APUNTES BÁSICOS SOBRE TÉCNICA HISTOLOGICA La histología (estudio de los tejidos), es la ciencia que se encarga del estudio de la estructura de células, tejidos y órganos. La comprensión de cómo la estructura de estos elementos se relaciona con las funciones que ellos cumplen, requiere de un conocimiento de la composición molecular de los mismos y de las interacciones a nivel molecular entre células y, entre células y componentes extracelulares, materias que se incluyen en la Histología moderna. La estructura del material histológico se estudia en rebanadas muy delgadas, llamadas cortes de tejido. Los cortes tienen un grosor menor que la mayoría de las células (1-10 mm) y muestran en un plano, estructuras tridimensionales de los tejidos. Estos cortes se analizarán en el microscopio de campo brillante que entrega información de cortes de tejido delgados y bien contrastados. MICROSCOPIO OPTICO DE CAMPO BRILLANTE Los microscopios, que datan del siglo XVII, han tenido un desarrollo notable hasta la fecha. Existen varios tipos de microscopios, cuyas propiedades se describen en los textos. El microscopio que se usará para los trabajos prácticos, es el microscopio de campo claro o campo brillante cuyas características se describen a continuación: Sistema óptico

a) Lente ocular: sistema de lentes planos convexos adosados a los extremos de un tubo, con un

diafragma circular entre ellos. Amplía la imagen virtual recogida por la lente objetivo y limita el campo visual del ojo. En su microscopio, estas lentes están unidas por un sistema de tubos binoculares y entregan un aumento de 10 veces (lOx).

b) Lente objetiva: sistema de lentes convergentes de distinto aumento que se ubican en el revólver.

Es la única lente de todo el sistema óptico que tiene poder de resolución. Sus aumentos son 4x, lOx, 40x, lOOx. Dependiendo del índice de refracción del medio (n), se distinguen:

Lentes objetivas en seco, están adecuadas al n del aire (n = 1), por lo que no debe interponerse nada entre la lente y la preparación. Sus aumentos son 4x, lOx, 40x.

Lentes objetivas de inmersión, adecuadas a n > 1 (generalmente n = 1.5), se utilizan agregando una capa de líquido transparente (aceite de inmersión) entre la lente y la preparación. Este tipo de lentes se identifica por una línea negra en su parte inferior, y en su microscopio posee un aumento de lOOx. En estas clases prácticas, se usará un aumento máximo de 40x.

c) Condensador: sistema de lentes convergentes dispuesto debajo de la platina, que proyecta sobre

la preparación un haz de luz en forma de amplio cono.

d) Diafragma: único elemento mecánico del sistema óptico. Su diámetro se puede modificar mediante una palanca lateral, con el fin de regular el haz de luz proveniente de la fuente lumínica de modo tal que éste quede centrado en el condensador.

e) Porta filtros: sistema de cristales pigmentados ubicado bajo el diafragma, que filtra selectivamente el espectro de la luz blanca. El de uso frecuente es el de color azul violáceo, que absorbe las longitudes de onda del rojo y el amarillo, emitidas por el filamento metálico de la lámpara.

f) Lente frontal: es una lente auxiliar para trabajar sólo con mayores aumentos. Se acciona mediante una palanca lateral, ubicada bajo el condensador. Sistema mecánico 1) Pie o Base de Sustentación: sobre él descansa la columna o estativo. Incluye un transformador para el funcionamiento de una lámpara de bajo voltaje. 2) Tubo: pieza dispuesta en un ángulo de 45° respecto de la columna, que lleva en su extremo superior dos lentes oculares para la observación binocular de la preparación. En su extremo inferior está conectada al revólver. 3) Platina: plataforma para acomodar la preparación mediante dos pinzas laterales, y que puede moverse en un rango de 76 mm x 26 mm. con la ayuda de una guía dispuesta en el costado de la platina. 4) Revólver: pieza giratoria que permite intercambiar las 4 lentes objetivas y obtener distintos aumentos durante la observación. 5) Tornillo macro-micrométrico integrado: permite enfocar correctamente la preparación al desplazar verticalmente la platina, alejándola o acercándola a la lente objetiva. Sistema de Iluminación La fuente de luz corresponde a una lámpara de bajo voltaje (6V 5W) acoplada a un tubo de iluminación ubicado debajo del condensador. La intensidad de la iluminación se puede regular mediante un tornillo negro situado en el extremo inferior izquierdo del pie. FACTORES INVOLUCRADOS EN LA OPTIMIZACION DE LA OBSERVACION BAJO EL

MICROSCOPIO a) Poder de Resolución (PR): es la capacidad de la lente, que permite hacer perceptible por

separado dos puntos que están muy próximos entre sí. Esta capacidad es inversamente proporcional al límite de resolución (d), que es la menor distancia que debe existir entre dos puntos para que éstos puedan ser individualizados como unidades separadas.

PR = 1 / d

El valor "d" es directamente proporcional a la longitud de onda de la luz (L = lambda) e inversamente proporcional a la Apertura Numérica (AN) de la lente:

d = L/AN En consecuencia, el PR es inversamente proporcional a la longitud de onda utilizada y directamente proporcional a la apertura numérica de la lente del microscopio:

PR = AN / L

b) Apertura Numérica (AN) es el producto del índice de refracción del medio interpuesto entre la muestra y la lente del objetivo, a través del cual pasa la luz, multiplicado por el seno del ángulo de apertura de la lente. Normalmente, la AN está indicada en el objetivo a utilizar.

AN = n x sen ángulo

Las lentes de inmersión incrementan la AN al utilizar aceite de inmersión, el cual posee un índice de refracción mayor que el aire. c) Poder de aumento: es la relación existente entre el tamaño del objeto y la imagen obtenida a

través de las lentes. Depende directamente de las lentes con sus diferentes aumentos. En su microscopio podrá calcular el valor del PA multiplicando el poder de la lente ocular por el poder de la respectiva lente objetiva.

INDICACIONES PARA EL MANEJO ADECUADO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO 1.Encienda la lámpara

2. Coloque la preparación histológica sobre la platina siempre con el cubreobjetos hacia arriba,

fijándola con las pinzas.

3. Suba la platina con ayuda del tomillo macro-micrométrico.

4. Inicie la observación con el objetivo de menor aumento, para obtener una imagen panorámica

del corte histológico, y por tanto del órgano observado. Localice a este aumento (4x) las zonas que

se desea observar a aumentos mayores sucesivos.

5. Afine el enfoque mediante el tornillo macro-micrométrico, hasta que la imagen sea nítida.

6. Toda vez que cambie de lentes objetivos debe bajar la platina, para evitar que se rompa la

preparación histológica, al chocar contra los lentes. Gire el revólver, colocando en línea de

observación el objetivo con el aumento deseado, en el campo previamente seleccionado con el

objetivo de menor aumento. Si necesita una imagen más nítida, regule con ayuda del tornillo

macro-micrométrico.

7. Optimice la iluminación regulando la intensidad de la luz.

Al terminar la observación:

baje la platina con el tornillo macro-micrométrico deje el revólver en el objetivo de menor aumento retire la preparación histológica apague la fuente luminosa cubra el equipo con su funda protectora

INTERPRETACIÓN DE LOS CORTES HISTOLOGICOS Para una adecuada interpretación de un corte observado al microscopio óptico, deben considerarse los siguientes factores: 1) El plano de corte. Este aspecto es fundamental, pues se debe reconstruir la estructura

tridimensional de células, tejidos y órganos a partir de cortes bidimensionales. Es importante considerar que los cortes que se estudiarán corresponden a:

órganos tubulares órganos macizos secciones corporales

2) Tinción empleada.

Interpretación funcional. Es importante establecer las correlaciones entre estructura y función de lo observado, tratando de transformar mentalmente las condiciones estáticas del corte en las dinámicas de la vida. Artefactos Durante la preparación de los cortes histológicos, pueden presentarse alteraciones denominadas artefactos, que deben ser reconocidos y diferenciados de áreas bien conservadas de tejidos. Generalmente, se deben a errores en la preparación del tejido, defectos en la cuchilla, que se traducen en muescas en la preparación, o errores de montaje como pliegues y arrugas. Al analizar cortes de tejido, debe tenerse en cuenta que estos muestran en un plano bidimensional las estructuras tridimensionales que forman los tejidos y órganos. La figura muestra los posibles cortes que se pueden obtener de un tubo curvado.

TÉCNICAS DE PREPARACIÓN DE MATERIAL BIOLÓGICO PARA SU OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO El método más comúnmente empleado en clases prácticas es la técnica de inclusión en parafina, que permite obtener preparaciones permanentes de tejidos (láminas o cortes histológicos), para ser observados en el microscopio óptico. Tiene como objetivo conservar la misma estructura y composición química que poseían estos tejidos cuando estaban vivos, ideal que no se alcanza, observándose en todas las preparaciones ciertos artefactos, consecuencia del proceso a que fueron sometidos. Etapas de la técnica de inclusión en parafina a) Obtención de la muestra: el material debe extirparse de un animal anestesiado o

inmediatamente después de su muerte. En el caso de material humano, los tejidos sólidos generalmente se obtienen por cirugía (biopsia), por endoscopía (como fragmentos de tejido digestivo, bronquial, etc ) o biopsia.

b) Fijación: tratamiento que estabiliza la estructura de un tejido en una etapa determinada, con un

mínimo de alteraciones de su estado in vivo. La fijación puede realizarse por inmersión, sumergiendo el tejido en la solución del líquido fijador, o por perfusión, inyectando al fijador por los vasos sanguíneos del órgano.

Los fijadores comúnmente empleados contienen formaldehído en forma de solución de formalina, aunque también suele emplearse alcohol, bicloruro de mercurio, bicromato de potasio y ciertos ácidos (pícrico, acético), compuestos que fijan por coagulación de las proteínas presentes en el tejido. Habitualmente, se emplean mezclas fijadoras que contienen proporciones variables de fijadores simples como, por ejemplo, el líquido de Bouin y el líquido de Helly, de Zenker y de Sousa. Los fijadores pueden o no conservar carbohidratos y lípidos, y su elección está determinada por el tejido en particular o el componente del mismo que se va a estudiar, así como por el método de tinción que se usará. Los fijadores químicos más usados son formaldehído (H-CHO) y glutaraldehido (CHO-(CH2)3-CHO), que actúan principalmente sobre proteínas. Los grupos aldehidos reaccionan con las cadenas laterales de aminoácidos que contienen-NH2, -SH, y -OH, formándose enlaces covalentes, ya sea entre zonas de la misma cadena polipeptídica o entre moléculas adyacentes. Como ejemplo se ilustra el producto formado al reaccionar el formaldehído con aminoácidos cuyas

cadenas laterales contienen grupos –NH2. Rl-NH2+CH2=O — R1-NH-CH2OH+ R2-NH2 —- RI -NH –CH2-NH-R2 + H2O c) Deshidratación: la inclusión en parafina requiere reemplazar el agua del tejido por parafina, con

el objeto de endurecer la muestra lo suficiente para cortarla. La primera etapa es una deshidratación gradual, pasando la muestra de tejido por varias soluciones de alcohol de concentraciones crecientes, hasta llegar al alcohol absoluto. La segunda etapa es el aclarado, en que se reemplaza el alcohol por un solvente que pueda mezclarse con el agente de inclusión (parafina), como es el xilol. Para ello, la muestra de tejido se pasa desde el alcohol absoluto a dos cambios sucesivos de xilol.

d) Inclusión: el trozo de tejido impregnado en xilol es sumergido en cambios sucesivos de

parafina a 60° C. Este hidrocarburo es líquido a 60° C y llena todos los espacios ocupados inicialmente por el agua tisular. La parafina líquida se endurece a temperatura

ambiente obteniéndose un bloque de tejido. e) Corte: los cortes de tejido se obtienen en instrumentos llamados micrótomos. En general, los

cortes en parafina tienen un grosor de 5-10 µm, y para su manipulación se adhieren a un portaobjetos.

f) Tinción: los tejidos se tiñen para aumentar el contraste natural y hacer más evidentes los

componentes celulares. La mayor parte de los colorantes se usan en soluciones acuosas, por lo cual la parafina que impregna al corte debe ser reemplazada por agua. Para remover la parafina, los cortes se sumergen en xilol y luego se hidratan en soluciones de alcohol de concentraciones decrecientes, hasta llegar al agua. El corte hidratado se sumerge en el colorante elegido.

g) Montaje: para guardar en forma indefinida a la preparación teñida, es necesario cubrirla con un

cubreobjeto. Durante el proceso de montaje, el corte es nuevamente deshidratado con una serie de alcoholes, a concentraciones crecientes hasta el alcohol absoluto, y luego se reemplaza éste por xilol. Sobre el corte impregnado en xilol se pone una gota de un medio de montaje soluble en xilol y sobre ella, el cubreobjetos. Cuando el xilol mezclado al medio de montaje se evapora, el corte queda impregnado por el medio de montaje y el cubreobjeto sólidamente adherido al portaobjetos. El medio de montaje elimina el efecto de difracción de la luz.

TINCIONES HISTOLOGICAS TINCION CON COLORANTES BASICOS Y ACIDOS HEMATOXILINA - EOSINA Técnica usada de rutina en la que se tiñe con 2 colorantes:

Hematoxilina, un colorante catiónico (o básico) de color azul- púrpura, y Eosina, un colorante aniónico (o ácido) de color rosado-rojizo

Los colorantes básicos y ácidos son sales neutras que contienen un radical ya sea básico (carga +) o ácido (carga -). La eosina es la sal sódica de tetra -bromofluoresceína y el color reside en este radical ácido. La hematoxilina, actúa como un colorante básico porque en la solución de tinción su componente coloreado es el complejo hemateína-Al

Los componentes teñidos por la hematoxilina, de color azul, reciben el nombre de basófilos y los teñidos por la eosina, de color rosado intenso, se denominan acidófilos o eosinófilos. En los tejidos, las moléculas de proteínas (nucleoproteínas, glicoproteínas, lipoproteínas) y de carbohidratos (glicolípidos y glicosaminoglicanos, glicoproteínas) contienen radicales que pueden formar enlaces electrostáticos con estos colorantes. La cromatina nuclear es muy basófila por su contenido en grupos -PO3. En cambio, las proteínas mitocondriales son ricas en aminoácidos básicos, por lo que el citoplasma de las células suele teñirse con la eosina. TINCIONES HISTOQUÍMICAS ESPECIFICAS En el estudio de los tejidos, son de gran ayuda las diferentes técnicas de fijación, inclusión y tinción, que permiten conservar o resaltar estructuras celulares y/o elementos tisulares importantes. Tanto la fijación como la inclusión determinan la conservación o no de algunas moléculas en el interior de las células. Por otro lado, las diferentes tinciones entregan una variedad de alternativas para diferenciar o contrastar agregados moleculares y estructuras de un tejido. El saber interpretar la información proporcionada por las tinciones será de gran ayuda para determinar características estructurales y funcionales de las células que constituyen un tejido. En la mayor parte de los casos, las reacciones son efectuadas sobre tejidos fijados. A continuación se describen algunas de las técnicas especiales más utilizadas en histología. 1. Impregnación con sales metálicas. Estos métodos emplean sales metálicas como el cloruro de oro, el nitrato de plata, etc. que producen, en condiciones físico-químicas adecuadas, precipitados negros que se depositan selectivamente sobre determinadas estructuras del tejido. La razón de la especificidad del precipitado no ha sido aún completamente comprendida. Como ejemplos de estas técnicas podemos mencionar la Técnica de Del Río Ortega para fibras reticulares y colágenas; la impregnación argéntica con el método de Golgi-Cox que permite observar los cuerpos neuronales y sus prolongaciones, y el método de Ramón y Caja! con sublimado de oro para ciertos tipos de células gliales. 2. Tinción con Acido Peryódico-Schiff (PAS) Esta tinción permite la localización de macromoléculas ricas en carbohidratos tales como glicógeno, glicoproteínas y proteoglicanos. La especificidad de la reacción de PAS, se basa en el uso de 2 reactivos, el ácido peryódico ( HI04 ) y el reactivo de Schiff. El ácido peryódico oxida dos

grupos hidroxilo ubicados en carbonos adyacentes (por ejemplo la unión 1,2-glicol en las hexosas), o grupos hidroxilo y amino adyacentes (como en las hexosaminas). Las uniones carbono-carbono se abren y los grupos hidroxilo y amino vecinales se convierten en aldehidos. En las condiciones de oxidación usadas en el método de PAS, la oxidación se detiene a nivel de aldehidos.

Oxidación de grupos aldehido vecinales con HIO4

(reactivo de Schiff) El reactivo de Schiff reacciona con los aldehidos, formando un producto estable de color rojo magenta. Para microscopía electrónica de transmisión (MET), se aplica un método similar, pero se reemplaza al reactivo de Schiff por la metenamina de plata, la cuál genera un producto de reacción opaco a los electrones. 3. Localización histoquímica de enzimas Una variante del método histoquímico, permite la demostración de la presencia de diferentes enzimas en el tejido. La enzima no es visualizada directamente, sino que lo que se observa es el producto de la reacción enzimática, que permite inferir su presencia. Este tipo de tinciones posee las características de las reacciones enzimáticas: un pH óptimo, especificidad de cada enzima por su sustrato y requiere de la presencia de agentes activadores e inhibidores específicos. La formación de un agente visible en el corte, en los sitios en que se ubica la enzima, se basa en la precipitación de uno de los productos de la reacción enzimática. El precipitado será visible al microscopio de luz, si es coloreado y, si contiene átomos de alto número atómico y, por lo tanto, es denso a los electrones, aparecerá como un depósito negro al microscopio electrónico de

transmisión (TEM). a) Un ejemplo es la técnica de Gomori para detectar fosfatasa ácida. Para realizar la reacción histoquímica, el corte de tejido se incuba en presencia de un sustrato para la enzima (glicerofosfato de Na) que contiene iones fosfatos. Estos iones fosfato son liberados del sustrato, por acción de la enzima presente en el tejido, y se combinan con iones de plomo, provistos por cloruro de plomo presente en el medio de incubación. En aquellos sitios donde se encuentra la enzima, se genera un precipitado visible al microscopio electrónico de transmisión. Si se desea analizar el material al microscopio de luz, el precipitado se expone a vapores de sulfuro, que transforman el producto de la reacción (fosfato de plomo), en un producto de color negro (sulfuro de plomo) visible.

b) Localización de la peroxidasa Para evidenciar esta enzima, los cortes de tejido se incuban en presencia de agua oxigenada (H2O2), que corresponde al sustrato de la enzima, y diaminobencidina (DAB), reactivo que en presencia de peroxidasa y H2O2 se oxida, dando origen a un producto coloreado insoluble. Este producto coloreado, en presencia de tetróxido de Osmio (OsO4), forma un producto denso a los electrones, visible al microscopio electrónico, denominado negro de Osmio.

4. Inmunohistoquímica La inmunohistoquímica es un método altamente específico que se vale de la capacidad que el organismo tiene de generar anticuerpos (inmunoglobulinas) contra determinadas moléculas denominadas antígenos, con las que se unen específicamente para inactivarlas. La producción de anticuerpos puede ser inducida artificialmente, en animales de laboratorio, mediante la inyección de un antígeno (proteína, glicoproteína o polisacárido altamente purificados). Una vez generado el anticuerpo, éste se purifica y se combina químicamente con distintas substancias que se utilizan como marcadores. Las moléculas marcadoras son muy variadas (colorantes fluorescentes, enzimas, átomos densos a los electrones como oro), y su presencia puede ser detectada de diversas maneras dependiendo de su naturaleza química.

Método directo: El anticuerpo específico contra el antígeno cuya localización se desea establecer,

se marca con elemento marcador y se aplica al corte de tejido. El elemento marcador puede ser un producto que se vea directamente (colorante fluorescente, oro coloidal) o que genere un producto coloreado o denso a los electrones, luego de una reacción enzimática. Método indirecto: En este método, los cortes de tejido se exponen a un anticuerpo específico no marcado (primer anticuerpo) formándose, en la zona donde se encuentra el antígeno, un complejo antígeno-anticuerpo invisible. Luego se aplica un segundo anticuerpo marcado, específico para el primer anticuerpo. El segundo anticuerpo se obtiene usando como antígeno el primer anticuerpo. Si el primer anticuerpo se obtuvo inyectando el antígeno a un conejo, el segundo anticuerpo se obtiene inyectando el primer anticuerpo (inmunoglobulinas de conejo) a otro animal, por ejemplo cabra, que producirá anticuerpos anti-inmunoglobulina de conejo. Este segundo anticuerpo se marca para hacerlo visible al microscopio.

técnica inmunocitoquímica directa técnica inmunocitoquímica indirecta 5. Autorradiografía Este método se basa en la capacidad de los compuestos radioactivos (de manera similar a la luz) de generar una imagen sobre una emulsión fotográfica. Permite estudiar la incorporación de moléculas precursoras que contienen átomos radioactivos, a macromoléculas propias de un espécimen biológico. La radioactividad proviene de átomos radioactivos que se han inyectado previamente al animal vivo. Se usa generalmente tritio (Ha), un isótopo que emite partículas de baja energía y corto alcance.

Localización de la marca en cortes de tejido.

El animal que recibió la inyección de moléculas radioactivas se sacrifica, y se preparan cortes del tejido que se desea estudiar. Sobre el corte se coloca una capa de emulsión fotográfica (suspensión de haluro de plata en gelatina) y se deja exponiendo en la oscuridad. Durante este período, las partículas β emitidas por los átomos radioactivos, inciden sobre alguno de los cristales

de haluro de plata, produciendo una imagen latente invisible (que corresponde a sitios dentro del cristal donde la plata iónica se transformará en plata metálica). Pasado un tiempo de exposición adecuado, se trata el corte con un revelador químico, que convierte todos los cristales de haluro de plata que han sido activados por partículas β (imagen latente) en plata metálica, obteniéndose la imagen real. Luego, se trata el corte con un fijador que disuelve todos los cristales de plata, pero no afecta a la plata reducida. En aquellos lugares del corte donde haya moléculas que emitieron radiación, se observa el depósito de granos negros de plata (granos de autorradiografía). Las estructuras que se encuentran por debajo de estos granos, contienen las macromoléculas que incorporaron el precursor radioactivo.

Ejemplos: a) Localización de células que se encuentran en proceso de división celular (mitosis) y migración posterior. Se administra endovenosamente a un animal experimental, una dosis de “timidina*, en la cuál alguno de los átomos de H está reemplazado por tritio. Esta “timidina* será captada por todos los núcleos celulares que se hallan en fase S del ciclo celular. Al sacrificar el animal unas horas más tarde, y procesar el tejido extraído para autorradiografía, todos los núcleos cubiertos por granos de plata (granos de autorradiografía) corresponderán a núcleos de células que estaban en fase S al hacerse la inyección. De esta forma se puede seguir el proceso de multiplicación celular y el destino de una población de células. b) La síntesis de proteínas se puede estudiar inyectando un aminoácido marcado y la síntesis de carbohidratos mediante un monosacárido marcado. Los precursores radioactivos se incorporan a macromoléculas, a los pocos minutos de inyectados. Células pancreáticas de un animal sacrificado 10 min (A) y 45 min (B) después de haber recibido una inyección de leucina tritiada. La proteína marcada se ubica en el aparato de Golgi (A) y luego en los granos de secreción (B)

A B 6. Hibridización (hibridación) in situ Esta técnica se fundamenta en la afinidad que las cadenas de ácidos nucleicos tienen con segmentos de ácidos nucleicos que contengan bases complementarias. La técnica permite la identificación, con gran precisión y especificidad, de secuencias de ADN y ARN contenidos en la célula, las que denotan la codificación genética de, por ejemplo, una proteína específica. Metodología Cuando una solución de DNA se expone a condiciones denaturantes (100°C y pH 13), la doble hélice de la molécula se disocia en dos hebras, que se separan debido a la ruptura de los puentes de hidrógeno entre bases complementarias. Cuando se realiza un estudio de RNA, que no adopta la conformación de doble hebra, el proceso de denaturación permite desestabilizar el plegamiento que el RNA adquiere naturalmente. Al someter esta solución de DNA o RNA denaturado a una temperatura de 65°C por un período prolongado de tiempo, puede ocurrir una hibridización (renaturación), que restablece la conformación natural de la molécula. De acuerdo a las condiciones experimentales, la hibridización puede ocurrir entre dos cadenas cualesquiera de ácidos nucleicos (DNA con DNA, RNA con RNA o DNA con RNA), siempre cuando ellas posean secuencias de nucleótidos complementarias. Esta última propiedad es aprovechada por el método para producir un apareamiento, de alta especificidad, entre una secuencia particular de DNA o RNA presente en la célula y una secuencia de DNA o RNA conocida, debidamente marcada (sonda), producida en el laboratorio. Las sondas se marcan uniendo a ellas elementos que puedan observarse al microscopio como:

isótopos radioactivos, que se detectan por autorradiografía moléculas fluorescentes (fluorocromo) que se estudian al microscopio bajo luz UV enzimas tales como peroxidasa o fosfatasa alcalina, cuya localización se puede detectar

revelando su actividad enzimática según lo descrito anteriormente. Sin embargo, el método más usado actualmente, es la síntesis de nucleótidos que contienen

una cadena lateral modificada por la adición de digoxigenina, un esteroide de origen vegetal. Estos nucleótidos son reconocidos por la DNA polimerasa e incorporados a las sondas sintetizadas. La digoxigenina es luego localizada mediante anticuerpos antidigoxigenina marcados con colorantes fluorescentes, que se visualizan al microscopio de luz UV, o enzimas cuya presencia se puede revelar mediante técnicas histoquímicas.

b) Localización de mRNA

Los granos de autorradiografía se ubicarán exclusivamente sobre el citoplasma de las células que presenten mRNA de secuencias complementarias a las de la sonda que se usó para la detección.