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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Química
São Paulo
Data do Depósito na CPG: 27/03/2009
MMeettaallooffáárrmmaaccooss ddee rruuttêênniioo:: ssíínntteessee,, ccaarraacctteerriizzaaççããoo,, aattiivviiddaaddee ffrreennttee àà lliinnhhaaggeemm cceelluullaarr KK556622 ee eessttuuddooss ddee
iinntteerraaççããoo ccoomm aallbbuummiinnaa ddee ssoorroo hhuummaannaa ((HHSSAA))
Renata Rolim Prudente dos Santos
ii
RENATA ROLIM PRUDENTE DOS SANTOS
MMeettaallooffáárrmmaaccooss ddee rruuttêênniioo:: ssíínntteessee,, ccaarraacctteerriizzaaççããoo,, aattiivviiddaaddee ffrreennttee àà lliinnhhaaggeemm cceelluullaarr KK556622 ee eessttuuddooss ddee iinntteerraaççããoo ccoomm
aallbbuummiinnaa ddee ssoorroo hhuummaannaa ((HHSSAA)) Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Doutora em Química área de
concentração Química Inorgânica
Orientadora Profª. Drª Denise de Oliveira Silva
São Paulo 2009
iii
Renata Rolim Prudente dos Santos Metalofármacos de rutênio: síntese, caracterização, atividade frente à linhagem celular K562 e estudos de interação com albumina de soro humana (HSA) Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Doutora em Química área de
concentração Química Inorgânica
Aprovado em: ____________ Banca Examinadora Prof. Dr.____________________________________________________________________ Instituição:__________________________________________________________________ Assinatura:__________________________________________________________________ Prof. Dr.____________________________________________________________________ Instituição:__________________________________________________________________ Assinatura:__________________________________________________________________ Prof. Dr.____________________________________________________________________ Instituição:__________________________________________________________________ Assinatura:__________________________________________________________________ Prof. Dr.____________________________________________________________________ Instituição:__________________________________________________________________ Assinatura:__________________________________________________________________
iv
À minha mãe e ao meu pai pelo seu amor, carinho e constante. apoio em toda a minha vida.
AMO VOCÊS!
v
Ao Daniel por estar sempre
ao meu lado me dando carinho e apoio.
vi
AAAGGGRRRAAADDDEEECCCIIIMMMEEENNNTTTOOOSSS
A profª Drª. Denise, por me aceitar em seu laboratório, pela confiança, pelos
ensinamentos, por me fazer uma profissional melhor durante estes 5 anos,
Ao Prof. Dr. Breno Pannia Espósito por toda a ajuda e paciência em esclarecer
algumas de minhas dúvidas durante o doutorado e pela doação das células K562;
À Profª. Drª. Márcia Laudelina Arruda Temperini, Drª Celly Mieko Shinohara e
Daniela Colevati pela ajuda com os espectros Raman
Ao Prof. Dr. Henrique E. Toma e Drª Anamaria D. P. Alexiou pelos espectros
eletrônicos no estado sólido;
À Profª. Drª. Neyde Yukie Murakami Iha pela utilização do espectrofluorímetro
À Profª. Drª. Ana Maria da Costa Ferreira e Profª. Drª Vera L. Constantino pela
ajuda e contribuição científica;
Ao Prof. Dr. Maurício da Silva Baptista por me deixar cuidar das minhas células em
seu laboratório;
À Profª. Drª. Alicia J. Kowaltowski pelo uso da autoclave e do frezzer -70º;
As amigas Karina, Mariana, Vivian e Ana Valéria pelas discussões científicas e não
científicas, pelo carinho e amizade;
Ao Otávio, Sérgio e Leonardo pela amizade, pelos conselhos e conversas bem
divertidas;
Ao Douglas, Rodrigo, Andréia, Débora, Rachel, João, Alan, aoss mais novos
integrantes do grupo Iguatinã, Carolina e Jaqueline e pelos que passaram pelos grupo,
Geise, Ana Celília, Leila, Felipo, Renata e Claudia pelo companheirismo, discussões e pelas
boas risadas dadas juntos;
À Cida pelo apoio técnico imprescindível nestes 5 anos;
vii
Ao Sr. Guilherme Machado, Quiral, pela doação do fármaco Platinil®;
Ao Antonio pelos ensinamentos na técnica de dicroísmo circular;
Ao Marcio, Luzia, Fernando e Adriana pelas análises realizadas na Central Analítica;
Ao Alfredo que me ajudou muito com as análises estatísticas e com os filmes para
difração de raio X;
Ao Ricardo pela grande ajuda com as TGs de última hora;
A todos os funcionários do IQ-USP que de alguma forma contribuíram com esta tese;
Ao meu amigo Luciano Cardoso que sempre diz que os químicos são imortais, com
este trabalho acho que me torno um pouquinho imortal como ele sempre diz;
As professoras Maria Antonieta, Valéria e Sandra cada uma do seu jeito me mostrou
como a química era interessante,
Aos amigos Samanta e Fernando pelos momentos de descontração durante estes 5
anos;
Ao amigo Angersom pelo incentivo para vir fazer pós graduação aqui na USP;
À amiga Márcia pelo apoio e carinho, mesmo que a distância;
À professora Drª Wania da Conceição Moreira pelos primeiros ensinamentos na
minha vida acadêmica;
À amiga Patricia que na reta final da redação me ajudou a “diminuir o peso da tese”
na minhas costas;
Ao meus irmãos Rafael e Rodrigo pelo apoio, carinho e cuidado;
A minha mãe, Nizi, por seu exemplo de competência e profissionalismo, pelo seu
apoio e amor;
Ao meu papito, Sérgio, por nossas conversas, pelos socorros nas horas mais difíceis e
pelo seu amor incondicional;
viii
A Deus por colocar na minha vida pessoas maravilhosas que me ajudaram, cada uma
da sua maneira, a crescer como ser humano;
Ao CNPq pela bolsa de pós graduação e à FAPESP pelo suporte financeiro.
ix
“A maior recompensa do nosso trabalho não é o que nos pagam por ele, mas aquilo em que ele nos transforma.”
John Ruskin
x
RRREEESSSUUUMMMOOO
Santos, R.R.P. Metalofármacos de rutênio: síntese, caracterização, atividade frente à
linhagem celular K562 e estudos de interação com albumina de soro humana (HSA). 2009.
Número de páginas do trabalho 135p. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em
Química, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
Este trabalho trata do estudo de complexos de rutênio contendo antiinflamatórios não-
esteróides, com o objetivo de contribuir para ampliar as pesquisas na área de potenciais
metalofármacos antitumorais.
A partir de reações do precursor dimetálico [Ru2(O2CCH3)4Cl] com os fármacos
carboxílicos sulindaco (HSulin) e diclofenaco de sódio (NaDiclofen) foram isolados,
respectivamente, os correspondentes complexos [Ru2(Sulin)4Cl] e [Ru2(Diclofen)4Cl]. A
reação entre o monômero [RuCl2(dmso)4] e o meloxicam (H2Melox) deu origem ao derivado
misto [Ru(dmso)2(HMelox)2]. Os compostos foram caracterizados por meio de análise
elementar, medidas de condutância molar, medidas de susceptibilidade magnética,
espectroscopia de absorção eletrônica UV-VIS-IR, espectroscopia vibracional FTIR e Raman,
e estudos de análise térmica (TG/DSC/MS).
As interações da albumina de soro humana HSA, importante proteína do plasma, com
os complexos obtidos, com o análogo [Ru2(IBP)4Cl] (HIBP = ibuprofeno) e também com os
fármacos orgânicos não-complexados foram investigadas empregando-se dicroísmo circular,
SDS-Page e fluorescência.
A atividade antitumoral dos metalofármacos foi avaliada, através de ensaios com
MTT, com base nos seus efeitos citotóxicos para a linhagem celular de leucemia humana
K562.
Palavras chaves: rutênio, HSA, K562, Faines, dicroísmo circular e fluorescência
xi
AAABBBSSSTTTRRRAAACCCTTT
Santos, R.R.P. Ruthenium metallodrugs of diclofenac, sulindac and meloxicam: synthesis,
characterization, activity against K562 cell line and interaction with human serum albumin
(HSA).. 2009. Número de páginas 135p. PhD Thesis – Graduate Program in Chemistry.
Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
This work describes the study of ruthenium complexes containing non-steroidal anti-
inflammatory drugs with the aim of helping to expand the research in the field of potential
anticancer metallodrugs.
Reactions of the [Ru2(O2CCH3)4Cl] dimetal complex with sulindac (HSulin) and
sodium diclofenac (NaDiclofen) carboxylic drugs gave the correspondent complexes
[Ru2(Sulin)4Cl] and [Ru2(Diclofen)4Cl], respectively. The reaction between the
[RuCl2(dmso)4] monomer and the meloxicam drug (H2Melox) led to the mixed derivative
[Ru(dmso)2(HMelox)2]. The compounds were characterized by elemental analysis, molar
conductance measurements, magnetic susceptibility, UV-VIS-IR electronic absorption
spectroscopy, Raman and FTIR vibrational spectroscopies and by studies of thermal analysis
(TG / DSC / MS).
The interactions of human serum albumin (HSA), the major plasma protein, with the
obtained complexes, the analogous [Ru2(IBP)4Cl] (= HIBP ibuprofen) and also with the non-
coordinated organic drugs have been investigated by circular dichroism, SDS-Page and
fluorescence.
The antitumor activity of the metallodrugs has been evaluated by MTT assays, on the
basis of their cytotoxic effects on K562 human leukemia cell line.
Keywords: ruthenium, HSA, K562, circular dichroism and fluorescence.
xii
LLLIIISSSTTTAAA DDDEEE AAABBBRRREEEVVVIIIAAATTTUUURRRAAASSS EEE SSSIIIGGGLLLAAASSS
Abs. Absorbância
Ac Acetato
CD: Dicroísmo Circular
DMSO: Dimetilsulfóxido (C2H6SO)
DSC: Diferential Scanning Calorimetric (calorimetria exploratória diferencial)
DTA: Diferential Thermal Analysis (análise térmica diferencial)
DTG: Termogravimetria derivada
EtOH: Etanol (C2H6O)
FAINES Fármacos Antiinflamatórios Não Esteróides
H2Melox Meloxicam
HDiclofen: Diclofenaco ácido (C14H11Cl2NO2)
HIBP: Ibuprofeno (C13H18O2)
HIm imidazol
HInd indazol
HSA: Human Serum Albumin (albumina de soro humana)
HSulin: Sulindaco ácido(C20H17FO3S)
MTT: Brometo de 3 -2,5-difeniltetrazólio
NaDiclofen Diclofenaco Sódico (Na C14H10Cl2NO2)
PAGE: Gel de Poliacrilamida
RPMI Roswell Park Memorial Institut
Ru2Diclofen: [Ru2(Diclofen)4Cl ]·4H2O
Ru2IBP: [Ru2(IBP)4Cl]·1/2H2O
Ru2Sulin: [Ru2(Sulin)4Cl]·6H2O
RuAc: [Ru2(Ac)4Cl]
xiii
RuDMSO: [Ru(dmso)4Cl2]
RuHMelox: [Ru (HMelox)2Cl2]·2 H2O
SBF: Soro Bovino Fetal
SDS: Dodecilsulfato de sódio
T% Porcentagem de Transmitância
Temed: N,N,N’,N’-Tetrametiletilenodiamino
ICP-AES Espectrometria de emissão atómica por indução eléctrica de plasma
TG: Termogravimetria
xiv
LLLIIISSSTTTAAA DDDEEE FFFIIIGGGUUURRRAAASSS
Figura 1- NAMI-A [Ru (DMSO) Cl4-(Im)......................................................................... - 3 -
Figura 2- HInd[RuInd2Cl4]................................................................................................ - 3 -
Figura 3 - Estrutura do [Ru2(O2CR )4]+. ............................................................................. - 4 -
Figura 4 – Representação da estrutura primária da Albumina Humana. ............................. - 7 -
Figura 5 - Estrutura α-hélice. ............................................................................................. - 8 -
Figura 6 - Estrutura folha ß................................................................................................ - 8 -
Figura 7 - Sítios de ligação da HSA................................................................................. - 10 -
Figura 8 – Sulindaco. ...................................................................................................... - 12 -
Figura 9 – Diclofenaco. ................................................................................................... - 12 -
Figura 10 – Ibuprofeno.................................................................................................... - 12 -
Figura 11 – Meloxicam. .................................................................................................. - 12 -
Figura 12 - Esquema da placa de 6 poços ........................................................................ - 28 -
Figura 13 - Câmara Neubauer.......................................................................................... - 28 -
Figura 14 - Esquema de como adicionar a solução com células na câmara de contagem. . - 28 -
Figura 15- Esquema de contagem utilizando a câmara Neubauer. .................................... - 29 -
Figura 16 - Grumos de Células ........................................................................................ - 30 -
Figura 17 - Esquema divisão da suspensão celular........................................................... - 31 -
Figura 18- Garrafa com células (a) adição recente de meio, (b) 24h após adição de meio. - 32 -
Figura 19 - Tubo Falcon com a solução de células após centrifugação............................. - 33 -
Figura 20 - Vials dentro do suporte para congelamento. .................................................. - 34 -
Figura 21 - Células vivas e mortas após adição do azul de Tripam................................... - 34 -
Figura 22 – Placa de 96 poços após a adição dos complexos e antes da incubação. .......... - 35 -
Figura 23 – Placa após adição da solução de MTT........................................................... - 36 -
xv
Figura 24 – Placa após 4h de incubação na estufa. ........................................................... - 36 -
Figura 25 – Cristais presentes no fundo dos poços. .......................................................... - 36 -
Figura 26 – Placa após a adição de DMSO ...................................................................... - 36 -
Figura 27 - Espectro eletrônico do complexo Ru2Ac em água.......................................... - 39 -
Figura 28 - Esptro eletrônico dos complexos Ru2Sulin e do fármaco HSulin em metanol. - 40 -
Figura 29 – Espectro eletrônico do NaDiclofen em água.................................................. - 41 -
Figura 30 - Espectros eletrônicos do complexo Ru2Diclofen em duas concentrações (—)
2,75x10-5 e (—) 1,46x10-2. .............................................................................................. - 41 -
Figura 31 - Espectro eletrônico do complexo RuDMSO em água. ................................... - 43 -
Figura 32 - Espectro eletrônico dos complexos RuHMelox e do fármaco Meloxicam em
metanol. .......................................................................................................................... - 44 -
Figura 33 - Espectros FTIR do fármaco HSulin. .............................................................. - 45 -
Figura 34 - Espectros FTIR e Raman do complexo Ru2Sulin ........................................... - 46 -
Figura 35 - Espectro FTIR do fármaco NaDiclofen.......................................................... - 48 -
Figura 36 - Espectros FTIR e Raman do complexo Ru2Diclofen...................................... - 49 -
Figura 37 - Espectros Raman do complexo Ru2Sulin e do Sulindaco. .............................. - 50 -
Figura 38 - Espectros Raman do complexo Ru2Diclofen e do Diclofenaco sódico. .......... - 51 -
Figura 39 - Espectro FTIR do fármaco Meloxicam. ......................................................... - 52 -
Figura 40 - Espectros FTIR e Raman do complexo RuHMelox........................................ - 53 -
Figura 41 – Curvas TG, DTG e DSC do Ru2Sulin. .......................................................... - 58 -
Figura 42– Espectros de massa obtidos dos principais produtos gasosos da decomposição
térmica do complexo Ru2Sulin. ....................................................................................... - 58 -
Figura 43 - Curvas TG, DTG e DSC do Ru2Diclofen....................................................... - 59 -
Figura 44 - Espectros de massa obtidos dos principais produtos gasosos da decomposição
térmica do complexo Ru2Diclofen. .................................................................................. - 59 -
xvi
Figura 45 – Complexo Ru2Sulin (A) e Ru2Diclofen (B) antes e depois de calcinado à 1000ºC.-
60 -
Figura 46 – Difratogramas dos resíduos de decomposição térmica do complexo Ru2Sulin
aquecidos em estufa a 1000 oC. ....................................................................................... - 60 -
Figura 47 – Difratogramas dos resíduos de decomposição térmica dos complexo Ru2Diclofen
aquecidos em estufa a 1000 oC. ....................................................................................... - 61 -
Figura 48 - Curvas TG, DTG e DSC do RuHMelox......................................................... - 62 -
Figura 49 - Espectros de massa obtidos dos principais produtos gasosos da decomposição
térmica do complexo RuHMelox..................................................................................... - 63 -
Figura 50 – RuHMelox antes e depois de calcinado à 1000ºC.......................................... - 64 -
Figura 51 - Difratograma do resíduo de decomposição térmica, à 1000ºC, do complexo
RuHMelox. ..................................................................................................................... - 64 -
Figura 52 - Estrutura otimizada para o complexo [Ru2(Sulin)4Cl], cores: azul claro –
C;marrom – Ru; vermelho – O; amarelo – S; verde – Cl; lilás – F. Os hidrogênios foram
omitidos para uma melhor visualização da estrutura. ....................................................... - 65 -
Figura 53 - Estrutura otimizada para o complexo [Ru2(Diclofen)4Cl], cores: azul claro –
C;marrom – Ru; vermelho – O; azul escuro – N; verde – Cl;. Os hidrogênios foram omitidos
para uma melhor visualização da estrutura....................................................................... - 66 -
Figura 54 – Esquema proposto para a síntese do RuHMelox............................................ - 67 -
Figura 55 - Estrutura otimizada para o complexo [Ru2(HMelox)2(DMSO)2], cores: azul claro
– C;marrom – Ru; vermelho – O; azul escuro – N; Os hidrogênios foram omitidos para uma
melhor visualização da estrutura...................................................................................... - 67 -
Figura 56 - Espectro CD da HSA com o Platinil® em diferentes razões molares. ............ - 70 -
Figura 57 - Espectro CD da HSA com o Ru2Ac em diferentes razões molares. ................ - 70 -
Figura 58 - Espectro CD da HSA com o NaDiclofen em diferentes razões molares. ........ - 71 -
xvii
Figura 59 - Espectro CD da HSA com o Ru2Diclofen em diferentes razões molares. ....... - 71 -
Figura 60 - Espectro CD da HSA com o HSulin em diferentes razões molares................. - 72 -
Figura 61 - Espectro CD da HSA com o Ru2Sulin em diferentes razões molares.............. - 72 -
Figura 62- Espectro CD da HSA com o HIBP em diferentes razões molares.................... - 73 -
Figura 63- Espectro CD da HSA com o Ru2IBP em diferentes razões molares................. - 74 -
Figura 64 - Espectro CD da HSA com o RuDMSO em diferentes razões molares............ - 74 -
Figura 65 - Espectro CD da HSA com o H2Melox em diferentes razões molares. ............ - 75 -
Figura 66- Espectro CD da HSA com o RuHMelox em diferentes razões molares. .......... - 75 -
Figura 67 - Estrutura do Triptofano: cores: azul claro – C; vermelho – O; azul escuro – N. Os
hidrogênios foram omitidos para uma melhor visualização da estrutura. .......................... - 80 -
Figura 68 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de Platinil® em diferentes razões
molares. .......................................................................................................................... - 81 -
Figura 69- Espectro de Fluorescência da HSA em presença de Ru2Ac em diferentes razões
molares. .......................................................................................................................... - 82 -
Figura 70- Espectro de Fluorescência da HSA em presença de NaDiclofen em diferentes
razões.............................................................................................................................. - 82 -
Figura 71 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de Ru2Diclofen em diferentes
razões molares................................................................................................................. - 83 -
Figura 72 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de HSulin em diferentes razões
molares. .......................................................................................................................... - 84 -
Figura 73 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de Ru2Sulin em diferentes razões
molares. .......................................................................................................................... - 84 -
Figura 74 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de HIBP em diferentes razões
molares. .......................................................................................................................... - 85 -
xviii
Figura 75 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de Ru2IBP em diferentes razões
molares. .......................................................................................................................... - 85 -
Figura 76 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de RuDMSO em diferentes
razões molares................................................................................................................. - 86 -
Figura 77 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de H2Melox- em diferentes razões
molares. .......................................................................................................................... - 86 -
Figura 78 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de RuHMelox em diferentes
razões molares................................................................................................................. - 87 -
Figura 79 - Espectro de fluorescência da HSA em pH 6,4 para diferentes λ de excitação. - 88 -
Figura 80 - Área integrada do espectro de fluorescência da HSA em pH6,4 com λ de excitação
de 280 nm. ...................................................................................................................... - 90 -
Figura 81 - Área integrada do espectro de fluorescência da HSA em pH6,4 com λ de excitação
de 298 nm. ...................................................................................................................... - 90 -
Figura 82 - Espectros de fluorescência em diferentes pHs................................................ - 91 -
Figura 83 – Gráficos Stern-Volmer para os compostos estudados. ................................... - 98 -
Figura 84 – Gráficos de constante de ligação e número de sítios obtidos a partir da equação
14.................................................................................................................................. - 102 -
Figura 85 - Equipamento de Eletroforese em gel plano e esquema de eletroforese. ........ - 104 -
Figura 86 – Géis do estudo preliminar de SDS-Page...................................................... - 104 -
Figura 87 – Gel SDS para o complexo Ru2Ac................................................................ - 105 -
Figura 88 - Gel SDS para o complexo Ru2Diclofen. ...................................................... - 105 -
Figura 89 - Gel SDS para o complexo Ru2IBP............................................................... - 105 -
Figura 90 - Gel SDS para o complexo Ru2Sulin............................................................. - 105 -
Figura 91 - Redução do MTT a Formazana. .................................................................. - 106 -
Figura 92 – Porcentagem de células vivas em função da concentração de complexo...... - 108 -
xix
Figura 93 – Dados obtidos no primeiro ensaio de MTT. ................................................ - 109 -
Figura 94 – Dados obtidos no segundo ensaio com MTT............................................... - 111 -
Figura 95 - Relação dose-resposta hipotética como distribuição de freqüência (a) e como
distribuição acumulativa de freqüência (b) .................................................................... - 113 -
Figura 96 – Curva dose resposta para o HIBP e o Ru2IBP. ............................................ - 114 -
Figura 97 – Curva dose resposta para NaDiclofen e o Ru2Diclofen................................ - 114 -
Figura 98 – Curva dose resposta para HSulin e o Ru2Sulin. ........................................... - 115 -
Figura 99 – Curva dose resposta para RuHMelox. ......................................................... - 115 -
xx
LLLIIISSSTTTAAA DDDEEE TTTAAABBBEEELLLAAASSS
Tabela 1 - Diluições da solução inicial de HSA. .............................................................. - 17 -
Tabela 2 - Massas e concentrações das soluções, dos fármacos e dos complexos, utilizadas
nos experimentos............................................................................................................. - 18 -
Tabela 3 - Volume (µL) de solução de Composto adicionada à solução de HSA de
concentração 1,5 x 10-5 molL-1 *. .................................................................................... - 18 -
Tabela 4 - Massas e concentrações das soluções, dos fármacos e dos complexos, utilizadas
nos experimentos de fluorescência................................................................................... - 19 -
Tabela 5 - Volume (µL) de solução de Complexo adicionada a solução de HSA*............ - 20 -
Tabela 6 – Volumes em µL das soluções de complexo e de meio para atingir as concentrações
de 20, 40, 60, 80 e 120 µmolL-1 em 300 µL. .................................................................... - 35 -
Tabela 7 - Resultados das análises elementares................................................................ - 38 -
Tabela 8 –Atribuições das bandas observadas nos espetros UV/VIS dos fármacos e dos
complexos de dirutênio. .................................................................................................. - 42 -
Tabela 9 – Atribuições das bandas dos complexos de dirutênio no estado sólido, na região do
infravermelho próximo.................................................................................................... - 43 -
Tabela 10 – Concentração, λmáx, ε e atribuições das bandas observadas nos espetros UV/VIS
dos complexos de dirutênio. ............................................................................................ - 44 -
Tabela 11 - Atribuições tentativas das principais bandas observadas nos espectros do Ru2Sulin
e do HSulin. .................................................................................................................... - 47 -
Tabela 12 - Atribuições tentativas das principais bandas observadas nos espectros FTIR e
Raman do Ru2Diclofen e do fármaco NaDiclofen............................................................ - 49 -
Tabela 13 - Atribuições tentativas para as bandas Raman dos compostos. ....................... - 51 -
xxi
Tabela 14 - Atribuições tentativas das principais bandas observadas nos espectros do
RuHMelox e do H2Melox................................................................................................ - 54 -
Tabela 15 - Susceptibilidades Magnéticas Molares e Momentos Magnéticos Efetivos. .... - 55 -
Tabela 16 - Medidas de condutância molar dos complexos em metanol. .......................... - 56 -
Tabela 17 - Valores das distâncias interplanares para os picos mais intensos do difratograma
do RuO2. ......................................................................................................................... - 61 -
Tabela 18 - Valores das distâncias interplanares para os picos mais intensos do difratograma
do RuO2. ......................................................................................................................... - 64 -
Tabela 19 – Previsão das porcentagens de estrutura secundária da HSA com a adição dos
complexos testados.......................................................................................................... - 76 -
Tabela 20 – Rendimentos Quânticos e porcentagens de supressão calculados. ................. - 92 -
Tabela 21 – Ksv e ks dos complexos estudados p<0,007. .................................................. - 98 -
Tabela 22 – Dados de constante de ligação e número de sítios de ligação p<0,007......... - 102 -
Tabela 23 – Porcentagem de células vivas após a contagem com Tripam para os diferentes
complexos e nas diferentes concentrações ..................................................................... - 108 -
Tabela 24 – Porcentagem de células vivas após a contagem com MTT nos diferentes
complexos e nas diferentes concentrações. .................................................................... - 110 -
Tabela 25 – Porcentagem de células vivas após a contagem com MTT para os diferentes
compostos e nas diversas concentrações. ....................................................................... - 111 -
Tabela 26 – Parâmetros da equação e valores de EC50 obtidos a partir da curva dose resposta. -
116 -
Tabela 27 –Fatores e níveis escolhidos para análise de sua influência na mortalidade das
células K562. ................................................................................................................ - 118 -
Tabela 28 – Analise de variância para estudo da influencia da troca do composto utilizado x a
concentração. ................................................................................................................ - 118 -
xxii
Tabela 29 – Fatores e níveis escolhidos para análise da influência da troca dos ligantes nos
complexos dimetálicos na morte celular. ....................................................................... - 119 -
Tabela 30 – Analise de variância fatorial para estudo da influencia da troca do ligante
utilizado x a concentração. ............................................................................................ - 120 -
Tabela 31 – Fatores e níveis escolhidos para análise da influência da presença da unidade
dimetálica nos complexos na morte celular.................................................................... - 121 -
Tabela 32 – Analise de variância fatorial para estudo da influencia da unidade dimetálica x a
concentração. ................................................................................................................ - 122 -
Tabela 33 – Fatores e níveis escolhidos para análise da influência da troca do ligante nos
complexos monoméricos na morte celular. .................................................................... - 123 -
Tabela 34 – Analise de variância fatorial para estudo da influencia da troca do ligante
utilizado x a concentração ............................................................................................. - 123 -
xxiii
SSSUUUMMMÁÁÁRRRIIIOOO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ - 1 -
1.1 COMPLEXOS DE RUTÊNIO NO MEIO BIOLÓGICO................................................................................. - 1 -
1.2 ALBUMINA HUMANA........................................................................................................................ - 5 -
ESTRUTURA DOS LIGANTES .................................................................................... - 12 -
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... - 13 -
3 PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................... - 14 -
3.1 REAGENTES E SOLVENTES .............................................................................................................. - 14 -
3.2 SÍNTESE DOS COMPLEXOS .............................................................................................................. - 15 -
3.2.1 Síntese do complexo [Ru2(C20H16FO3S)4Cl] (Ru2Sulin)............................................................ - 15 -
3.2.2 Síntese do complexo [Ru2(C14H10Cl2NO2)4Cl] (Ru2Diclofen). .................................................. - 16 -
3.2.3 Síntese do complexo [Ru (C14H12N3O4S2)2(dmso)2 Cl2] (RuHMelox). ...................................... - 16 -
3.3 PREPARO DAS SOLUÇÕES PARA OS EXPERIMENTOS COM HSA........................................................ - 17 -
3.4 EQUIPAMENTOS E TÉCNICAS. ......................................................................................................... - 21 -
3.5 TESTES BIOLÓGICOS. ...................................................................................................................... - 26 -
4 SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DOS COMPLEXOS ........................................ - 37 -
4.1 SÍNTESES ........................................................................................................................................ - 37 -
4.2 ESPECTROS DE ABSORÇÃO ELETRÔNICA ......................................................................................... - 39 -
4.2.1 Espectros dos complexos de dirutênio e dos correspondentes fármacos. ................................. - 39 -
4.2.2 Espectros dos complexos RuDMSO, RuHMelox e do H2Melox. .............................................. - 43 -
4.3 ESPECTROS VIBRACIONAIS FTIR E RAMAN.................................................................................... - 44 -
4.3.1 Composto Ru2Sulin e do fármaco HSulin. ................................................................................ - 44 -
4.3.2 Composto Ru2Diclofen e do fármaco NaDiclofen..................................................................... - 47 -
4.3.3 Espectros Raman na região de freqüência mais baixa. ............................................................ - 50 -
4.3.4 Compostos RuHMelox e H2Melox............................................................................................. - 51 -
xxiv
4.4 SUSCEPTIBILIDADE MAGNÉTICA. ................................................................................................... - 55 -
4.5 MEDIDAS DE CONDUTÂNCIA MOLAR. ............................................................................................ - 56 -
4.6 ANÁLISE DE TG/DSC/MS .............................................................................................................. - 56 -
4.6.1 Curvas TG, DTG e DSC dos complexos Ru2Sulin e Ru2Diclofen. ............................................ - 56 -
4.6.2 Curvas TG, DTG e DSC do complexo RuHMelox .................................................................... - 62 -
4.7 PROPOSTA DE ESTRUTURAS PARA OS COMPLEXOS SINTETIZADOS:.................................................. - 65 -
4.7.1 Ru2Sulin e Ru2Diclofen ............................................................................................................. - 65 -
4.7.2 RuHMelox ................................................................................................................................. - 66 -
5.1 DICROÍSMO CIRCULAR ................................................................................................................... - 68 -
5.2 FLUORESCÊNCIA............................................................................................................................. - 79 -
5.2.1 Determinação do rendimento quântico de emissão a partir de uma amostra padrão 89. ......... - 89 -
5.2.2 Determinação das constantes de SternVolmer para os sistemas estudados. ............................ - 96 -
5.2.3 Determinação do número de sítios de ligação e da constante de ligação HSA-Complexo....... - 99 -
5.3 SDS-PAGE ...................................................................................................................................- 103 -
6 TESTES COM CÉLULAS K562 – RESULTADOS E DISCUSSÕES .................. - 106 -
6.1 TESTE PARA ESCOLHA DO MÉTODO DE CONTAGEM DAS CÉLULAS..................................................- 107 -
6.2 TESTE DE CITOTOXICIDADE COM MTT. .........................................................................................- 110 -
6.3 CURVA DOSE RESPOSTA. ...............................................................................................................- 112 -
6.4 TRATAMENTO ESTATÍSTICO. ..........................................................................................................- 116 -
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................. - 124 -
8 REFERÊNCIAS .................................................................................................... - 128 -
- 1 -
111 IIINNNTTTRRROOODDDUUUÇÇÇÃÃÃOOO
1.1 Complexos de Rutênio no meio biológico.
Muitos metais têm papel importante nos sistemas vivos, uma vez que se ligam e
interagem com moléculas biológicas tais como proteínas e DNA, e apresentam afinidade por
moléculas cruciais para a vida, como oxigênio (O2) e óxido nítrico (NO).
O uso de metais em medicina vem sendo praticado há aproximadamente 5000 anos.
Os egípcios usavam o cobre para esterilizar água e o ouro era usado como medicamento na
Arábia e na China. Os metais mais utilizados na antiguidade eram ouro, prata e platina; pois
se acreditava que por serem nobres trariam algum benefício para o corpo. Somente nos
últimos cem anos é que se começou um estudo efetivo das propriedades medicinais de
compostos metálicos.
A medicina vem se beneficiando com o uso de drogas e agentes diagnosticantes
baseados em compostos inorgânicos. Por isso, vários grupos de pesquisa tem se dedicado à
química sintética de complexos de metais de transição, visando principalmente avaliar e
determinar o potencial terapêutico e ação biológica que estes compostos podem apresentar.
Os estudos sobre a cisplatina constituem, talvez, o maior sucesso da Química
Inorgânica Medicinal, uma vez que a partir do uso clínico do composto, o número de mortes
de homens por tumor de testículos diminuiu cerca de 80%.
Desde então, houve um grande interesse por complexos metálicos como possíveis
agentes terapêuticos. Iniciou-se uma nova era de busca por compostos metálicos com
propriedades farmacológicas, investigação de mecanismos de ação e tentativas de melhorar
atividades de novos e antigos fármacos 1.
- 2 -
O impulso decisivo para o crescimento na área de metalofármacos foi a procura de
novas drogas quimioterápicas alternativas à cisplatina, cis-[PtCl2(NH3)2], que é muito
utilizada na medicina atualmente.
Dentre inúmeros compostos investigados na literatura, estão os complexos de rutênio.
A possibilidade de identificação de uma nova droga anticancer entre complexos de rutênio
tem chamado a atenção de vários pesquisadores. Alguns estudos versam sobre o modo de
ligação, dos íons de rutênio, ao DNA e as vantagens proporcionadas por estes íons nesta
ação2-5. Vários grupos de pesquisas estão aprimorando e desenvolvendo estudos sobre a
aplicação e interação com biomoléculas de complexos de Ru(II) com diferentes ligantes, tais
como: cloroquinona 6; ligantes piridínicos 7-11, arenos 12, 13 e ligantes heterocíclicos 14-16.
Os complexos de Ru(III) mais estudados são aqueles que contém ligantes
heterocíclicos do tipo (HL)[trans-RuCl4L2], sendo L um ligante nitrogenado heterocíclico 17,
18. A classe das aminas de rutênio e as espécies com sulfóxido 5, 18. Os complexos (HL)[trans-
RuCl4(DMSO-S)L], sendo L= imidazol, conhecido como NAMI-A (Figura 1) 19, é um dos
compostos mais promissores, até o momento, sendo o primeiro a entrar para testes clínicos.
Todo este sucesso se dá ao fato do NAMI-A ser particularmente eficiente contra metástase de
tumores experimentais 20, 21, além disso, tem a capacidade de inibir o crescimento de
metástases já estabelecidas 22, de prevenir a formação de metástase 23-25 e, diferentemente da
cisplatina, não apresenta toxicidade significativa. 21.
Outro complexo também bastante interessante é o HInd[RuInd2Cl4], (Ind = indazol)
(Figura 2), KP1019. Existem estudos da interação deste complexo com biomoléculas 26, 27; ele
apresenta atividade contra uma ampla gama de modelos de tumores 17, 28-30 incluindo
carcinomas de colon e já está em fase I de testes clínicos 31.
Embora dois complexos, até o momento, sejam os mais promissores na busca de
novos antitumorais de rutênio e estudos sobre o modo de ação e estrutura tenham sido
- 3 -
realizados, muitos aspectos do mecanismo de ação inibitória do tumor ainda são
desconhecido.
Figura 1- NAMI-A [Ru (DMSO) Cl4-(Im).
Figura 2- HInd[RuInd2Cl4]
Nosso grupo de pesquisa tem investigados a interação de íons metálicos com fármacos
anti-inflamatórios não esteróides (FAINEs) com o objetivo de sintetizar novos
metalofármacos e testar sua atividade biológica. Os fármacos ibuprofeno, naproxeno,
indometacina, sulindaco e diclofenaco são exemplos desta classe de medicamentos que por
possuírem um grupo ácido (-COOH) em sua estrutura podem atuar como ligantes
estabilizando complexos dimetálicos. A escolha dos FAINEs se deve não somente a sua
atividade antiinflamatória, mas também à sua capacidade de prevenir e tratar alguns tumores
descoberta recentemente. FAINEs tais como sulindaco (Figura 8) e indometacina são capazes
de prevenir tumores induzidos em ratos e reduzir adenomas Min em camundongos. Ensaios
clínicos controlados, em humanos, confirmaram que a utilização de
FAINEs reduz o risco de câncer e da formação de polipose adenomatosa familiar 32.
Outras séries de estudos têm sugerido que a ingestão regular de
anti-inflamatórios não esteróides, pode diminuir o risco de câncer de mama 33, câncer de
colon 34, câncer de prostata35, câncer de endométrio 36, câncer de esôfago 37, dentre outros.
Estudos sugerem que o mecanismo de ação dos FAINEs no tratamento do câncer se
através da sua ação na ciclooxigenase 2 (COX2), já que níveis altos de COX-2 tem sido
- 4 -
relatada em alguns tipos de cancer, tais como; de próstata, de mama, de colon, de pâncreas e
de fígado. 35
Como ligantes, os FAINES carboxílicos podem estabilizar espécies com estruturas do
tipo “gaiola” nas quais quatro carboxilatos equatoriais se ligam em ponte a dois íons
metálicos de rutênio (Figura 3) 38.
Figura 3 - Estrutura do [Ru2(O2CR )4]+.
Um dos primeiros trabalhos do grupo mostrou que o complexo, [Ru2(IBP)4Cl]
apresenta atividade anti-inflamatória similares à do fármaco HIBP, porém provocando menor
efeito ulcerativo sobre o estômago do que o fármaco orgânico, in vivo 39
Em outro estudo, foram realizados testes in vitro quanto à ação antiproliferativa sobre
células C6 de glioma de rato, que constituem uma linhagem celular modelo para a espécie de
glioma maligno. Os resultados mostraram que os complexos [Ru2(IBP)4Cl] e [Ru2(NPX)4
(H2O)2]PF6 inibem a proliferação dessas células com mais eficácia que os respectivos
fármacos livres 40.
O desenvolvimento de um complexo metálico para fins terapêuticos requer o
conhecimento dos possíveis processos de biotransformação que antecedem a sua interação
com as células tumorais. Esta biotransformação depende da natureza do complexo e pode
envolver hidrólise do ligante, reações de oxido- redução e ou substituição dos ligantes por
- 5 -
biomoléculas presentes no sangue. Estas transformações podem alterar a estrutura e/ou
composição do complexo metálico e requerem, ainda, um estudo das possíveis interações com
biomoléculas, pois entre a administração da droga e do seu alvo a mesma percorre um longo
caminho podendo interagir com diversas proteínas presentes no sangue, por exemplo a
albumina de soro humana.
1.2 Albumina Humana.
A albumina é a proteína mais abundante do sistema circulatório, em concentração
próxima de 40 mg/mL (~ 0,6 mM). Esta proteína desempenha uma variedade muito grande de
papeis no meio biológico; contribuindo com 80% da pressão osmótica sangüínea e sendo
essencialmente responsável pela manutenção do pH do sangue. Nos mamíferos albumina a
albumina é sintetizada pelo fígado e possui um tempo de meia-vida de 19 dias41. Uma notável
propriedade desta proteína é a sua capacidade de ligar-se, reversivelmente, a uma incrível
variedade de moléculas. Localizada em todos os tecidos corporais, a HSA realiza o transporte
e distribuição de diversas substâncias endógenas ou exógenas tais como: hormônios,
aminoácidos, íons metálicos e drogas 42. Ela é a principal transportadora de ácidos graxos que
são insolúveis no plasma sanguíneo 43, 44, e desempenha outras funções como o seqüestro de
radicais livres de oxigênio e a inativação de vários metabólitos tóxicos lipofílicos, como a
bilirrubina.
A estrutura primária da albumina é constituída de uma única cadeia polipeptídica que
contém 585 resíduos de aminoácidos (~ 66 kd). A macromolécula pode ser dividida em 9
alças (L1-L9) formadas por 17 pontes dissulfeto entre resíduos de cisteína e grupos SH livres
(Cys34) 41, e em três domínios sendo cada um deles constituído de 3 alças (Figura 4).
- 6 -
A albumina de soro humana (HSA) apresenta algumas características estruturais
importantes, que merecem destaque:
a) A presença de um único resíduo de triptofano (na posição 214);
b) O conteúdo baixo de resíduos de metionina (6 resíduos) em relação ao de cisteína
(35 resíduos), e um número ímpar de resíduos de cisteína o qual é de importância fundamental
para a estabilização da estrutura e para a ligação de alguns íons metálicos com à proteína;
c) O conteúdo elevado de aminoácidos com carga, como ácido aspártico (36), ácido
glutâmico (61), lisina (59) e arginina (23), que conferem à proteína uma carga total elevada (-
17, em pH fisiológico) e portanto, uma boa hidrossolubilidade.
d) Ausência de sítios de glicosilação, ao contrário de outras proteínas da família das
albuminas, como a α-fetoproteina. 41, 45
A carga total elevada, proveniente de cerca de 185 possíveis íons por molécula, a pH
7, contribui para a solubilidade da proteína, e as muitas ligações dissulfeto, para a sua
estabilidade. A carga global líquida em pH 7 é -12 a -18 para as albuminas bovina, humana e
de rato 41.
Para os mamíferos a seqüência de aminoácidos é bem preservada, um exemplo é a
comparação da albumina humana com as albuminas bovina e a eqüina, que mostra 75% de
homologia 41.
Em termos de estrutura secundária os dados cristalográficos mostram que a albumina é
constituída predominantemente por α-hélices (67%), com pequenas contribuições de folhas β
(23%) e turnos (10%) 41. As α-hélices (Figura 5) são estabilizadas por ligações de hidrogênio
entre os oxigênios das carbonilas das ligações peptídicas e os nitrogênios das amidas dos
quartos aminoácidos subseqüentes.
- 7 -
Figura 4 – Representação da estrutura primária da Albumina Humana.
AR VA
ASHILY SEGL
AL ARHI PH LY AS LE GL GL PH LY LE IL AL PHVA GL TY
LE
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ASLY GL TH CY PH c AL GL GL LY LY LE VA
c AL
c AL SEGLc ALc ALGLGLLE
Dom
ínio
I
Dom
ínio
II
Dom
inio
III
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
L8
L9
- 8 -
Figura 5 - Estrutura α-hélice1.
As estruturas folha β (Figura 6) são estabilizadas por ligações de hidrogênio entre os
oxigênios das carbonilas das ligações peptídicas de um trecho da cadeia e os nitrogênios das
amidas das ligações peptídicas de outro trecho distante desta mesma cadeia primária, que será
colocada na vizinhança do primeiro trecho. Existem duas variedades de folhas β pregueadas:
A) A folha β pregueada antiparalela, em que as cadeias polipeptídicas vizinhas unidas por
ligações de hidrogênio estão em sentidos opostos; B) A folha β pregueada paralela, na qual as
cadeias estão orientadas no mesmo sentido (Figura 6) 46.
Figura 6 - Estrutura folha ß.
1 Química: A Ciência Central - Person Education
- 9 -
Conforme ilustrado na
Figura 4, a configuração tri-dimensional é composta por três domínios homólogos (I,
II e III). Cada domínio, por sua vez, é formado por dois subdomínios (IA, IB, etc), que são
predominantemente helicoidais e contem várias ligações cruzadas de pontes dissulfeto 41.
A estrutura terciária da albumina foi elucidada através de difração de raio x 42, 47, onde
observou-se que, no cristal obtido em uma solução na faixa de pH 4,5 – 8,0, a molécula de
HSA tem forma semelhante a de um coração aproximadamente igual a um triângulo
eqüilátero de lados ~ 80 Å e com 30 Å de profundidade.
A albumina possui uma distribuição assimétrica de carga em sua estrutura primária.
Em pH neutro, a carga total calculada é de -10, -8 e 0, respectivamente para os domínios I, II
e III da albumina humana, sendo uma distribuição semelhante observada em outras
albuminas. Portanto, a carga negativa é bem alta no sítio N-terminal e menor no domínio C-
terminal o que confere assimetria elétrica para a macromolécula48.
A albumina é a única proteína conhecida cujo arranjo tridimensional depende
inteiramente da presença das 17 pontes de dissulfeto, o que pode explicar sua capacidade de
se manter estável frente a condições desnaturantes das mais adversas 41.
A albumina pode se ligar rapidamente e com grande afinidade a vários ligantes
diferentes. As reações de equilíbrio HSA-ligante apresentam constantes de velocidade de
pseudo-primeira ordem de 10-5s-1, ou seja, o equilíbrio é atingido em cerca de 1
microssegundo 49. Isso sugere que a proteína tem capacidade de alterar sua conformação
interna de modo rápido. Regiões hidrofóbicas, por um lado, e grupos substituintes carregados
devem auxiliar na fixação dos ligantes à proteína.
No que diz respeito ao transporte de metais, a albumina humana atua de modo
diferente da maioria das outras proteínas, justamente por sua capacidade de transportar várias
espécies diferentes e com grande afinidade.
- 10 -
Quanto à afinidade por diferentes tipos de ligantes, a estrutura da albumina pode ser
subdividida nos seguintes sítios:
a) Sítios I e II – ligantes heterocíclicos pequenos, ácidos carboxílicos, compostos
aromáticos e bilirrubina;
b) Sítios III e IV – ácidos graxos de cadeia longa;
c) Sítios V e VI (Cys34 e N-terminal, respectivamente) – íons metálicos.41, 50
Uma ilustração destes sítios é apresentada na Figura 7, que mostra também as posições
de ligação para marcadores farmacêuticos importantes tais como: diazepam, ibuprofeno,
aspirina e warfarina, e marcadores endógenos como triptofano e bilirrubina 41.
Figura 7 - Sítios de ligação da HSA2.
É amplamente aceito na indústria farmacêutica que a distribuição global, o
metabolismo e a eficácia de muitas drogas podem ser alterados com base em suas afinidades
2 Adaptada de Elsevier © Ghuman J et al. (2005) J Mol Biol 353: 38–52.
Sitio III
Aspirina
Diazepan
Digitoxina
Clorofibrato
Ibuprofeno
AZT (Zidovudina)
Triptofano
Octanoato
Sitio II
Aspirina
Warfarina
Bilirrubina
Sitio I
Auranofina
Au(I)
Hg(II)
Cu(II)
Ni(II)
- 11 -
pela soro albumina. Além disso, novas drogas promissoras acabam sendo ineficazes devido à
sua elevada afinidade por esta abundante proteína. Desta forma, o entendimento da interação
de várias classes de fármacos com a albumina pode sugerir novos caminhos para terapia e
design de novas drogas, colocando a albumina em posição adequada, numa segunda etapa
para racionalização de novas drogas 51-53.
- 12 -
EEESSSTTTRRRUUUTTTUUURRRAAA DDDOOOSSS LLLIIIGGGAAANNNTTTEEESSS
Figura 8 – Sulindaco.
Figura 9 – Diclofenaco.
Figura 10 – Ibuprofeno.
Figura 11 – Meloxicam.
- 13 -
222 OOOBBBJJJEEETTTIIIVVVOOOSSS
Este trabalho teve como principal meta gerar uma nova contribuição para o
desenvolvimento dos estudos sobre metalofármacos, dando continuidade às pesquisas do
grupo sobre complexos de rutênio contendo fármacos anti-inflamatórios não-esteróides
(FAINES) como ligantes.
Os principais objetivos foram:
Desenvolvimento de metodologias sintéticas para a obtenção de complexos de
Ru2(II,III) com carboxilatos derivados fármacos anti-inflamatórios não-esteróides: sulindaco e
diclofenaco, e de um complexo de Ru(II) com ligante derivado do meloxicam.
Caracterização dos complexos obtidos por meio de análises elementares,
espectroscopia eletrônica, espectroscopias vibracionais FTIR e Raman, medidas de
susceptibilidade magnética, medidas de condutância molar, análises termogravimétricas (TG e
DSC), e difratometria de raios x pelo método do pó.
Estudos de interação dos novos complexos preparados, e também de um complexo de
dirutênio-ibuprofenato, com albumina de soro humana (HSA) empregando-se as técnicas de
dicroísmo circular e fluorescência.
Avaliação da atividade biológica dos complexos frente à linhagem celular K562 e
realização de análise estatística dos dados obtidos nestes ensaios.
- 14 -
33 PPAARRTTEE EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALL
3.1 Reagentes e Solventes
Reagentes
Albumina Humana (HSA) Aldrich
Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3) Merck
Cloreto de lítio (LiCl) Aldrich
Cloreto de rutênio(III) (RuCl3·nH2O) Aldrich
Cloreto de sódio (NaCl) Synth
Diclofenaco sódico (NaC14H10Cl2NO2) Buenos Aires *
Dihidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4) Synth
Hidróxido de sódio (NaOH) Merck
Ibuprofeno (C13H18O2) Aldrich
Meloxicam (C14H13N3O4S2) Rhamus *
Ru2Ac **
Ru2IBP **
RuDMSO **
Sulindaco (C20H17FO3S) Rhamus *
* Farmácia de Manipulação.
** Sínteses realizadas conforme métodos descritos na referência 40 e 54.
- 15 -
Solventes
Metanol (CH3OH) Merck
Etanol (CH3CH2OH) Merck
Acetona (CH3COCH3) Synth
Clorofórmio (HCCl3) Merck
Dimetilsulfóxido (H3CSOCH3) Merck
3.2 Síntese dos Complexos
3.2.1 Síntese do complexo [Ru2(C20H16FO3S)4Cl] (Ru2Sulin).
Dissolveu-se 0,102 g de Ru2Ac em 80 mL de água e deixou-se sob agitação e
atmosfera de nitrogênio por 30 min. Após este período, no qual ocorreu a total dissolução do
Ru2Ac, reduziu-se o volume da solução com a ajuda de um roto-evaporador, a 25 mL
adicionou-se 20 mL de etanol e 0,092 g de LiCl dissolvido em 5 mL de água. Uma solução
contendo 0,369 g sulindaco em 40 mL de etanol foi acrescentada a seguir e a mistura colocada
sob aquecimento em banho- maria (45 oC - 50 oC ) e mantida sob agitação e atmosfera de
nitrogênio, por 3 horas observando-se a formação de um precipitado de cor laranja. Depois de
resfriada filtrou-se a mistura, o sólido obtido foi lavado com etanol gelado e depois secado a
vácuo em dessecador contendo pentóxido de fósforo e sílica gel. Rendimento= 78%
- 16 -
3.2.2 Síntese do complexo [Ru2(C14H10Cl2NO2)4Cl] (Ru2Diclofen).
Dissolveu-se 0,500 g de Ru2Ac em 80 mL de água e deixou-se sob agitação e
atmosfera de nitrogênio por 30 min. Após este período, no qual ocorreu a total dissolução do
Ru2Ac, reduziu-se o volume da solução com a ajuda de um roto-evaporador, a 25 mL
adicionou-se 20 mL de etanol e 0,462 g de LiCl dissolvido em 5 mL de água. Uma solução
contendo 1,342 g diclofenaco em 40 mL de etanol foi acrescentada a seguir e a mistura
colocada sob aquecimento em banho- maria (45 oC - 50 oC ) e mantida sob agitação e
atmosfera de nitrogênio, por 3 horas observando-se a formação de um precipitado de cor cinza
esverdeado. Depois de resfriada filtrou-se a mistura, o sólido obtido foi lavado com etanol
gelado e depois secado a vácuo em dessecador contendo pentóxido de fósforo e sílica gel.
Rendimento=75%
3.2.3 Síntese do complexo [Ru (C14H12N3O4S2)2(dmso)2 Cl2] (RuHMelox).
Suspendeu-se 0,702 g de meloxicam em 100 mL de água em um balão de fundo
redondo de 250 mL. Sob agitação adicionou-se gota a gota uma solução 1 molL-1 de
hidróxido de sódio até que o meloxicam solubiliza-se (pH 8,0).
A seguir, em 10 mL de água, dissolveu-se 0,500 g de [Ru(DMSO)4Cl2] e esta solução
foi adicionada à solução de meloxicam. Deixou-se a mistura sob agitação em banho-maria
(60oC), por 30 min. Após resfriamento filtrou-se a mistura, o sólido obtido foi lavado com
água gelada e depois seco a vácuo em dessecador contendo pentóxido de fósforo e sílica gel.
Rendimento=85%
- 17 -
3.3 Preparo das Soluções para os experimentos com HSA.
Tampão fisiológico
As massas de 1,460 g de NaCl, 0,525 g de NaHCO3 e 0,120 g de NaH2PO4, foram
pesadas e os sais foram dissolvidos, separadamente, em água deionizada e transferidos para
um balão volumétrico de 250 mL, completando-se o volume com água deionizada. O ajuste
da solução para pH 7,4 foi realizado,quando necessário, adicionando-se gotas de uma solução
de HCl 1 molL-1 ou NaOH 1 molL-1 antes de completar com água deionizada o volume do
balão.
Solução de HSA
Preparou-se uma solução 2,5 x 10-3 molL-1 de HSA (1,65 g de HSA em 10mL água
deionizada) em balão volumétrico, e a partir desta fizeram-se as diluições necessárias, com
tampão fisiológico, para cada experimento conforme a Tabela 1.
Tabela 1 - Diluições da solução inicial de HSA.
Experimento Volume Inicial solução de HSA*
Concentração final de HSA
Volume Final da solução de HSA
Dicroísmo Circular 30 µL 1,5 x 10-5 molL-1 5 mL
Fluorescência 8 µL 4,0 x 10-6 molL-1 5 mL
*Os volumes foram medidos com pipetas automáticas (Gilson).
Preparo das soluções dos complexos e fármacos para o estudo de CD.
Pesou-se uma determinada massa de complexo (Tabela 2) e transferiu-se para um
balão volumérico de 5 mL. Adicionou-se 500 µL de DMSO, com o auxilio de uma pipeta
automática Gilson de volume máximo 1000 µL, e a seguir completou-se o volume com o
- 18 -
solvente adequado. A partir desta solução fizeram-se as diluições necessárias para cada
experimento de acordo com a Tabela 3.
A solução de Platinil®, frasco com 10 mg /20 mL, (concentração 1,67 x 10-3 molL-1),
foi doada por Quiral Química do Brasil S.A. e foi utilizada da maneira como é
comercializada.
Tabela 2 - Massas e concentrações das soluções, dos fármacos e dos complexos, utilizadas nos
experimentos.
Complexos Massa (g) Concentração (molL-1) Solvente
HIBP 0,0137 1,33 x 10-2 Etanol
HSulin 0,0147 8,25 x 10-3 Etanol
NaDiclofen 0,0147 9,24 x 10-3 Água
Ru2Ac 0,0154 6,50 x 10-3 Água
Ru2Diclofen 0,0140 1,97 x 10-3 Etanol
Ru2IBP 0,0172 3,25 x 10-3 Etanol
Ru2Sulin 0,0122 1,38 x 10-3 Etanol
RuDMSO 0,0172 7,10 x 10-3 Água
RuHMelox 0,0106 2,33 x 10-3 Etanol
Tabela 3 - Volume (µL) de solução de Composto adicionada à solução de HSA de concentração 1,5 x
10-5 molL-1 *.
Razão molar HSA: Composto
1:1 1:2 1:3 1:4 1:5
Composto Volumes adicionados (µL)
NaDiclofen 8,1 16,2 24,3 32,4 40,5
HIBP 5,6 11,2 16,8 22,4 28,0
- 19 -
HSulin 9,1 18,2 27,3 36,4 45,5
Platinil® 45,0 90,0 135,0 180,0 225,0
Ru2Diclofen 38,0 76,0 114,0 152,0 190,0
Ru2IBP 23,1 46,2 69,3 92,4 115,5
Ru2Sulin 54,3 108,6 162,9 217,2 271,5
Ru2Ac 11,5 23,0 34,5 46,0 57,5
RuDMSO 10,6 21,2 31,8 42,4 53,0
RuHMelox 32,2 64,4 96,6 128,8 161,0
*Todas as adições foram realizadas com pipetas automáticas Gilson.
Preparo das soluções dos complexos e fármacos para o estudo de Fluorescência.
As soluções dos compostos foram preparadas a partir das soluções de concentração
inicial indicadas na Tabela 4, fazendo-se as diluições necessárias de acordo com a
Tabela 5. Para o complexo Ru2Ac registrou-se o espectro para a razão molar 1:20 para
se obter um valor de fluorescência mais próximo a zero.
Tabela 4 - Massas e concentrações das soluções, dos fármacos e dos complexos, utilizadas nos
experimentos de fluorescência.
Complexos Massa (g) Concentração (molL-1) Solvente
HIBP 0,0055 5,3 x 10-3 Etanol
HSulin 0,0090 5,0 x 10-3 Etanol
NaDiclofen 0,083 5,2 x 10-3 Água
Ru2Ac 0,0121 5,1 x 10-3 Água
Ru2Diclofen 0,0359 5,0 x 10-3 Etanol
Ru2IBP 0,0269 5,1 x 10-3 Etanol
Ru2Sulin 0,0448 5,1 x 10-3 Etanol
- 20 -
RuDMSO 0,0122 5,0 x 10-3 Água
H2Melox 0,0089 5,0 x 10-3 Água
RuHMelox 0,0230 5,1 x 10-3 Etanol
Tabela 5 - Volume (µL) de solução de Complexo adicionada a solução de HSA*.
Razão molar HSA: Composto
1:1 1:2 1:3 1:4 1:5. 1:10.
Composto Volumes adicionados (µL)
NaDiclofen 8 16 24 32 40 80
HIBP 8 16 24 32 40 80
HSulin 8 16 24 32 40 80
Platinil® ** 12 24 36 48 60 120
Ru2Ac 4 8 12 16 20 40
Ru2Diclofen 4 8 12 16 20 40
Ru2IBP 4 8 12 16 20 40
Ru2Sulin 4 8 12 16 20 40
RuDMSO 8 16 24 32 40 80
RuHMelox 4 8 12 16 20 40
*Todas as adições foram realizadas com pipetas automáticas (Gilson).
Preparo das soluções dos complexos e fármacos para o estudo de SDS-PAGE
Para o experimento preparou-se uma solução de HSA na concentração de 2,5 x 10-4
molL-1 e soluções dos complexos Ru2Ac, Ru2Sulin, Ru2Diclofen e Ru2IBP e dos fármacos
HSulin, NaDiclofen e HIBP na concentração de aproximadamente 3,7 x 10-4 molL-1. O
volume final de solução a ser aplicada no gel deve ser de 10 µL e a concentração de HSA para
o experimento no volume utilizado é de 7,5 x 10-5 molL-1.
- 21 -
Para cada amostra, foram adicionados em um ependorf de 1,5 mL: 3,0 µL de solução
de HSA, 2,0 µL de solução de composto e 3,0 µL de solução tampão fisiológico. Para o
controle usou-se a proteína livre com tampão. As soluções foram incubadas por 30 min em
banho termostatizado à 37ºC e depois adicionou-se 1,0 µL de SDS 10% e 1,0 µL de azul de
bromofenol. As amostras foram centrifugadas e então aplicadas nos géis, com o auxilio de
uma microseringa.
1)Gel de resolução 12% (receita para
dois géis)
Acrilamida/Bis-acrilamida........10mL
Tampão (Tris Buffer) 1,5M pH
8,8............................................9,4 mL
SDS 10%...............................0,25 mL
H2O.........................................4,2 mL
Temed......................................15 mL
Persulfato de amônio............1,25 mL
2)Gel de empacotamento (receita para
dois géis)
Acrilamida/Bis-acrilamida........875 µL
Tampão (Tris Buffer) 1M pH
6,8.............................................875 µL
SDS 10%.....................................70 µL
H2O...........................................4,8 mL
Temed.........................................15 µL
Persulfato de amônio..............1,25 mL
3.4 Equipamentos e Técnicas.
Análise elementar
As determinações dos teores de C, H, N foram efetuadas nos laboratórios da Central
Analítica do IQ-USP utilizando-se um equipamento ELEMENTAR ANALYZER CHN
modelo 2400 da Perkin Elmer. A determinação da percentagem de Ru foi efetuada utilizando-
se a técnica de ICP-AES, aparelho SPECTROGENESIS – FES 50-60 Hz.
- 22 -
Espectroscopia vibracional
Os espectros vibracionais na região do infravermelho foram registrados com um
aparelho ABB BOMEN - MB séries. Para a região de 4000 a 400 cm-1, obteve-se espectros
por reflectância difusa, porém o aparelho já nos fornece os espectros em porcentagem de
transmitância, com as amostras dos compostos dispersas em KBr.
Espectroscopia eletrônica
Os espectros eletrônicos dos complexos em solução na região do UV-visível foram
obtidos num Espectrofotômetro SHIMADZU UV-VISÍVEL, modelo UV- 1650 PC, com
banho termostatizador, utilizando cubetas de quartzo de 1,0 cm.. Para o registro dos espectros
dos compostos no estado sólido foi utilizado um aparelho GUIDED WAVE, modelo 260, no
laboratório do Prof. Dr. Henrique E. Toma, com a colaboração da Profª Drª Anamaria D. P.
Alexiou.
Medidas de susceptibilidade magnética
As medidas de susceptibilidade magnética foram realizadas utilizando o Método
Faraday, numa balança CAHN modelo DTL 7500 com campo magnético de 1 Tesla. O
padrão usado foi o Hg[Co(SCN)4], κ = 16,44 x 10-6 unid. CGS/Gauss a 20 °C e θ = +10°. As
leituras de massa, da barquinha vazia, do padrão e da amostra, com e sem campo magnético,
foram feitas em triplicata e usadas para cálculo de suas médias aritméticas. Os cálculos das
susceptibilidades magnéticas foram realizados segundo descrito na referencia 55.
- 23 -
Espectroscopia Vibracional Raman
Os espectros Raman dos compostos no estado sólido foram registrados no laboratório
de Espectroscopia Molecular do IQ-USP, com a colaboração da Profª Drª Márcia Laudelina
Arruda Temperini, Drª Celly Mieko Shinohara e Daniela Colevati. Utilizou-se um
equipamento Raman RENISHAW, modelo 3000, com sistema de detector CCD refrigerado
termoeletricamente (Wright 600 x 400 pixels) e microscópio metalúrgico (Olympus).
Empregou-se a linha de excitação de 632,8 nm, potência de 24 mW e filtro de densidade
óptica 1.
Medidas de Condutividade
As medidas de condutividade foram realizadas com um condutivímetro DIGIMED,
modelo DM-31, usando-se como padrão de referência uma solução de KCl de condutância
específica de 146,9 µScm-1 e uma célula de constante k = 0,1 cm-1. As soluções dos
complexos em estudo apresentavam concentrações aproximadamente igual a 1 x 10-3 molL-1.
Análise Termogravimétrica
As curvas termogravimétricas (TG), termogravimétrica diferencial (DTG) e
calorimetria exploratória diferencial (DSC) foram executadas em um equipamento TG/DSC
modelo STA PC Luxx, marca NETZSCH, acoplado a um espectrômetro de massas QMS
403C Aeolos e um injetor de gases PulseTA, ambos também da marca NETZSCH. As curvas
foram registradas em atmosfera de ar sintético, as massas das amostras (~ 8 mg) foram
pesadas em cadinho de alumina e a taxa de aquecimento foi de 10 ºC.min-1 até a temperatura
final de 1000 ºC.
- 24 -
Dicroísmo Circular
Para este experimento utilizou-se um Espectropolarímetro JSACO J-720, registrando-
se os espectros no intervalo de 195-260 nm. Para as medidas, foi usada uma cela de quartzo
esférica de 0,1cm de caminho óptico
Os dados obtidos, em unidades de CD (mgrau) por comprimento de onda, foram
convertidos para unidades de elipsidade molar residual (MRE), expressas em grau.cm2 .dmol-1
por comprimento de onda, com auxílio do programa Espectra Analisys – Jasco, instalado no
próprio equipamento. Esta conversão é dada pela equação:
10][
×××=
lnCpMREou obsθ
θ Equação 1
Onde:
Cp = concentração molar da proteína = 1,5 x 10-5 molL-1
n = número de resíduos de aminoácidos = 585
l = caminho óptico = 0,1 cm
Fluorescência
As medidas de emissão neste trabalho foram obtidas no Laboratório de Fotoquímica
Inorgânica & Conversão de Energia, com colaboração da Profª Drª Neyde Yukie Murakami
Iha, da Drª Karina Passalaqua Moreli Frin e dos alunos de doutorado Antonio Otávio Toledo
do Patrocinio e Sergio Kenji Mizoguchi, em um espectrofluorômetro PHOTON-COUNTING
da ISS, modelo PC1. A resolução é controlada pelas fendas nos monocromadores de emissão
- 25 -
e excitação, sendo que cada milímetro de fenda corresponde a 8 nm na largura de meia-banda.
Os espectros foram obtidos utilizando cubeta retangular de quartzo com as quatro faces
lapidadas de caminho óptico igual a 1,000 cm, velocidade de varredura de 1 nms-1, com fenda
de 0,5 nm para excitação e 2,0 nm para emissão.
SDS-PAGE
As análises de eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio (SDS-
PAGE) foram realizadas no aparelho Eletrophoresis Power Supply – EPS 301, no laboratório
da Profª. Drª. Ana Maria da Costa Ferreira com o auxilio da Drª. Mariana Pedrinha Abbott e
da Dra. Vivian Chagas Silveira.
Os géis são feitos pela polimerização de acrilamida e N,N’-metilenibisacrilamida,
induzida por radicais livres, no tampão de escolha. O gel em geral é montado com o formato
de uma fatia retangular delgada, na qual diversas amostras podem ser analisadas
simultaneamente em canaletas paralelas (Figura 85). As amostras, aplicadas em canaletas que
são feitas na parte superior do gel, migram em linhas paralelas de cima para baixo56.
Difratometria de Raio X
Os difratogramas de raios X foram obtidos empregando-se um difratômetro RIGAKU,
modelo Mini flex, com ânodo de cobre (radiação Kα = 1,541Å). As varreduras foram feitas
nos intervalos de 20 – 60º, com passo de 0,02º entre cada ponto. As amostras sólidas foram
suspensas em etanol e sonicadas por 30 minutos para obter suspensões com partículas bem
pequenas, em seguida gotejou-se as suspensões em lâminas de quartzo para obtenção de um
filme. Após a secagem registrou-se o difratograma das mesmas.
- 26 -
3.5 Testes Biológicos.
Equipamentos e Materiais descartáveis
- Micropipetas de 10 mL, 5 mL, 1000 µL, 200 µL, 100 µL e 10 µL (Gilson)
- Micropipeta de 8 canais (Ependorf)
- Fluxo Laminar (FiltraCom modelo BOFluxo90A)
- Incubadora de CO2 (Hepa Class 100 -Thermo Electron Corporation)
- Microscópio (Carl Zeiss - Jena)
- Centrifuga Excelsa IITM mod 206 BL
- Leitora de Microplacas (FLUOStar OPTIMA – BMG LABTECH)
- Câmara de contagem ou Câmara Neubauer (Lopti Labo)
- Lamínula
- Placa 96 poços (TPP)
- Placa 06 poços (TPP)
- Garrafa para cultivo celular (TPP)
-Ponteiras, para micropipetas (Gilson)
- Tubos Falcon (TPP)
Materiais
- Linhagem Celular - Células K562, obtidas de leucemia mielóide de uma mulher, branca, 53
anos. Cedidas pelo Prof. Dr. Breno Pannia Espósito.
- Meio de Cultura – RPMI (EMCARE), Roswell Park Memorial Institut: mistura de sais
enriquecidos com aminoácidos, vitaminas e outros componentes essenciais para o crescimento
celular. A ele foi adicionado soro bovino fetal (10%v/v).
- 27 -
- Solução de MTT (Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) (MERCK)
preparada na concentração de 2,0 mg/mL em água.
- Solução de Azul de Tripam (MERCK)
- Soro Bovino Fetal - FBS (EMCARE)
Procedimento geral para os experimentos com células.
Todas as etapas do cultivo de célula e os testes com os compostos, descritos a seguir,
foram realizadas na sala de células do Laboratório de Cinética Rápida e Fototermia do Prof.
Dr. Maurício da Silva Baptista, IQ-USP.
1ª Etapa: Descongelamento das células K562;
Antes de começar o procedimento de descongelamento (dia 1) das células, capela de
fluxo laminar e os materiais necessários foram limpos com álcool 70% e depois mantidos
dentro da capela ligada, sob radiação UV por 10 min para esterilização. Este procedimento de
limpeza foi repetido antes do inicio de cada o trabalho realizados na sala de células, para se
evitar contaminação.
Um “criovial” contendo 1 mL de células foi retirado de um botijão de nitrogênio
líquido e descongelado em banho-maria de álcool a 37ºC. Dentro da capela de fluxo laminar
transferiu-se as células para um tubo Falcon e adicionou-se 4 mL de meio RPMI contendo
10% FBS e centrifugou-se à 1200 RPM por 10 min.
O sobrenadante foi então descartado e as células foram ressuspensas em 3 mL de meio
de cultura e colocadas em um poço (poço 1) de uma placa de 6 poços (Figura 12).
Homogeneizou-se bem a suspensão presente no poço 1 e transferiu-se 10 µL para um poço de
uma placa de 96 poços, para realizar a contagem de células vivas e mortas (conforme descrito
a seguir) e em seguida guardou-se a placa em estufa a 37ºC e sob atmosfera de 5% CO2.
- 28 -
Figura 12 - Esquema da placa de 6 poços
Contagem de células em Câmara Neubauer (Figura 13)
À alíquota retirada do poço 1, que foi colocada em um poço de uma placa de 96 poços,
adicionou-se 10 µL de corante azul de Tripam, obtendo-se assim uma diluição à metade da
concentração celular, ou seja: suspensão celular/mistura = 1:2 (v/v).
Homogeneizou-se a suspensão com corante e retirou-se uma alíquota de 10µL que foi,
então, colocada entre uma lamínula e a câmera de contagem Neubauer (Figura 14).
Encostando-se a ponta da pipeta na borda da lamínula, preencheu-se cuidadosamente a
câmara de contagem (o líquido deve preencher apenas um lado da câmara e não deve chegar
aos canais de cada lado da área de contagem) (Figura 14).
Figura 13 - Câmara Neubauer
Figura 14 - Esquema de como adicionar a
solução com células na câmara de contagem.
1 2 3
4 5 6
- 29 -
Colocou-se a câmara de contagem no microscópio e focalizou-se a área demarcada da
câmara com a objetiva menor. A contagem das células foi realizada em toda a área da câmara
de acordo com o esquema da Figura 15.
Figura 15- Esquema de contagem utilizando a câmara Neubauer.
Como durante a contagem, podem ser observados diferentes tipos de arranjos de
células, conforme esquematizado na Figura 16, é preciso estabelecer alguns critérios para
classificá-los. Os critérios estabelecidos para se realizar a contagem das células foram:
• células nitidamente separadas foram contadas separadamente (por exemplo, a
representação A na Figura 16 corresponde a 4 células);
• nos grumos constituídos por várias células facilmente distinguíveis por seus
citoplasmas, contou-se cada uma das células (B, Figura 16: 8 células, em um grumo);
• nos grumos cujas células eram difíceis de serem distinguidas umas das outras, um
grumo seria contado como um único grumo de células (C, Figura 16: um grumo), mas este
caso não foi encontrado durante as contagens realizadas.
- 30 -
Figura 16 - Grumos de Células
Para calcular a concentração das células na suspensão utilizou-se a equação:
diluiçãodefatorcâmaradavolume
vivascélulasncélulas __
__
)_º(][ ×= Equação 2
210
85][
4×= − mL
células
7107,1][ ×=células células/mL
Nessa primeira contagem encontrou-se 85 células vivas e 15 células mortas, o que nos
dá 85% de células vivas.
2ª Etapa: Manutenção e Multiplicação
Depois da 1ª etapa (de descongelamento e contagem de células) é preciso fazer as
células se multiplicarem para gerar um número maior que seja suficiente para a realização dos
ensaios. A manutenção das células exige senso crítico e tomadas de decisão da parte de quem
as manipula. Devido à presença do indicador vermelho de fenol (faixa de pH 6,6 - 8,0), o
meio de cultura apresenta coloração rósea a qual evidencia o seu caráter básico. No entanto,
quando a quantidade de células torna-se muito alta, os resíduos da atividade celular acabam
deixando o meio ácido e, portanto, a cor deste muda de rosa para amarela.
A B C
- 31 -
No dia seguinte ao descongelamento (dia 2) a cor do meio, no poço 1, estava amarela
então dividiu-se os 3 mL de suspensão de células presentes, no poço 1, em mais 2 poços,
primeiro ressuspendeu-se as células da suspensão, para uma melhor homogeneização da
mesma, e pipetou-se 1 mL da suspensão para cada poço, ficando assim o poço 1, 2 e 3 com 1
mL de suspensão de células. A seguir adicionou-se 2 mL de meio RPMI em cada poço com
células (Figura 17).
Figura 17 - Esquema divisão da suspensão celular
Após esta divisão, contou-se a quantidade de células presentes em cada poço,
conforme descrito anteriormente, e a placa foi guardada novamente na estufa sob as mesmas
condições.
A manutenção das células exige senso crítico. O meio de cultura possui coloração
rósea devido à presença de um indicador. No entanto, quando a quantidade de células é muito
alta, os resíduos da atividade celular acabam tornando o meio ácido e, portanto, muda a cor da
solução para amarela.
No dia seguinte (dia 3), os meios apresentavam coloração amarelada, então realizou-se
a contagem das células presentes nos 3 poços. A suspensão do poço (1) foi dividida em 3
novos poços, 1 mL da suspensão para cada poço, de uma nova placa de 6 poços e em seguida
adicionou-se 2 mL de meio em cada poço com células. As suspensões dos poços (2) e (3)
foram colocadas em tubos Falcon e centrifugadas. Em seguida, os sobrenadantes foram
1 2 3
4 5 6
- 32 -
descartados e então adicionou-se 10 mL de meio RPMI em cada tudo e transferiu-se as
suspensões para 2 garrafas de cultura de 60 mL (Figura 18a), as garrafas e a placa de 6 poços
foram guardadas na estufa.
No dia seguinte (dia 4) o meio nas garrafas apresentava coloração amarela (Figura
18b) então centrifugou-se toda a suspensão (Figura 19) e descartou-se o sobrenadante.
Ressuspendeu-se as células em novo meio RPMI(15 mL) e colocou-se as novas suspensões
nas garrafas correspondentes, realizou-se a contagem das células e as garrafas foram
guardadas na estufa. A placa com 3 poços com células, apresentava coloração ainda rósea
realizou-se então apenas a contagem das células e a placa foi novamente guardada na estufa.
A mudança para garrafas com volumes maiores foi gradativa, primeiro utilizou-se uma
garrafa de volume pequeno (60 mL) e de acordo com a necessidade foi-se aumentando o
volume da mesma. Nesta fase onde utilizou-se as garrafas sempre centrifugou-se o volume
total e descartou-se o sobrenadante e adicionou-se meio novo. A placa com células foi
mantida até o final do experimento para, caso acontecesse algum imprevisto teríamos células
descongeladas prontas para o uso.
(a)
(b)
Figura 18- Garrafa com células (a) adição recente de meio, (b) 24h após adição de meio.
- 33 -
Figura 19 - Tubo Falcon com a solução de células após centrifugação.
Todos os dias foram feitas as contagens das células para se ter um controle da
evolução do crescimento celular.
Após uma semana já havia quantidade suficiente de células para realização do
congelamento e do experimento.
3ª Etapa: Congelamento das células K562
O congelamento de uma parte das células é necessário, para garantir uma reserva de
material, que poderá ser usado caso ocorra contaminação das células durante os trabalhos.
Para o congelamento a concentração das células foi de 5,0 x 106 células/mL e 80%
delas estavam vivas.
A solução com as células foi centrifugada e ressuspensa em 1 mL de meio contendo
10% de DMSO. Os vials foram colocados em um freezer a -70ºC, (Laboratório de
Mitocôndrias e Viabilidade Celular da Profª. Drª. Alicia J. Kowaltowski) dentro de um
suporte (Figura 20) preenchido com etanol por 24h. Depois foram transferidos e armazenados
em nitrogênio liquido.
- 34 -
Figura 20 - Vials dentro do suporte para congelamento.
Teste com Azul de Tripam e MTT
O objetivo deste primeiro ensaio biológico foi analisar os fatores de crescimento das
células tumorais na presença dos complexos Ru2Diclofen, Ru2Sulin Ru2Ac, Ru2IBP e os
fármacos HSulin, NaDiclofen, HIBP. Preparou-se soluções dos compostos na concentração
2,25 x 10-3 molL-1:
Células Vivas
Células Mortas
Células Vivas
Células Mortas
Figura 21 - Células vivas e mortas após adição do azul de Tripam
- 35 -
Preparou-se então uma placa de 96 poços (Figura 22) onde adicionou-se 200 µL de
uma solução de células com concentração 2,4 x 105 células/mL, a seguir adicionou-se a
solução de complexo e meio conforme Tabela 6.
Tabela 6 – Volumes em µL das soluções de complexo e de meio para atingir as concentrações de 20,
40, 60, 80 e 120 µmolL-1 em 300 µL.
20 µmolL-1 40 µmolL-1 60 µmolL-1 80 µmolL-1 120 µmolL-1
Volumes adicionados (µL)
Complexo 2,6 5,3 8,0 10,6 16,0
Meio 97,4 94,7 92,0 89,4 84,0
Como controle utilizou-se os solventes água/5%DMSO e etanol/5%DMSO. Todas as
medidas foram realizadas em triplicata. Após a adição dos complexos a placa ficou na estufa
por 24h, em seguida realizou-se o teste com azul de Tripam e MTT.
Figura 22 – Placa de 96 poços após a adição dos complexos e antes da incubação.
Após as 24h aliquotou-se todas as amostras presentes nos poços e realizou-se a
contagem das células, com o auxilio do microscópio foi possível contar as células vivas
(pontos brilhantes) e das células mortas (pontos azuis) devido ao corante azul de Tripam.
- 36 -
Após retirar as alíquotas para o teste com azul de Tripam, adicionou-se aos poços 100
µL de uma solução de MTT 2,5 gmL-1 e deixou a placa por mais 4h na estufa (Figura 23).
Depois de 4h a placa apresentava pequenos cristais depositados no fundo dos poços
(Figura 24). Retirou-se o sobrenadante (~ 250 µL), cuidadosamente para que não se retirasse
junto os cristais formados (Figura 25) e adicionou-se 300 µL de DMSO para dissolver os
cristais formados (Figura 26). Homogeneizou-se bem a solução de cada poço para garantir
que todos os cristais haviam se dissolvido.
A placa então foi lida no leitor de microplacas, no comprimento de onda de 585 nm.
Figura 23 – Placa após adição da solução de MTT.
Figura 24 – Placa após 4h de incubação na estufa.
Figura 25 – Cristais presentes no fundo dos poços.
Figura 26 – Placa após a adição de DMSO
- 37 -
4 SSÍÍNNTTEESSEE EE CCAARRAACCTTEERRIIZZAAÇÇÃÃOO DDOOSS CCOOMMPPLLEEXXOOSS.
4.1 Sínteses
O composto precursor [Ru2(Ac)4Cl] é bastante conhecido na literatura 57. A partir
deste, é possível obter novos compostos de valência mista, seja pela troca dos acetatos por
outros carboxilatos, ou pela substituição do cloreto axial por ligantes diversos. A síntese deste
precursor foi realizada de acordo com rotas sintéticas desenvolvidas em nosso laboratório 40 e
os dados de caracterização confirmam sua composição.
O segundo precursor, [Ru (DMSO)4Cl2], foi preparado de acordo com método descrito
na literatura 54. Suas caracterizações serão apresentadas juntamente com a dos novos
compostos sintetizados.
Os complexos de dirutênio com fármacos, foram obtidos a partir da reação do
[Ru2(Ac)4Cl] com o FAINE correspondente. No caso do Ru2IBP utilizou-se procedimento
desenvolvido, anteriormente, em nosso grupo de pesquisa. O método sintético foi adaptado
para a obtenção dos complexos análogos com o sulindaco e o diclofenaco.
Os resultados das análises elementares (Tabela 7) mostram-se coerentes para a
substituição dos quatro ligantes equatoriais do precursor pelos carboxilatos derivados dos
fármacos utilizados, conforme a reação:
−− +→+ 2342224322 4])([4])([ COCHClCRORuRCOClCCHORu
O complexo de Ru(II) com o fármaco meloxicam, obtido a partir da reação do
[RuCl2(DMSO)4] com o H2Melox apresenta análises elementares coerentes com a
substituição de dois cloretos e de duas moléculas de DMSO do precursor, de acordo com a
equação abaixo, considerando-se a presença de 2 moléculas de água de hidratação na
composição do produto final (Tabela 7).
- 38 -
−− ++→+ ClDMSODMSOHMeloxRuHMeloxClDMSORu 22])()([2])([ 2224
Os compostos sintetizados não são solúveis em água, porém são bastante solúveis nos
solventes orgânicos: etanol, metanol e DMSO.
Tabela 7 - Resultados das análises elementares
Composto Resultado C% H% N% S% Ru%
[Ru2(OAc)4Cl] Calculado 20,3 2,5 - - -
Ru2Ac Experimental 20,3 2,3 - - -
[Ru2(C13H17O2)4Cl]·1/2H2O Calculado 58,71 6,24 - - -
Ru2IBP Experimental 58,8 6,3 - - -
[Ru2(C20H16FO3S)4Cl] 6H2O Calculado 54,4 4,3 - 7,3 11,4
Ru2Sulin Experimental 54,2 4,4 - 7,0 11,1
[Ru2(C14H10Cl2NO2)4Cl].4H2O Calculado 45,1 3,2 3,8 - 13,6
Ru2Diclofen Experimental 45,9 3,2 3,9 - 15,1
[Ru(DMSO)4Cl2] Calculado 19,8 5,0 - - -
RuDMSO Experimental 19,9 4,8 - - -
[Ru(HMelox)2(DMSO)2]·2H2O Calculado 37,2 3,9 8,1 18,6 9,8
RuHMelox Experimental 36,8 4,3 7,5 19,3 10,8
- 39 -
4.2 Espectros de absorção eletrônica
4.2.1 Espectros dos complexos de dirutênio e dos correspondentes fármacos.
O espectro eletrônico do complexo Ru2Ac (Figura 27) está de acordo com a literatura
1, 58, 59. Observa-se a presença de uma banda em 428 nm que pode ser atribuída à transição π
(Ru-O,Ru2) →π*(Ru2), e também de uma segunda banda menos intensa em 991 nm referente
à transição δ(Ru2)→ δ*(Ru2). Estas atribuições estão de acordo com a literatura para o
complexo Ru2Ac em solução que são caracterizados basicamente por uma banda no visível,
em torno de 430 nm (~23500 cm-1), e uma banda menos intensa na região do infravermelho
próximo, ao redor de 1100 nm (~9000 cm-1).
400 600 800 1000
0,0
0,3
0,6
0,9
991
428
Abs.
Comprimento de onda em nm
Figura 27 - Espectro eletrônico do complexo Ru2Ac em água.
Na Figura 28, são mostrados os espectros do complexo Ru2Sulin e do fármaco
sulindaco. O HSulin exibe bandas de absorção na região do UV (226, 259 (ombro), 285 e 328
nm). Estas também são observadas para o complexo Ru2Sulin, sem apresentarem alterações
- 40 -
significativas, exceto a banda de 226 nm que sofre um pequeno deslocamento para menor
comprimento de onda, indicando a interação com o metal. A diferença no perfil dos espectros
na região de 400 a 500 nm, pode ser atribuída à presença de uma banda pouco intensa, em
aproximadamente 430 nm, (identificada pela deconvolução do espectro), a qual se refere à
transição π (Ru-O,Ru2) → π* (Ru2) da unidade dimetálica.
200 300 400 500
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Abs.
Comprimento de Onda (nm)
Ru2Sulin
HSulin
328
285
226
Figura 28 - Esptro eletrônico dos complexos Ru2Sulin e do fármaco HSulin em metanol.
As Figura 29 e 30 apresentam os espectros do NaDiclofen e do Ru2Diclofen. O
NaDiclofen possui uma banda intensa em 282 nm referente a transferência de carga
intramolecular do carboxilato. No espectro do Ru2Diclofen a banda aparece em 279 nm. O
complexo apresenta ainda um ombro em 342 nm que pode ser atribuído a transferência de
carga entre o ligante e a unidade dimetálica que possui duas cargas positivas 60. Com uma
solução mais concentrada foi possível observar, a banda referente a transição π (Ru-O, Ru2)
→ π* (Ru2) em 425 nm.
- 41 -
200 300 400 500
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Abs.
Comrpimento de onda (nm)
282
Figura 29 – Espectro eletrônico do NaDiclofen em água.
200 400 600
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Abs
Comprimento de Onda (nm)
425
279
342
Figura 30 - Espectros eletrônicos do complexo Ru2Diclofen em duas concentrações (—) 2,75x10-5 e
(—) 1,46x10-2.
- 42 -
Tabela 8 –Atribuições das bandas observadas nos espetros UV/VIS dos fármacos e dos complexos de
dirutênio.
Composto λ (nm) ε x103 (cm-1mol-1L-1) Atribuição
Ru2Ac 428
991
0,8
0,03
π (Ru-O,Ru2) →π*(Ru2)
δ(Ru2)→ δ*(Ru2)
HSulin
328
285
226
5,2
6,0
7,4
transições intraligante
Ru2Sulin
329
285
226
~ 430
6,4
5,7
7,4
*
transições intraligante
π (Ru-O,Ru2) →π*(Ru2)
NaDiclofen 282 15,4 transferência intraligante
Ru2Diclofen
278
342
425
7,0
*
*
transferência intraligante
transferência de carga L-M
π (Ru-O,Ru2) →π*(Ru2)
* valores não calculados.
Os espectros dos complexos de dirutênio no estado sólido, semelhantemente ao
espectro do Ru2Ac, também apresentam bandas no infravermelho próximo, em comprimento
de onda máximo entre 1000-1150 nm. Esta banda pode ser atribuída à transição δ (Ru2) → δ*
(Ru2) 59, 61, 62, comprovando a presença do núcleo Ru2 nos complexos.
- 43 -
Tabela 9 – Atribuições das bandas dos complexos de dirutênio no estado sólido, na região do
infravermelho próximo.
Compostos λmáx (nm) Atribuição
Ru2Ac 974 δ (Ru2) � δ* (Ru2)
Ru2Sulin 1060 δ (Ru2) � δ* (Ru2)*
Ru2Diclofen 1057 δ (Ru2) � δ* (Ru2)*
Ru2IBP 1125 δ (Ru2) � δ* (Ru2)*
* valores aproximados : bandas largas
4.2.2 Espectros dos complexos RuDMSO, RuHMelox e do H2Melox.
Nos casos dos monômeros, observa-se para o precursor, RuDMSO (Figura 31), bandas
em 314 e 349 nm que são atribuídas às transições d-d 54.
O RuHMelox apresenta uma banda em 272 nm e outra larga e intensa com λmáx em
364 nm. Ambas podem ser atribuídas à transições internas do ligante H2Melox e a segunda
pode estar encobrindo bandas d-d que seriam esperadas nesta região (Figura 32).
250 300 350 400 450 500 550
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
349 nm
314 nm
Abs.
Comprimento de Onda (nm)
Figura 31 - Espectro eletrônico do complexo RuDMSO em água.
- 44 -
200 300 400 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
RuHMelox
HMelox
Abs.
Comprimento de Onda (nm)
272
364
369271
Figura 32 - Espectro eletrônico dos complexos RuHMelox e do fármaco Meloxicam em metanol.
Tabela 10 – Concentração, λmáx, ε e atribuições das bandas observadas nos espetros UV/VIS dos
complexos de dirutênio.
Composto λ (nm) ε x103 (cm-1mol-1L-1) Atribuição
RuDMSO 349
314
10,4
0,4 transição d-d
H2Melox 369
271
2,6
3,1 transição do ligante
RuHMelox 364
272
26,3
15,8 transição do ligante
4.3 Espectros Vibracionais FTIR e Raman.
4.3.1 Composto Ru2Sulin e do fármaco HSulin.
O sulindaco apresenta uma banda em 1701 cm-1 referente à freqüência de estiramento
da carbonila (ν(C=O)) do grupo -COOH (Figura 33). Esta banda não aparece no espectro do
- 45 -
complexo (Figura 34), no qual observa-se o surgimento de duas novas bandas, em 1469 e
1406 cm-1. Estas podem ser atribuídas, respectivamente, aos modos vibracionais dos
estiramentos anti-simétrico (νa) e simétrico (νs) do grupo COO-, indicando que o fármaco
perdeu seu hidrogênio ácido, coordenando-se ao rutênio na forma de ânion carboxilato.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
50
60
70
80
90
100
T%
Número de Onda (cm-1)
1701
3447
1007
11581270
Figura 33 - Espectros FTIR do fármaco HSulin.
O valor da diferença νa-νs = ∆ν é igual a 63 cm-1, indicando que este grupo está
coordenado ao núcleo dimetálico em ponte, de acordo com a literatura 1, 63.
As banda observadas em 1007 e 1019 cm-1 para o HSulin podem ser atribuídas ao
estiramento do grupo sulfóxido (υ(SO)). O padrão observado é característico do polimorfo II
que é a forma mais estável do fármaco 64, 65. No espectro do complexo são observadas bandas
em 1009 cm-1 e em 1039 cm-1. A alteração observada ao comparar o HSulin com o Ru2Sulin
pode ser devido a interações intra- e intermoleculares no sólido como, por exemplo, formação
de ligações de hidrogênio entre os grupos sulfóxido dos ligantes e as moléculas de água de
hidratação e/ ou a interação entre os grupos sulfóxido de moléculas vizinhas. Modificações
nesta região também são observadas quando se comparam espectros de diferentes polimorfos
do HSulin 65, 66.
- 46 -
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 4001800 1600 1400 1200 1000 800 600 400
u.a
FTIR
1617
1582
1607
14671406
1181
1169
Número de Onda (cm-1)
Raman
678
Figura 34 - Espectros FTIR e Raman do complexo Ru2Sulin
A banda observada no espectro do HSulin em 1270 cm-1 atribuída à vibração do
dímero formado pela interação dos grupos -COOH de duas moléculas de sulindaco
desaparece no espectro do complexo, confirmando a ausência do grupamento ácido. As
bandas em 1158 e 1169 cm-1, no HSulin e Ru2Sulin respectivamente, referem-se à freqüência
de estiramento da ligação C-F (υ(C-F)). O deslocamento pode ser devido à interações intra e/ou
intermoleculares. Uma nova banda observada no complexo em 678 cm-1, pode ser atribuída à
deformação angular OCO (δ(OCO)).
Observa-se ainda no complexo Ru2Sulin, na região de baixa freqüência, uma banda em
410 cm-1 que pode ser atribuída ao estiramento da ligação metal oxigênio ν(RuO) 67, 68.
Os espectros Raman dos compostos Ru2Sulin e Ru2Diclofen são apresentados nas
Figuras 26-28, e as atribuições das principais bandas na Tabela 7.
- 47 -
Tabela 11 - Atribuições tentativas das principais bandas observadas nos espectros do Ru2Sulin e do
HSulin.
HSulin Ru2Sulin
FTIR
Ru2Sulin
Raman Atribuição
ν (cm-1)
3447 3442 * ν (OH)
2914 2916 * ν (CH)
1704 - - ν (C=O) / ácido
1601 1607 1617 e 1582 ν (C=C)
- 1467 - νa (CO2-)
- 1406 1389 νs (CO2-)
1270 - - ν (COOH···COOH)
1158 1169 1181 ν (C-F)
1007 e 1019
1009 e 1039
1084 ν (SO)
- 678 encoberta δ (OCO)
- 410 - ν (Ru-O)
*região não abrangida no espectro Raman registrado.
4.3.2 Composto Ru2Diclofen e do fármaco NaDiclofen.
Os espectros dos compostos NaDiclofen e Ru2Diclofen são mostrados nas Figura 35 e
36 e a atribuição tentativa das principais bandas na Tabela 12.
Na Figura 35 duas bandas importantes são observadas em 3394 e 3257 cm-1 para o Na
Diclofen, que podem ser atribuídas, respectivamente, às freqüências ν(N-H) e ν(NH-O). No caso
do Ru2Diclofen, entretanto, na região do ν(N-H) aparecem bandas fracas em 3357, 3349 e 3342
cm-1 e também uma banda média em 3323 cm-1. O estiramento ν(N-H) também é observado
- 48 -
para o fármaco na forma protonada (HDiclofen) em 3323 cm-1 69. Na região de 1600 a 1380
cm-1 observam-se várias bandas típicas de vibração do anel aromático.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
T%
Número de onda (cm-1)
3388
3257
1575
1500
1454
1400
1168
1091
Figura 35 - Espectro FTIR do fármaco NaDiclofen.
O NaDiclofen apresenta duas bandas características dos estiramentos νa(COO) e νs(COO),
respectivamente, em 1575 e 1400 cm-1. O valor de ∆ν é de 175 cm-1, sendo coerente com a
literatura 70 para ligações iônicas de carboxilato. Comparando-se os espectros FTIR do
Ru2Diclofen com o NaDiclofen e HDiclofen 69, é possível identificar o suegimento de bandas
intensas em 1452 e 1411 cm-1, que podem ser atribuídas à νa(COO) e νs(COO), respectivamente. O
∆ν é igual a 41 cm-1, indicando que o grupo -COO está coordenando ao núcleo dimetálico em
ponte, de acordo com a literatura 63, 70.
Uma banda nova aparece em 690 cm-1 e pode ser atribuída à freqüência δ(OCO) do
grupo –COO- 55.
A banda em 1454 cm-1, no espectro do NaDiclofen, pode ser atribuída à vibração δ(Cl-
anel dissubstituido), segundo a literatura 60. No espectro do Ru2Diclofen a banda se sobrepõe aquela
de 1452 cm-1 (νa (-COO-)). No complexo sintetizado observa-se a banda em 410 cm-1 que pode
ser atribuída à freqüência de estiramento Ru-O (ν(Ru-O)) 40.
- 49 -
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 4001800 1600 1400 1200 1000 800 600 400
u.a
FTIR
Número de Onda (cm-1)
raman
1575
15781399
1409
690
672
Figura 36 - Espectros FTIR e Raman do complexo Ru2Diclofen.
Tabela 12 - Atribuições tentativas das principais bandas observadas nos espectros FTIR e Raman do
Ru2Diclofen e do fármaco NaDiclofen.
NaDiclofen Ru2Diclofen
FTIR
Ru2Diclofen
Raman Atribuições
ν (cm-1)
3394/3257 3355/3323 * ν NH
1587 1587 - vibrações do anel
1575 1452 - νa (COO-)
1401 1409 1399 νs (COO-)
- 690 692 δ(OCO)
- 410 - ν (Ru-O)
*região não abrangida no espectro Raman registrado.
- 50 -
4.3.3 Espectros Raman na região de freqüência mais baixa.
Os espectros Raman dos compostos Ru2Sulin e Ru2Diclofen, na faixa de 150-1000 cm-
1, são apresentados nas Figuras 37 – 38 , e as atribuições das principais bandas na Tabela 13.
Nos espectros dos complexos é possível observar bandas em 333 e 327 cm-1, para o
Ru2Sulin e Ru2Diclofen respectivamente, que podem ser atribuidas ao ν(Ru-Ru). A banda em
398 e 360 cm-1, Ru2Sulin e Ru2Diclofen respectivamente, deve-se ao ν(Ru-O). Os dados
observados estão de acordo com dados reportados para os complexos Ru2Ac (327 e 370 cm-1)
e Ru2IBP (336 e 374 cm-1) 40, 67.
200 400 600 800 1000
Intensidade Raman (u.a)
Número de Onda (cm-1)
HSulin
Ru2Sulin
333
181
589
Figura 37 - Espectros Raman do complexo Ru2Sulin e do Sulindaco.
- 51 -
200 400 600 800 1000
Intensidade Raman (u.a)
Número de Onda (cm-1)
NaDiclofen
Ru2Diclofen
175
296
322
Figura 38 - Espectros Raman do complexo Ru2Diclofen e do Diclofenaco sódico.
Tabela 13 - Atribuições tentativas para as bandas Raman dos compostos.
Atribuição Ru2Sulin Ru2Diclofen Ru2IBP40
ν (cm-1)
ν Ru-O 398 360 374
ν Ru-Ru 333 328 336
δ Ru-O 181 - 183
4.3.4 Compostos RuHMelox e H2Melox.
Na Figura 39 observa-se, no espectro do fármaco, uma banda em 3293 cm-1 referente
ao estiramento νN-H, e uma banda em 1621 cm-1, referente ao ν(C=O) do grupo amida
No espectro do complexo (Figura 40), a banda de νN-H está ausente e a banda de ν(C=O)
desloca-se para 1594 cm-1 o que indica modificações do grupamento amida quando o
- 52 -
meloxicam se coordena ao rutênio. O abaixamento da freqüência ν(C=O) evidencia participação
do oxigênio da amida na ligação ao Ru(II).
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
30
40
50
60
70
80
90
100
T%
Número de Onda (cm-1)
3293
1621
1550
1347 610
Figura 39 - Espectro FTIR do fármaco Meloxicam.
Observa-se também um deslocamento das bandas em 1550 e 1531 cm-1 do H2Melox
para 1520 e 1510 cm-1 no RuHMelox. Estas bandas podem ser atribuídas à freqüências de
estiramento de anel tiazólico substituído e a diminuição dos valores pode indicar a
participação do N tiazólico na coordenação ao Ru(II). Outro deslocamento é observado para a
banda em 610 cm-1, no H2Melox, que no complexo RuHMelox aparece em 627 cm-1. Este
deslocamento está de acordo com os dados observados para complexos metálicos com
piridina e seus derivados (imidazóis e tiazóis), para os quais as deformações do anel da
piridina livre são deslocadas para freqüências mais altas após a complexação pelo átomo de
nitrogênio 70. O mesmo comportamento foi observado para complexos metálicos com o
fármaco piroxicam 71, que são estruturalmente análogos aos complexos com meloxicam 72, 73.
As bandas de estiramento νa(SO2) e νs(SO2) do H2Melox, em 1347 e 1186 cm-1,
respectivamente, deslocam-se para 1336 e 1171 cm-1 no complexo. Estes pequenos
- 53 -
deslocamentos tem sido atribuídos a mudanças de densidade eletrônica sobre o átomo de
enxofre, sem envolvimento do grupo SO2 na coordenação a íons metálicos 71, 73.
No espectro do RuHMelox apresentam-se novas bandas que podem ser atribuídas ao
ligante DMSO: as bandas intensas em 1432 e 1020 cm-1 têm contribuição de deformação
angular dos grupos –CH3, e a banda larga em 1196 – 1094 cm-1 pode ser atribuída ao
estiramento ν(SO) de dimetilsulfóxido coordenado ao Ru(II) pelo átomo de enxofre. Outra nova
banda pode ser observada em 425 cm-1 que pode ser atribuída ao estiramento da ligação
rutênio-enxofre, ν(Ru-S), caracterizando a ligação do DMSO pelo átomo de enxofre, em 446
cm-1 existe um ombro que pode ter contribuição de ν(Ru-N). A banda em 395 cm-1 pode ser
atribuída ao estiramento Ru-O (ν(Ru-O)) 54.
A presença de águas de hidratação pode ser constatada pelo aparecimento de uma
banda larga em aproximadamente 3640 cm-1 (ν(OH)).
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 4001800 1600 1400 1200 1000 800 600 400
u.a
FTIR
Núemro de Onda (cm-1)
15901347
1555
1556
Raman
425
627
6841171
1171
Figura 40 - Espectros FTIR e Raman do complexo RuHMelox.
- 54 -
Tabela 14 - Atribuições tentativas das principais bandas observadas nos espectros do RuHMelox e do
H2Melox.
RuHMelox
FTIR
RuHMelox
Raman
Meloxicam
FTIR
Meloxicam
Raman Atribuições
ν (cm-1)
- * 3293
3242 3290 ν (NH)
1596 1606 - 1590 1621 desaparece ν (C=O)/ amida
1574
1556
1555
1550
1531
1556 e 1583
1529 ν (anel tiazólico)
1432
1405
1426
1414, 1395 - - δ(-CH3)DMSO
1336 - 1347 1341 νa (SO2)
1301
1275
1305
1259
1302
1268
1301
1263 δ(-CH3)
1182
1171
desaparece
1171
1186
1163
1181
1162 νs (SO2)
1006 encoberta - - ν (SO)
1098 e 1090 desaparece - - ν (S=O)DMSO
627 684 610 613 δ (anel tiazólico)
446 - - - ν (Ru-N)
425 423 - - ν (Ru-S)DMSO
395 - - ν (Ru-O)
- 55 -
4.4 Susceptibilidade Magnética.
Para verificar o comportamento magnético dos tetracarboxilatos de dirutênio foram
realizadas medidas de susceptibilidade magnética em temperatura ambiente, 25ºC. A partir
dos dados de susceptibilidade magnética molar (χM) obteve-se os valores de momento
magnético efetivo (µef), e a partir destes, os números de elétrons desemparelhados puderam
ser calculado, de acordo com a literatura 55 (Tabela 15).
Tabela 15 - Susceptibilidades Magnéticas Molares e Momentos Magnéticos Efetivos.
Complexo χM x 10-3 (unidades CGS mol-1) µef (M.B.)
Ru2Ac 7,2 4,2
Ru2Sulin 7,9 4,4
Ru2IBP 6,3 3,9
Ru2Diclofen 6,6 4,0
Os valores dos momentos magnéticos efetivos dos complexos de Ru2(II,III) estão na
faixa de 4,0 - 4,7 MB, de acordo com o esperado para espécies que apresentam três elétrons
desemparelhados e configuração eletrônica σ2 π4 δ2 π*2δ*1 com spin S = 3/2 38. Com uma
ordem de ligação igual a 2,5, os complexos de rutênio do tipo [Ru2(O2CR)4]+ apresentam 3
elétrons desemparelhados que, em geral, estão deslocalizados sobre os íons metálicos 1, 38. O
conhecimento das propriedades magnéticas dos tetracarboxilatos de [Ru2]5+ é portanto de
fundamental importância na elucidação da sua estrutura, uma vez que a presença dos 3
elétrons desemparelhados dão forte evidência da existência da ligação metal-metal múltipla
nestas espécies.
- 56 -
4.5 Medidas de Condutância Molar.
As medidas condutâncias molares dos compostos são apresentadas na Tabela 16.
Tabela 16 - Medidas de condutância molar dos complexos em metanol.
Complexo ΛM (Scm2mol-1)
Ru2Sulin 23,7
Ru2Diclofen *
Ru2IBP 2,5
RuHMelox 2,8
*Não atingiu o limite de detecção do aparelho.
Na literatura 74 os valores da condutância molar de eletrólitos 1:1 encontram-se na
faixa de 80 – 115 Scm2mol-1 para o solvente metanol. Portanto, os dados obtidos para os
complexos em estudo indicam que todos se comportam como não eletrólitos quando
dissolvidos em metanol.
4.6 Análise de TG/DSC/MS
4.6.1 Curvas TG, DTG e DSC dos complexos Ru2Sulin e Ru2Diclofen.
A curva TG do Ru2Sulin (Figura 41) apresenta uma pequena perda de massa (~2 %)
abaixo de 100 oC, que corresponde à saída de parte das moléculas de água de hidratação. A
partir deste ponto, até 250 oC, ocorre pequena perda de massa com saída de água e CO2,
indicando início da decomposição do fármaco ligante. A perda de massa acentuada, na faixa
de 260 – 400 ºC corresponde à completa decomposição dos ligantes equatoriais,
principalmente na forma de CO2, HF, SO, SO2 e H2O gasosos, conforme detectado com um
- 57 -
espectrômetro de massas acoplado a TG (Figura 42). O cloreto axial é liberado na forma de
HCl (g). Entre 400 e 600oC continua saindo HF e em temperatura superior a 600oC, o produto
de decomposição térmica formado apresenta-se estável.
A perda de massa total (-82%) é próxima do valor calculado para a formação de dois
mols de RuO2 (-85%) para cada mol de complexo, o que está de acordo com experimentos
realizados anteriormente em nosso laboratório para complexos análogos. O difratograma
(Figura 46) do resíduo obtido por aquecimento do composto a 1000 oC exibe um perfil
característico que é deste óxido 40.
A curva DSC do Ru2Sulin é caracterizada por eventos exotérmicos entre 200 e 400 ºC,
que correspodem às principais perdas de massa discutidas acima.
A curva TG do complexo Ru2Diclofen (Figura 43) mostra pequena perda de massa
abaixo de 100ºC referentes a perda de moléculas de água. Entre 100ºC e 200ºC, observa-se
ainda saída de água. Após estes eventos (entre 200 e 500 ºC) ocorrem perdas de massa
maiores, indicando decomposições dos ligantes equatoriais, principalmente nas formas de
CO2, H2O, NO, NO2 e HCl gasosos, conforme se pode ver nos espectros de massa
apresentados na Figura 44.
A curva DSC do Ru2Diclofen é caracterizada por eventos exotérmicos entre 200 e 500
ºC, que correspodem às principais perdas de massa discutidas acima.
A perda de massa experimental total (-79%) observada para o Ru2Diclofen é muito
próxima do valor calculado (82%) para a perda de moléculas de água, de quatro ligantes
diclofenaco equatoriais e do ligante cloreto axial, supondo-se neste caso também a formação
de óxido de rutênio (IV) como produto final da decomposição térmica. O difratograma
(Figura 47) do resíduo obtido por aquecimento do complexo a 1000 oC exibe um perfil
característico que é deste óxido 40.
- 58 -
200 400 600 800 1000
0
20
40
60
80
100
200 400 600 800 1000
-20
-15
-10
-5
0
200 400 600 800 1000
0
10
20
30
40
50
Mass/%
Temperatura (ºC)
DTG/(%/min)
-82%
DSC/(mW/mg)
250ºC
331ºC80ºC
245ºC
291ºC
331ºC
Figura 41 – Curvas TG, DTG e DSC do Ru2Sulin.
200 400 600 800 1000
0,01,0x10
-52,0x10
-53,0x10
-54,0x10
-5
200 400 600 800 1000
0,02,0x10
-64,0x10
-66,0x10
-6
200 400 600 800 1000
0,03,0x10
-56,0x10
-59,0x10
-5
200 400 600 800 1000
0,0
2,0x10-6
4,0x10-6
200 400 600 800 1000
0,01,0x10
-62,0x10
-63,0x10
-6
200 400 600 800 1000
1,4x10-11
2,1x10-11
2,8x10-11
3,5x10-11
H2O
HF
CO2
SO
QMID (A)
SO2
Temperatura (ºC)
HCl
Figura 42– Espectros de massa obtidos dos principais produtos gasosos da decomposição térmica do
complexo Ru2Sulin.
- 59 -
200 400 600 800 1000
20
40
60
80
100
200 400 600 800 1000
-10
-8
-6
-4
-2
0
200 400 600 800 1000
0
5
10
15
20
25
30
Temperatura (ºC)
Mass/%
266
415
169
-79%
DTG/(%/min)
DSC/(mW/mg)
171
272
418
Figura 43 - Curvas TG, DTG e DSC do Ru2Diclofen.
200 400 600 800 1000
6,0x10-10
9,0x10-10
1,2x10-9
1,5x10-9
200 400 600 800 1000
0,08,0x10
-111,6x10
-102,4x10
-103,2x10
-10
200 400 600 800 1000
0,06,0x10
-111,2x10
-101,8x10
-102,4x10
-10
200 400 600 800 1000
0,0
2,0x10-9
4,0x10-9
6,0x10-9
200 400 600 800 1000
0,06,0x10
-81,2x10
-71,8x10
-72,4x10
-73,0x10
-7
H2O
QMID (A)
NO
HCl
CO2
Temperatura (ºC)
NO2
Figura 44 - Espectros de massa obtidos dos principais produtos gasosos da decomposição térmica do
complexo Ru2Diclofen.
- 60 -
A análise do resíduo da decomposição térmica dos complexos Ru2Sulin e Ru2Diclofen
(Figura 45) a 1000ºC foi feita por DRX (Figura 46 e 47).
Figura 45 – Complexo Ru2Sulin (A) e Ru2Diclofen (B) antes e depois de calcinado à 1000ºC.
20 30 40 50 60
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Intensidade Relativa
2θ/Graus
Ru2Sulin28,2
35,154,3
Figura 46 – Difratogramas dos resíduos de decomposição térmica do complexo Ru2Sulin aquecidos
em estufa a 1000 oC.
A B
- 61 -
20 30 40 50 60
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Intensidade relativa
2θ/ graus
Ru2Diclofen28,1
35,1
54,3
Figura 47 – Difratogramas dos resíduos de decomposição térmica dos complexo Ru2Diclofen
aquecidos em estufa a 1000 oC.
O perfil dos difratogramas obtidos, Figura 46 e 47, é coerente com a formação do
RuO2 como resíduo resultante da decomposição térmica até 1000ºC dos complexos Ru2Sulin
e Ru2Diclofen, pois comparando os valores de d calculados para os 3 picos mais intensos
nestes difratogramas é possível observar que são coerentes com os dados publicados na
literatura 75 para este óxido.
Tabela 17 - Valores das distâncias interplanares para os picos mais intensos do difratograma do RuO2.
Valores obtidos a partir dos difratogramas dos resíduos resultantes da decomposição térmica dos complexos.
Valores descritos na literatura - JCPDS 75- para o
RuO2.
Intensidade relativa (%)
2θ d(Å) Intensidade relativa (%)
d(Å)
100 28,1 3,2 100 3,2
82 35,2 2,5 77 2,5 Ru2Sulin
76 54,4 1,6 54 1,7
- 62 -
100 28,1 3,2 100 3,2
76 35,2 2,5 77 2,5 Ru2Diclofen
58 54,4 1,6 54 1,7
4.6.2 Curvas TG, DTG e DSC do complexo RuHMelox
Na literatura são encontrados estudos a respeito do comportamento térmico do
meloxicam e de complexos de cobre que possuem este fármaco como ligante 73 e de
complexos ternários de tenoxicam e piroxicam que são análogos ao meloxicam. 76.
O complexo RuHMelox (Figura 48) apresenta uma primeira etapa de decomposição,
dentro da faixa de temperatura de 25 a 130°C, corresponde à perda das duas moléculas de
água de coordenação (2H2O). A etapa de decomposição seguinte ocorre de 130 à 330 ºC onde
uma grande parte do nitrogênio presente no ligante H2Melox é liberada nesta faixa de
temperatura na forma de NO2 e água, observa-se ainda a presença, em menor quantidade, de
CO2, SO e SO2 como produtos de decomposição. A última etapa da decomposição do
complexo RuHMelox ocorre entre 340 – 500ºC tendo como produto de decomposição o CO2,
SO e SO2 em maior quantidade e em menor quantidade H2O e NO2.
200 400 600 800 1000
0
20
40
60
80
100
200 400 600 800 1000
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
200 400 600 800 1000
0
5
10
15
20
25
Temperatura (ºC)
Mass/%
DTG/(%/min) DSC/(mW/mg)
-91%
113156
225
259
331
402
404
Figura 48 - Curvas TG, DTG e DSC do RuHMelox.
- 63 -
A decomposição dos ligantes aparece primeiro como processos endotérmicos e a
ultima etapa como um processo exotérmico na corresponde curva DSC do complexo.
A perda de massa total obtida (experimental 91%, calculada 86%) é coerente com a
total decomposição dos ligantes e com a formação de RuO2 como produto final de
decomposição.
As espécies formadas na decomposição térmica do RuHMelox foram analisadas no
espectrômetro de massa e seus espectros estão apresentados na Figura 49. O sólido azulado
(Figura 50) obtido após a decomposição térmica do complexo RuHMelox foi identificado por
análise DRX (Figura 51) como RuO2.
200 400 600 800 1000
4,0x10-6
8,0x10-6
1,2x10-5
1,6x10-5
200 400 600 800 1000
0,09,0x10
-61,8x10
-52,7x10
-53,6x10
-5
200 400 600 800 1000
0,01,0x10
-72,0x10
-73,0x10
-74,0x10-7
200 400 600 800 1000
0,06,0x10
-71,2x10-6
1,8x10-6
2,4x10-6
200 400 600 800 1000
0,06,0x10
-71,2x10
-61,8x10
-62,4x10
-6
200 400 600 800 1000
1,2x10-11
1,4x10-11
1,6x10-11
1,8x10-11
2,0x10-11
H2O
CO2
NO2
SO
SO2
QMID (A)
Temperatura(ºC)
HCl
Figura 49 - Espectros de massa obtidos dos principais produtos gasosos da decomposição térmica do
complexo RuHMelox.
- 64 -
Figura 50 – RuHMelox antes e depois de calcinado à 1000ºC.
20 30 40 50 60
0
1000
2000
3000
4000
5000
Intensidade relativa
2θ/ graus
RuHMelox28,1
35,2
54,3
Figura 51 - Difratograma do resíduo de decomposição térmica, à 1000ºC, do complexo RuHMelox.
Tabela 18 - Valores das distâncias interplanares para os picos mais intensos do difratograma do RuO2.
Valores obtidos a partir dos difratogramas dos resíduos resultantes da decomposição térmica.
Valores descritos na literatura - JCPDS75 - para o
RuO2.
Intensidade relativa (%)
2θ d(Å) Intensidade relativa (%)
d(Å)
100 28,1 3,2 100 3,2
81 35,2 2,5 77 2,5 RuHMelox
57 54,4 1,6 54 1,7
- 65 -
4.7 Proposta de estruturas para os complexos sintetizados:
4.7.1 Ru2Sulin e Ru2Diclofen
De acordo com os dados de caracterização, os complexos sintetizados apresentam em
seus espectros eletrônicos bandas referentes à transição π (Ru-O,Ru2) →π*(Ru2),
características dos carboxilatos de dirutênio. Medidas de susceptibilidade magnética mostram
que os compostos apresentam 3 elétrons desemparelhados, o que pode ser explicado
considerando uma estrutura em gaiola para estas espécies. Os espectros FTIR comprovam que
os fármacos ligam-se a unidade dimetálica através do ânion carboxilato. A partir destes dados,
as estruturas a seguir foram propostas para os novos complexos utilizando-se o programa
HyperChem 7.5.
Figura 52 - Estrutura otimizada para o complexo [Ru2(Sulin)4Cl], cores: azul claro – C;marrom – Ru;
vermelho – O; amarelo – S; verde – Cl; lilás – F. Os hidrogênios foram omitidos para uma melhor
visualização da estrutura.
- 66 -
Figura 53 - Estrutura otimizada para o complexo [Ru2(Diclofen)4Cl], cores: azul claro – C;marrom –
Ru; vermelho – O; azul escuro – N; verde – Cl;. Os hidrogênios foram omitidos para uma melhor
visualização da estrutura.
4.7.2 RuHMelox
De acordo com os dados obtidos propõe-se que o complexo RuHMelox apresenta uma
estrutura contendo dois ânions H2Melox ocupando as posições trans em ponte e duas
moléculas de DMSO.
- 67 -
Figura 54 – Esquema proposto para a síntese do RuHMelox.3
Figura 55 - Estrutura otimizada para o complexo [Ru2(HMelox)2(DMSO)2], cores: azul claro – C;marrom – Ru; vermelho – O; azul escuro – N; Os hidrogênios foram omitidos para uma
melhor visualização da estrutura.
3 Esquema de Claudia Regina Gordijo adaptado para o complexo de rutênio.
- 68 -
555 EEESSSTTTUUUDDDOOOSSS DDDAAA IIINNNTTTEEERRRAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDOOOSSS CCCOOOMMMPPPLLLEEEXXXOOOSSS CCCOOOMMM AAA AAALLLBBBUUUMMMIIINNNAAA HHHUUUMMMAAANNNAAA ––– RRREEESSSUUULLLTTTAAADDDOOOSSS EEE DDDIIISSSCCCUUUSSSSSSÕÕÕEEESSS
5.1 Dicroísmo Circular
Para investigar as mudanças conformacionais e estruturais da albumina humana, frente
aos complexos sintetizados, utilizou-se a técnica de Dicroísmo Circular. A existência de uma
característica especial da ligação peptídica, que é o fato de os átomos que a compõem
poderem interagir com átomos de outras ligações peptídicas, contribuindo para forçar a
proteína a assumir uma estrutura peculiar, ou seja, não aleatória. Essa forma de estruturação
da cadeia protéica origina a chamada "estrutura secundária" da proteína, que pode então
assumir arranjos helicoidais em determinados trechos de sua seqüência de aminoácidos.77
Estudos cristalográficos e de RMN, comprovam que proteínas, de fato, apresentam
regiões com arranjos helicoidais, intercaladas com regiões menos estruturadas. Essas formas
regulares de arranjos atômicos interagem de modo particular com a radiação polarizada,
fazendo, por exemplo, com que uma luz com polarização circular no sentido horário seja
absorvida diferentemente do que uma luz com polarização no sentido anti-horário. A
espectroscopia de dicroísmo circular permite detectar essa diferença de absorção de radiação
com polarização circular, indicando se há arranjos helicoidais dentro de uma molécula de
proteína. 41
Ao fazermos um experimento de dicroísmo circular para proteínas, estamos nos
informando sobre as características da estrutura secundária. Com este experimento não
conseguimos obter informações sobre as posições dos átomos na macromolécula, mas somos
capazes de dizer se estão ocorrendo mudanças na conformação da proteína e, em caso
positivo, correlacioná-las com as características do meio circundante. Podemos saber, por
exemplo, se mudanças de temperatura, ou de pH, ou a presença de outras moléculas no
- 69 -
solvente são capazes de modificar a estrutura da proteína, e se essas modificações de estrutura
afetam a atividade biológica da macromolécula.77
A estrutura secundária da Albumina é predominantemente do tipo α-hélice
(aproximadamente 67%); o número de hélices na estrutura é 28. O espectro CD da HSA
apresenta duas bandas negativas na região do ultravioleta, em 209 e 220 nm, que são
características dessa estrutura.
Nos experimentos de CD realizados investigou-se a perturbação causada pelos
diferentes compostos na estrutura secundária da proteína, empregando-se vadiadas razões
molares de HSA : Composto.
Para verificar quantitativamente as mudanças na estrutura secundária da proteína, a
partir dos dados obtidos no experimento, calcularam-se as porcentagens dos tipos de estrutura
secundária na proteína após a adição de crescentes quantidades de complexo (Tabela 19).
Analisou-se também um composto antitumoral conhecido na literatura, a Cisplatina
(Platinil®), para verificar como o mesmo se comporta frente à HSA. Na Figura 56 pode-se
observar que a alteração no perfil do espectro da HSA é pequena quando se adiciona o
Platinil® até a razão molar 1:10. Esse comportamento indica que a concentração de cis-
platina no meio não é suficiente para induzir uma grande mudança na estrutura secundária da
proteína 78. De acordo com os dados da Tabela 19 observa-se que na razão molar
1HSA:1Platinil® a contribuição da estrutura alfa diminui de 59% para 45% e da estrutura
beta passa de 8 para 23%. Com as demais adições de Platinil® estas porcentagens
permanecem praticamente inalteradas.
No espectro do complexo Ru2Ac (Figura 57) a banda em 208 nm diminui com o
aumento da quantidade de complexo adicionada à proteína. Esta mudança no espectro
evidencia que o complexo está interagindo com a proteína.
- 70 -
200 220 240 260
-2,0x104
-1,5x104
-1,0x104
-5,0x103
0,0
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
θ[deg.cm2.dmol-1]
Comprimento de Onda (nm)
HSA: Platinil
Figura 56 - Espectro CD da HSA com o Platinil® em diferentes razões molares.
200 220 240 260
-2,0x104
-1,5x104
-1,0x104
-5,0x103
0,0
θ [deg.cm2.dmol-1]
Comprimento de Onda (nm)
HSA: RuAc
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
Figura 57 - Espectro CD da HSA com o Ru2Ac em diferentes razões molares.
Nota-se que a proteína, com a adição de Ru2Ac, até a razão 1:5 perde pouco sua
estrutura α e suas estruturas beta e randômica apresentam um pequeno aumento em relação a
proteína livre. Somente a partir da adição de um grande excesso de complexo (1:10) a
proteína acaba perdendo consideravelmente sua estrutura alfa.
Nas Figura 58 e 59 temos os espectros CD da HSA com o fármaco NaDiclofen e com
o complexo Ru2Diclofen, respectivamente. Para ambos observa-se a perda gradativa da banda
- 71 -
em 208 nm e a diminuição da intensidade da banda em 220 nm, o que indica que o fármaco
livre e o complexo Ru2Diclofen apresentam comportamentos semelhantes quando se compara
o mesmo número de mols de fármaco.
200 220 240 260
-2,0x104
-1,5x104
-1,0x104
-5,0x103
0,0
Comprimento de Onda (nm)
θ [deg.cm2.dmol-1]
HSA: NaDiclofen
1:0
1:4
1:8
1:12
1:16
1:20
1:40
Figura 58 - Espectro CD da HSA com o NaDiclofen em diferentes razões molares.
200 220 240 260
-2,0x104
-1,5x104
-1,0x104
-5,0x103
0,0
HSA:Ru2Diclofen
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
Comprimento de Onda (nm)
θ [deg.cm2.dmol-1]
Figura 59 - Espectro CD da HSA com o Ru2Diclofen em diferentes razões molares.
- 72 -
Nas Figura 60 e 61 observa-se o comportamento da estrutura da proteína frente a
diferentes concentrações de HSulin e de Ru2Sulin. Nota-se que a proteína em presença do
fármaco sulindaco apresenta comportamento semelhante ao observado em presença do
Ru2Sulin, quando se compara o mesmo número de mols de fármaco.
200 220 240 260
-2,0x104
-1,5x104
-1,0x104
-5,0x103
0,0
Comprimento de Onda (nm)
θ [deg.cm2.dmol-1]
HSA:HSulin
1:0
1:4
1:8
1:12
1:16
1:20
1:40
Figura 60 - Espectro CD da HSA com o HSulin em diferentes razões molares.
200 220 240 260
-2,0x104
-1,5x104
-1,0x104
-5,0x103
0,0
Comprimento de Onda (nm)
θ [deg.cm2.dmol-1]
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
HSA:Ru2Sulin
Figura 61 - Espectro CD da HSA com o Ru2Sulin em diferentes razões molares.
- 73 -
A porcentagem de estrutura α –hélice sofre uma redução e a da β um aumento logo
nas primeiras adições de Ru2Sulin e de HSulin (Tabela 19), de modo semelhante ao que
acontece com o Nadiclofen e Ru2Diclofen.
Nos casos do HIBP (Figura 62) e Ru2IBP (Figura 63), observa-se comportamentos
diferentes para o ibuprofeno, as adições sucessivas de fármaco não altera significativamente a
estrutura da proteína, enquanto que com a variação na proporção HSA:Complexo a
composição da estrutura secundária é alterada.
200 220 240 260
-2,0x104
-1,5x104
-1,0x104
-5,0x103
0,0
θ [deg.cm2dmol-1]
Comprimento de Onda (nm)
HSA:HIBP
1:0
1:4
1:8
1:12
1:16
1:20
1:40
Figura 62- Espectro CD da HSA com o HIBP em diferentes razões molares.
- 74 -
200 220 240 260
-2,0x104
-1,5x104
-1,0x104
-5,0x103
0,0
HSA:Ru2IBP
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:6
θ [deg.cm2.dmol-1]
Comprimento de Onda (nm)
Figura 63- Espectro CD da HSA com o Ru2IBP em diferentes razões molares.
Os espectros CD das Figura 64 – 66 que a presença dos complexos RuDMSO,
H2Melox e RuHMelox, respectivamente, provocam apenas pequenas alterações na estrutura
da proteína e que adições crescentes destas substâncias não modificam significativamente a
estrutura secundária da mesma.
200 220 240 260
-2,0x104
-1,5x104
-1,0x104
-5,0x103
0,0
θ[deg.cm2.dmol-1]
Comprimento de Onda (nm)
HSA:RuDMSO
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
Figura 64 - Espectro CD da HSA com o RuDMSO em diferentes razões molares.
- 75 -
190 200 210 220 230 240 250 260
-1,6x102
-1,2x102
-8,0x101
-4,0x101
0,0
θ [deg.cm2.dmol-1]
Comprimento de Onda (nm)
1:0
1:2
1:4
1:6
1:8
1:10
1:20
HSA:H2Melox
Figura 65 - Espectro CD da HSA com o H2Melox em diferentes razões molares.
200 220 240 260
-2,0x104
-1,5x104
-1,0x104
-5,0x103
0,0
θ[deg.cm2dmol-1]
Comprimento de Onda (nm)
HSA:RuHMelox
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
Figura 66- Espectro CD da HSA com o RuHMelox em diferentes razões molares.
- 76 -
Tabela 19 – Previsão das porcentagens de estrutura secundária da HSA com a adição dos complexos
testados.
Alfa (α) Beta (β) Turno
HSA 59% 8% 33%
1HSA:1Platinil® 45% 23% 33%
1HSA:2Platinil® 45% 23% 33%
1HSA:3Platinil® 45% 23% 33%
1HSA:4Platinil® 45% 23% 33%
1HSA:5Platinil® 45% 22% 33%
1HSA:10Platinil® 43% 17% 40%
1HSA:1Ru2Ac 58% 8% 34%
1HSA:2Ru2Ac 52% 15% 33%
1HSA:3Ru2Ac 45% 23% 32%
1HSA:4Ru2Ac 45% 23% 32%
1HSA:5Ru2Ac 43% 16% 41%
1HSA:10Ru2Ac 5% 47% 47%
1HSA:4NaDiclofen 47% 21% 32%
1HSA:8NaDiclofen 41% 6% 53%
1HSA:12NaDiclofen 35% 7% 57%
1HSA:16NaDiclofen 36% 7% 58%
1HSA:20NaDiclofen 10% 42% 48%
1HSA:40NaDiclofen 8% 44% 48%
1HSA:1Ru2Diclofen 44% 18% 38%
1HSA:2Ru2Diclofen 39% 1% 59%
1HSA:3Ru2Diclofen 37% 4% 59%
- 77 -
1HSA:4Ru2Diclofen 33% 10% 57%
1HSA:5Ru2Diclofen 10% 42% 48%
1HSA:10Ru2Diclofen 6% 47% 48%
1HSA:4HSulin 45% 23% 32%
1HSA:8HSulin 39% 1% 60%
1HSA:12HSulin 39% 1% 60%
1HSA:16HSulin 34% 9% 57%
1HSA:20HSulin 10% 42% 48%
1HSA:40HSulin 8% 44% 48%
1HSA:1Ru2Sulin 45% 23% 32%
1HSA:2Ru2Sulin 39% 1% 60%
1HSA:3Ru2Sulin 34% 9% 57%
1HSA:4Ru2Sulin 30% 15% 55%
1HSA:5Ru2Sulin 8% 44% 48%
1HSA:10Ru2Sulin 4% 48% 48%
1HSA:4HIBP 45% 22% 33%
1HSA:8HIBP 45% 22% 33%
1HSA:12HIBP 45% 22% 33%
1HSA:16HIBP 45% 22% 33%
1HSA:20HIBP 45% 22% 33%
1HSA:40HIBP 45% 22% 33%
1HSA:1Ru2IBP 45% 22% 33%
1HSA:2Ru2IBP 41% 9% 50%
1HSA:3Ru2IBP 39% 1% 60%
- 78 -
1HSA:4Ru2IBP 39% 1% 60%
1HSA:5Ru2IBP 37% 3% 59%
1HSA:10Ru2IBP 32% 13% 55%
1HSA:1RuDMSO 45% 23% 33%
1HSA:2RuDMSO 45% 23% 33%
1HSA:3RuDMSO 45% 23% 33%
1HSA:4RuDMSO 45% 23% 33%
1HSA:5RuDMSO 45% 23% 33%
1HSA:10RuDMSO 45% 23% 33%
1HSA:1H2Melox 45% 23% 33%
1HSA:2H2Melox 45% 23% 33%
1HSA:3H2Melox 45% 22% 33%
1HSA:4H2Melox 44% 20% 34%
1HSA:5H2Melox 44% 21% 34%
1HSA:10H2Melox 43% 16% 41%
1HSA:1RuHMelox 45% 23% 33%
1HSA:2RuHMelox 45% 23% 33%
1HSA:3RuHMelox 45% 22% 33%
1HSA:4RuHMelox 44% 20% 34%
1HSA:5RuHMelox 44% 21% 34%
1HSA:10RuHMelox 43% 16% 41%
* A soma das porcentagens, em alguns casos, não resulta em 100% devido ao arredondamento feito pelo K2D.
- 79 -
5.2 Fluorescência
A técnica de Fluorescência pode também auxiliar o estudo destas interações proteína-
complexo. A Fluorescência é um processo em que os elétrons em estados excitados de uma
molécula tendem a voltar para o estado fundamental cedendo energia para o meio, e emitindo
fótons. A energia do fóton emitido não é igual à do fóton absorvido, apesar do fato de a
absorção de radiação e a emissão na fluorescência resultarem em transições entre estado
eletrônico excitado e estado fundamental. Ao absorver um fóton, a molécula estava num
arranjo de equilíbrio adequado ao estado eletrônico fundamental. Quando passa a um estado
eletrônico excitado, esta molécula vai se rearranjar, ou sofrer uma relaxação, para outra
geometria, que seja mais adequada a esse estado excitado. Uma pequena parte da energia é
perdida nessa relaxação, de modo que no momento da emissão, a diferença de energia entre o
estado excitado e o fundamental será menor do que aquela existente no momento da absorção.
Como resultado, a energia do fóton emitido é menor que a do fóton absorvido 79.
Na espectroscopia de fluorescência, irradia-se uma amostra com luz UV-visível e
detecta-se a radiação emitida por ela. Experimentalmente, pode-se determinar a energia da
radiação emitida, a intensidade com que ocorre a emissão, o desvio na direção de polarização
(quando a luz incidente é polarizada), o intervalo de tempo no qual a molécula permanece no
estado excitado (da ordem de 10-9 segundos). Todos esses “parâmetros fluorescentes”
dependem da interação da molécula fluorescente com o meio circundante, compreendido
como as moléculas vizinhas, sejam essas moléculas do solvente ou outras presentes no meio.
No caso de proteínas, existem 3 aminoácidos que absorvem luz UV-visível e que podem
apresentar fluorescência: a fenilalanina, a tirosina e o triptofano. Do estudo das características
de fluorescência desses aminoácidos em proteínas, é possível obter informações a respeito da
- 80 -
ocorrência de mudanças estruturais relacionadas, como sempre, à atividade que as proteínas
exercem nos organismos vivos.80
O triptofano Figura 67 em particular tem se mostrado bastante conveniente para este
tipo de estudo, dada a dependência entre suas propriedades fluorescentes e o caráter
hidrofóbico ou hidrofílico de suas vizinhanças. Por exemplo, há no músculo uma proteína
chamada troponina, que sofre uma mudança de conformação quando íons de cálcio ligam-se a
ela e essa mudança pode ser claramente notada observando-se a fluorescência de um resíduo
triptofano presente na membrana. O que está sendo observado nesse caso é um evento
molecular relacionado às etapas iniciais do processo de movimentação muscular, que depende
da interação com íons de cálcio presentes no meio celular 27, 80-86.
Figura 67 - Estrutura do Triptofano: cores: azul claro – C; vermelho – O; azul escuro – N. Os
hidrogênios foram omitidos para uma melhor visualização da estrutura.
O resíduo de triptofano é o mais freqüentemente estudado entre os três fluoróforos
intrínsecos da HSA (tirosina e fenilalanina) para obter informações sobre mudanças
conformacionais da proteína. A fim de excluir o efeito concomitante da fluorescência dos
resíduos de tirosina a HSA é excitada em 298 nm. Neste comprimento de onda de excitação, o
comprimento de onda de emissão da HSA é 350 nm. Emm todos os experimentos deste
trabalho a concentração de HSA usada foi de 4x10-6 molL-1.
- 81 -
Na Figura 68 temos o espectro de emissão da HSA na presença de diferentes
concentrações de Platinil®. Observa-se apenas pequenas variações no espectro, o que indica
que em presença de cisplatina, não ocorre supressão significativa da fluorescência do
triptofano.
320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
0
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
6x105
7x105
8x105
Intensidade de Fluorescência
Comprimento de Onda (nm)
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
HSA:Platinil
Figura 68 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de Platinil® em diferentes razões molares.
Na Figura 69, temos o espectro de HSA em presença de diferentes concentrações de
Ru2Ac. Neste caso observa-se um decaimento gradativo da intensidade de fluorescência, o
que está de acordo com o descrito na literatura para complexos de rutênio. 81, 87
O estudo com o fármaco NaDiclofen (Figura 70) mostra, também, um decaimento da
intensidade de fluorescência, esta queda ocorre de maneira acentuada já na razão
1HSA:1Diclofenaco. A Figura 71 mostra que a adição de Ru2Diclofen à solução com
albumina na proporção 1HSA:1 Ru2Diclofen faz diminuir de maneira mais efetiva a
intensidade da fluorescência do triptofano. Logo na primeira adição a intensidade já cai para
aproximadamente 84%, mostrando que a mudança no ambiente ao redor do triptofano causada
tanto pelo fármaco quanto pelo complexo é mais efetiva quando comparada a causada pelo
complexo Ru2Ac.
- 82 -
320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
0
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
6x105
7x105
8x105
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
Intensidade de Fluorescência
Comprimento de Onda (nm)
HSA:Ru2Ac
Figura 69- Espectro de Fluorescência da HSA em presença de Ru2Ac em diferentes razões molares.
320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
0
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
6x105
7x105
8x105
Intensidade de Fluorescência
Comprimento de Onda (nm)
1:0
1:2
1:4
1:6
1:8
1:10
1:20
HSA: NaDiclofen
Figura 70- Espectro de Fluorescência da HSA em presença de NaDiclofen em diferentes razões.
- 83 -
320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
0
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
6x105
7x105
8x105
Intensidade de Fluorescência
Comprimento de Onda (nm)
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
HSA: Ru2Diclofen
Figura 71 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de Ru2Diclofen em diferentes razões
molares.
Nas Figura 72 Figura 73 observa-se a supressão causada pelo fármaco HSulin e pelo
complexo Ru2Sulin. O fármaco HSulin é o que apresenta maior supressão na intensidade de
fluorescência. Em termos de porcentagem de o complexo Ru2Sulin apresenta supressão bem
mais significativa, na primeira adição de complexo (1HSA:1Ru2Sulin) observa-se que a
intensidade de fluorescência decai para aproximadamente 76% da fluorescência inicial e com
as demais adições está intensidade cai para 9% o que mostra que este complexo atua de
maneira muito mais efetiva no que diz respeito a mudança de polaridade do meio em torno do
resíduo de triptofano.
No caso do ibuprofeno (Figura 74), observa-se variação não significativa da
intensidade da banda, o que indica que a presença do fármaco não causa supressão da
fluorescência do triptofano.
No caso do complexo Ru2IBP (Figura 75), observa-se supressão da fluorescência,
porém, levando em conta as faixas de razões molares da HSA:composto, pode-se dizer que
- 84 -
esta é menos acentuadas do que aquelas supressões observadas para os complexos Ru2Sulin e
Ru2Diclofen.
320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
0
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
6x105
7x105
8x105
Intensidade de Fluorescência
Comprimento de Onda (nm)
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
HSA:HSulin
Figura 72 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de HSulin em diferentes razões molares.
320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
0
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
6x105
7x105
8x105
Intensidade de Fluorescência
Comprimento de Onda (nm)
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
HSA: Ru2Sulin
Figura 73 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de Ru2Sulin em diferentes razões molares.
- 85 -
320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
0
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
6x105
7x105
8x105
9x105
Intensidade de Fluorescência
Comprimento de Onda (nm)
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
HSA:HIBP
Figura 74 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de HIBP em diferentes razões molares.
320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
0
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
6x105
7x105
8x105
Intensidade de Fluorescência
Comprimento de Onda (nm)
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
HSA: Ru2IBP
Figura 75 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de Ru2IBP em diferentes razões molares.
Na Figura 76 observa-se o comportamento da fluorescência do triptofano frente ao
complexo RuDMSO, neste caso a supressão de fluorescência também não parece ser
significativa. Já na presença do fármaco H2Melox (Figura 77) o triptofano apresenta uma
- 86 -
supressão similar a do complexo RuHMelox (Figura 78), o que nos dá mais uma evidência de
que o ligante é de grande importância na supressão da fluorescência.
320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
0
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
6x105
7x105
8x105
Intensidade de Fluorescência
Comprimento de Onda (nm)
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
HSA: RuDMSO
Figura 76 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de RuDMSO em diferentes razões
molares.
320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
0
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
6x105
7x105
8x105
Intensidade de Fluorescência
Comprimento de Onda (nm)
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
HSA:H2Melox
Figura 77 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de H2Melox- em diferentes razões
molares.
- 87 -
320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
0
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
6x105
7x105
8x105
Intensidade de Fluorescência
Comprimento de Onda (nm)
1:0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
HSA:RuHMelox
Figura 78 - Espectro de Fluorescência da HSA em presença de RuHMelox em diferentes razões
molares.
Cálculo de porcentagem de supressão de fluorescência
A radiação UV pode ser usada para excitar macromoléculas, mas a probabilidade desta
luz UV provocar uma alteração mensurável é pequena porque a energia pode ser dissipada
tanto como fluorescência quanto como calor. Esta probabilidade é chamada rendimento
quântico φ, que representa o número de partículas danificadas pelo número de quanta
absorvido.
A resposta da fotomultiplicadora do espectrofluorímetro pode variar de um dia de
experimento para o outro, mesmo utilizando-se as mesmas condições de: concentração da
proteína, pH da solução e λ de excitação. Para poder comparar com maior confiança
experimentos de fluorescência realizados em dias diferentes, torna-se necessário calcular o
rendimento quântico das espécies estudadas, pois este é sempre constante quando se utiliza as
mesmas condições experimentais.
No caso dos experimentos realizados neste trabalho, foi necessário calcular o
rendimento quântico da HSA livre e também das combinações HSA:Complexos.
- 88 -
De acordo com a literatura 88 o rendimento quântico da HSA em água e pH 6,4, com λ
de excitação de 280 nm, é de 0,132 e a intensidade da fluorescência varia significativamente
com a mudança do pH.
Como aqui os experimentos foram realizados para um λ de excitação diferente , 298
nm ao invés de 280 nm, o primeiro passo foi verificar se ocorreria alteração na intensidade de
fluorescência com a mudança do λ de excitação. Para isso preparou-se uma solução de
albumina humana com concentração 4,0x10-6 molL-1 em água e pH 6,4 e então registrou-se os
espectros cpara ambos os λ de excitação 280 nm e 298 nm.
Como se pode observar na Figura 79, os espectros apresentam perfis diferentes e,
portanto rendimentos quânticos de emissão diferentes, o rendimento quântico de 0,132, para λ
de excitação 280 nm, não pode ser utilizado para os experimentos realizados com λ de
excitação de 298 nm. Porém é possível calcular o rendimento quântico de emissão da HSA
com λ de excitação de 298 nm a partir do rendimento quântico para a amostra excitada em
280 nm.
350 400 450 500
0,0
5,0x104
1,0x105
1,5x105
2,0x105
2,5x105
3,0x105
Intensidade
Comprimento de Onda (nm)
pH6.4 (280)
pH6.4 (298)
Figura 79 - Espectro de fluorescência da HSA em pH 6,4 para diferentes λ de excitação.
- 89 -
5.2.1 Determinação do rendimento quântico de emissão a partir de uma amostra padrão 89.
O rendimento quântico de uma amostra desconhecida pode ser calculado pela seguinte
equação:
p
p
a
a emaaem
ppem
em CI
CIϕ
ε
εϕ
)(
)(
)(= Equação 3
Onde:
Iem(a)= intensidade de emissão da amostra
Iem(p)= intensidade de emissão do padrão
εa = absortividade molar da amostra
εp= absortividade molar do padrão
Ca = concentração molar da amostra
Cp= concentração molar do padrão
φem(a)= rendimento quântico de emissão da amostra
φem(p)= rendimento quântico de emissão do padrão
As medidas de rendimento quântico devem ser feitas nas mesmas condições para o
padrão e para a amostra. Ambos os espectros devem ser corrigidos para a resposta da
fotomultiplicadora.
Para o caso em que Aamostra=Apadrão no comprimento de onda de excitação, a equação 3
é reduzida a:
p
p
a
a emem
emem I
Iϕϕ
∫
∫= Equação 4
As áreas integradas dos espectros registrados para cada λ excitação foram calculadas
com o auxilio do software Origin 7.5 (Figura 80 Figura 81).
- 90 -
350 400 450 500
0,0
5,0x104
1,0x105
1,5x105
2,0x105
2,5x105
3,0x105
[19/10/2007 11:00 "/Graph2" (2454392)]
Integration of albuminapH_pH6.4 from zero:
i = 1 --> 181
x = 320 --> 500
Area Peak atWidth Height
------------------------------------------------------------
1,44633E7 338 51 252988,1
Intensidade
Comprimento de Onda (nm)
pH6.4 298 nm
Figura 80 - Área integrada do espectro de
fluorescência da HSA em pH6,4 com λ de
excitação de 280 nm.
350 400 450 500
0,0
5,0x104
1,0x105
1,5x105
2,0x105
2,5x105
3,0x105
[19/10/2007 10:53 "/Graph2" (2454392)]
Integration of albuminapH_pH6.4a from zero:
i = 1 --> 181
x = 320 --> 500
Area Peak atWidth Height
------------------------------------------------------------
1,54006E7 323 49 286416,2
Intensidade
Comprimento de Onda (nm)
pH6.4 (280)
Figura 81 - Área integrada do espectro de
fluorescência da HSA em pH6,4 com λ de
excitação de 298 nm.
Considerando como padrão a amostra de λ de excitação em 280nm (φem(p)=0,132) e
usando a equação (4), temos:
132,01054,1
1045,17
7
×××
=aemϕ
124,0=aemϕ
Então para λ de excitação em 298 nm, temos que o rendimento quântico de emissão,
para a albumina humana é de 0,124 em pH 6,4.
Como nos experimentos realizados aqui o pH das soluções foi de 7,4, investigou-se
qual seria a influência da variação do pH no rendimento.
Para tanto preparou-se 5 soluções de HSA em diferentes pHs, que foram ajustados
com soluções de HCl 1,0 molL-1 e NaOH 1,0 molL-1. Registrou-se então os espectros de
emissão das soluções com λ de excitação em 298 nm.
Na Figura 82 observa-se que para a solução de HSA em pH 1,7 a intensidade de
fluorescência é maior que em pH 4,7, 6,4 e 7,4, nos quais se mantem aproximadamente
- 91 -
constante, já para pH 10,5 ocorre uma diminuição de intensidade. Isso mostra que embora a
intensidade de fluorescência seja influenciada pelo pH do meio, é possível utilizar o valor do
o rendimento quântico calculado para a solução com pH 6,4 também para a solução de pH
7,4.
350 400 450 500
0,0
5,0x104
1,0x105
1,5x105
2,0x105
2,5x105
3,0x105
Intensidade
Comprimento de Onda (nm)
pH 1,7
pH 4,8
pH 6,4
pH 7,4
pH 10,5
Figura 82 - Espectros de fluorescência em diferentes pHs.
Os rendimentos quânticos para cada experimento HSA:Composto foram então
calculados usando-se a equação (2). Como rendimento quântico padrão considerou-se o valor
calculado de 0,124, para HSA no comprimento de onda de excitação de 298 nm e pH 6,4. Os
valores de supresão foram calculados de acordo com a equação 5 e são apresentados na
Tabela 20
Tabela 20 100%sup ×=padrão
amostraressão ϕ
ϕ Equação 5
- 92 -
Tabela 20 – Rendimentos Quânticos e porcentagens de supressão calculados.
Espécie Área do Gráfico Rendimento Quantico % supressão
HSA 4,680 x 10+07 0,124 100%
1HSA:1Platinil® 4,323 x 10+07 0,115 92%
1HSA:2Platinil® 4,409 x 10+07 0,117 94%
1HSA:3Platinil® 4,595 x 10+07 0,122 98%
1HSA:4Platinil® 4,520 x 10+07 0,120 97%
1HSA:5Platinil® 4,294 x 10+07 0,114 92%
1HSA:10Platinil® 4,607 x 10+07 0,122 98%
1 HSA:1Ru2Ac 4,467 x 10+07 0,118 95%
1 HSA:2Ru2Ac 3,962 x 10+07 0,105 85%
1 HSA:3Ru2Ac 3,578 x 10+07 0,095 76%
1 HSA:4Ru2Ac 3,607 x 10+07 0,096 77%
1 HSA:5Ru2Ac 3,485 x 10+07 0,092 74%
1 HSA:10Ru2Ac 2,839 x 10+07 0,075 61%
1 HSA:2NaDiclofen 3,705 x 10+07 0,098 79%
1 HSA:4NaDiclofen 3,172 x 10+07 0,084 68%
1 HSA:6NaDiclofen 2,283 x 10+07 0,061 49%
1 HSA:8NaDiclofen 2,198 x 10+07 0,058 47%
1 HSA:10NaDiclofen 1,817 x 10+07 0,048 39%
1 HSA:20NaDiclofen 1,330 x 10+07 0,035 28%
1 HSA:1Ru2Diclofen 3,935 x 10+07 0,104 84%
1 HSA:2Ru2Diclofen 3,154 x 10+07 0,084 67%
1 HSA:3Ru2Diclofen 2,965 x 10+07 0,079 63%
- 93 -
1 HSA:4Ru2Diclofen 2,278 x 10+07 0,060 49%
1 HSA:5Ru2Diclofen 2,202 x 10+07 0,058 47%
1 HSA:10Ru2Diclofen 1,089 x 10+07 0,029 23%
1 HSA:2HSulin 3,764 x 10+07 0,100 80%
1 HSA:4HSulin 2,848 x 10+07 0,075 61%
1 HSA:6HSulin 1,886 x 10+07 0,050 40%
1 HSA:8HSulin 1,473 x 10+07 0,039 31%
1 HSA:10HSulin 1,307 x 10+07 0,035 28%
1 HSA:20HSulin 7,157 x 10+06 0,019 15%
1 HSA:1Ru2Sulin 3,561 x 10+07 0,094 76%
1 HSA:2Ru2Sulin 2,364E+07 0,063 51%
1 HSA:3Ru2Sulin 1,888 x 10+07 0,050 40%
1 HSA:4Ru2Sulin 1,561 x 10+07 0,041 33%
1 HSA:5Ru2Sulin 1,194 x 10+07 0,032 26%
1 HSA:10Ru2Sulin 4,165 x 10+06 0,011 9%
1 HSA:1RuDMSO 4,674 x 10+07 0,124 100%
1 HSA:2RuDMSO 4,608 x 10+07 0,122 98%
1 HSA:3RuDMSO 4,389 x 10+07 0,116 94%
1 HSA:4RuDMSO 4,458 x 10+07 0,118 95%
1 HSA:5RuDMSO 4,562 x 10+07 0,121 97%
1 HSA:10RuDMSO 4,348 x 10+07 0,115 93%
1 HSA:2HIBP 4,568 x 10+07 0,121 100%
1 HSA:4HIBP 4,681E x 10+07 0,124 100%
- 94 -
1 HSA:6HIBP 4,681 x 10+07 0,124 100%
1 HSA:8HIBP 4,568 x 10+07 0,121 100%
1 HSA:10HIBP 4,568 x 10+07 0,121 100%
1 HSA:20HIBP 4,389 x 10+07 0,116 100%
1 HSA:1Ru2IBP 4,291 x 10+07 0,114 92%
1 HSA:2Ru2IBP 4,296 x 10+07 0,114 92%
1 HSA:3Ru2IBP 4,111 x 10+07 0,109 88%
1 HSA:4Ru2IBP 3,883 x 10+07 0,103 83%
1 HSA:5Ru2IBP 3,963 x 10+07 0,105 85%
1 HSA:10Ru2IBP 3,454 x 10+07 0,092 74%
1 HSA:2H2Melox 3,662 x 10+07 0,097 78%
1 HSA:4H2Melox 2,814 x 10+07 0,058 47%
1 HSA:6H2Melox 1,757 x 10+07 0,022 18%
1 HSA:8H2Melox 1,373 x 10+07 0,006 5%
1 HSA:10H2Melox 1,143 x 10+07 0,002 1%
1 HSA:20H2Melox 5,796 x 10+06 0,000 0%
1 HSA:1RuHMelox 4,021 x 10+07 0,107 86%
1 HSA:2RuHMelox 3,111 x 10+07 0,082 66%
1 HSA:3RuHMelox 2,617 x 10+07 0,069 56%
1 HSA:4RuHMelox 2,096 x 10+07 0,056 45%
1 HSA:5RuHMelox 1,718 x 10+07 0,046 37%
1 HSA:10RuHMelox 7,531 x 10+06 0,020 16%
- 95 -
Os estudos de fluorescência mostraram que os compostos Platinil®, HIBP e RuDMSO
não apresentam impacto significativo na supressão da fluorescência. Para o fármaco orgânico
HIBP é reportado na literatura que ele se liga preferencialmente ao subdomínio IIIA da
proteína 41, com isso não afeta a vizinhança do resíduo de triptofano não tendo ação
supressora de fluorescência. Os compostos Platinil® e RuDMSO também não afetam a
fluorescência este fato pode ser explicado de duas maneiras, uma seria devido aos compostos
estudados se ligarem a um subdomínio diferente do IIA, a outra explicação seria se ligarem ao
subdomínio IIA e não suprimirem a fluorescência. Para este esclarecimento seria necessário
um estudo mais aprofundado para se identificar exatamente onde estes compostos estão se
ligando, já que de acordo com os espectros CD estes compostos interagem com a proteína,
porém praticamente não alteram sua estrutura secundária.
O complexo Ru2Ac até a proporção 1HSA:5Ru2Ac apresenta o mesmo
comportamento que o fármaco Platinil® no que diz respeito a perda de estrutura alfa-hélice e
atua como um moderado supressor da fluorescência do triptofano.
Em todas as proporções estudadas os compostos Ru2Sulin, Ru2Diclofen, NaDiclofen e
HSulin apresentaram grande eficácia na supressão da fluorescência do triptofano presente na
HSA, para estes mesmos compostos os estudos de CD mostram que ocorre uma interação dos
mesmos com a HSA e a partir da proporção 1HSA:8fármaco orgânico ou ligante tem-se um
perda gradativa da estrutura alfa-hélice. Os compostos H2Melox e o RuHMelox nos espectros
de CD não apresentam variação significativa na estrutura secundária, assim como o Platinil®,
porém nos estudos de fluorescência provocam efeitos similares aos demais complexos de
rutênio estudados e seus fármacos orgânicos.
De acordo com as regras empíricas para espectros de fluorescência de proteínas 90,
uma explicação possível é a de que os sistemas estudados, que tem efeito supressor, tornam o
ambiente ao redor do triptofano mais hidrofílico e isso pode ser devido à ligação do complexo
- 96 -
ou fármaco orgânico nas proximidades do resíduo triptofano. A forte supressão da
fluorescência do Trp 214 indica que a conformação hidrofóbica na região do subdomínio IIA
é significativamente afetada pela presença dos compostos estudados.
O forte impacto na fluorescência indicou claramente que a ligação das drogas à HSA
mudou o microambiente do triptofano e dos resíduos da estrutura terciária da HSA, o que está
de acordo com a literatura que diz que os complexos de rutênio, imidazolium [ trans-
tetrachlorobis (imidazol) rutênio (III) e trans-indazolium (bisindazole) tetrachlororutênio(III)
por exemplo, tendem a modificar o ambiente hidrofóbico onde o resíduo de triptofano está
localizado, com isso observa-se em seus espectros de fluorescência , quando em presença de
complexos de rutênio, um decaimento na intensidade de fluorescência do resíduo de
triptofano 81, 87 .
5.2.2 Determinação das constantes de SternVolmer para os sistemas estudados.
Três processos de supressão de fluorescência são conhecidos: estático, dinâmico e de
transferência não radioativa. Na supressão dinâmica o supressor se difunde até o fluoróforo
durante o seu tempo de vida do estado excitado e em contato com o fluoróforo retorna ao
estado fundamental, sem emissão de fóton. Ambos os processos dinâmico e estático são bem
descritos pela equação conhecida de Stern-Volmer (equação 6)
][10 SKF
FSV+= Equação 6
Nesta equação F0 e F são as intensidades de fluorescência na ausência e presença de
supressor , [S] é a concentração de supressor e KSV é a constante de supressão de Stern-
Volmer, que pode ser escrita como:
osSV tkK ×= Equação 7
- 97 -
Onde é ks é a constante de velocidade de supressão bimolecular e t0 é o tempo de vida
do fluoróforo na ausência de supressor.
As constantes de supressão Stern-Volmer (KSV) foram determinadas construindo-se
retas a partir da equação 6 (Figura 83); para a condição Cdrug /CHSA ≤ 10 para todos os
compostos, exceto para o complexo Ru2Sulin e RuHMelox onde a razão Cdrug /CHSA ≤ 5.
0,0 2,0x10-5
4,0x10-5
6,0x10-5
8,0x10-5
1,0x10-4
0
5
10
15
20
25
30
35
NaDiclofen
F0/F
[NaDiclofen]
0,0 8,0x10-6
1,6x10-5
2,4x10-5
3,2x10-5
4,0x10-5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
Ru2Diclofen
F0/F
[Ru2Diclofen]
8,0x10-6
1,6x10-5
2,4x10-5
3,2x10-5
4,0x10-5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
H2Melox
F0/F
[H2Melox]
4,0x10
-68,0x10
-61,2x10
-51,6x10
-52,0x10
-5
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
RuHMelox
F0/F
[RuHMelox]
0,0 8,0x10-6
1,6x10-5
2,4x10-5
3,2x10-5
4,0x10-5
0
2
4
6
8
10
HSulin
F0/F
[HSulin]
4,0x10
-68,0x10
-61,2x10
-51,6x10
-52,0x10
-5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
Ru2Sulin
F0/F
[Ru2Sulin]
- 98 -
0,0 2,0x10-5
4,0x10-5
6,0x10-5
8,0x10-5
1,0x10-4
1
2
3
4
5
6
7
Ru2Ac
F0/F
[Ru2Ac]
0,0 8,0x10-6
1,6x10-5
2,4x10-5
3,2x10-5
4,0x10-5
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Ru2IBP
F0/F
[Ru2IBP]
0,0 5,0x10-6
1,0x10-5
1,5x10-5
2,0x10-5
2,5x10-5
1,00
1,05
1,10
1,15
1,20
RuDMSO
F0/F
[RuDMSO]
Figura 83 – Gráficos Stern-Volmer para os compostos estudados.
Supondo que o t0 da biomoléculas é 10-8 s 91 as constantes das velocidades de
supressão ks também foram calculadas (Tabela 21).
Os valores das constantes de supressão ks são maiores do que o valor da constante de
difusão limitante Kdif da biomolécula (Kdif = 2,0 x 1010 mol-1Ls-1 92), o que sugere que a
supressão da fluorescência deve-se à uma interação específica entre a HSA e o supressor 93.
Tabela 21 – Ksv e ks dos complexos estudados p<0,007.
Composto R KSV(molL-1) ks (molL-1s-1)
NaDiclofen 0,99 35 x 104 7,0 x 1013
H2Melox- 0,98 7,5 x 104 1,5 x 1013
HSulin 0,98 20 x 1045 4,0 x 1013
Ru2Ac 0,99 5,8 x 104 1,2 x 1013
- 99 -
Ru2Diclofen 0,99 8,2 x 104 1,6 x 1013
Ru2Sulin 0,99 18 x 1045 3,6 x 1013
Ru2IBP 0,98 1,4 x 104 2,8 x 1012
RuDMSO 0,99 0,79 x 104 1,6 x 1012
RuHMelox 0,99 8,1 x 104 1,6 x 1012
5.2.3 Determinação do número de sítios de ligação e da constante de ligação HSA-
Complexo.
Partindo-se do pressuposto de que existem n potenciais sítios de ligação para a droga
supressora na proteína HSA, a supressão pode ser mostrada como 94:
HSASuprHSASuprn n→←+
Equação 8
Onde:
Supr: Supressor (droga)
HSA: Proteína
A constante de ligação Klig pode ser calculada como equação 09
inn
lig HSASupr
HSASuprK
][][
][=
Equação 9
Como:
][][][ HSASuprHSAHSA ninicialfinal −=
finalinicialn HSAHSAHSASupr ][][][ −= Equação 10
Substituindo a equação 10 na equação 9 temos:
- 100 -
inicialn
finaliniciallig HSASupr
HSAHSAK
][][
][][ −=
Equação 11
Supondo que a intensidade da fluorescência é proporcional à concentração da proteína
tem-se:
0][
][
F
F
HSA
HSA
inicial
final =
F
FHSAHSA finalinicial
0][][ ×= Equação 12
Substituindo a equação 12 na equação 11 temos:
−=
finaln
finaliniciallig HSASupr
HSAHSA
F
FK
][][
][][0
Equação 13
Aplicando-se logarítimo na equação 13:
−−−=
finaln
finaliniciallig HSASupr
HSAHSAFFK
][][
][][log)log(log 0
]log[)log(log 0 SuprnKF
FFlig −=
−
Equação 14
Então Klig e o número de sítios de ligação n podem ser calculados construindo-se retas
a partir da equação 14 (figura 84)
- 101 -
-5,6 -5,4 -5,2 -5,0 -4,8 -4,6 -4,4 -4,2 -4,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
NaDiclofen
log (F0-F/F)
log[NaDiclofen]
-5,4 -5,2 -5,0 -4,8 -4,6 -4,4 -4,2
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
Ru2Diclofen
log(F0-F/F)
log[Ru2Diclofen]
-5,2 -5,0 -4,8 -4,6 -4,4 -4,2 -4,0
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
H2Melox
log(F0-F/F)
log[H2Melox]
-5,4 -5,2 -5,0 -4,8 -4,6 -4,4 -4,2
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
RuHMelox
log(F0-F/F)
log[RuHMelox]
-5,4 -5,2 -5,0 -4,8 -4,6 -4,4 -4,2
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
HSulin
log(F0-F/F)
log[HSulin]
-5,4 -5,2 -5,0 -4,8 -4,6 -4,4 -4,2
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Ru2Sulin
log(F0-F/F)
log[Ru2Sulin]
-5,6 -5,4 -5,2 -5,0 -4,8 -4,6 -4,4 -4,2 -4,0
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Ru2Ac
log(F0-F/F)
log[Ru2Ac]
-5,4 -5,2 -5,0 -4,8 -4,6
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
Ru2IBP
log(F0-F/F)
log[Ru2IBP]
- 102 -
-5,4 -5,2 -5,0 -4,8 -4,6
-1,8
-1,6
-1,4
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
RuDMSO
log(F0-F/F)
log[RuDMSO]
Figura 84 – Gráficos de constante de ligação e número de sítios obtidos a partir da equação 14.
O número de sítios de ligação n e a constante ligação Klig, de acordo com a equação 14
e estão apresentados na tabela Tabela 22.
Tabela 22 – Dados de constante de ligação e número de sítios de ligação p<0,007.
Complexo log Klig Klig n R
NaDiclofen 5,6 40 x 104 1 0,99
H2Melox- 6,7 500 x 104 1 0,98
HSulin 7,4 2500 x 104 1 0,99
Ru2Ac 4,8 6,3 x 104 1 0,97
Ru2Diclofen 4,8 6,3 x 104 1 0,96
Ru2Sulin 6,3 200 x 104 1 0,91
Ru2IBP 4,3 2,0 x 104 1 0,94
RuDMSO 5,1 12 x 104 1 0,99
RuHMelox 4,9 7,0 x 104 1 0,90
Todos os compostos apresentam um sito de ligação para os compostos estudados.
Quando Cdroga/CHSA é superior a 10 para quase todos os compostos, exceto para os complexos
RuHMelox e Ru2Sulin que esta razãoé superior a 5, e o gráfico de Stern-Volmer não é linear,
isso sugerem que o mecanismo de supressão pode não ser simplesmente estático.
- 103 -
5.3 SDS-PAGE
A eletroforese é a migração de íons em um campo elétrico, ela é amplamente utilizada
para a separação analítica de moléculas biológicas. A eletroforese em gel de poliacrilamida-
dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) é um procedimento eletroforético que separa as
proteínas com base nas massas moleculares. O SDS de fórmula ([CH3-(CH2)10-CH2-O-SO3-
]Na+) liga-se às porções hidrofóbicas das proteínas (1,4g de SDS para cada g de proteína),
rompendo suas dobras e permitindo que elas assumam em conformação estendida estável.
Como resultado, o tamanho do complexo proteína-SDS é proporcional à sua massa molecular.
Quando se liga, o SDS adiciona um grande numero de cargas negativas às moléculas das
proteínas, fazendo com que tornem-se insignificantes suas cargas intrínsecas. Dessa forma, as
velocidades de migração vão depender exclusivamente das massas dos complexos proteína-
SDS. As proteínas menores migram mais rapidamente do que as maiores. 86
As massas moleculares de proteínas comuns são rotineiramente determinadas com
uma exatidão de 5 a 10% por SDS-PAGE. As mobilidades relativas das proteínas nesses géis
variam linearmente com os logaritmos de suas massas moleculares. Na prática, a massa
molecular de uma proteína é determinada realizando-se a eletroforese da proteína juntamente
com várias proteínas “padrão” de massas moleculares conhecidas e de valores próximos aos
da proteína de interesse.
Na eletroforese em gel de poliacrilamida, os géis são feitos pela polimerização de
acrilamida e N,N’-metilenibisacrilamida, induzida por radicais livres, no tampão de escolha.
O gel em geral é montado com o formato de uma fatia retangular delgada, na qual diversas
amostras podem ser analisadas simultaneamente em canaletas paralelas (Figura 85). As
amostras, aplicadas em canaletas que são feitas na parte superior do gel, migram em linhas
paralelas de cima para baixo.56.
- 104 -
Figura 85 - Equipamento de Eletroforese em gel plano e esquema de eletroforese.
Realizou-se um estudo preliminar para verificar o comportamento dos compostos
frente à albumina humana na proporção 1:1. Após o preparo das soluções e dos géis aplicou-
se as amostras nos géis e o resultado da corrida está ilustrado na Figura 86
Figura 86 – Géis do estudo preliminar de SDS-Page.
As manchas obtidas nos géis estão na mesma direção da marca do padrão BSA
(albumina de soro bovina), que que apresenta praticamente o mesmo peso molecular da HSA.
Os compostos, nas condições testadas, não alteraram o peso molecular da HSA , o que indica
que na razão molar testada não ocorre a clivagem da proteína.
Para verificar se maiores concentrações de complexos poderiam clivar a HSA,
realizou-se um novo experimento variando a proporção HSA: Composto, de 1:1 até 1:5 e
1:10.
- 105 -
Figura 87 – Gel SDS para o complexo Ru2Ac.
Figura 88 - Gel SDS para o complexo Ru2Diclofen.
Figura 89 - Gel SDS para o complexo Ru2IBP.
Figura 90 - Gel SDS para o complexo Ru2Sulin.
Os resultados obtido nos mostram que nas proporções testadas os complexos não
clivam a proteína. Na proporção 1HSA:10 Complexo observa-se uma diminuição da
quantidade de proteína, isso se deve a precipitação que ocorre ao adicionar o complexo a
solução de HSA antes de aplica-la no gel, que acaba diminuindo a quantidade de proteína em
solução.
Com os dados obtidos pode-se verificar que os complexos ao interagirem com a
proteína HSA, não causam sua clivagem em nenhuma das proporções testadas.
- 106 -
66 TTEESSTTEESS CCOOMM CCÉÉLLUULLAASS KK556622 –– RREESSUULLTTAADDOOSS EE
DDIISSCCUUSSSSÕÕEESS
Viabilidade Celular
A maior parte dos ensaios de viabilidade celular, que são realizados, baseia-se em um
dos seguintes parâmetros: 1) atividade metabólica; 2) integridade da membrana das células
saudáveis.
A atividade metabólica de uma população de células pode ser analisada incubando-se
estas com sais de tetrazólio e medindo-se o dano induzido por estes sais no metabolismo
celular de glicídeos, usualmente através da atividade de desidrogenases. O sal de tetrazólio
mais utilizado é o MTT e suas reações permitem localizar a atividade de desidrogenases
presentes em células viáveis. O sal de tetrazólio não reage diretamente com as desidrogenases,
mas sim com os produtos de reações que envolvem NADH e NADPH que reduzem o MTT
para uma espécie colorida, a formazana (Figura 91).
A formazana é insolúvel em água, mas após a dissolução em DMSO, a quantificação
da inibição enzimática pode ser fácil e rapidamente efetuada por ensaios colorimétricos.
Figura 91 - Redução do MTT a Formazana.
Redutase
Mitocondrial MTT Formazana
- 107 -
O outro tipo de ensaio de viabilidade celular baseia-se na habilidade das células
saudáveis, com membrana plasmática totalmente íntegra, excluírem corantes, tal como o azul
de Tripam, ao contrário das células mortas que incorporam este corante, Figura 21.
Desta maneira no final do ensaio é possível contar, com o auxilio de um microscópio,
tanto o número de células vivas quanto o de mortas. Este método é simples e requer apenas
uma pequena fração do total de células, para determinar a concentração celular (número de
célula / mL) no frasco de cultivo. Um ponto negativo deste método é quando precisa-se
analisar uma quantidade grande de compostos em diferentes concentrações, nestas condições
este procedimento seria bastante demorado uma vez que é necessário aliquotar todas as
amostras e realizar a limpeza da câmara de contagem a cada teste.
O objetivo deste primeiro ensaio biológico era avaliar os fatores de crescimento das
células tumorais na presença dos três complexos do tipo [Ru2(O2CR)4Cl]: Ru2Sulin,
Ru2Diclofen e Ru2IBP.
A contagem das células foi realizada tanto com azul de Tripam quanto com MTT.
Como controle utilizou-se o solvente de cada complexo (água/5%DMSO ou
EtOH/5%DMSO).
6.1 Teste para escolha do método de contagem das células.
Os resultados obtidos após 24h de incubação, para o teste com azul de Tripam, das
células com diferentes complexos e diferentes concentrações, estão apresentados na Figura 92
e resumidos na Tabela 23. Para os cálculos das porcentagens de células viáveis dos padrões
considerou-se a água sem DMSO como sendo o solvente que não inviabiliza as células (100%
de células vivas) e então normalizou-se os resultados dos padrões.
- 108 -
20 40 60 80 100 120
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células vivas
concentração uM
água
Ru2Ac
EtOH
Ru2Sulin
Ru2Diclofen
Ru2IBP
Figura 92 – Porcentagem de células vivas em função da concentração de complexo.
De acordo com os resultados obtidos é possível verificar que, após um período de 24 h
de incubação, os compostos apresentaram efeito inibitório significativos sobre a linhagem de
célula K562. O complexo Ru2Ac apresenta menor atividade que os demais compostos
testados não sendo capaze de inviabilizar 50% das células, já os complexos Ru2Sulin e
Ru2IBP, na concentração de 60 µmolL-1, apresentam resultados significativos inviabilizando
mais de 50% das células. O composto Ru2Diclofen foi o que apresentou melhores resultados
chegando a matar 50% das células já na concentração 40 µmolL-1.
Tabela 23 – Porcentagem de células vivas após a contagem com Tripam para os diferentes complexos
e nas diferentes concentrações
Composto 20 µM 40 µM 60 µM 80 µM 120 µM
Água 95% 92% 92% 86% 93%
EtOH 97% 86% 81% 69% 65%
Ru2Ac 74% 69% 71% 76% 70%
Ru2Sulin 72% 74% 42% 60% 56%
Ru2Diclofen 76% 49% 35% 20% 16%
Ru2IBP 79% 59% 41% 41% 47%
- 109 -
Para efeito de comparação realizou-se a determinação dos fatores de crescimento
celular do experimento anterior também utilizando ensaios com MTT. Na água e no etanol,
por serem controles, a % de células vivas foi considerada 100% para efeito de cálculo.
De acordo com os resultados obtidos (Figura 93) é possível verificar, após um período
de 24 h de incubação, os compostos apresentaram efeito inibitório sobre o crescimento da
linhagem de célula K562.
O complexo Ru2Ac apresenta neste caso um comportamento anômalo ao mostrado no
experimento com azul de Tripam, não chegando a matar 50% das células na concentração de
120 µmolL-1 , já os complexos Ru2Sulin, Ru2IBP, na concentração de 60 µmolL-1, apresentam
resultados significativos matando cerca de 50% das células. O composto Ru2Diclofen foi o
que apresentou melhores resultados chegando a matar mais de 50% das células já na
concentração 20 µmolL-1.
20 40 60 80 100 120
20
40
60
80
100
120
Concentração em uM
% células vivas
água
Ru2Ac
EtOH
Ru2Sulin
Ru2Diclofen
Ru2IBP
Figura 93 – Dados obtidos no primeiro ensaio de MTT.
- 110 -
Tabela 24 – Porcentagem de células vivas após a contagem com MTT nos diferentes complexos e nas
diferentes concentrações.
Composto 20 µM 40 µM 60 µM 80 µM 120 µM
Água 100% 100% 100% 100% 100%
Ru2Ac 84% 82% 100% 81% 68%
Etanol 100% 100% 100% 100% 100%
Ru2Sulin 114% 60% 53% 52% 42%
Ru2Diclofen 43% 15% 13% 18% 19%
Ru2IBP 109% 72% 50% 43% 26%
O teste com MTT possui a vantagem da rapidez na leitura o que permite realizar um
maior número de experimentos em um tempo menor, assim sendo, escolheu-se este ensaio
para os testes de atividade citotóxica.
6.2 Teste de citotoxicidade com MTT.
Foram testados os complexos de rutênio (Ru2Sulin, Ru2IBP e Ru2Diclofen), os
fármacos orgânicos (HSulin, NaDiclofen e HIBP), o complexo precursor Ru2Ac e os
complexos RuDMSO e RuHMelox e o fármaco Platinil®. Todos os ensaios foram realizados
em quadruplicata e os resultados estão apresentados na Tabela 25.
Na Figura 94 observa-se que o composto Ru2Ac e o fármaco diclofenaco foram os que
apresentaram menor índice de mortalidade celular, seguidos pelo RuDMSO, HSulin,
RuHMelox e HIBP. Já os complexos Ru2Sulin, Ru2IBP e Ru2Diclofen apresentaram como
visto anteriormente um resultado significativo na maior concentração. O composto
Ru2Diclofen foi o que realmente apresentou melhores resultados, já que logo na primeira
- 111 -
adição apresentou uma queda na % de células vivas de aproximadamente 30%. Realizou-se o
tratamento estatístico dos dados obtidos.
0 40 80 120 160 200 240
20
40
60
80
100
120
% células vivas
Concentração
HSulin
Ru2Sulin
NaDiclofen
Ru2Diclofen
HIBP
Ru2IBP
RuDMSO
RuHMelox
RuAc
Figura 94 – Dados obtidos no segundo ensaio com MTT
Tabela 25 – Porcentagem de células vivas após a contagem com MTT para os diferentes compostos e
nas diversas concentrações.
Composto 20 µM 40 µM 60 µM 80 µM 120 µM 240 µM
Água 103% 119% 132% 114% 113% 67%
Ru2Ac 118% 94% 98% 85% 85% 89%
NaDiclofen 108% 90% 99% 83% 82% 80%
RuDMSO 107% 86% 98% 79% 86% 79%
Etanol 107% 128% 141% 124% 115% 45%
HSulin 110% 96% 97% 76% 65% 47%
HIBP 96% 87% 85% 67% 58% 40%
Ru2Diclofen 96% 73% 78% 65% 64% 63%
Ru2Sulin 111% 96% 92% 74% 54% 38%
- 112 -
Ru2IBP 97% 85% 85% 63% 49% 36%
RuHMelox 120% 83% 101% 90% 64% 49%
*valores maiores que 100% são devido ao crescimento celular.
6.3 Curva dose Resposta.
A curva dose-resposta representa a relação entre a dose administrada e a proporção da
população que responde com um efeito. Em geral estas curva são sigmóides. Uma forma de
explicar a configuração das curvas dose-resposta é dizer que cada indivíduo de uma
população tem uma “tolerância” própria e requer uma determinada dose antes de responder
com um efeito. A princípio, deve existir tanto uma dose mínima (baixa) a qual ninguém
responderá como uma dose máxima (alta) a qual todos responderão. A razão disto é a
variabilidade biológica, isto é, as diferentes sensibilidades dos indivíduos (ou animais) à ação
de determinada substância química.
É importante mencionar que, para cada efeito haverá, então, uma curva dose-resposta
distinta. Além disso a configuração da curva dose-resposta da mesma substância química e a
mesma espécie animal pode variar com as mudanças das condições experimentais, por
exemplo, as mudanças na forma de distribuição da dose no tempo (freqüência).
A curva sigmóide ou em forma de S é uma expressão curvilínea comumente observada
para a maior parte das curvas dose-resposta. O fundamento biológico desta relação pode ser
compreendido parcialmente quando se pensa na natureza da distribuição de freqüência das
suscetibilidades ou resistências individuais em uma população. A maior parte dos indivíduos
que compõem uma certa população responderão próximo a um nível de dose média, sendo
poucos os que responderão somente a níveis de dose muito baixos ou muito altos. Isto gera
uma curva de distribuição normal de freqüência, em escala logarítmica das doses, que se
apresenta como uma distribuição simétrica
- 113 -
A Figura 95 mostra uma distribuição normal de freqüência, simétrica em relação ao
ponto central. Sua distribuição acumulativa de freqüência mostra a curva sigmóide
freqüentemente observada. Uma relação dose-resposta se apresentará como uma distribuição
acumulativa de freqüência porque o indivíduo que reage a uma dose baixa também reagirá,
naturalmente, à dose mais elevadas. Em conseqüência, a freqüência de indivíduos reativos a
uma determinada dose elevada inclui todos aqueles que respondem a essa dose e também
todas as doses inferiores a ela.
100%
50%
1,25 2,5 5 10 20 40 80 Dose mg
a
b
100%
50%
1,25 2,5 5 10 20 40 80 Dose mg
a
b
Figura 95 - Relação dose-resposta hipotética como distribuição de freqüência (a) e como distribuição
acumulativa de freqüência (b)
A curva dose-resposta sé descrita pela seguinte equação :
pxLOGx
AAAy )(
121 0101 −+
−+= Equação 15
Esta equação utilizada pelo programa Origin 7.5 para obtenção das curvas dose-
resposta e para a determinação do EC50.
- 114 -
1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4
0
50
100
1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4
0
50
100
% Resposta
Ru2IBP
HIBP
Log(concentração)
Figura 96 – Curva dose resposta para o HIBP e o Ru2IBP.
1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4
0
50
100
1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4
0
50
100
Log (concentração)
NaDiclofen
Ru2Diclofen
% Resposta
Figura 97 – Curva dose resposta para NaDiclofen e o Ru2Diclofen.
- 115 -
1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4
0
50
100
1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4
0
50
100
% Resposta
HSulin
Ru2Sulin
Log(concentração)
Figura 98 – Curva dose resposta para HSulin e o Ru2Sulin.
1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4
0
50
100
% Resposta
Log[RuHMelox]
Figura 99 – Curva dose resposta para RuHMelox.
- 116 -
A inclinação da curva dose resposta pode nos dar uma noção de como uma mudança
na concentração pode afetar a resposta pretendida. Se a curva tem uma inclinação acentuada
isso indica que uma pequena mudança na concentração pode levar a um grande efeito na
resposta pretendida (exemplo: curvas dose resposta do Ru2Sulin, Ru2IBP e RuHMelox). Já
quando a inclinação é menos acentuada nos leva propor que para ter uma grande mudança na
resposta esperada temos que ter uma grande variação na concentração de substância utilizada
(exemplo: curva dose- resposta do Ru2Diclofen).
Tabela 26 – Parâmetros da equação e valores de EC50 obtidos a partir da curva dose resposta.
A1 A2 LOGx0 p EC50 (µmolL-1)
HIBP 2,56 65,94 1,97 2,28 92,7
Ru2IBP -0,08 76,99 1,90 8,08 78,8
NaDiclofen -0,56 77,69 1,97 6,10 92,3
Ru2Diclofen 24,14 78,05 1,59 39,11 38,5
HSulin -0,49 54,93 1,99 3,38 97,2
Ru2Sulin -0,56 77,69 1,97 6,10 92,3
RuHMelox -1,37 52,88 2,00 4,37 100,7
Os dados dão indícios de que os complexos estudados apresentam resultados melhores
que os fármacos orgânicos na morte celular.
6.4 Tratamento estatístico.
Quando se quer determinar a influencia de uma ou mais variáveis sobre uma outra
variável de interesse , ou seja, quando se está interessado em descobrir como a resposta de um
dado experimento depende de um ou mais fatores, utiliza-se uma análise de variância.
- 117 -
A primeira coisa a ser feita é determinar quais são os fatores e as respostas de interesse
para o sistema que se deseja estudar. Os fatores, isto é, as variáveis que podem ser
controladas, tanto podem ser qualitativos como quantitativos. Depois, especifica-se os níveis
em que cada fator será estudado, podemos, por exemplo, estudar os efeitos do fator
concentração em 4 níveis, 2 molL-1, 4 molL-1, 6 molL-1 e 8 molL-1 e o efeito do tipo de
fármaco em três níveis: fármaco A, B e C.
O planejamento fatorial requer que o experimento realizado compreenda todas as
possíveis combinações dos níveis dos fatores. Cada um desses experimentos, em que o
sistema é submetido a um conjunto de níveis definido (por exemplo, concentração 4 molL-1 e
o fármaco B), é um ensaio experimental. Havendo 4 níveis num fator e 3 no outro, como
nesse caso, serão necessários 4 x 3 = 12 ensaios diferentes, e a análise é chamada de
planejamento fatorial 4x3. Para estudar o efeito de qualquer fator sobre a resposta é preciso
fazê-lo variar e observar o resultado dessa variação. Isso obviamente implica na realização de
ensaios em pelo menos dois níveis desse fator.
Um planejamento fatorial em que todas as variáveis são estudadas em apenas dois
níveis é, portanto o mais simples de todos eles. Na análise de dois níveis costuma-se
identificar os níveis superior e inferior com os sinais (+) e (-), respectivamente. A atribuição
desses sinais também pode ser feita para os níveis dos fatores qualitativos. Esta é u ma
escolha arbitrária, que em nada afetará nossas conclusões. 95.
Para os testes com as células K562, a primeira análise realizada foi a influência do
fator concentração em 5 níveis (20, 40, 60, 80 e 120 µM) em conjunto com a influência do
fator substância aplicada em 2 níveis (complexo e ligante) na mortalidade das células K562
(Tabela 28).
- 118 -
Tabela 27 –Fatores e níveis escolhidos para análise de sua influência na mortalidade das células K562.
Fator 1 Fator 2
Substância Níveis Concentração Níveis
ligante (HSulin; NaDiclofen; HIBP) -1 20 µM -1
40 µM -0,5
complexo (Ru2Sulin; Ru2Diclofen; Ru2IBP) +1 60 µM 0
80 µM 0,5
120 µM 1
A partir das análises realizadas (Tabela 28) pode-se afirmar que, estatisticamente, que
a troca dos ligantes HSulin e HIBP pelos seus respectivos complexos Ru2Sulin e Ru2IBP não
tem efeito significativo na resposta % de células vivas. Porém na análise do fármaco
NaDiclofen e do Ru2Diclofen observa-se que existe efeito significativo na % de células vivas
com a troca dos mesmos.
Tabela 28 – Analise de variância para estudo da influencia da troca do composto utilizado x a
concentração.
Ligante x Complexo Comparação SS Graus de
liberdade MS F p
média 18,537 1 18,537 1253,6A <0,000
ligante ou complexo 0,021 1 0,021 1,410B <0,251
concentração 1,814 2 0,907 61,34A <0,000
(ligante ou complexo)x concentração
0,191 2 0,095 6,448A <0,008
HSulin x Ru2Sulin
erro 0,266 18 0,015 27,40B
média 10,738 1 10,738 2541,8A <0,000
ligante ou complexo 2,092 1 2,092 495,1A <0,000
NaDiclofen x Ru2Diclofen
concentração 0,568 2 0,284 67,24A <0,000
- 119 -
(ligante ou complexo)x concentração
0,123 2 0,061 14,52A <0,000
erro 0,076 18 0,004 131,8B
média 14,216 1 14,216 1622,5A <0,000
ligante ou complexo 0,016 1 0,016 1,771B <0,200
concentração 1,570 2 0,785 89,59A <0,000
(ligante ou complexo)x concentração
0,233 2 0,116 13,28A <0,000
HIBP x Ru2IBP
erro 0,158 18 0,009 41,50B
SS= soma quadrática MS= média quadrática F= teste F p= significância estatística
A = significativo; B = não significativo para α = 0,05.
Para estudar o efeito da troca dos ligantes nos complexos escolheu-se como fator 1 os
complexos com unidade dimetálica em dois níveis (Ru2Ac e Ru2Sulin ou Ru2Diclofen ou
Ru2IBP) e como fator 2 a influência da concentração em 5 níveis (20, 40, 60, 80 e 120 µM) na
mortalidade das células K562 (Tabela 29) e os resultados estão apresentados na Tabela 30.
Tabela 29 – Fatores e níveis escolhidos para análise da influência da troca dos ligantes nos complexos
dimetálicos na morte celular.
Fator 1 Fator 2
Substância Níveis Concentração Níveis
Ru2Ac -1 20 µM -1
40 µM -0,5
Complexo (Ru2Sulin; Ru2Diclofen; Ru2IBP) +1 60 µM 0
80 µM 0,5
120 µM 1
- 120 -
Na tabela a seguir é possível observar que a troca de ligante tem efeito significativo na
morte celular, os complexos dimetálicos sintetizados apresentam efeito mais significativo na
% de células vivas que o precursor Ru2Ac, o que nos leva a acreditar que o metal tem um
papel menor no que diz respeito a mortalidade das células K562. Como já era esperado a
mudança na concentração também tem efeito significativo na % de células vivas.
Tabela 30 – Analise de variância fatorial para estudo da influencia da troca do ligante utilizado x a
concentração.
Ligante x Complexo Comparação SS Graus de
liberdade MS F p
média 20,301 1 20,301 925,2A <0,000
Ru2Ac ou complexo 0,166 1 0,166 7,548A <0,013
concentração 0,392 2 0,196 8,924A <0,002
(ligante ou complexo)x concentração
0,049 2 0,024 1,112B <0,351
Ru2Ac x Ru2Sulin
erro 0,395 18 0,022 5,524 B
média 11,368 1 11,368 560,0A <0,000
Ru2Ac ou complexo 2,375 1 2,375 116,9A <0,000
concentração 0,709 2 0,355 17,47A <0,000
(ligante ou complexo)x concentração
0,063 2 0,031 1,547B <0,240
Ru2Ac x RuDiclofen
erro 0,365 18 0,020 31,00B
média 17,435 1 17,435 763,3A <0,000
ligante ou complexo 0,543 1 0,543 23,78A <0,000
concentração 0,445 2 0,223 9,748A <0,001
(ligante ou complexo)x concentração
0,000 2 0,000 0,0068B <0,993
Ru2Ac x RuIBP
erro 0,411 18 0,023 8,658B
A = significativo; B = não significativo para α = 0,05.
- 121 -
Outra análise possível de ser feita é a da influencia do metal na resposta % células
vivas. Para isso determinou-se como fator 1 o fármaco orgânico ou o complexo utilizado e
como fator 2 a concentração de ligante no sistema. Assim, assumiu-se os níveis 80 e 240 µM
quando avalia-se o ligante puro em solução e 20 e 60 µM quando na forma de complexos, já que
nestas concentrações a quantidade de ligante no complexo é 4x maior.
Tabela 31 – Fatores e níveis escolhidos para análise da influência da presença da unidade dimetálica
nos complexos na morte celular.
Fator 1 Fator 2
Substância Níveis Concentração Níveis
80 µM -1 HSulin; NaDiclofen; HIBP -1
240 µM 1
20 µM -1 Ru2Sulin; Ru2Diclofen; Ru2IBP 1
60 µM 1
A partir da Tabela 32 observa-se que substituir fármaco orgânico pelo complexo tem
uma influência significativa, para este estudo manteve –se a quantidade de ligante ou fármaco
orgânico sempre a mesma nos dois níveis do fator 2, como vimos anteriormente o efeito do
ligante (fármaco coordenado) é significativo quando comparamos o Ru2Ac com os complexos
sintetizados com os FAINEs, isso leva a acreditar que o metal favorece de alguma forma a
disponibilidade do fármaco complexado para as células. Como já era esperado, a
concentração também tem efeito significativo na mortalidade das células.
- 122 -
Tabela 32 – Analise de variância fatorial para estudo da influencia da unidade dimetálica x a
concentração.
Ligante x Complexo Comparação SS Graus de
liberdade MS F p
média 11,718 1 11,718 980,8A <0,000
ligante ou complexo 0,917 1 0,917 76,76A <0,000
concentração 0,311 1 0,311 26,01A <0,000
(ligante ou complexo)x concentração
0,001 1 0,001 0,0684B <0,798
HSulin x Ru2Sulin
erro 0,143 12 0,012 34,28B
média 6,396 1 6,396 1044,9A <0,000
Ru2Ac ou complexo 0,509 1 0,509 83,19A <0,000
concentração 0,225 1 0,225 36,81A <0,000
(ligante ou complexo)x concentração
0,173 1 0,173 28,22A <0,000
NaDiclofen x Ru2Diclofen
erro 0,073 12 0,006 49,41B
média 9,357 1 9,357 1140,7A <0,000
ligante ou complexo 0,818 1 0,818 99,74A <0,000
concentração 0,166 1 0,166 20,28A <0,001
(ligante ou complexo)x concentração
0,017 1 0,017 2,106B <0,172
HIBP x Ru2IBP
erro 0,098 12 0,008 40,71B
A = significativo; B = não significativo para α = 0,05.
Analisou-se também o efeito da mudança entre o complexo RuDMSO e o complexo
RuHMelox e as diferentes concentrações.
- 123 -
Tabela 33 – Fatores e níveis escolhidos para análise da influência da troca do ligante nos complexos
monoméricos na morte celular.
Fator 1 Fator 2
Substância Níveis Concentração Níveis
20 µM -1 RuDMSO -1
40 µM -0,5
60 µM 0
80 µM 0,5 RuHMelox 1
120 µM 1
De acordo com a análise da Tabela 31, a troca do complexo RuDMSO pelo complexo
RuHMelox não altera significativamente a resposta da morte celular, porém a variação na
concentração, como esperado, tem efeito na morte celular.
Tabela 34 – Analise de variância fatorial para estudo da influencia da troca do ligante utilizado x a
concentração
Ligante x Complexo Comparação SS Graus de
liberdade MS F p
média 23,005 1 23,005 2475,774A <0,000
ligante ou complexo 0,024 1 0,024 2,533B <0,129
concentração 0,544 2 0,272 29,270A <0,000
(ligante ou complexo)x concentração
0,165 2 0,083 8,899A <0,002
RuDMSO x RuHMelox
erro 0,167 18 0,009 15,77B
A = significativo; B = não significativo para α = 0,05.
- 124 -
77 CCOONNSSIIDDEERRAAÇÇÕÕEESS FFIINNAAIISS
O principal objetivo deste trabalho foi o estudo de complexos de rutênio contendo
fármacos antiinflamatórios não-esteróides como ligantes. Dois tipos de compostos foram
sintetizados: dois complexos de Ru2(II,III) com carboxilatos derivados dos fármacos
sulindaco e diclofenaco e um complexo de Ru(II) com ânion derivado do fármaco meloxicam.
As técnicas empregadas na caracterização forneceram dados espectroscópicos e
estruturais importantes para os novos complexos sintetizados. Assim foi possível identificar
que os complexos de fórmulas [Ru2(Sulin)4Cl] e [Ru2(Diclofen)4Cl] apresentam núcleos de
Ru2(II,III), com ligação metal-metal múltipla, aos quais quatro fármacos se coordenam
equatorialmente, pelos oxigênios do grupo carboxilato, gerando estruturas “gaiola” nas quais
os cloretos ocupam a posição axial. O complexo Ru(II)-meloxicam, de fórmula
[Ru(dmso)2(HMelox)2], possui duas moléculas de dmso em posição trans na esfera de
coordenação e dois íons HMelox- coordenados de modo bidentado ao centro metálico. O
estudo dos comportamentos térmicos dos complexos indicaram que os mesmos decompõe-se
em temperaturas maiores que 150ºC e a partir de 500ºC não apresentam mais perda de massa.
O estudo de difração de raio-x do produto obtido a partir da queima dos complexos a 1000ºC,
comprovam a formação de óxido de rutênio (IV) após a calcinação.
Em razão da importância dos sistemas quanto à potencialidade biológica, foram
realizados estudos para se investigar a interação dos complexos com albumina humana (HSA)
e ensaios para se avaliar o potencial antitumoral frente a linhagem celular de leucemia
humana K562. Nestes estudos incluíram-se também os complexos precursores (RuDMSO e
RuAc), o complexo RuIBP e os fármacos orgânicos não-coordenados.
Por meio de estudos de dicroísmo circular (CD), verificou-se que em presença de
todos os compostos, a HSA tem sua estrutura secundária modificada, com perda da
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contribuição de α-hélice, o que dá indícios de interação com a proteína. A alteração estrutural
da HSA em presença do fármaco Platinil® (cisplatina) foi utilizada como parâmetro de
comparação. No caso, variando-se a razão molar HSA:Platinil® de 1:1 até 1:5, o que se
observa é sempre uma alteração de 59% α-hélice, 8% β-folha e 33% randômica (HSA) para
45% α-hélice, 22% β-folha e 33% randômica. Esta perda aproximada de estabilização de 14-
15 % de α-hélice acompanhada pelo ganho de estabilização de 14-15 % β-folha será chamada
aqui de padrão Platinil/HSA, com o objetivo de facilitar as comparações. Comportamento
semelhante ao padrão Platinil/HSA foi observado para a HSA em presença dos monômeros
RuDMSO e RuHMelox, e dos fármacos HIBP e H2Melox, em todas as razões molares.
Diferentemente, para os complexos dimetálicos, observou-se que as contribuições das
estruturas α-hélice, β-folha e randômica dependem da razão molar HSA:composto. Para os
derivados de dirutênio-fármacos o padrão Platinil/HSA é atingido quando se tem 1 HSA: 1
complexo, enquanto que para o precursor RuAc, o padrão só é observado para a razão 1
HSA: 3 RuAc. Aumentando-se as quantidades de complexos nestes casos, ocorre uma
tendência progressiva de transformação de β-folha em randômica e depois de α-hélice em β-
folha. Para os fármacos NaDiclofen, HSulin, o padrão Platinil/HSA só é observado quando se
tem razões molares de 1 HSA: 4 Fármaco, enquanto que nos casos do HIBP e H2Melox o
padrão é observado independentemente da razão molar proteína: fármaco. Com base nos
resultados obtidos, é possível propor que: (a) A modificação da estrutura secundária da HSA
independe da razão molar proteína:composto para os complexos monoméricos de rutênio
investigados, mas é dependente desta razão para os complexos dimetálicos; (b) Nos casos dos
complexos Ru-Sulin e Ru-Diclofen, os ligantes orgânicos devem ter grande influência na
interação com a proteína, uma vez que as contribuições estruturais da HSA se assemelham são
comparadas as razões molares proteína:metalofármaco e proteína: 4 fármaco orgânico
(lembrando que cada mol de complexo contém 4 mols de fármacos coordenados); (c) No caso
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do ibuprofeno existe diferença significativa quando se comparam os comportamentos da HSA
frente ao fármaco HIBP e frente ao complexo RuIBP; neste caso a influência do ligante não
deve ser predominante na interação do complexo com a proteína .
Por SDS_PAGE observou-se que os complexos, nas proporções HSA:Complexo 1:1 a
1:10 mesmo interagindo com a proteína não são capazes de cliva-la.
Os estudos de investigação da supressão de fluorescência do Trp 214 no espectro da
HSA forneceram subsídios para identificar quais dos compostos estudados afetam mais
significativamente a conformação hidrofóbica na região do subdomínio IIA, ou seja, tornam o
ambiente ao redor do triptofano mais hidrofílico, o que pode indicar ligação do complexo ou
do fármaco nas proximidades deste resíduo. Para os compostos cisplatina (Platinil®),
RuDMSO e HIBP, observou-se uma pequena supressão da fluorescência, variando-se a razão
molar de proteína:composto de 1:0 até 1:10. O RuIBP suprimiu um pouco mais a
fluorescência neste intervalo de razão molar. Para os demais complexos e fármacos, no
entanto, a supressão da fluorescência foi mais significativa, aumentando com o aumento a
razão molar de proteína:composto.
Os valores das constantes de supressão ks são maiores do que o valor da constante de
difusão limitante Kdif da biomolécula (Kdif = 2,0 x 1010 mol-1Ls-1 92), o que sugere que a
supressão da fluorescência deve-se à uma interação específica entre a HSA e o supressor.
Através das medidas de fluorescência pode-se ainda prever que a albumina apresenta
um sito de ligação para os compostos estudados. Quando Cdroga/CHSA é superior a 10 para os
compostos estudados, exceto os complexos RuHMelox e Ru2Sulin em que esta razão é
superior a 5, e o gráfico de Stern-Volmer não é linear, sugere-se que o mecanismo de
supressão pode não ser simplesmente estático.
Os estudos da avaliação da atividade biológica dos complexos frente à linhagem
celular K562 mostrou que todos os compostos estudados apresentam atividade
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antiproliferativa frente a este tipo de células porém de acordo com os tratamentos estatísticos
verificou-se que os fármacos orgânicos atuam de maneira significativa na morte das células e
que nos complexos a unidade dimetálica associada aos fármacos ligantes,de alguma forma
favorece este efeito.
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88 RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS
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I
Súmula Curricular
Renata Rolim Prudente dos Santos
Formação
Candidata a Doutoranda no Instituto de Química da Universidade de São Paulo. (02/
2004 – 04/ 2009)
Licenciada em Química pela Universidade de São Paulo - (Concluído em 12/2005).
Bacharel em Química pela Universidade Federal de São Carlos – (Concluído em
12/2003).
Técnica em Química pela E.M.S.G Primeiro de Maio – (1996 – 1997).
Projetos
1-Doutorado Direto :Complexos de Rutênio com o Fármaco Sulindaco, Diclofenaco e
Ácido Mefenâmico- Síntese, Caracterização e potencial biológico.
Orientadora: Profa. Dra. Denise de Oliveira Silva
2-Iniciação científica :Investigação das Propriedades de Adsorção do fosfato
Quimicamente ligado à Superfície de Sílica gel- agosto/2000 a dezembro/2003.
Orientadora: Profa. Dra. Wania da Conceição Moreira
Bolsas
1-Bolsa de Formação de Pesquisador de Doutorado Direto - CNPQ
período de março/2005 a fevereiro/2009.
2-Bolsa PAE-USP
Participação no Programa de Aperfeiçoamento de Ensino – PAE, da Universidade de
São Paulo, como estagiária/bolsista. (de agosto/2004 – julho/2006)
3-Bolsa de Iniciação Científica – CNPq –PIBC – UFSCar.
período agosto/2001 a julho/2002.
Cursos
1-Química e Sociedade –durante a 28a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química, realizada em Poços de Caldas, MG, no período de 30 de maio a 02 de junho de 2005
2-Catálise Ambiental –durante a XXII Escola de Verão em Química “Prof. Dr. José
Tércio B. Ferreira”, realizada em São Carlos, SP, no período de 18 a 22 de fevereiro de 2002.
3-Segurança em laboratório e tratamento de resíduos - durante a XXII Escola de
Verão em Química “Prof. Dr. José Tércio B. Ferreira”, realizada em São Carlos, SP, no
período de 25 de fevereiro a 01 de março de 2002.
II
4-Polímeros Condutores: propriedades e aplicações- durante a XXII Escola de Verão
em Química “Prof. Dr. José Tércio B. Ferreira”, realizada em São Carlos, SP, no período de
25 de fevereiro a 01 de março de 2002.
Experiência em Pesquisa
1-Laboratório de Química Inorgânica Sintética e Estrutural – Bioinorgânica e
Metalofármacos, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, Brasil.(Fev/2004-
Mar/2009). Estudante de Doutorado sob a supervisão da Profa. Dra. Denise de Oliveira Silva
2-Laboratório de Química de Sólidos e Superfícies – Departamento de Química,
Universidade Federal de São Carlos, Brasil.(Fev/2002 – Dez/2003). Estudante de iniciação
científica sob a supervisão da Profa. Dra. Wania da Conceição Moreira.
Experiência Acadêmica
1-Monitora da disciplina “Transformações Químicas” no período de março/2007 a
julho/2007. Departamento de Química Fundamental – Instituto de Química – Universidade de
São Paulo.
2-Monitora da disciplina “Inorgânica Básica” no período de agosto/2006 a
dezembro/2006. Departamento de Química Fundamental – Instituto de Química –
Universidade de São Paulo.
3-Monitora da disciplina “Química Geral e Inorgânica Básica” no período de
março/2005 a julho/2005 e março/2004 a julho/2004. Departamento de Química Fundamental
– Instituto de Química – Universidade de São Paulo.
4-Monitora da disciplina “Química dos Elementos” no período de agosto/2004 a
dezembro/2004, agosto/2003 a dezembro/2003 e. março/2003 a julho/2003 Departamento de
Química Fundamental – Instituto de Química – Universidade de São Paulo e Departamento de
Química – Universidade Federal de São Carlos.
Contribuições Científicas em Congressos
1-SANTOS, R. R. P., Silva, D.O.
Diruthenium(II,III)-ibuprofen Metallodrug: Interaction with Human Serum Albumin
and effects on Leukemic Tumor Cell In: Eurobic 9, 2008, Wroclaw, Poland. Livro de
Resumos. , 2008.
2-SANTOS, R. R. P., Silva, D.O.
Fluorescence Quentching of human serum albumin by diruthenium-diclofenac
complex In: XIV Brazilian Meeting on Inorganic Chemistry and I-LABIC , 2008, Foz do
Iguaçu - Pr. Livro de Resumos. , 2008.
3-SANTOS, R. R. P., Silva, D.O.
III
Estudo do comportamento da estrutura secundária da Albumina Humana frente a
compostos de dirutênio com os fármacos: diclofenaco e sulindaco. In: 31º Reunião Anual da
Sociedade Brasileira de Química, 2008, Águas de Lindóia. Livro de Resumos. , 2008.
4-SANTOS, L.R.S.R ,SANTOS, R. R. P., Silva, D.O.
Síntese e Caracterização de um complexo de dirutênio com o fármaco cetoprofeno e
estudos preliminares de interação com albumina humana. In: 31º Reunião Anual da
Sociedade Brasileira de Química, 2008, Águas de Lindóia. Livro de Resumos. , 2008.
5-SANTOS, R. R. P., Silva, D.O.
Estudo de um Dímero de Ru2(II,III)-Diclofenaco e sua Interação com Albumina
Humana. In: 30º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2007, Águas de
Lindóia. Livro de Resumos. , 2007.
6-SANTOS, R. R. P., Silva, D.O.
Studies of Interactions of Diruthenium-Sulindac and Diruthenium-Acetate complex
with Human Serum Albumin In: XIII Brazilian Meeting on Inorganic Chemistry, 2006,
Fortaleza. Livro de Resumos. , 2006.
7-SANTOS, R. R. P., Silva, D.O.
Interação entre um dímero de Ru2(II,III)-sulindaco e um monômero de Ru(II)-
dimetilsulfóxido. In: 28º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2005, Poços
de Caldas. Livro de Resumos. , 2005.
8-SANTOS, R. R. P., Silva, D.O.
Sulindac intercalated into Zn-Al Layered Double Hydroxide: A NSAID LHD new
hybrid material. In: Brazilian MRS Meeting 2005 - IV Encontro da SBPMat - Sociedade
Brasileira de Pesquisas em Materiais, 2005, Recife. Livro de Resumos. , 2005.
9-SANTOS, R. R. P.
Syntesis and Characterization of a diruthenium complex with the drug sulindac In:
XII Brazilian Meeting on Inorganic Chemistry, 2004, São Carlos Livro de Resumos. ,
2004.
10-SANTOS, R. R. P
.Investigação das propriedades de adsorção do fosfato de nióbio quimicamente ligado
à superfície de sílica gel In: X Congresso de Iniciação Científica da UFSCar, 2002, São
Carlos. Cd-rom X Congresso de Iniciação Científica. , 2002.
![Alterações funcionais da albumina na cirrose hepáticaalbumina, [9,10] que implica que as funções globais da albumina, resultantes das propriedades oncóticas e não oncóticas,](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/60cddab2be90a8100333f3fb/alteraes-funcionais-da-albumina-na-cirrose-heptica-albumina-910-que-implica.jpg)
