11

GENETGENETİİK TANI K TANI YYÖÖNTEMLERNTEMLERİİ

Yrd.Yrd.DoDoçç.Dr.Dr.Ay.Ayşşe Ge Güül ZAMANl ZAMANİİ

SelSelççuk uk ÜÜniversitesi Meram Tniversitesi Meram Tııp Fakp Faküültesiltesi

TTııbbi Genetik AD, KONYAbbi Genetik AD, KONYA

22

GENETGENETİİK TANI YK TANI YÖÖNTEMLERNTEMLERİİ11-- SitogenetikSitogenetik ve Molekve Moleküüler ler SitogenetikSitogenetik TanTanıı YYööntemlerintemleri

I. I. SitogenetikSitogenetik TanTanıı YYööntemlerintemleri1. Klasik 1. Klasik SitogenetikSitogenetik TanTanıı YYööntemlerintemleri2. 2. ÖÖzellezelleşşmimişş SitogenetikSitogenetik TanTanıı yyööntemlerintemleri

a. Kardea. Kardeşş kromatidkromatid dedeğğiişşimi (imi (SisterSister ChromatidChromatid Exchange= SCE)Exchange= SCE)b. b. MikronMikronüükleuskleus (MN)(MN)c. c. FrajilFrajil bböölge tayinilge tayini

II. MolekII. Moleküüler ler SitogenetikSitogenetik TanTanıı YYööntemleri ntemleri 1.Ak1.Akışış karyotiplemesikaryotiplemesi((FlowFlow karyotypingkaryotyping))2. 2. FloresansFloresans in in situsitu hibridizasyonhibridizasyon (FISH)(FISH)3. Fiber FISH3. Fiber FISH4. 4. MulticolorMulticolor--FISHFISH

a. a. SpectralSpectral karyotypingkaryotyping (SKY)(SKY)b. b. MultiplexMultiplex--FISH (MFISH (M--FISH)FISH)c. Rc. R--FISHFISHd. d. CobraCobra--FISHFISHe.e.KomparatifKomparatif genomikgenomik hibridizasyonhibridizasyon(CGH)(CGH)

2. Molek2. Moleküüler Genetik Tanler Genetik Tanıı YYööntemlerintemleriI. I. PolimerazPolimeraz zincir reaksiyonu (PZR)zincir reaksiyonu (PZR)II. II. AllelAllel--öözgzgüü oligonoligonüükleotidkleotid analizi (analizi (AlleleAllele--specificspecific oligonucleotidoligonucleotid= ASO)= ASO)III. DNA dizi Analizi III. DNA dizi Analizi IV. IV. MikroarrayMikroarray AnaliziAnalizi

33

Kromozomlar mitotik/mayotik metafaz

Spontan olarak bölünen dokularda

Kültürde bölünmeleri için uyarılan hücrelerde

44

Spontan olarak bölünen hücreler:Kemik iliğiLenf nodülleriSolid tumorlerBazı plevral ya da asidik sıvılarFetal asitlerKistik higromaFetus ya da yeni doğan kanı

55

Spontan olarak bölünme hızı düşük olan hücreler:

Kan lenfositleri Amniyon sıvısıKoryonik villuslarDeri ve fibroblast içeren diğer dokular

66

HÜCRE (DOKU) KÜLTÜRÜ

• Kısa süreli kültür (24-72, bazen 96 saat)

Örn: Kemik iliği, kan …• Uzun süreli kültür (1-3 hafta)

Örn: Amniyon sıvısı, deri ve diğer dokular ...

77

Doku Kültüründen kullanılan besi yerleri ve katkımaddeleri (Kültür Ortamı):1. Besi Yerleri (=Vasat)

Dengelenmiş tuz solüsyonu ile hazırlanırlarHanks ya da HBSS→ozmotik basınç ve pH kontrolü

Glukoz→hücreler için enerjiMedyumlar

TC Medium 199Minimal Esential Medium (MEM)McCoy’s 5ANutrient Ham’s F-10RPMI-1640 … gibi

Daha spesifik besi yerleri. Örn: ChangLeibovitz L15

88

Doku Kültüründen kullanılan besi yerleri ve katkı maddeleri (Kültür Ortamı):

2. AntibiyotikPenicillin amphotericinstreptomycin BAKTERİ nystatin MANTAR

3. SerumDana serumu (FBS)Sığır fetusu serumu (FCS)

Hücre büyüme faktörleri, adhezyon faktörleri, iz elementler, hormonlar,vitaminler

4. L-GlutaminÇoğunlukla besi yerinin içinde hazır

99

5. . Mitoz uyaranı

=Mitojen: EBV(Epstein Bar Virus),Pokeweed mitojen (PWM),Phorbol ester (TPA)

En çok kullanılan mitojen : Phytohemagglutinin insan periferik kan

kültüründeki olgun lenfositleri uyararak onlarıbölünmeye teşvik eder.

1010

KROMOZOM ELDESİ ve PREPARATLARIN HAZIRLANMASI(HARVESTING)

* 2 saat önce Kolşisin ya da Demekolsin

(mitozu durdurmak için)sıvı faz

* Santrifüjhücre fazı

* Hipotonik Muamelesi0.075 M KCl , % 0.95’lik Na Sitrat

* Fiksatif Muamelesi:(3 Metanol : 1 Asetik Asit) X 3 kere

* Lamlara yayma ve kurutma

1111

GG--BandlamaBandlama

Most common method usedMost common method usedChromosomes treated with Chromosomes treated with trypsintrypsin–– denatures proteindenatures protein

GiemsaGiemsa stain stain –– each chromosome each chromosome

characteristic light and dark characteristic light and dark bandsbands

–– 400 bands per haploid 400 bands per haploid genomegenome

–– Each band corresponds to Each band corresponds to 55--10 10 megabasesmegabases

–– Dark bands are gene poorDark bands are gene poor

1212

İİdiyogramdiyogram

1313

ISCNISCN

International System for International System for Human Human CytogeneticCytogeneticNomenclatureNomenclatureKromozomlarKromozomlarıın n herbirherbirbböölgesinin lgesinin numaralandnumaralandıırrıılmaslmasııSSentromereentromere (proximal) (proximal) en en yakyakıın bn böölgeler ilgeler iççin en kin en küçüüçükkSSentromereentromere (distal) (distal) en uzak en uzak bböölgeler ilgeler iççin en bin en büüyyüük k numaralarnumaralar

1414

HRBHRB--BandlamaBandlama

– Yüksek çözünme – 800 band

prometafazkromozom

– Metotreksat veKolşisin kullanılır

1515

QQ--BandlamaBandlama

ÖÖzellikle Y kromozomu zellikle Y kromozomu anomalilerinde ve anomalilerinde ve mozaisizimmozaisizim tantanııssıında nda kullankullanııllıırrGG--bandband benzeri benzeri bandlarbandlarelde edilir.Fakat elde edilir.Fakat polimorfizmlerpolimorfizmlersaptanamazsaptanamazFloresansFloresans mikroskop mikroskop gereklidir.gereklidir.

1616

RR--BandlamaBandlama

X kromozom X kromozom anomalilerini anomalilerini tantanıımlamak imlamak iççin in kullankullanııllıırrKromozomlar Kromozomlar giemsagiemsaile ile bandlanmadanbandlanmadan öönce nce ııssııya tabii tutulurya tabii tutulurAAççıık ve karanlk ve karanlıık k renkteki renkteki bandlarbandlar terstir.terstir.

1717

CC--BandlamaBandlama

SentromerleriSentromerleri ve ve heterokrometiniheterokrometinitantanıımlamak imlamak iççin in kullankullanııllıır.r.HeteroHeterokromatik kromatik bböölgelerlgeler–– Tekrarlayan diziler Tekrarlayan diziler

iiççerirerir–– OldukOldukçça a kondansekondanse

kromatin fiberleridir.kromatin fiberleridir.

1818

NORNOR--BandlamaBandlama

GGüümmüüşş(NOR)boyama:(NOR)boyama:NukleolarNukleolarorganizasyon borganizasyon böölgeleri lgeleri ve ve akrosentrikakrosentrikkromozomlarkromozomlarıın ikincil n ikincil boboğğumlarumlarıı boyanboyanıır.r.

1919

KardeKardeşş kromatidkromatid dedeğğiişşimiimi

İİki hki hüücre dcre dööngngüüssüü boyunca boyunca kromatidlerikromatidleri ayayıırma frma fıırsatrsatııveren veren BrdUBrdU ((bromobromo--deoxydeoxy--uridineuridine) k) küültltüür ortamr ortamıına na eklenir. eklenir. Sadece bir zincirde DNA Sadece bir zincirde DNA BrdUBrdU almalmışışsa normal sa normal karanlkaranlıık k GiemsaGiemsa boyamasboyamasııolur, diolur, diğğer zincir daha aer zincir daha aççıık k renkle boyanrenkle boyanıır.r.EEğğer deer değğiişşim im gergerççekleekleşştiyse, tiyse, kromatidkromatidparparçça para parçça aa aççıık ve koyu k ve koyu renklerde grenklerde göörrüüllüür: r: ""harlequinharlequin kromozomlarkromozomlarıı““..

2020

KardeKardeşş kromatidkromatid dedeğğiişşimiimi

2121

MikronMikronüükleuskleus teknitekniğğii

2222

FrajilFrajil bböölge lge tesbititesbiti

2323

AkAkışış KaryotiplemesiKaryotiplemesiUltrasonik titreşim başlığı

Hücre süspansiyonu

Koruma sıvısı

ANALİZÖRdedektörler

Hücre toplayıcıHücre toplayıcı

Nonfloresan negatif yüklü

tek hücre içeren damlalar

pozitifyüklü tek floresan

hücre içeren damlalar

2424

AkAkışış KaryotiplemesiKaryotiplemesi

Kro

moz

om s

ayısı

Floresan oranı

2525

Floresans In SituHibridizasyon FISHFISH

Hedefin hazırlanması Probun hazırlanması

Denaturasyon

Hibridizasyon

Hibridizasyon sonrası yıkama

Kromozomların boyanması

Floresans mikroskobi

2626

TTüüm Kromozom Boyama m Kromozom Boyama ProblarProblarıı(Kromozom (Kromozom PaintingPainting ProbProb ))

Chromosome 8 painting probe

2727

SentromerSentromer Spesifik Spesifik ProblarProblar

● kromozom 7 sentromer spesifik signal● kromozom 8 sentromer spesifik signal

2828

DiGeorge Sendromu (22 de mikrodelesyon)● 22q13’e özgü kontrol sinyali● 22q11.2’ye özgü DiGeorge probu

SRY lokus spesifik prob kullanılarak yapılmış FISH örneği. SRY/X probu kullanıldı.● X kromozomu ● SRY

Lokus Spesifik ProblarTek Gen Probları

2929

TelomerikTelomerik ProblarProblar::

3030

Fiber FISHFiber FISH

3131

Spektral Spektral KaryotiplemeKaryotipleme(SKY)(SKY)

3232

MultiplexMultiplex FISHFISH

AkciAkciğğer kanseri her kanseri hüücre dizilerinde 5cre dizilerinde 5--florokromflorokrom MM--FISH karFISH karışıışımmıı ile ile hibridizasyonhibridizasyon sonrassonrasıı A)gerA)gerççek renk ek renk metafazmetafazıı, B) s, B) sıınnııflandflandıırrıılmlmışış renk renk sunumusunumu

3333

MultiplexMultiplex FISHFISH

C). C). KaryotipKaryotip

3434

CobraCobra FISHFISH

İİnsan nsan COBRACOBRA––FISH prob FISH prob setsetİİ ile elde edilen ile elde edilen 1212--renkrenkimaimajjıı. . Sadece Sadece üçüç adet adet floroflorokromkromkullankullanıılarak yaplarak yapıılan oranllan oranlııiişşaretlemearetleme(DEAC, Cy3 and (DEAC, Cy3 and Cy5 ). Cy5 ). Beyaz ok klasik Beyaz ok klasik sitogenetiksitogenetikyyööntemlerle ntemlerle tesbittesbitedilemeyen bir edilemeyen bir translokasyonutranslokasyonuggööstermektedir.stermektedir.

www.nature.com/.../www.nature.com/.../v1/n1/full/nprot.2006.41.htmlv1/n1/full/nprot.2006.41.html

3535

R x FISH=R x FISH=CrossCross--speciesspeciescolourcolour FISHFISH

www.nature.com/.../www.nature.com/.../v1/n1/full/nprot.2006.41.htmlv1/n1/full/nprot.2006.41.html

3636

KarKarşışılalaşşttıırmalrmalıı genomikgenomik hibridizasyonhibridizasyon==comparativecomparative genomicgenomic hybridizationhybridization (CGH):(CGH):

3737

Normal doku DNA’sı(KONTROL)

Hasta dokunun DNA’sı(TEST)

İşaretleme(Kırmızı Floresan)

İşaretleme(Yeşil floresan)

Normal metafaz kromozomu ile hibridizasyon

-2 0 2 (log2 ratio)

Delesyon

Amplifikasyon

Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon(CGH):

3838

KarKarşışılalaşşttıırmalrmalıı genomikgenomik hibridizasyonhibridizasyon(CGH):(CGH):

CGH-metafaz plağı

Test DNA’sı ile hibridizasyon

*Test DNAFITC/yeşil

*Referans DNARhodamine/kırmızı

3939

KarKarşışılalaşşttıırmalrmalıı genomikgenomik hibridizasyonhibridizasyon(CGH):(CGH):

Aynı metafazın CGH karyogramı(bir önceki slayt

CGH- karyotip

4040

KarKarşışılalaşşttıırmalrmalıı genomikgenomik hibridizasyonhibridizasyon(CGH):(CGH):

CGH idiyogramları

4141

KarKarşışılalaşşttıırmalrmalıı genomikgenomik hibridizasyonhibridizasyon(CGH):(CGH):

kazanım kayıpnormal

4242

PolimerazPolimeraz zincir reaksiyonu(PZR)zincir reaksiyonu(PZR)

Amplifiye edilecek olan cift zincirli kromozomal

DNA bölgesi(hedef bölge)

DNA oligonükleotidprimerler

Ayrılan DNA zincirleri bağlanan primer

DNAsentezi

DNAsenteziDNA

senteziAyrılan DNA zincirleri

bağlanan primer

Ayrılan DNA zincirleri bağlanan primer

Çift zincir DNA

Isıylazincirlerinayrılması

Primerlerinhibridizasyonu

PrimerlerdenDNA sentezi

DNA polimeraz+dATP,+dGTP,+TTP,+dCTP

1.basamak 2.basamak 3.basamak

Birinci siklus

Birinci siklusİki adet cift sarmal DNA molekülü sentezlenir

İkinci siklusDört adet cift sarmal DNA

molekülü sentezlenir

Üçüncü siklusSekiz adet cift sarmal DNA

molekülü sentezlenir

4343

PZR'ninPZR'nin genetikte kullangenetikte kullanıım m alanlaralanlarıı::

OnkogenezisOnkogenezis araaraşşttıırmalarrmalarıı,,KalKalııtsal hastaltsal hastalııklarda taklarda taşışıyyııccıınnıın ve hastann ve hastanıın tann tanııssıı (mutasyon (mutasyon analizi),analizi),PrenatalPrenatal tantanıı,,Klinik Klinik öörneklerde patojen organizmalarrneklerde patojen organizmalarıın saptanmasn saptanmasıı,,Adli tAdli tııp (DNA parmak izi arap (DNA parmak izi araşşttıırmasrmasıı,vb),,vb),ProbProb oluoluşşturulmasturulmasıı/klonlama/gen ekspresyon /klonlama/gen ekspresyon arastarastıırmalarrmalarıı,,DNA dizi analizinde, bDNA dizi analizinde, büüyyüük miktarda DNA k miktarda DNA öörneklerinin rneklerinin oluoluşşturulmasturulmasıında,nda,Bilinmeyen dizilerin tayininde,Bilinmeyen dizilerin tayininde,GeGeççmimişş DNA'nDNA'nıın incelenmesinde,n incelenmesinde,RestrictionRestriction FragmentFragment LengthLength PolymorphismPolymorphism (RFLP) analizinde,(RFLP) analizinde,InvitroInvitro fertilizasyonfertilizasyon yapyapıılan tek hlan tek hüücrede, crede, implantasyonimplantasyon ööncesi ncesi genetik testlerin yapgenetik testlerin yapıılmaslmasıı,,DNA protein DNA protein interaksiyonununinteraksiyonunun araaraşşttıırrıılmaslmasıında (nda (footprintingfootprinting) ) kullankullanıılabilir.labilir.

4444

AllelAllel--öözgzgüü oligonoligonüükleotidkleotid (ASO)(ASO)

Hatalı eşleşme Hibridizasyon yok

Genotip

Hibridizasyon

Hatalı eşleşme Hibridizasyon yok

Hibridizasyon

Genotip

4545

AllelAllel--öözgzgüü oligonoligonüükleotidkleotid(ASO)(ASO)

hastalar

heterozigot

heterozigot

heterozigot

heterozigot

Hom

ozigot

Hom

ozigot

Hom

ozigot

Hom

ozigot

4646

DNA Dizi Analizi:DNA Dizi Analizi:

4747

DNA Dizi Analizi:DNA Dizi Analizi:

4848

MikroarrayMikroarray AnaliziAnalizi

Hedef mRNAhazırlanması

Microarray oluşturulmasıRT/PCRFloresan boyalarla

işaretleme

Eşitoranda

birleştirme

Hedef karışımmikroarray ile hibridize edilir

Verinin analizitarama

4949

MikroarrayMikroarray analizianalizi

5050

MikroarrayMikroarray analizianalizi