilakukan pemeriksaan berdasarkan sifat fisika
kimia maupun biologi
Adanya bakteri Coliform dalam air merupakan salah satu indikator
mikrobiologi yang dapat menentukan kualitas air Coliform merupakan bakteri
yang terkandung dalam jumlah banyak pada kotoran manusia dan hewan (Fadilah
et al 2014) Menurut Peraturan Menteri Kesehatan
No492MENKESPerIV2010 dan No907MENKESSKVII2002 Syarat
kualitas air bersih yang dapat digunakan sehari-hari memiliki standar maksimum
total bakteri Coliform yaitu 0 AMP100 mL air sehingga adanya Coliform dalam
httplibunimusacid
iv
air menunjukkan bahwa air tersebut sudah tercemar Bakteri Coliform tidak dapat
menimbulkan penyakit tertentu secara langsung tetapi semakin tinggi
kontaminasi bakteri ini maka resiko adanya bakteri lain yang dapat menimbulkan
gangguan kesehatan semakin tinggi (Alwi amp Maulina 2012)
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati terdapat pabrik
tepung tapioka yang banyak menghasilkan limbah salah satunya limbah cair yang
dialirkan ke sungai dan pemukiman penduduk Kandungan dari limbah cair yang
merupakan proses dari produksi pembuatan tepung tapioka tersebut adalah bahan
organik yang meliputi karbohidrat lemak serat dan protein (Robby et al 2013)
Kandungan limbah cair tersebut merupakan nutrient bagi bakteri yang dapat
menyebabkan suburnya pertumbuhan bakteri antara lain Coliform kemungkinan
adanya Coliform dalam air dapat ditemukan di sumber air yang dipakai untuk
keperluan rumah tangga seperti sumur gali atau sungai yang ada disekitar limbah
tersebut (Munfiah et al 2013)
Salah satu bakteri dari kelompok Coliform adalah Escherichia coli (E
coli) E coli merupakan anggota dari famili Enterobactericeae yang berbentuk
batang bersifat gram negatif dan dalam keadaan normal berada di usus manusia
Ecoli menjadi patogen jika mencapai jaringan di luar habitat normalnnya
(Winarno 2008) Manusia dapat terinfeksi E coli karena makan dan minum yang
terkontaminasi bakteri tersebut sehingga dapat menyebabkan diare dan kram pada
abdomen (Juliantina 2008) Infeksi yang disebabkan E coli dapat dihambat
pertumbuhannya dengan pemberian antibiotik
httplibunimusacid
iv
Menurut penelitian (Martha amp Tejasari 2014) saat ini diketahui banyak
resistensi E coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik seperti antibiotik
ampisilin 100 siprofloksasin 7419 kloramphenikol 2903 dan gentamisin
3226 hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik
Selain itu bakteri gram negatif seperti E coli menghasilkan plasmid yang dapat
memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat
menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al 2010)
Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik
dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan
kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga
berubah sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E coli isolat air sumur
gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E coli
12 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan
bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid
Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
13 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai
antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
Kata Pengantar
Assalammuarsquolaikum warohmatullahi wabarokatuh
Segala puji syukur atas kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan
segala rahmat hidayah dan Inayah-Nya Sholawat dan salam kepada
junjungan kita Baginda Rasulullah SAW beserta keluarga dan para Sahabat-
Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir yang berjudul
ldquoGambaran Sensitivitas Berbagai Antibiotik dan Profil Plasmid Escherichia
coli Isolat Air Sumur Gali Desa Ngemplak Kabupaten Patirdquo
Penyusunan skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk
menyelesaikan pendidikan Diploma IV Analis Kesehatan di Universitas
Muhammadiyah Semarang 2016
Penulis menyadari bahwa terselesaikannya tugas akhir ini tidak lepas
dari bimbingan dukungan dan bantuan dari berbagai pihak Oleh karena itu
pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terimakasih
kepada
1 Ibu Dr Sri Darmawati MSi selaku dosen pembimbing I beserta Bapak M
Evy Prastiyanto MSc selaku dosen pembimbing II yang telah
memberikan bimbingan arahan izin penelitian kritik dan saran serta
memotivasi selama penyusunan skripsi
2 Ibu Dra Sri Sinto Dewi MSi Med selaku Ketua Program Studi D IV
Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang
httplibunimusacid
iv
3 Bapak Suhari Ibu Sumiyati dan keluarga tercinta yang telah memberikan
doa dukungan moral dan material
Penulis menyadari masih banyak ketidak sempurnaan dan kekurangan
dalam penulisan tugas akhir ini Penulis mengharapkan kritik dan saran yang
membangun Semoga proposal penelitian ini dapat bermanfaat bagi para
pembaca Amin
Wassalammuarsquolaikum warohmatullahi wabarokatuh
Semarang September 2016
Erla Farikatun Nisa
G1C012017
httplibunimusacid
iv
DAFTAR ISIHalaman
HALAMAN JUDUL iHALAMAN PERSETUJUAN iiHALAMAN PENGESAHAN iiiABSTRAK ivSURAT PERNYATAAN ORIGINALITAS viKATA PENGANTARviiDAFTAR ISI ixDAFTAR TABEL xiDAFTAR GAMBARxiiDAFTAR LAMPIRAN xiiBAB I PENDAHULUAN 1
11 Latar Belakang 112 Rumusan Masalah 313 Tujuan Penelitian 414 Manfaat Penelitian 415 Orisinalitas Penelitian 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 621 Sumur Gali disekitar Limbah Tepung Tapioka Kabupaten Pati 622 Escherichia coli 7221 Morfologi Escherichia coli 8222 Patogenitas Escherichia coli 923 Uji Sensitivitas Bakteri 1024 Resistensi Escherichia coli Terhadap Antibiotik1125 DNA Plasmid 1226 Elektroforesis Gel Agarosa 1327 Kerangka Teori 15
BAB III METODE PENELITIAN 1631 Desain Penelitian 1632 Variabel Penelitian1633 Definisi Operasional 1634 Populasi dan Sampel Penelitian 1635 Alat dan Bahan17351 Alat 17352 Bahan 1736 Cara Kerja 17361 Uji Sensitivitas Bakteri 17362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli18363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli 1937 Alur Penelitian 2038 Teknik Pengumpulan Data2039 Pengolahan Data dan Analisis Data 20310 Waktu dan Tempat Penelitian 213101 Tempat Penelitian 21
httplibunimusacid
iv
3102 Waktu Penelitian 21311 Skema Uji Sensitivitas 22312 Skema Isolasi DNA Plasmid23313 Skema Separasi DNA Plasmid25
BAB IV PEMBAHASAN2641 Hasil Penelitian 26411 Hasil Uji Sensitivitas26412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid E coli 2742 Pembahasan28
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 3351 Kesimpulan 3352 Saran 33
DAFTAR PUSTAKALAMPIRAN
httplibunimusacid
iv
DAFTAR TABEL
HalamanTabel 1 Orisinalitas Penelitian 5Tabel 2 Standart Hasil Uji Sensitivitas 10Tabel 3 Definisi Operasional 26Tabel 4 Hasil Uji Sensitivitas E coli terhadap Antibiotik 28
httplibunimusacid
iv
DAFTAR GAMBAR
Nomor HalamanGambar 1 Gambar Plasmid Pada Sel Bakteri 12Gambar 2 Skema Kerangka Teori 15Gambar 3 Alur Penelitian 20Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas 22Gambar 5 Skema Isolasi DNA Plasmid 23Gambar 6 Skema Separasi DNA Plasmid 25Gambar 7 Hasil Elektroforesis Agarosa DNA Plasmid 27
httplibunimusacid
iv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran HalamanLampiran 1 Pembuatan Media 38Lampiran 2 Gambar Penelitian 41
httplibunimusacid
iv
BAB I
PENDAHULUAN
11 Latar Belakang
Air merupakan kebutuhan pokok yang tidak dapat dipisahkan dalam
kehidupan manusia Air dimanfaatkan manusia untuk kebutuhan hidup salah
satunya kebutuhan rumah tangga dan industri Penyediaan air bersih sekarang ini
menjadi prioritas dalam perbaikan derajat kesehatan masyarakat Seiring
meningkatnya kepadatan penduduk dan pesatnya pembangunan maka kebutuhan
air pun semakin meningkat sehingga dituntut tersedianya air yang sehat yang
meliputi pengawasan dan penetapan kualitas air untuk berbagai kebutuhan dan
kehidupan manusia yang bertujuan untuk menjamin tercapainya air minum
maupun air bersih yang memenuhi syarat kesehatan bagi masyarakat (Alwi amp
Maulina 2012) Masih banyak masyarakat yang memanfaatkan air sumur gali
untuk kebutuhan hidupnya yang masih belum jelas kualitasnya untuk
mengetahui kualitas air perlu dilakukan pemeriksaan berdasarkan sifat fisika
kimia maupun biologi
Adanya bakteri Coliform dalam air merupakan salah satu indikator
mikrobiologi yang dapat menentukan kualitas air Coliform merupakan bakteri
yang terkandung dalam jumlah banyak pada kotoran manusia dan hewan (Fadilah
et al 2014) Menurut Peraturan Menteri Kesehatan
No492MENKESPerIV2010 dan No907MENKESSKVII2002 Syarat
kualitas air bersih yang dapat digunakan sehari-hari memiliki standar maksimum
total bakteri Coliform yaitu 0 AMP100 mL air sehingga adanya Coliform dalam
httplibunimusacid
iv
air menunjukkan bahwa air tersebut sudah tercemar Bakteri Coliform tidak dapat
menimbulkan penyakit tertentu secara langsung tetapi semakin tinggi
kontaminasi bakteri ini maka resiko adanya bakteri lain yang dapat menimbulkan
gangguan kesehatan semakin tinggi (Alwi amp Maulina 2012)
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati terdapat pabrik
tepung tapioka yang banyak menghasilkan limbah salah satunya limbah cair yang
dialirkan ke sungai dan pemukiman penduduk Kandungan dari limbah cair yang
merupakan proses dari produksi pembuatan tepung tapioka tersebut adalah bahan
organik yang meliputi karbohidrat lemak serat dan protein (Robby et al 2013)
Kandungan limbah cair tersebut merupakan nutrient bagi bakteri yang dapat
menyebabkan suburnya pertumbuhan bakteri antara lain Coliform kemungkinan
adanya Coliform dalam air dapat ditemukan di sumber air yang dipakai untuk
keperluan rumah tangga seperti sumur gali atau sungai yang ada disekitar limbah
tersebut (Munfiah et al 2013)
Salah satu bakteri dari kelompok Coliform adalah Escherichia coli (E
coli) E coli merupakan anggota dari famili Enterobactericeae yang berbentuk
batang bersifat gram negatif dan dalam keadaan normal berada di usus manusia
Ecoli menjadi patogen jika mencapai jaringan di luar habitat normalnnya
(Winarno 2008) Manusia dapat terinfeksi E coli karena makan dan minum yang
terkontaminasi bakteri tersebut sehingga dapat menyebabkan diare dan kram pada
abdomen (Juliantina 2008) Infeksi yang disebabkan E coli dapat dihambat
pertumbuhannya dengan pemberian antibiotik
httplibunimusacid
iv
Menurut penelitian (Martha amp Tejasari 2014) saat ini diketahui banyak
resistensi E coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik seperti antibiotik
ampisilin 100 siprofloksasin 7419 kloramphenikol 2903 dan gentamisin
3226 hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik
Selain itu bakteri gram negatif seperti E coli menghasilkan plasmid yang dapat
memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat
menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al 2010)
Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik
dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan
kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga
berubah sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E coli isolat air sumur
gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E coli
12 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan
bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid
Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
13 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai
antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
3 Bapak Suhari Ibu Sumiyati dan keluarga tercinta yang telah memberikan
doa dukungan moral dan material
Penulis menyadari masih banyak ketidak sempurnaan dan kekurangan
dalam penulisan tugas akhir ini Penulis mengharapkan kritik dan saran yang
membangun Semoga proposal penelitian ini dapat bermanfaat bagi para
pembaca Amin
Wassalammuarsquolaikum warohmatullahi wabarokatuh
Semarang September 2016
Erla Farikatun Nisa
G1C012017
httplibunimusacid
iv
DAFTAR ISIHalaman
HALAMAN JUDUL iHALAMAN PERSETUJUAN iiHALAMAN PENGESAHAN iiiABSTRAK ivSURAT PERNYATAAN ORIGINALITAS viKATA PENGANTARviiDAFTAR ISI ixDAFTAR TABEL xiDAFTAR GAMBARxiiDAFTAR LAMPIRAN xiiBAB I PENDAHULUAN 1
11 Latar Belakang 112 Rumusan Masalah 313 Tujuan Penelitian 414 Manfaat Penelitian 415 Orisinalitas Penelitian 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 621 Sumur Gali disekitar Limbah Tepung Tapioka Kabupaten Pati 622 Escherichia coli 7221 Morfologi Escherichia coli 8222 Patogenitas Escherichia coli 923 Uji Sensitivitas Bakteri 1024 Resistensi Escherichia coli Terhadap Antibiotik1125 DNA Plasmid 1226 Elektroforesis Gel Agarosa 1327 Kerangka Teori 15
BAB III METODE PENELITIAN 1631 Desain Penelitian 1632 Variabel Penelitian1633 Definisi Operasional 1634 Populasi dan Sampel Penelitian 1635 Alat dan Bahan17351 Alat 17352 Bahan 1736 Cara Kerja 17361 Uji Sensitivitas Bakteri 17362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli18363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli 1937 Alur Penelitian 2038 Teknik Pengumpulan Data2039 Pengolahan Data dan Analisis Data 20310 Waktu dan Tempat Penelitian 213101 Tempat Penelitian 21
httplibunimusacid
iv
3102 Waktu Penelitian 21311 Skema Uji Sensitivitas 22312 Skema Isolasi DNA Plasmid23313 Skema Separasi DNA Plasmid25
BAB IV PEMBAHASAN2641 Hasil Penelitian 26411 Hasil Uji Sensitivitas26412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid E coli 2742 Pembahasan28
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 3351 Kesimpulan 3352 Saran 33
DAFTAR PUSTAKALAMPIRAN
httplibunimusacid
iv
DAFTAR TABEL
HalamanTabel 1 Orisinalitas Penelitian 5Tabel 2 Standart Hasil Uji Sensitivitas 10Tabel 3 Definisi Operasional 26Tabel 4 Hasil Uji Sensitivitas E coli terhadap Antibiotik 28
httplibunimusacid
iv
DAFTAR GAMBAR
Nomor HalamanGambar 1 Gambar Plasmid Pada Sel Bakteri 12Gambar 2 Skema Kerangka Teori 15Gambar 3 Alur Penelitian 20Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas 22Gambar 5 Skema Isolasi DNA Plasmid 23Gambar 6 Skema Separasi DNA Plasmid 25Gambar 7 Hasil Elektroforesis Agarosa DNA Plasmid 27
httplibunimusacid
iv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran HalamanLampiran 1 Pembuatan Media 38Lampiran 2 Gambar Penelitian 41
httplibunimusacid
iv
BAB I
PENDAHULUAN
11 Latar Belakang
Air merupakan kebutuhan pokok yang tidak dapat dipisahkan dalam
kehidupan manusia Air dimanfaatkan manusia untuk kebutuhan hidup salah
satunya kebutuhan rumah tangga dan industri Penyediaan air bersih sekarang ini
menjadi prioritas dalam perbaikan derajat kesehatan masyarakat Seiring
meningkatnya kepadatan penduduk dan pesatnya pembangunan maka kebutuhan
air pun semakin meningkat sehingga dituntut tersedianya air yang sehat yang
meliputi pengawasan dan penetapan kualitas air untuk berbagai kebutuhan dan
kehidupan manusia yang bertujuan untuk menjamin tercapainya air minum
maupun air bersih yang memenuhi syarat kesehatan bagi masyarakat (Alwi amp
Maulina 2012) Masih banyak masyarakat yang memanfaatkan air sumur gali
untuk kebutuhan hidupnya yang masih belum jelas kualitasnya untuk
mengetahui kualitas air perlu dilakukan pemeriksaan berdasarkan sifat fisika
kimia maupun biologi
Adanya bakteri Coliform dalam air merupakan salah satu indikator
mikrobiologi yang dapat menentukan kualitas air Coliform merupakan bakteri
yang terkandung dalam jumlah banyak pada kotoran manusia dan hewan (Fadilah
et al 2014) Menurut Peraturan Menteri Kesehatan
No492MENKESPerIV2010 dan No907MENKESSKVII2002 Syarat
kualitas air bersih yang dapat digunakan sehari-hari memiliki standar maksimum
total bakteri Coliform yaitu 0 AMP100 mL air sehingga adanya Coliform dalam
httplibunimusacid
iv
air menunjukkan bahwa air tersebut sudah tercemar Bakteri Coliform tidak dapat
menimbulkan penyakit tertentu secara langsung tetapi semakin tinggi
kontaminasi bakteri ini maka resiko adanya bakteri lain yang dapat menimbulkan
gangguan kesehatan semakin tinggi (Alwi amp Maulina 2012)
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati terdapat pabrik
tepung tapioka yang banyak menghasilkan limbah salah satunya limbah cair yang
dialirkan ke sungai dan pemukiman penduduk Kandungan dari limbah cair yang
merupakan proses dari produksi pembuatan tepung tapioka tersebut adalah bahan
organik yang meliputi karbohidrat lemak serat dan protein (Robby et al 2013)
Kandungan limbah cair tersebut merupakan nutrient bagi bakteri yang dapat
menyebabkan suburnya pertumbuhan bakteri antara lain Coliform kemungkinan
adanya Coliform dalam air dapat ditemukan di sumber air yang dipakai untuk
keperluan rumah tangga seperti sumur gali atau sungai yang ada disekitar limbah
tersebut (Munfiah et al 2013)
Salah satu bakteri dari kelompok Coliform adalah Escherichia coli (E
coli) E coli merupakan anggota dari famili Enterobactericeae yang berbentuk
batang bersifat gram negatif dan dalam keadaan normal berada di usus manusia
Ecoli menjadi patogen jika mencapai jaringan di luar habitat normalnnya
(Winarno 2008) Manusia dapat terinfeksi E coli karena makan dan minum yang
terkontaminasi bakteri tersebut sehingga dapat menyebabkan diare dan kram pada
abdomen (Juliantina 2008) Infeksi yang disebabkan E coli dapat dihambat
pertumbuhannya dengan pemberian antibiotik
httplibunimusacid
iv
Menurut penelitian (Martha amp Tejasari 2014) saat ini diketahui banyak
resistensi E coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik seperti antibiotik
ampisilin 100 siprofloksasin 7419 kloramphenikol 2903 dan gentamisin
3226 hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik
Selain itu bakteri gram negatif seperti E coli menghasilkan plasmid yang dapat
memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat
menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al 2010)
Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik
dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan
kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga
berubah sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E coli isolat air sumur
gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E coli
12 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan
bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid
Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
13 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai
antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
DAFTAR ISIHalaman
HALAMAN JUDUL iHALAMAN PERSETUJUAN iiHALAMAN PENGESAHAN iiiABSTRAK ivSURAT PERNYATAAN ORIGINALITAS viKATA PENGANTARviiDAFTAR ISI ixDAFTAR TABEL xiDAFTAR GAMBARxiiDAFTAR LAMPIRAN xiiBAB I PENDAHULUAN 1
11 Latar Belakang 112 Rumusan Masalah 313 Tujuan Penelitian 414 Manfaat Penelitian 415 Orisinalitas Penelitian 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 621 Sumur Gali disekitar Limbah Tepung Tapioka Kabupaten Pati 622 Escherichia coli 7221 Morfologi Escherichia coli 8222 Patogenitas Escherichia coli 923 Uji Sensitivitas Bakteri 1024 Resistensi Escherichia coli Terhadap Antibiotik1125 DNA Plasmid 1226 Elektroforesis Gel Agarosa 1327 Kerangka Teori 15
BAB III METODE PENELITIAN 1631 Desain Penelitian 1632 Variabel Penelitian1633 Definisi Operasional 1634 Populasi dan Sampel Penelitian 1635 Alat dan Bahan17351 Alat 17352 Bahan 1736 Cara Kerja 17361 Uji Sensitivitas Bakteri 17362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli18363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli 1937 Alur Penelitian 2038 Teknik Pengumpulan Data2039 Pengolahan Data dan Analisis Data 20310 Waktu dan Tempat Penelitian 213101 Tempat Penelitian 21
httplibunimusacid
iv
3102 Waktu Penelitian 21311 Skema Uji Sensitivitas 22312 Skema Isolasi DNA Plasmid23313 Skema Separasi DNA Plasmid25
BAB IV PEMBAHASAN2641 Hasil Penelitian 26411 Hasil Uji Sensitivitas26412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid E coli 2742 Pembahasan28
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 3351 Kesimpulan 3352 Saran 33
DAFTAR PUSTAKALAMPIRAN
httplibunimusacid
iv
DAFTAR TABEL
HalamanTabel 1 Orisinalitas Penelitian 5Tabel 2 Standart Hasil Uji Sensitivitas 10Tabel 3 Definisi Operasional 26Tabel 4 Hasil Uji Sensitivitas E coli terhadap Antibiotik 28
httplibunimusacid
iv
DAFTAR GAMBAR
Nomor HalamanGambar 1 Gambar Plasmid Pada Sel Bakteri 12Gambar 2 Skema Kerangka Teori 15Gambar 3 Alur Penelitian 20Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas 22Gambar 5 Skema Isolasi DNA Plasmid 23Gambar 6 Skema Separasi DNA Plasmid 25Gambar 7 Hasil Elektroforesis Agarosa DNA Plasmid 27
httplibunimusacid
iv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran HalamanLampiran 1 Pembuatan Media 38Lampiran 2 Gambar Penelitian 41
httplibunimusacid
iv
BAB I
PENDAHULUAN
11 Latar Belakang
Air merupakan kebutuhan pokok yang tidak dapat dipisahkan dalam
kehidupan manusia Air dimanfaatkan manusia untuk kebutuhan hidup salah
satunya kebutuhan rumah tangga dan industri Penyediaan air bersih sekarang ini
menjadi prioritas dalam perbaikan derajat kesehatan masyarakat Seiring
meningkatnya kepadatan penduduk dan pesatnya pembangunan maka kebutuhan
air pun semakin meningkat sehingga dituntut tersedianya air yang sehat yang
meliputi pengawasan dan penetapan kualitas air untuk berbagai kebutuhan dan
kehidupan manusia yang bertujuan untuk menjamin tercapainya air minum
maupun air bersih yang memenuhi syarat kesehatan bagi masyarakat (Alwi amp
Maulina 2012) Masih banyak masyarakat yang memanfaatkan air sumur gali
untuk kebutuhan hidupnya yang masih belum jelas kualitasnya untuk
mengetahui kualitas air perlu dilakukan pemeriksaan berdasarkan sifat fisika
kimia maupun biologi
Adanya bakteri Coliform dalam air merupakan salah satu indikator
mikrobiologi yang dapat menentukan kualitas air Coliform merupakan bakteri
yang terkandung dalam jumlah banyak pada kotoran manusia dan hewan (Fadilah
et al 2014) Menurut Peraturan Menteri Kesehatan
No492MENKESPerIV2010 dan No907MENKESSKVII2002 Syarat
kualitas air bersih yang dapat digunakan sehari-hari memiliki standar maksimum
total bakteri Coliform yaitu 0 AMP100 mL air sehingga adanya Coliform dalam
httplibunimusacid
iv
air menunjukkan bahwa air tersebut sudah tercemar Bakteri Coliform tidak dapat
menimbulkan penyakit tertentu secara langsung tetapi semakin tinggi
kontaminasi bakteri ini maka resiko adanya bakteri lain yang dapat menimbulkan
gangguan kesehatan semakin tinggi (Alwi amp Maulina 2012)
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati terdapat pabrik
tepung tapioka yang banyak menghasilkan limbah salah satunya limbah cair yang
dialirkan ke sungai dan pemukiman penduduk Kandungan dari limbah cair yang
merupakan proses dari produksi pembuatan tepung tapioka tersebut adalah bahan
organik yang meliputi karbohidrat lemak serat dan protein (Robby et al 2013)
Kandungan limbah cair tersebut merupakan nutrient bagi bakteri yang dapat
menyebabkan suburnya pertumbuhan bakteri antara lain Coliform kemungkinan
adanya Coliform dalam air dapat ditemukan di sumber air yang dipakai untuk
keperluan rumah tangga seperti sumur gali atau sungai yang ada disekitar limbah
tersebut (Munfiah et al 2013)
Salah satu bakteri dari kelompok Coliform adalah Escherichia coli (E
coli) E coli merupakan anggota dari famili Enterobactericeae yang berbentuk
batang bersifat gram negatif dan dalam keadaan normal berada di usus manusia
Ecoli menjadi patogen jika mencapai jaringan di luar habitat normalnnya
(Winarno 2008) Manusia dapat terinfeksi E coli karena makan dan minum yang
terkontaminasi bakteri tersebut sehingga dapat menyebabkan diare dan kram pada
abdomen (Juliantina 2008) Infeksi yang disebabkan E coli dapat dihambat
pertumbuhannya dengan pemberian antibiotik
httplibunimusacid
iv
Menurut penelitian (Martha amp Tejasari 2014) saat ini diketahui banyak
resistensi E coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik seperti antibiotik
ampisilin 100 siprofloksasin 7419 kloramphenikol 2903 dan gentamisin
3226 hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik
Selain itu bakteri gram negatif seperti E coli menghasilkan plasmid yang dapat
memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat
menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al 2010)
Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik
dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan
kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga
berubah sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E coli isolat air sumur
gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E coli
12 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan
bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid
Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
13 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai
antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
3102 Waktu Penelitian 21311 Skema Uji Sensitivitas 22312 Skema Isolasi DNA Plasmid23313 Skema Separasi DNA Plasmid25
BAB IV PEMBAHASAN2641 Hasil Penelitian 26411 Hasil Uji Sensitivitas26412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid E coli 2742 Pembahasan28
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 3351 Kesimpulan 3352 Saran 33
DAFTAR PUSTAKALAMPIRAN
httplibunimusacid
iv
DAFTAR TABEL
HalamanTabel 1 Orisinalitas Penelitian 5Tabel 2 Standart Hasil Uji Sensitivitas 10Tabel 3 Definisi Operasional 26Tabel 4 Hasil Uji Sensitivitas E coli terhadap Antibiotik 28
httplibunimusacid
iv
DAFTAR GAMBAR
Nomor HalamanGambar 1 Gambar Plasmid Pada Sel Bakteri 12Gambar 2 Skema Kerangka Teori 15Gambar 3 Alur Penelitian 20Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas 22Gambar 5 Skema Isolasi DNA Plasmid 23Gambar 6 Skema Separasi DNA Plasmid 25Gambar 7 Hasil Elektroforesis Agarosa DNA Plasmid 27
httplibunimusacid
iv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran HalamanLampiran 1 Pembuatan Media 38Lampiran 2 Gambar Penelitian 41
httplibunimusacid
iv
BAB I
PENDAHULUAN
11 Latar Belakang
Air merupakan kebutuhan pokok yang tidak dapat dipisahkan dalam
kehidupan manusia Air dimanfaatkan manusia untuk kebutuhan hidup salah
satunya kebutuhan rumah tangga dan industri Penyediaan air bersih sekarang ini
menjadi prioritas dalam perbaikan derajat kesehatan masyarakat Seiring
meningkatnya kepadatan penduduk dan pesatnya pembangunan maka kebutuhan
air pun semakin meningkat sehingga dituntut tersedianya air yang sehat yang
meliputi pengawasan dan penetapan kualitas air untuk berbagai kebutuhan dan
kehidupan manusia yang bertujuan untuk menjamin tercapainya air minum
maupun air bersih yang memenuhi syarat kesehatan bagi masyarakat (Alwi amp
Maulina 2012) Masih banyak masyarakat yang memanfaatkan air sumur gali
untuk kebutuhan hidupnya yang masih belum jelas kualitasnya untuk
mengetahui kualitas air perlu dilakukan pemeriksaan berdasarkan sifat fisika
kimia maupun biologi
Adanya bakteri Coliform dalam air merupakan salah satu indikator
mikrobiologi yang dapat menentukan kualitas air Coliform merupakan bakteri
yang terkandung dalam jumlah banyak pada kotoran manusia dan hewan (Fadilah
et al 2014) Menurut Peraturan Menteri Kesehatan
No492MENKESPerIV2010 dan No907MENKESSKVII2002 Syarat
kualitas air bersih yang dapat digunakan sehari-hari memiliki standar maksimum
total bakteri Coliform yaitu 0 AMP100 mL air sehingga adanya Coliform dalam
httplibunimusacid
iv
air menunjukkan bahwa air tersebut sudah tercemar Bakteri Coliform tidak dapat
menimbulkan penyakit tertentu secara langsung tetapi semakin tinggi
kontaminasi bakteri ini maka resiko adanya bakteri lain yang dapat menimbulkan
gangguan kesehatan semakin tinggi (Alwi amp Maulina 2012)
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati terdapat pabrik
tepung tapioka yang banyak menghasilkan limbah salah satunya limbah cair yang
dialirkan ke sungai dan pemukiman penduduk Kandungan dari limbah cair yang
merupakan proses dari produksi pembuatan tepung tapioka tersebut adalah bahan
organik yang meliputi karbohidrat lemak serat dan protein (Robby et al 2013)
Kandungan limbah cair tersebut merupakan nutrient bagi bakteri yang dapat
menyebabkan suburnya pertumbuhan bakteri antara lain Coliform kemungkinan
adanya Coliform dalam air dapat ditemukan di sumber air yang dipakai untuk
keperluan rumah tangga seperti sumur gali atau sungai yang ada disekitar limbah
tersebut (Munfiah et al 2013)
Salah satu bakteri dari kelompok Coliform adalah Escherichia coli (E
coli) E coli merupakan anggota dari famili Enterobactericeae yang berbentuk
batang bersifat gram negatif dan dalam keadaan normal berada di usus manusia
Ecoli menjadi patogen jika mencapai jaringan di luar habitat normalnnya
(Winarno 2008) Manusia dapat terinfeksi E coli karena makan dan minum yang
terkontaminasi bakteri tersebut sehingga dapat menyebabkan diare dan kram pada
abdomen (Juliantina 2008) Infeksi yang disebabkan E coli dapat dihambat
pertumbuhannya dengan pemberian antibiotik
httplibunimusacid
iv
Menurut penelitian (Martha amp Tejasari 2014) saat ini diketahui banyak
resistensi E coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik seperti antibiotik
ampisilin 100 siprofloksasin 7419 kloramphenikol 2903 dan gentamisin
3226 hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik
Selain itu bakteri gram negatif seperti E coli menghasilkan plasmid yang dapat
memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat
menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al 2010)
Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik
dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan
kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga
berubah sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E coli isolat air sumur
gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E coli
12 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan
bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid
Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
13 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai
antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
DAFTAR TABEL
HalamanTabel 1 Orisinalitas Penelitian 5Tabel 2 Standart Hasil Uji Sensitivitas 10Tabel 3 Definisi Operasional 26Tabel 4 Hasil Uji Sensitivitas E coli terhadap Antibiotik 28
httplibunimusacid
iv
DAFTAR GAMBAR
Nomor HalamanGambar 1 Gambar Plasmid Pada Sel Bakteri 12Gambar 2 Skema Kerangka Teori 15Gambar 3 Alur Penelitian 20Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas 22Gambar 5 Skema Isolasi DNA Plasmid 23Gambar 6 Skema Separasi DNA Plasmid 25Gambar 7 Hasil Elektroforesis Agarosa DNA Plasmid 27
httplibunimusacid
iv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran HalamanLampiran 1 Pembuatan Media 38Lampiran 2 Gambar Penelitian 41
httplibunimusacid
iv
BAB I
PENDAHULUAN
11 Latar Belakang
Air merupakan kebutuhan pokok yang tidak dapat dipisahkan dalam
kehidupan manusia Air dimanfaatkan manusia untuk kebutuhan hidup salah
satunya kebutuhan rumah tangga dan industri Penyediaan air bersih sekarang ini
menjadi prioritas dalam perbaikan derajat kesehatan masyarakat Seiring
meningkatnya kepadatan penduduk dan pesatnya pembangunan maka kebutuhan
air pun semakin meningkat sehingga dituntut tersedianya air yang sehat yang
meliputi pengawasan dan penetapan kualitas air untuk berbagai kebutuhan dan
kehidupan manusia yang bertujuan untuk menjamin tercapainya air minum
maupun air bersih yang memenuhi syarat kesehatan bagi masyarakat (Alwi amp
Maulina 2012) Masih banyak masyarakat yang memanfaatkan air sumur gali
untuk kebutuhan hidupnya yang masih belum jelas kualitasnya untuk
mengetahui kualitas air perlu dilakukan pemeriksaan berdasarkan sifat fisika
kimia maupun biologi
Adanya bakteri Coliform dalam air merupakan salah satu indikator
mikrobiologi yang dapat menentukan kualitas air Coliform merupakan bakteri
yang terkandung dalam jumlah banyak pada kotoran manusia dan hewan (Fadilah
et al 2014) Menurut Peraturan Menteri Kesehatan
No492MENKESPerIV2010 dan No907MENKESSKVII2002 Syarat
kualitas air bersih yang dapat digunakan sehari-hari memiliki standar maksimum
total bakteri Coliform yaitu 0 AMP100 mL air sehingga adanya Coliform dalam
httplibunimusacid
iv
air menunjukkan bahwa air tersebut sudah tercemar Bakteri Coliform tidak dapat
menimbulkan penyakit tertentu secara langsung tetapi semakin tinggi
kontaminasi bakteri ini maka resiko adanya bakteri lain yang dapat menimbulkan
gangguan kesehatan semakin tinggi (Alwi amp Maulina 2012)
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati terdapat pabrik
tepung tapioka yang banyak menghasilkan limbah salah satunya limbah cair yang
dialirkan ke sungai dan pemukiman penduduk Kandungan dari limbah cair yang
merupakan proses dari produksi pembuatan tepung tapioka tersebut adalah bahan
organik yang meliputi karbohidrat lemak serat dan protein (Robby et al 2013)
Kandungan limbah cair tersebut merupakan nutrient bagi bakteri yang dapat
menyebabkan suburnya pertumbuhan bakteri antara lain Coliform kemungkinan
adanya Coliform dalam air dapat ditemukan di sumber air yang dipakai untuk
keperluan rumah tangga seperti sumur gali atau sungai yang ada disekitar limbah
tersebut (Munfiah et al 2013)
Salah satu bakteri dari kelompok Coliform adalah Escherichia coli (E
coli) E coli merupakan anggota dari famili Enterobactericeae yang berbentuk
batang bersifat gram negatif dan dalam keadaan normal berada di usus manusia
Ecoli menjadi patogen jika mencapai jaringan di luar habitat normalnnya
(Winarno 2008) Manusia dapat terinfeksi E coli karena makan dan minum yang
terkontaminasi bakteri tersebut sehingga dapat menyebabkan diare dan kram pada
abdomen (Juliantina 2008) Infeksi yang disebabkan E coli dapat dihambat
pertumbuhannya dengan pemberian antibiotik
httplibunimusacid
iv
Menurut penelitian (Martha amp Tejasari 2014) saat ini diketahui banyak
resistensi E coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik seperti antibiotik
ampisilin 100 siprofloksasin 7419 kloramphenikol 2903 dan gentamisin
3226 hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik
Selain itu bakteri gram negatif seperti E coli menghasilkan plasmid yang dapat
memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat
menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al 2010)
Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik
dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan
kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga
berubah sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E coli isolat air sumur
gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E coli
12 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan
bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid
Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
13 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai
antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
DAFTAR GAMBAR
Nomor HalamanGambar 1 Gambar Plasmid Pada Sel Bakteri 12Gambar 2 Skema Kerangka Teori 15Gambar 3 Alur Penelitian 20Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas 22Gambar 5 Skema Isolasi DNA Plasmid 23Gambar 6 Skema Separasi DNA Plasmid 25Gambar 7 Hasil Elektroforesis Agarosa DNA Plasmid 27
httplibunimusacid
iv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran HalamanLampiran 1 Pembuatan Media 38Lampiran 2 Gambar Penelitian 41
httplibunimusacid
iv
BAB I
PENDAHULUAN
11 Latar Belakang
Air merupakan kebutuhan pokok yang tidak dapat dipisahkan dalam
kehidupan manusia Air dimanfaatkan manusia untuk kebutuhan hidup salah
satunya kebutuhan rumah tangga dan industri Penyediaan air bersih sekarang ini
menjadi prioritas dalam perbaikan derajat kesehatan masyarakat Seiring
meningkatnya kepadatan penduduk dan pesatnya pembangunan maka kebutuhan
air pun semakin meningkat sehingga dituntut tersedianya air yang sehat yang
meliputi pengawasan dan penetapan kualitas air untuk berbagai kebutuhan dan
kehidupan manusia yang bertujuan untuk menjamin tercapainya air minum
maupun air bersih yang memenuhi syarat kesehatan bagi masyarakat (Alwi amp
Maulina 2012) Masih banyak masyarakat yang memanfaatkan air sumur gali
untuk kebutuhan hidupnya yang masih belum jelas kualitasnya untuk
mengetahui kualitas air perlu dilakukan pemeriksaan berdasarkan sifat fisika
kimia maupun biologi
Adanya bakteri Coliform dalam air merupakan salah satu indikator
mikrobiologi yang dapat menentukan kualitas air Coliform merupakan bakteri
yang terkandung dalam jumlah banyak pada kotoran manusia dan hewan (Fadilah
et al 2014) Menurut Peraturan Menteri Kesehatan
No492MENKESPerIV2010 dan No907MENKESSKVII2002 Syarat
kualitas air bersih yang dapat digunakan sehari-hari memiliki standar maksimum
total bakteri Coliform yaitu 0 AMP100 mL air sehingga adanya Coliform dalam
httplibunimusacid
iv
air menunjukkan bahwa air tersebut sudah tercemar Bakteri Coliform tidak dapat
menimbulkan penyakit tertentu secara langsung tetapi semakin tinggi
kontaminasi bakteri ini maka resiko adanya bakteri lain yang dapat menimbulkan
gangguan kesehatan semakin tinggi (Alwi amp Maulina 2012)
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati terdapat pabrik
tepung tapioka yang banyak menghasilkan limbah salah satunya limbah cair yang
dialirkan ke sungai dan pemukiman penduduk Kandungan dari limbah cair yang
merupakan proses dari produksi pembuatan tepung tapioka tersebut adalah bahan
organik yang meliputi karbohidrat lemak serat dan protein (Robby et al 2013)
Kandungan limbah cair tersebut merupakan nutrient bagi bakteri yang dapat
menyebabkan suburnya pertumbuhan bakteri antara lain Coliform kemungkinan
adanya Coliform dalam air dapat ditemukan di sumber air yang dipakai untuk
keperluan rumah tangga seperti sumur gali atau sungai yang ada disekitar limbah
tersebut (Munfiah et al 2013)
Salah satu bakteri dari kelompok Coliform adalah Escherichia coli (E
coli) E coli merupakan anggota dari famili Enterobactericeae yang berbentuk
batang bersifat gram negatif dan dalam keadaan normal berada di usus manusia
Ecoli menjadi patogen jika mencapai jaringan di luar habitat normalnnya
(Winarno 2008) Manusia dapat terinfeksi E coli karena makan dan minum yang
terkontaminasi bakteri tersebut sehingga dapat menyebabkan diare dan kram pada
abdomen (Juliantina 2008) Infeksi yang disebabkan E coli dapat dihambat
pertumbuhannya dengan pemberian antibiotik
httplibunimusacid
iv
Menurut penelitian (Martha amp Tejasari 2014) saat ini diketahui banyak
resistensi E coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik seperti antibiotik
ampisilin 100 siprofloksasin 7419 kloramphenikol 2903 dan gentamisin
3226 hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik
Selain itu bakteri gram negatif seperti E coli menghasilkan plasmid yang dapat
memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat
menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al 2010)
Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik
dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan
kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga
berubah sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E coli isolat air sumur
gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E coli
12 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan
bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid
Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
13 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai
antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran HalamanLampiran 1 Pembuatan Media 38Lampiran 2 Gambar Penelitian 41
httplibunimusacid
iv
BAB I
PENDAHULUAN
11 Latar Belakang
Air merupakan kebutuhan pokok yang tidak dapat dipisahkan dalam
kehidupan manusia Air dimanfaatkan manusia untuk kebutuhan hidup salah
satunya kebutuhan rumah tangga dan industri Penyediaan air bersih sekarang ini
menjadi prioritas dalam perbaikan derajat kesehatan masyarakat Seiring
meningkatnya kepadatan penduduk dan pesatnya pembangunan maka kebutuhan
air pun semakin meningkat sehingga dituntut tersedianya air yang sehat yang
meliputi pengawasan dan penetapan kualitas air untuk berbagai kebutuhan dan
kehidupan manusia yang bertujuan untuk menjamin tercapainya air minum
maupun air bersih yang memenuhi syarat kesehatan bagi masyarakat (Alwi amp
Maulina 2012) Masih banyak masyarakat yang memanfaatkan air sumur gali
untuk kebutuhan hidupnya yang masih belum jelas kualitasnya untuk
mengetahui kualitas air perlu dilakukan pemeriksaan berdasarkan sifat fisika
kimia maupun biologi
Adanya bakteri Coliform dalam air merupakan salah satu indikator
mikrobiologi yang dapat menentukan kualitas air Coliform merupakan bakteri
yang terkandung dalam jumlah banyak pada kotoran manusia dan hewan (Fadilah
et al 2014) Menurut Peraturan Menteri Kesehatan
No492MENKESPerIV2010 dan No907MENKESSKVII2002 Syarat
kualitas air bersih yang dapat digunakan sehari-hari memiliki standar maksimum
total bakteri Coliform yaitu 0 AMP100 mL air sehingga adanya Coliform dalam
httplibunimusacid
iv
air menunjukkan bahwa air tersebut sudah tercemar Bakteri Coliform tidak dapat
menimbulkan penyakit tertentu secara langsung tetapi semakin tinggi
kontaminasi bakteri ini maka resiko adanya bakteri lain yang dapat menimbulkan
gangguan kesehatan semakin tinggi (Alwi amp Maulina 2012)
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati terdapat pabrik
tepung tapioka yang banyak menghasilkan limbah salah satunya limbah cair yang
dialirkan ke sungai dan pemukiman penduduk Kandungan dari limbah cair yang
merupakan proses dari produksi pembuatan tepung tapioka tersebut adalah bahan
organik yang meliputi karbohidrat lemak serat dan protein (Robby et al 2013)
Kandungan limbah cair tersebut merupakan nutrient bagi bakteri yang dapat
menyebabkan suburnya pertumbuhan bakteri antara lain Coliform kemungkinan
adanya Coliform dalam air dapat ditemukan di sumber air yang dipakai untuk
keperluan rumah tangga seperti sumur gali atau sungai yang ada disekitar limbah
tersebut (Munfiah et al 2013)
Salah satu bakteri dari kelompok Coliform adalah Escherichia coli (E
coli) E coli merupakan anggota dari famili Enterobactericeae yang berbentuk
batang bersifat gram negatif dan dalam keadaan normal berada di usus manusia
Ecoli menjadi patogen jika mencapai jaringan di luar habitat normalnnya
(Winarno 2008) Manusia dapat terinfeksi E coli karena makan dan minum yang
terkontaminasi bakteri tersebut sehingga dapat menyebabkan diare dan kram pada
abdomen (Juliantina 2008) Infeksi yang disebabkan E coli dapat dihambat
pertumbuhannya dengan pemberian antibiotik
httplibunimusacid
iv
Menurut penelitian (Martha amp Tejasari 2014) saat ini diketahui banyak
resistensi E coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik seperti antibiotik
ampisilin 100 siprofloksasin 7419 kloramphenikol 2903 dan gentamisin
3226 hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik
Selain itu bakteri gram negatif seperti E coli menghasilkan plasmid yang dapat
memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat
menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al 2010)
Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik
dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan
kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga
berubah sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E coli isolat air sumur
gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E coli
12 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan
bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid
Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
13 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai
antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
BAB I
PENDAHULUAN
11 Latar Belakang
Air merupakan kebutuhan pokok yang tidak dapat dipisahkan dalam
kehidupan manusia Air dimanfaatkan manusia untuk kebutuhan hidup salah
satunya kebutuhan rumah tangga dan industri Penyediaan air bersih sekarang ini
menjadi prioritas dalam perbaikan derajat kesehatan masyarakat Seiring
meningkatnya kepadatan penduduk dan pesatnya pembangunan maka kebutuhan
air pun semakin meningkat sehingga dituntut tersedianya air yang sehat yang
meliputi pengawasan dan penetapan kualitas air untuk berbagai kebutuhan dan
kehidupan manusia yang bertujuan untuk menjamin tercapainya air minum
maupun air bersih yang memenuhi syarat kesehatan bagi masyarakat (Alwi amp
Maulina 2012) Masih banyak masyarakat yang memanfaatkan air sumur gali
untuk kebutuhan hidupnya yang masih belum jelas kualitasnya untuk
mengetahui kualitas air perlu dilakukan pemeriksaan berdasarkan sifat fisika
kimia maupun biologi
Adanya bakteri Coliform dalam air merupakan salah satu indikator
mikrobiologi yang dapat menentukan kualitas air Coliform merupakan bakteri
yang terkandung dalam jumlah banyak pada kotoran manusia dan hewan (Fadilah
et al 2014) Menurut Peraturan Menteri Kesehatan
No492MENKESPerIV2010 dan No907MENKESSKVII2002 Syarat
kualitas air bersih yang dapat digunakan sehari-hari memiliki standar maksimum
total bakteri Coliform yaitu 0 AMP100 mL air sehingga adanya Coliform dalam
httplibunimusacid
iv
air menunjukkan bahwa air tersebut sudah tercemar Bakteri Coliform tidak dapat
menimbulkan penyakit tertentu secara langsung tetapi semakin tinggi
kontaminasi bakteri ini maka resiko adanya bakteri lain yang dapat menimbulkan
gangguan kesehatan semakin tinggi (Alwi amp Maulina 2012)
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati terdapat pabrik
tepung tapioka yang banyak menghasilkan limbah salah satunya limbah cair yang
dialirkan ke sungai dan pemukiman penduduk Kandungan dari limbah cair yang
merupakan proses dari produksi pembuatan tepung tapioka tersebut adalah bahan
organik yang meliputi karbohidrat lemak serat dan protein (Robby et al 2013)
Kandungan limbah cair tersebut merupakan nutrient bagi bakteri yang dapat
menyebabkan suburnya pertumbuhan bakteri antara lain Coliform kemungkinan
adanya Coliform dalam air dapat ditemukan di sumber air yang dipakai untuk
keperluan rumah tangga seperti sumur gali atau sungai yang ada disekitar limbah
tersebut (Munfiah et al 2013)
Salah satu bakteri dari kelompok Coliform adalah Escherichia coli (E
coli) E coli merupakan anggota dari famili Enterobactericeae yang berbentuk
batang bersifat gram negatif dan dalam keadaan normal berada di usus manusia
Ecoli menjadi patogen jika mencapai jaringan di luar habitat normalnnya
(Winarno 2008) Manusia dapat terinfeksi E coli karena makan dan minum yang
terkontaminasi bakteri tersebut sehingga dapat menyebabkan diare dan kram pada
abdomen (Juliantina 2008) Infeksi yang disebabkan E coli dapat dihambat
pertumbuhannya dengan pemberian antibiotik
httplibunimusacid
iv
Menurut penelitian (Martha amp Tejasari 2014) saat ini diketahui banyak
resistensi E coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik seperti antibiotik
ampisilin 100 siprofloksasin 7419 kloramphenikol 2903 dan gentamisin
3226 hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik
Selain itu bakteri gram negatif seperti E coli menghasilkan plasmid yang dapat
memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat
menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al 2010)
Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik
dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan
kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga
berubah sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E coli isolat air sumur
gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E coli
12 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan
bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid
Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
13 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai
antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
air menunjukkan bahwa air tersebut sudah tercemar Bakteri Coliform tidak dapat
menimbulkan penyakit tertentu secara langsung tetapi semakin tinggi
kontaminasi bakteri ini maka resiko adanya bakteri lain yang dapat menimbulkan
gangguan kesehatan semakin tinggi (Alwi amp Maulina 2012)
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati terdapat pabrik
tepung tapioka yang banyak menghasilkan limbah salah satunya limbah cair yang
dialirkan ke sungai dan pemukiman penduduk Kandungan dari limbah cair yang
merupakan proses dari produksi pembuatan tepung tapioka tersebut adalah bahan
organik yang meliputi karbohidrat lemak serat dan protein (Robby et al 2013)
Kandungan limbah cair tersebut merupakan nutrient bagi bakteri yang dapat
menyebabkan suburnya pertumbuhan bakteri antara lain Coliform kemungkinan
adanya Coliform dalam air dapat ditemukan di sumber air yang dipakai untuk
keperluan rumah tangga seperti sumur gali atau sungai yang ada disekitar limbah
tersebut (Munfiah et al 2013)
Salah satu bakteri dari kelompok Coliform adalah Escherichia coli (E
coli) E coli merupakan anggota dari famili Enterobactericeae yang berbentuk
batang bersifat gram negatif dan dalam keadaan normal berada di usus manusia
Ecoli menjadi patogen jika mencapai jaringan di luar habitat normalnnya
(Winarno 2008) Manusia dapat terinfeksi E coli karena makan dan minum yang
terkontaminasi bakteri tersebut sehingga dapat menyebabkan diare dan kram pada
abdomen (Juliantina 2008) Infeksi yang disebabkan E coli dapat dihambat
pertumbuhannya dengan pemberian antibiotik
httplibunimusacid
iv
Menurut penelitian (Martha amp Tejasari 2014) saat ini diketahui banyak
resistensi E coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik seperti antibiotik
ampisilin 100 siprofloksasin 7419 kloramphenikol 2903 dan gentamisin
3226 hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik
Selain itu bakteri gram negatif seperti E coli menghasilkan plasmid yang dapat
memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat
menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al 2010)
Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik
dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan
kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga
berubah sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E coli isolat air sumur
gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E coli
12 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan
bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid
Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
13 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai
antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
Menurut penelitian (Martha amp Tejasari 2014) saat ini diketahui banyak
resistensi E coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik seperti antibiotik
ampisilin 100 siprofloksasin 7419 kloramphenikol 2903 dan gentamisin
3226 hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik
Selain itu bakteri gram negatif seperti E coli menghasilkan plasmid yang dapat
memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat
menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al 2010)
Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik
dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan
kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga
berubah sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E coli isolat air sumur
gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E coli
12 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan
bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid
Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
13 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai
antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
14 Manfaat Penelitian
141 Bagi peneliti
Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang
biologi molekuler
142 Bagi Ilmu Pengetahuan
Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam
bidang biologi molekuler
httplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
15 Orisinilitas
Penelitian ndash penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji
sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat
pada tabel 1
No Namatahunjurnal
Judul Hasil
1 Fery Indradewi A2006
Deteksi DNA plasmidpada Lactobacillus spdengan metodeelektroforesis gel agarosa
Hasil pengujian menunjukkan bahwaLactobacillus sp tidak mengandungDNA plasmid kecuali Citrobacterfreundii yang dipakai kontrol jelasadanya band DNA plasmid
2 Michael HaryadiWibowoWidagdo SriNugrohoWidya Asmara2011 jurnal sainveteriner
Profil plasmidEscherichia coli resistsenterhadap beberapaantibiotika yang diisolasidari peternakan ayamkomersial
Hasil sensitivitas 8 isolat bakteriterhadap ketiga jenis antibiotik yaituampisilin streptomisin dan enrofloksasinmenunjukkan sifat resistenHasil DNA plasmid terhadap 8 isolat Ecoli yaitu isolat 16 dan 3 masing-masingmempunyai 2 jenis plasmid satu plasmidberukuran diantara 5148 bp sampaidengan 21226 bp dan plasmid lainberukuran 5148 bp isolat 2 teramatimemiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmidterletak pada posisi antara 5148 bpsampai dengan 21266 bp dan 5148 bpisolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2plasmid terletak diantara 5148 ndash 21266bp dan satu plasmid sedikit diatas 5148bp isolat 7 memiliki 2 plasmid yangterletak di 4973 bp dan 4268 bp isolat 5dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmidyang terletak pada 5148 bp
Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya
menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa Penelitian ini untuk mengetahui
sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada
bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka
httplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
21 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati
Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk
hidup di bumi Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa
lain jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama
kebutuhan air bersih (Rahayu amp Dwi 2010) Kebutuhan air bersih di indonesia
pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan air permukaan dan air tanah
(Chandra 2006) Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat
khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali Sumur gali
menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan
air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan
kedalaman tertentu
Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan
penghasil tepung tapioka untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa
Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri Hasil dari
kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair Limbah cair
yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran
sungai penduduk Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko
terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada
disekitar sungai (Munfiah et al 2013)
httplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan
menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al
2015) Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali
harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas
air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi
kesehatan Menurut (Agustiningsih et al 2012) adanya pemeriksaan kualitas air
bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau suhu warna rasa dan
kekeruhan) parameter kimia meliputi (pH klorida nitrit nitrat dan magnesium)
paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air)
Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada
tidaknya bakteri Coliform dalam air Bakteri Coliform merupakan indikator
pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang
terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan Salah satu bakteri yang
termasuk kedalam kelompok Coliform adalah Ecoli (Tururaja amp Mogea 2010)
22 Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif tumbuh baik
hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan
untuk isolasi bakteri enterik pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada
media yang mengandung pepton (Jawetz 2007) Pada media Mac Conkey (MC)
menghasilkan koloni berwarna merah muda karena mampu memfermentasi
laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan
warna hijau metalik (Iswara 2015) Karakteristik taksonomi E coli dalam buku
httplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut (Brinner et al
1932)
Domain Bacteria
Kingdom Bacteria
Phylum Proteobacteria
Class Gamma proteobacteria
Order Enterobacteriales
Family Enterobacteriaceae
Genus Escherichia
Species Escherichia coli
221 Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif motil atau non
motil tidak berspora dengan ukuran 04 - 10 μm x 13 μm koloni berbentuk
bulat cembung halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia 2008)
Bakteri E coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat
ditemukan diusus besar (Jawetz 2007) Bakteri E coli disebut sebagai bakteri
oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain
diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia
Bakteri E coli bergerak menggunakan flagel peritrik Morfologi kapsula
atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida Kadang-kadang mukoid
memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas
antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh
banyak E coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz 2005)
httplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
Bakteri E coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang
berbeda banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen antara lain
filamentus proteinaceus seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi
jumlah Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh
panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi Hal itu merupakan faktor virulensi
yang penting (Brooks 2007)
222 Patogenitas Escherichia coli
Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat
menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya sehingga
menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal seperti saluran
air kemih saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada
tempat tersebut (Winarno 2008)
Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih
(ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan
pada sel epitel hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam
gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada
saluran kemih (ISK) Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit
lain yaitu sepsis (Jawetz 2005) Pemberian antiobiotik merupakan cara
pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri seringnya
penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya
uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik
httplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
23 Uji sensitivitas bakteri
Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat
kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui
daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo 2009)
Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh
mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik Senyawa
yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan
organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al 2013)
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode
Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method)
dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik Hasil uji sensitivitas
bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI)
yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2 Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol gentamisinampisilin dan siprofloksasin
Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif
Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 ndash 17 18
Gentamisin (CN 10 ) 12 13 ndash 14 15
Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 ndash 16 17
Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 ndash 20 21
Hasil dari uji sensitivitas bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan
adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
24 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik
Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih
menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat untuk pengobatan
biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana 2004)
Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap
antibiotik tersebut Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik
(ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik
generasi pertama karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen
yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik Bakteri yang resisten
terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance)
[Darmawati et al 2015]
Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik
generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas
yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif
(Warganegara ampApriliana 2014) Namun demikin pemberiaan antibiotik secara
berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun
namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau
kromosom DNA Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai
kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny amp
Herwana 2007)
Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi
gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase Jadi resistensi
bakteri terhadap antibiotik ampisilin kotrimoksasol kloramfenikol dan
httplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid
sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga
dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al 2015)
25 DNA Plasmid
Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik
berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang
terletak di daerah inti Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal yaitu plasmid Plasmid merupakan molekul DNA yang
melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom
Plasmid dianggap baik berukuran kecil sebagai bahan genetik tambahan dapat
melakukan replikasi sendiri secara otonom terkadang dapat bersatu dengan
kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke
spesies lain (Fery 2006)
Gambar 1 Plasmid didalam sel bakteri [httpwwwthefullwikiorgplasmid]
Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh
unsur yang bersifat genetik seperti plasmid Gen pada plasmid untuk resistensi
httplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak
antibiotik Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya
memberikan sifat-sifat baru pada inang Pada umumnya plasmid tersebut dinamai
sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi plasmid virulensi plasmid
degradatif seks plasmid dan kol- plasmid (Michael 2011) Sel bakteri dapat
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid Plasmid
mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 ndash 300 kb untuk mengetahui ukuran dari
plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan
Simmons 2003)
26 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam
suatu medan listrik Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan bentuk dan ukuran molekul Elektroforesis digunakan
untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti
2011)
Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA
dan RNA menurut muatan ukuran dan bentuk Metode ini merupakan suatu
teknik yang sederhana cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya Saat arus listrik diaplikasikan pada gel
molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub
positif (anoda) Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat
httplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel
(Fatchiyah 2011)
Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan bentuk molekul DNA konsentrasi agarosa arus listrik dan suhu
Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur
fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah 2011) Etidhium bromid akan
menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA Penggunaan Etidhium bromid
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan
memendarkan sinar ultraviolet jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah
akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo 2005) Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker)
httplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
27 Kerangka Teori
Gambar 2 Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
Antibiotik
SensitivitasDNA plasmid
Patogenitas
Profil plasmid E coli
Air sumur gali
Escherichia coli
Elektroforesis gel agarosa
Resistensi
httplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
BAB III
METODE PENELITIAN
31 Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif
32 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah sensitivitas E coli terhadap antibiotik dan
profil DNA plasmid E coli
33 Definisi Operasional
Tabel 3 Definisi Operasional
Subjek Penelitian DefinisiSensitivitas antibiotik Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotikdan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalammembunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitardisk antibiotik
Profil Plasmid E coli Profil plasmid E coli adalah profil sub-sub unit plasmidyang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan caraElektroforesis Gel Agarosa
34 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak
Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka Sampel yang
diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak Spesimen dari penelitian ini
adalah 10 strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
httplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
35 Alat dan Bahan
351 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis
power supplay vortex waterbath (Memmert) sentrifuge (Hettich) microwave
(Electrolux) UV Transiluminator jangka sorong
352 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E coli media
Muller Hinton Agar (MHA OXOID) Disk antibiotik (kloramfenikol
siprofloksasin gentamisin ampisilin) Lysing solution I (Glukosa EDTA Tris)
Lysing solution II (NaOH SDS) Lysing solution III (Kalium asetat Asam
asetat) TAE (Tris Acetid Acid EDTA) Ethanol 70 Ethanol absolute RNAse
Agarosa dH2O steril Ethidium bromid (EtBr) loading buffer
36 Cara Kerja
361 Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 10 strain E coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten
Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby
Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA) Dibuat suspensi dengan cara satu
koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair diinkubasi dengan suhu
37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar
McFarland 05 Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media
MHA secara merata dengan menggunakan triangle tunggu selama 5 - 10 menit
supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar lalu letakkan disk antibiotik pada
permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas
httplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 ndash 24 jam Diamati penghambatan
pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan
menggunakan jangka sorong
362 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi 5 ml media LB Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath
selama semalam setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan dibuang setelah itu dalam tabung
yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu
simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II
homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama
5 menit selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan
cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit kemudian di
sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Supernatan diambil lalu di
pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 11 lalu gojok
dengan shaker selama 15 menit kemudian di sentrifuge 12000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan
ditambahkan Ethanol absolut dingin 11 kemudian ditambahkan Na Asetat
sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Setelah itu disimpan dalam freezer
(-200C) selama 1 jam Selanjutnya sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama
10 menit pellet dicuci dengan ethanol 70 kemudian di sentrifuge 12000 rpm
pada suhu 40C selama 10 menit setelah itu pellet di keringkan anginkan plusmn selama
1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l setelah itu tambahkan 10 l
httplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam Kemudian cek DNA plasmid
dengan elektroforesis gel agarosa 15
363 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose
Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose
menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70
Setelah alat pencetak gel disiapkan gel agarose dibuat dengan ditimbang 15 gram
agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE kemudian larutan agarose
dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan
digoyang- goyang agar cepat larut) selanjutnya larutan agarose ditambah
Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose
di tuang ke dalam cetakan gel agarose dan pasang sisir diatas larutan agarose
Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir
diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al 2011)
Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya
Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke
dalam sumuran gel Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan
dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60
menit Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan
dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV)
httplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
37 Alur Penelitian
Gambar 3 Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil
plasmid E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati
38 Teknik Pengumpulan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil
penelitian disajikan dalam bentuk narasi
39 Pengolahan Data dan Analisis Data
Data diolah dan dianalisis secara deskriptif
Air sumur gali Desa Ngemplak
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol Gentamisin
Ampisilin Siprofloksasin) metode Kirby Bauer
Isolasi DNA plasmid E coli
Elektroforesis metode Gel Agarosa 15
Gambaran profil plasmid E coli
httplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
310 Tempat dan Waktu Penelitian
3101 Tempat Penelitian
Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E
coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta
3102 Waktu Penelitian
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan
bulan Juli 2016
httplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
311 Skema Uji Sensitivitas
Gambar 4 Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik
10 Strain E coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer
Ampisilin Kloramfenikol Siprofloksasi Gentamisin
Resisten Sensitif
httplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
312 Skema Isolasi DNA plasmid
Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB
Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam
Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15
Buang supernatan Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink dalam es 5 menit
Di tambah 200 l lysing solution II homogenkan ink dalam es 5 menit
Di tambah 150 l lysing solution III homogenkan ink dalam es 5 menit
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Ambil supernatan pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 11
homogenkan
Inkubasi 370C selama 48
Inkubasi 370C selama 48 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan ethanol absolut dingin 11
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Gojok dengan shaker selama 15 menit
Tambahkan Na Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi)
Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam
Pellet dicuci dengan ethanol 70
httplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
Gambar 5 Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli
Pellet dikering anginkan plusmn 1 jam kemudian pellet dilarutkan denganTE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l inkubasi selama 1 jam
Sentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit
Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa
httplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
313 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose
Gambar 6 Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli
Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol
Larutan Agarose (15 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai
larut sempurna menggunakan microwave
Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan tunggu sampai dingin
Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi
Angkat sisir secara perlahan lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam
Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran
Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 ndash 60 menit
Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
Gambaran profil plasmid Escherichia coli
httplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
41 Hasil Penelitian
411 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli
Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E coli dari isolat air sumur gali asal
DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol Siprofloksasin
Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4
Tabel4 Hasil ujisensitivitas bakteri E coli terhadap antibiotik kloramfenikolsiprofloksasin gentamisin dan ampisilin
Jenis Antibiotik
No KodeSampel
Kloramfenikol(C 30)
mm
Kepekaan Siprofloksasin(CIP 5)
Mm
Kepekaan Gentamisin(CN 10)
mm
Kepekaan Ampisilin(Amp 10)
mm
Kepekaan
1 SG02C 202 S 193 I 183 S 122 R
2 SG03C 212 S 242 S 134 I 12 R
3 SG04C 17 I 242 S 112 R 103 R
4 SG05B 194 S 253 S 13 I 0 R
5 SG07C 192 S 23 S 112 R 0 R
6 SG08C 163 I 244 S 104 R 2 R
7 SG09C 214 S 214 S 102 R 2 R
8 SG10C 183 S 162 I 132 I 0 R
9 SG11C 192 S 152 I 132 I 124 R
10 SG12C 173 I 304 S 154 S 122 R
Keterangan S sensitive I Intermediate R resistensi
Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E coli yang
diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat
jenis antibiotik yang digunakan yaitu kloramfenikol siprofloksasin gentamisin
dan ampisilin Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap
httplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin Empat strain resisten terhadap
antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin
412 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli
Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E coli setelah diseparasi
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 15 diamati dibawah sinar ultraviolet
menunjukkan hasil
Gambar 7 Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut ndash turut M =Marker 1) SG02C 2) SG03C 3) SG04C 4) SG05B 5) SG07C 6) SG08C 7)SG09C 8) SG10C 9) SG11C 10) SG12C
Gambar 7 diatas pada 10 strain E coliteramati bahwa masing ndash masing strain
mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran
yang berbeda ndash beda 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8000 bp
pada nomer 138 dan 10 sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran
5000 bp yang ditunjukkan pada nomer 24567 dan 9
42 Pembahasan
Hasil uji sensitivitas 10 strain E Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak
Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol siprofloksasin gentamisin dan
httplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E
coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet sedangkan pada antibiotik
gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan
intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E coli semua
menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin Dilihat dari hasil uji
sensitivitas tersebut hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al 2005)
yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E coli
terhadap berbagai antibiotik
Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan
dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino
yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil
transferase Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika Kloramfenikol
bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi
apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al 2005) Jadi penggunaan
antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap
pengobatan E coli namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya
Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi
pertama Hasil sensitif pada 7 strain E coli secara umum terjadi pada saat
perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA
bakteri menjadi 2 utas DNA Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan
enzim DNA girase Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat
kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal sehingga bakteri
mati (Martha amp Tejasari 2014)
httplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida dua strain
bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein
bakteri Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada
reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan
mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga
mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al
2016)
Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan
penetrasi kedalam sel bakteri rendahnya afinitas obat pada ribosom atau
inaktivasi obat oleh enzim bakteri Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal
yaitu enzim adenilat fosforilat dan asetilat Informasi genetik untuk sintesis
enzim terutama didapat melalui konjugasi transfer DNA sebagai plasmid dan
transfer faktor resisten Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas
terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan
spektrum kenamisin gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al 2004)
Resistensi dari 10 strain E coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan
tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang
mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al 2013)
Resistensi E coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan
bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid
Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin
sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba Hal ini dapat juga disebabkan
karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit
httplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan
(Tenover 2006) Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan
hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga
ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi
resisten (Refdanita et al 2004)
Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E coli lain yang belum
memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada
bakteri lain dari satu sel ke sel lain Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam
satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga
dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas
pengobatan terhadap antibiotik (Michael2011)
Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E coli adalah plasmid
Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E
coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar
berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada
Gambar 6DNA Plasmid E coliterlihat bahwa masing ndash masing strain teramati
mempunyai satu jenis plasmid Hal tersebut sama dengan penelitian yang
dilakukan (Al-Bahry 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100
mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan
menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik
httplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena
ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid
Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA
yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran
8000 bp dan plasmid lain berukuran 5000 bp Plasmid pada kode sampel SG02
SG04 SG10 dan SG12 terletak pada posisi 8000 bp sedangkan plasmid pada
kode sampel SG03 SG05 SG07 SG08 SG09 SG11 terletak pada posisi
5000 bp
Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al 2008)yang dapat
mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E coli di Bangladesh
menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda 7 diantaranya mempunyai
plasmid dengan ukuran yang besar 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil namun
demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut Hasil
elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti
hanya mempunyai satu jenis plasmid
Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA
plasmid bahwa E coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbeda-
beda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol siprofloksasin
gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di
Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E coli yang diamati dibawah
sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp
Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan
httplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA
plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama
httplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
51 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap
berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa
Ngemplak KabupatenPati menunjukkan dari 10 strain E coli terdapat 3 strain
intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol Terhadap
antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif
Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6
strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet Terhadap 10 strain E
coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin Hasil
elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid
dengan ukuran 8000 bp yakni (SG02 SG04 SG10 dan SG12) sedangkan 6
strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG03 SG05
SG07 SG08 SG09 dan SG11)
52 Saran
Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler
Gambaran profil DNA plasmid E coli dari beberapa tempat yang lain dari
berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil
DNA plasmid dari berbagai tempat
httplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
DAFTAR PUSTAKA
Agustiningsih D Sasongko BS amp Sudarno 2012 Analisis Kualitas Air danStrategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten KendalJurnal Presipitasi Vol 9(2) Pp 64-71
Al-Bahry SN Al-Mashany BM Elshafie AE Pathare N AL-Harthy AH2006 Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated fromChicken Intestine J of Ala Acad Of Sci 77(3-4) 152-159
Alwi M amp Maulina S 2012 Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coliPada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur KotaPalu Jurnal Biocelebes Vol 6(1) pp 40-47
Annisa A N Ria SP amp Aminin LN 2011 Pemurnian DNA Plasmid Puc19Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea Jurnal Sains danMatematika Vol 19(2) pp 47-53
Brooks GF 2007 Mikrobiologi Kedokteran jawetz Melnick amp Adelberg EGCJakarta
Brinner DJ Krieg NR amp Staley JT 1932 Bergeyrsquos Manual of SystematicBacteriology USA
Chandra B 2006 Pengantar Kesehatan Lingkungan Penerbit Buku KedokteranEGC Jakarta
Darmawati S Sembiring L Asmara W Artama WT 2015 Identifikasibakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakterfenotipik pp89ndash96
Departemen Kesehatan Republik Indonesia 2002 Syarat ndash syarat PengawasanKualitas Air Minum PerMenkes RI No907MenkesSKVII2002 DepKes RIJakarta
Endriani R Andrini F amp Alfina D 2010 Pola Resistensi Bakteri PenyebabInfeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru JurnalNatur Indonesia Vol 12(2) pp130ndash135
Fadilah R et al 2014 Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali padaKawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( StudiKasus Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo Kabupaten Sleman Yogyakarta ) Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan Vol 6(1) pp38ndash47
httplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
Fatchiyah Arumingtyas E L Widyarti S rahayu S 2011 Biologi molekularPrinsip dasar analisis Penerbit Erlangga Jakarta
Fery IA 2006 Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp Dengan MetodeElektroforesis Gel Agarosa WARTA-WIPTEK Vol 14(2) p02
Ikmalia 2008Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinargamma Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullahJakarta
Islam MJ Sultana S Das KK Sharmin N Hasan MN 2008 Isolation ofplasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry Int JSustain Crop Prod 3 (5) 46-50
Iswara AI 2015 Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp273ndash277
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2005 Mikrobiologi kedokteran Salemba MedikaJakarta
Jawetz M dan Adelbergrsquos 2007 Mikrobiologi Kedokteran Buku KedokteranEGC Jakarta
Juliantina F DA Citra B Nirwani 2008 Manfaat Sirih Merah (Pipercrocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif danGram Negatif UII Press Yogyakarta
Kelanit SR Runtuboi YP Dirky Gunaedi T 2016 Uji Resistensi danDeteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura Jurnal BiologiPapua Vol 8(1) pp 48-56
Krisnaningsih MM Firdiana Asmara W Wibowo HM 2005 UjiSensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap BeberapaJenis Antibiotik Jurnal Sain Veteriner Vol (1) pp 16-17
Martha D amp Tejasari M 2014 Escherichia coli Resisten terhadap Seftrisksondan Siprofloksasin Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba(Kesehatan) Bandung Indonesia Hal586-587
Michael HW Nugroho SW amp Asmara W 2011 Profil Plasmid Escherichiacoli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari PeternakanAyam Komersial Jurnal Sain Veteriner Vol 29(1) pp 43-50
httplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
Munfiah S Nurjazuli amp Setiani O 2013 Kualitas Fisik dan Kimia Air SumurGali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II KabupatenDemak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in theWorking Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency JurnalKesehatan Lingkungan Indonesia Vol 12(2) pp154ndash159
Noviana H 2004 Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dariberbagai spesimen klinis Jurnal Kedokteran Trisakti Vol 23(4) pp122ndash126
Nur I Musjaya MG amp Muhammad A 2013 Uji Resistensi dan SensitivitasBakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita DemamTifoid Terhadap Antibiotik Jurnal BiocelebesVol 7(1) pp27ndash34
Rahayu SP amp Dwi OP 2010 Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tankterhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali Jurnal IKESMAVol6(1) pp25ndash33
Refdanita Maksum R Nurgani A Endang P 2004 Pola Kepekaan KumanTerhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati JakartaTahun 2001-2002 Jakarta makara kesehatan vol8(2)
Robby RH et al 2013 Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri TepungTapioka dengan Reaktor Anaerobik 3000 Liter Berdistributor Jurnal TeknikPomits Vol 2(1) pp1ndash5
Snustad DP amp MJ Simmons 2003Principles of Genetic Hoboken (US) Wiley ampSons Inc
Tenover FC 2006 Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri Amerika Jof Med 199(6A)S3-S10
Tururaja T amp Mogea R 2010 Bakteri Coliform di Perairan Teluk DoreriManokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species Ilmu kelautanVol 15(1) pp47-52
Waluyo L 2009 Mikrobiologi Lingkungan UMM PRESS Malang
Warganegara E amp Apriliana E 2014 AD The Determining type of Extended-Spectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistanceCephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek BandarLampung JUKE Vol 4(7) pp87ndash96
Widiyanto AF Yuniarno S amp Kuswanto 2015 Polusi Air Tanah AkibatLimbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga Jurnal Kesehatan MasyarakatVol 10(2) pp246ndash254
httplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
Widyarti S 2011 Prinsip dasar analisis-biologi molekuler penerbit erlanggaJakarta
Winarno FG 2008 Kimia Pangan dan Gizi MBrio Press Bogor
Yenny amp Herwana E 2007 Resistensi dari bakteri enterik aspek globalterhadap antimikroba UNIVERSA MEDICINA Vol 26(1) Pp 46-56
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 1 Pembuatan Media
1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri tabung
reaksi erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak
terkontaminasi oleh mikroba Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus
dengan kertas selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave
yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Alat
dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum
digunakan
2 Pembuatan Media
a Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Cara pembuatan ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan
aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih setelah
itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus
dengan kertas diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2
atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml
dinginkan lalu masukkan ke kulkas
b Media Mac Concey (MC) OXOID
Komposisi pepton 85 gram laktosa 5 gram NaCl 15 gram netral red
0015 gram agar 675 gram aquadest 500 ml PH 72 plusmn02
Cara pembuatan ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan
aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan
sampai mendidih disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas
httplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian
angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan di
bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas
c Media Lauria Bertani
Bahan 025 gram ekstrak yeast 1 gram tryptone 1 gram Nacl dan 50 ml
dH2O
Cara Membuat Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O
kemudian diautoclave suhu 121deg C selama 15 menit setelah itu angkat
media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing
5 ml
d Pembuatan Lysing Solution I
Bahan 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr 10 mM EDTA (05M)
03846 gr 25 mM Tris (1M) 030 gr Aquadest 100 ml
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
e Pembuatan Lysing Solution II
Bahan 04 M NaoH 16 gr SDS 2 1 gr Aquadest 50 ml
Cara Membuat dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50
ml saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan
perbandingan 11
f Pembuatan Lysing solution III
Cara Membuat 5 M Kalium Asetat (pH 48) 60 ml Asam asetat 115 ml
dan Aquadest 100 ml
httplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
Cara Membuat diambil labu ukur 100 ml kemudian dihomogenkan
semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml
g Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter
Bahan Stok TAE 5x Aquadest 800 ml
Cara pembuatan diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml
dH2O steril dan homogenkan
h Pembuatan Gel Agarosa 15
Bahan serbuk agarosa 15 gram Ethidium Bromide 2 ul TAE 1x 150 ml
Cara Membuat Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml
TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave
selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat
larut) setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan biarkan dingin lalu
tuang kedalam baki gel agarosa
i Pembuatan Standar MacFarland 05
Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1 dari larutan BaCl2 1 yang dicampur
dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume
10 ml tabung ditutup lalu dihomogenkan Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam
tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman
Komposisi H2SO4 1 995 ml
BaCl2 1 005 ml
Prosedur
1 Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril
2 Dihomogenkan larutan tersebut
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 2 Gambar Penelitian
Inkubasi E coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid
Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 3
Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media
Penanaman disk antibiotik pada media MHA
httplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
iv
LAMPIRAN 4
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik gentamisin resisten
b) kloramfenikol intermediet c) ampisilin resisten d) siprofloksasin sensitif
Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik a) Antibiotik kloramfenikol
sensitif b) ampisilin resisten c) siprofloksasin intermediet d) gentamisin resisten
httplibunimusacid
ivhttplibunimusacid
ivhttplibunimusacid