INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

8/4/2019 INTRODUCCIN A LAS TCNICAS HISTOLGICAS

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INTRODUCCIN A LAS TCNICAS

HISTOLGICASDR. M.V.Z. RICARDO GUARDIA SARU

DOCENTE HISTOLOGA I YEMBRIOLOGAUNITEPC


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INTRODUCCIN

Se define tcnica histolgica al conjunto deoperaciones a que se somete una materia organizada,a fin de posibilitar su estudio al microscopio.

El examen al microscopio se hace generalmente por luz

transmitida, lo que significa que la luz debe "atravesar"el objeto a examinar para llegar, despus de haberpasado por las distintas lentes del aparato, aimpresionar a nuestro rgano visual. Por esa causa,debe ser reducido a lminas muy delgadas y

transparentes, las cuales lograremos efectuando unaserie de operaciones que sern descriptas msadelante.


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PASOS DE LA TCNICA HISTOLGICA

OBTENCIN DEL MATERIAL

FIJACIN

DESHIDRATACIN

ACLARACIN

INCLUSIN EN PARAFINA

OBTENCIN DE CORTES

COLORACIN

MONTAJE


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OBTENCIN DE LA PIEZA


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OBTENCIN DE LA MUESTRA

El material a utilizar puede ser extrado de losdiversos animales de laboratorio, o bienpuede tratarse de material humano. Entre los

animales de observacin se eligen aquellosque por su semejanza con el ser humanopueden sustituirlo sin grandes diferencias, y

cuya obtencin y crianza puede ser fcilmenteefectuada en el laboratorio.


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FASES EN LA OBTENCIN DEMATERIAL ANIMAL

Muerte del animal:

podemos producirla valindonos de un traumatismo brusco, o por laintoxicacin a causa de una dosis exagerada de narctico.

Extraccin de los rganos:

conociendo la anatoma del animal, debemos dirigirnos directamentea los rganos que nos interesan estudiar. En el caso de que estos seanvarios, es conveniente extraer primero los que ms fcilmente sedescomponen, estos son el pncreas y la porcin inferior del tubodigestivo.

Reduccin a piezas: teniendo en cuenta que para el tamao de las piezas debemos

considerar muy especialmente las cualidades del fijador a usar,hablaremos de este asunto cuando tratemos la fijacin.


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OBTENCIN DEL MATERIAL

Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadver. Para histologa

normal es necesario que se trate de un cadver fresco y que nohaya sido atacado por ninguna lesin, por lo menos el rganoque se quiere estudiar.

Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con

el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnsticohistopatolgico.

Piezas operadas: los tejidos que han sido extrados de las intervenciones

quirrgicas, generalmente tumores u rganos inflamados,tambin pueden darnos material de investigacin pero, como enel caso anterior, slo servirn para anatoma patolgica.


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FIJACIN


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INTRODUCCIN

La fijacin tiene por objeto matar las clulas yconservarlas, hasta donde sea posible, en el estado enque se encontraban durante la vida. Por lo tanto es unmtodo histolgico destinado a obtener preparados

duraderos que conservan la estructura morfolgica yqumica de las clulas y tejidos al estado vivo y quepermite realizar, posteriormente, los procedimientosde coloracin o de identificacin que facilitan el

completo conocimiento de su constitucin ntima. Se llaman fijadores a las sustancias qumicas o a los

agentes fsicos que se utilizan para tal fin.


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CUALIDADES DE LOS FIJADORES

Actuar con rapidez, matando y fijando a lasclulas antes de que aparezcan los fenmenosagnicos o post-mortem (autolisis,

desintegracin, etc.). Poseer alto poder de penetracin para

asegurar la fijacin correcta hasta en las capas

profundas de la pieza a fijar. Conservar, en lo posible, los detalles

estructurales que presentaban in vivo.


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CUALIDADES DE LOS FIJADORES

Permitir o favorecer el empleo de losprocedimientos necesarios para suobservacin ulterior (ejecucin de cortes,

coloracin, etc.). Impedir la desaparicin de los elementos

solubles durante la fijacin o despus de ella.

No provocar o impedir la produccin deestructuras artificiales.

No retraer excesivamente los tejidos ni

volverlos friables o quebradizos.


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MANERA DE ACTUAR DE LOSFIJADORES

Vara con la composicin o naturaleza de los mismos:coagulando las protenas sin combinarse con ellas(alcohol, cido pcrico, yodo, calor), formandocombinaciones qumicas con las sustancias orgnicas

(cido crmico y sus sales), o reducindose en contactocon las mismas y originando en su seno un precipitadosumamente fino (cido smico, bicloruro de mercurio,cloruro de oro).

La mayor parte de los fijadores actan como oxidantes,favoreciendo as la coloracin ulterior de los tejidos .


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AGENTES FIJADORES

Los agentes fijadores pueden ser de orden fsico o de ordenqumico.

AgentesFsicos: Fro

Calor

Agentes qumicos: cido actico

cido smico

cido pcrico Alcohol metlico

Alcohol etlico

Bicromatos

Formaldehdo


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FIJADORES SIMPLES

Formol al 10%, es el ms usado. Su empleo es aconsejableen todos los casos en que no se disponga de un fijadorespecial, principalmente cuando se trata de fijar rganos otejidos para estudios histolgicos topogrficos.

Alcohol etlico absoluto o de 96%, se usa generalmente enmicroqumica.

Alcohol metlico, se lo emplea con frecuencia para fijarfrotis desecados (sangre, mdula sea, ganglio, bazo,lquidos de puncin, etc.).

cido smico al 1 2%, es poco penetrante pero enrgico,conserva muy bien estructuras celulares. Bicromato de potasio al 3-5%.


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FIJADORES COMPUESTOS

En su composicin intervienen un nmerovariable de fijadores simples racionalmenteelegidos con el fin de completar la accin de cada

uno de ellos o atenuar sus defectos. Lquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-actica.

Lquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-actica.

Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol. Lquido de Bouin, mezcla picro-formos-actica.

Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohlico.


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FIJADORES FSICOS

Desecacin.

Calor seco.

Calor hmedo. Fro.

Congelacin y desecacin


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DESHIDRATACINACLARACININCLUSIN EN PARAFINA


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DESHIDRATACIN

Las piezas al ser retiradas del fijador, o despusde haberlas lavado, estn embebidas en agua;impidiendo que sean penetradas por la parafina.

Por lo tanto, en primer lugar, debemosdeshidratar los tejidos sumergindolos enlquidos anhidros, vidos de agua. Para evitaralteraciones provocadas por una deshidratacin

brusca, se aconseja proceder escalonadamenteutilizando, preferentemente, alcohol etlico degraduacin creciente.


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Se dispone una lmina

en un cassette dedeshidratacin.

Deshidratacin en alcoholes sucesivos


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Deshidratacin en alcoholes sucesivos.


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IMPREGNACIN POR UN DISOLVENTEDE LA PARAFINA (ACLARACIN)

Las piezas perfectamente deshidratadas sesumergen en el disolvente, xilol o toluol. Alagregar el Xilol, no debe aparecer ningunaturbidez.

Si se pone blanco lechoso es que ladeshidratacin no ha sido bien lograda ydebemos repetir el bao de alcohol absoluto

cerciorndonos que realmente lo sea: una gotade alcohol agregada a unos ml de toluol no debeenturbiarlo.


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PENETRACIN DE LA PARAFINA

Se sumergen las piezas en parafina (56 - 58de punto de fusin), mantenida lquida en laestufa a no ms de 62 C. Despus de 1 a 2

horas se renueva la parafina.


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INCLUSIN DEFINITIVA OFORMACIN DEL BLOQUE

En moldes de papel o de metal ad-hoc (barrasde Leuckart) se vierte la parafina fundida, delmismo punto de fusin de la que ha servidopara la penetracin. Se colocan las piezasorientndolas y luego se pone el molde en

heladera.

Barras de Leuckart


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INCLUSIN DEFINITIVA OFORMACIN DEL BLOQUE

A los 15 30 minutos la parafina se habrsolidificado completamente, recortamos los

bloques en forma de pirmide cuadrangulartruncada, lo adherimos a un taquito demadera mediante una esptula calentada con

la llama de un mechero y ya podemos realizarlos cortes con el micrtomo.

Taco para cortar.


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p


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OBTENCIN DE CORTES


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OBTENCIN DEL CORTE

El objeto de la inclusin que hemos descriptoanteriormente es hacer posible la reduccindel tejido a cortes lo suficientemente delgados

como para permitir el paso de la luz paraexaminarlo al microscopio. Los micrtomosson instrumentos de gran precisin que nos

proporcionan cortes delgados parejos y deespesor graduable. Los cortes ms corrientesson los de 4-6 micrones.


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MICRTOMOS

Tipo deslizamiento:

en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla sedesliza por unas guas especiales merced a un soporte

al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos. Tipo Minot:

en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la quese desliza sujeta a una platina, sta se desliza

verticalmente cuando se hace girar una manivela.Permite obtener cortes seriados en forma de cinta.

Corte en micrtomo tipo Minot.


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Micrtomo tipo deslizamiento


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MICRTOMOS

Tipo congelacin: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en lugar

de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato secaracteriza por tener un sistema de congelacin colocadodebajo de la platina que utiliza la expansin brusca del

anhdrido carbnico contenido en un cilindro con el cual secomunica.

Criostato: consta de un micrtomo tipo Minot incluido en una cmara de

congelacin. El volante de inercia que controla la realizacin delcorte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y elmecanismo de avance estn situados dentro de la cmara fra(normalmente a -20 C). El criostato posee la gran ventaja depermitir la obtencin de cortes mucho ms delgados (por logeneral de 4 m y, en manos experimentadas, hasta 2 m).


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Criostato


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EXTENSIN EN PLACA

Los cortes de parafina se extienden, alobtenerlos del micrtomo, en agua tibiacontenida en un cristalizador. En ese mismo

agua se introducen portaobjetos, previamentedesengrasados, cubiertos con una capa deadhesivo de Mayer y, con la ayuda de una

aguja histolgica, se colocan los cortes sobreel portaobjetos y a continuacin se lo levanta.


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Una vez se hall d


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retallado ydesbastado el bloque

se obtienen lassecciones en tiras

que sern colocadassobre un

portaobjetos cubiertocon agua calentada a

unos 40 C. Elportaobjetos ha sido

tratado previamenteson solucionesadhesivas. El calor yla hidrofobicidad dela parafina hace que

las secciones se

estiren sobre lasuperficie del agua yuna vez evaporada

queden adheridas alportaobjetos


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COLORACIN


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COLORACIN

Luego de realizado el corte, se procede arehidratarlo para permitir su coloracin.

Colorantes:

reciben esta denominacin las sustancias que puedenconferir color a otros cuerpos.

Coloracin: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teido

por una sustancia colorante, sin perder el colorcuando es lavado con el disolvente utilizado alpreparar la solucin colorante.


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CLASIFICACIN DE LOS COLORANTES

COLORANTES NATURALES:

Animales (carmn)

Vegetales (hematoxilina, orcena, azafrn)

COLORANTES ARTIFICIALES O SINTTICOS :

cidos: sales cuya base es incolora y su cido es coloreado (eosina oeosinato de sodio). Son colorantes citoplasmticos.

Bsicos: sales cuya base es coloreada y el cido es incoloro (azul demetileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.

Neutros: sales en las que tanto el cido como la base son coloreados.

Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. Indiferentes: no forman sales. Tien aquellas sustancias que tienen un

poder disolvente superior al del lquido que ha servido para prepararla solucin colorante (Sudn lll, rojo escarlata).


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MTODOS DE COLORACIN

Coloracin directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto.

Coloracin indirecta: requiere la intervencin de intermediarios o mordientes para

que la coloracin tenga lugar.

Coloracin progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto ptimo.

Coloracin regresiva: se realiza primero una sobrecoloracin y luego se elimina el

resto del colorante por medio de diferenciadores. A esteproceso se lo denomina diferenciacin.


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MTODOS DE COLORACIN

Coloracin simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado

(ncleo, fibras elsticas, etc.).

Coloracin combinada: se tien los elementos nucleares y citoplasmticos

recurrindose, generalmente, al empleo sucesivo de coloresbsicos y cidos que contrastan por sus colores.

Coloracin panptica: es una coloracin combinada realizada sucesivamente por

colorantes neutros (May-Grnwald-Giemsa).

Coloracin pancrmica: en un solo bao colorante actan todos los colorantes neutros

que se necesiten.


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MTODO DE COLORACIN


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HEMATOXILINA

Es un colorante vegetal.

Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Losagentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de

exposicin) u oxidantes artificiales (xido de mercurio,permanganato de potasio, dicromato potsico, etc.)

Es un colorante directo, pero en la prctica se lo utilizaen forma de lacas hematoxilnicas (se utiliza alumbre

de potasio o de sodio como mordiente para preparar lasolucin colorante), comportndose en este caso comoun colorante indirecto.


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EOSINA

Es un colorante artificial (se trata de derivadoshidroxixantnicos halogenados con tresgrupos arilo).

Presenta autofluorescencia espontnea.

Se la emplea tanto en soluciones acuosascomo alcohlicas.


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RESULTADO

LA CROMATINA NUCLEAR YCOMPUESTOS BASFILOS APARECEN

ENAZULPORLAHEMATOXILINA. ELCITOPLASMA, COLGENO Y

COMPUESTOS ACIDFILOS SE TIENENROSAOROJOPORLAEOSINA.


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Batera de Tincin Hematoxilina Eosina


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Pasos que se siguen durante una tincingeneral de hematoxilina-eosina. Los tiempos


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general de hematoxilina eosina. Los tiemposson aproximativos porque dependen del grosor

de los cortes y de la concentracin de loscolorantes. El desparafinado permite eliminar el

medio de inclusin, la parafina. El paso poragua de grifo es tpico de la hematoxilena y se

denomina diferenciacin.Las sales del agua permiten obtener una

coloracin ms violcea, en vez de prpura. Ladeshidratacin final es necesaria porque el

medio de montaje no suele ser hidrosoluble.Estos medios de montaje no afectan al tejido, ni

a los colorantes y tienen unas propiedadespticas excelentes. Adems, conservan las

preparaciones durante aos en buenascondiciones. Tras el montado y secado

(evaporacin del xileno), las secciones se puedeobservar con el microscopio ptico.


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MONTAJE


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MONTAJE

Luego de la coloracin, se deshidrata el corte yse procede a la aclaracin y montajedefinitivo, dado que nos hemos propuesto

hacer un preparado en condiciones de serobservado y protegido del ambiente paraevitar su deterioro.

La deshidratacin se realiza con alcoholes degraduaciones crecientes.


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MONTAJE

La aclaracin se realiza con xilol o carboxilol. Elobjetivo de este paso es impregnar el corte conun disolvente del Blsamo de Canad, que almismo tiempo le confiere un ndice de refraccin

semejante al del vidrio. Para el montaje se limpia el portaobjeto

alrededor del corte y se deposita sobre el mismouna gota de Blsamo de Canad disuelto en xilol

y se cubre con un cubreobjeto. Se deja secar unas horas antes de su observacin

al microscopio


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PROCESO HISTOLGICOTIEMPOS (minutos)


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PROCESO TIEMPOS (minutos)BaoMara Horno deMicroondas Estufa deParafinacin TemperaturaAmbiente

Fijacin:Formol 30 30 30 12 24 (hrs.)

Deshidratacin:Alcohol 1 10 5 30 30 60Alcohol 2 10 5 30 30 60Alcohol 3 10 5 45 30 60Alcohol 4 10 5 30 60Alcohol 5

10

5

30

60

Alcohol 6 10 5 30 60Aclaracin:

Xilol 1 5 3 30 20 - 40Xilol 2 5 3 30 20 40Xilol 3 5 3 45 20 40Xilol 4 5 3 20 40

Parafinacin:Parafina 1 10 10 30 10Parafina 2 10 10 45 10Parafina 3 10 10 45 10Parafina 4 10 10 10Parafina 5 15 15 15


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PROTOCOLO GENERAL

Fijacin En formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua

destilada) por lo menos durante 6 hs.

Corte Se le da el tamao deseado a la pieza y se la coloca en una bolsa

de gasa, con el fin de enjuagarla en agua corriente durante, porlo menos, 15'.

Deshidratacin Alcohol 70, 1h30'. Alcohol 96, 1h30'. Alcohol 100 (l), 1h30'. Alcohol 100 (ll), 1h30'. Toluol, entre 1h30' y 3hs.


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PROTOCOLO GENERAL

Inclusin Secado de la muestra con gasa.

Parafina 56 (l), 1h30'.

Parafina 56 (ll), 1h30'. Formacin de la barra.

30' de frezzer.

Fractura del taco Corte


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PROTOCOLO GENERAL

Coloracin Secado de los cortes en estufa a 58C, 15'.

Xilol o toluol (I), 15' en estufa.

Xilol o toluol (II), 2'.

Alcohol 100, 30".

Alcohol 96, 30".

Alcohol 70, 30". Alcohol 50, 30".

Agua destilada, 30".

Hematoxilina, 130".

Agua corriente, 2.

Alcohol 50, 15".

Eosina, 30". Alcohol 96, 10".

Alcohol 100, 10".

Xilol, 1 por lo menos.

Montaje con Blsamo de Canad sinttico.

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