IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA,SZEROLÓGIAI REAKCIÓK

(KOMPLEMENT MEDIÁLT LÍZIS,PRECIPITÁCIÓ, AGGLUTINÁCIÓ)

(Az Ag-Ea kölcsönhatást követő másodlagos szerológiai reakciók)

Antigén-ellenanyagkomplex

Mannóz Patogén felszín

C1q, C1r, C1s

Szerin proteáz

C4, C2

MBLMASP-1/MASP-2

Szerin proteáz

C4, C2

C3

B, D

C3 KONVERTÁZ

KOMPLEMENT RENDSZER

KLASSZIKUS ÚT MB-LEKTIN ÚT ALTERNATÍV ÚT

C4a*

C3a, C5a

Gyulladásos mediátorok

Fagocita toborzás

C3b

Opszonizáció

Kötődik a fagocita CR-hoz

Immunkomplex eltávolítás

TerminálisC5b – C9

MAC

Patogén/sejt lízis

Y

Y

YY

Y

Y

YY

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

YY

Y

Y

Y

Y

YY

Y

Y

YY

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

YY

Y

Y

YY

Y

Y

YY

Y

Y

Y

Y

YY

Y

Y

YY

Y

komplementfehérjéka humán szérumban

növekvő mennyiségű humán szérum

Szérum komplement aktivitás titrálása

hemolízis

hőinaktiválthumán szérum

Y

Y

YY

Y

Y

YY

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

YY

Y

Y

KONTROLL KÍSÉRLETEK

fiziológiássóoldat

desztilláltvíz

Y

YYY

Y

Y

YY

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

YY

YY

Y

Y

YY

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Hemolízis (ozmolízis)

Negatív kontroll

Pozitív kontroll

Ülepedés Ülepedés

növekvő mennyiségűfelülúszó

Y

Y

Y

Y

YYY

Y

Y

Y

YYY

Y

YYY

YY Y

YY

Y

YY YY

Y

Y

Y

Y

Y

1

2

felülúszó

YY

Y

Y

Y

Y

Y

Y

YY

Y

YY YYY

Y

Y

Y

felülúszó

YY

Y

Y

Y

Y

Y

felülúszó

csökkenő mennyiségű anti-BSA ellenanyag

Y

komplementa humánszérumban

BSA

anti-BSAellenanyag

KOMPLEMENT KIMERÍTÉS

növekvő mennyiségűfelülúszó

növekvő mennyiségűfelülúszó

IMMUNKOMPLEX

Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott (oldható) komplexei.A komplexképződés pillanatszerűen is lejátszódhat, egyensúlyra vezető folyamat.

Nem azonos a precipitátummal!

A precipitátum az immunkomplexekből fizikai-kémiai folyamatok során keletkező oldhatatlan csapadékot jelenti. Időigényes folyamat.

antigéntúlsúly ellenanyagtúlsúlysokcsapadék

kevéscsapadék

növekvő ellenanyag mennyiség

EKVIVALENCIAellenanyagtúlsúly antigéntúlsúly

növekvő antigén mennyiség

sokcsapadék

kevéscsapadék

Precipitációs görbe

- valencia (kapcsolatteremtő képesség)

- hőmérséklet (37оC ; 4 оC )

- pH

- sókoncentráció

- idő

- egyéb (pl. PEG)

Ekvivalenciát befolyásoló tényezők:

IgM-pentamer IgA-dimer

Oldékonyságot csökkenti, kedvez a csapadék-képződésnek

MÓDSZEREKImmundiffúzió: (lágy gélközegben)

- radiális egyszerű (ellenanyagot vagy antigént keverik a gélbe)

- radiális kettős (mindkét komponens diffundál a gélben)

Elektroforézis:- immunoelektroforézis (többkomponensű antigént elektroforetizálják,

majd polivalens ellenszérummal reagáltatják.)

- rakéta elektroforézis (ellenanyagot gélbe keverik, antigént elektroforetizálják)

- két-dimenziós elektroforézis (elektroforetikus tulajdonságok alapján szétválasztott antigén frakciókat ellenanyag tartalmú gélen újra

elektroforetizálják)

Turbidimetria (a fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri)

Nefelometria (a szórt fény intenzitását méri)

Radiális kettős immundiffúzió

Immundiffúziós módszerek

Antigének közös determinánsainak

vizsgálata

Mancini módszer Ouchterlony módszer

Extrahálható nukleáris anitgén (ENA) specifikus

antitestek kimutatása

(Ro, La, Sm, RNP, Scl-70, Jo1)

Antigén koncentráció meghatározása radiális immundiffúzióval

IgG koncentráció mérése szérumból radiális immundiffúzióval.A standardok átmérője lehetővé teszi a kalibrációs görbe megrajzolását. A vizsgált szérum minta IgG koncentrációja a görbéről leolvasható: - T1 – IgG mielómás beteg szérumából; 15 mg/ml - T2 – hipogammaglobulinémiás beteg széruma; 2,6 mg/ml - T3 – normál szérum; 9,6 mg/ml

A gyűrű átmérője

IgG

ko

nce

ntr

áci

ó (

mg

/ml)

Radiális immundiffúzió: az antigén koncentráció és a precipitációs gyűrű méretének kapcsolata. A nagyobb koncentrációjú antigén a lyuktól messzebbre vándorolva éri el azt az egyensúlyi állapotot, ahol a megfelelő ellenanyag-mennyiséggel precipitátumot képez.

Ag koncentráció

A g

yű

rű á

tmé

rője

Ea a gélben

Immunelektroforézis

+ -

Immunprecipitáció

Az antigén-ellenanyag kapcsolódást követően képződő oldott immunkomplexeket szilárd fázishoz kötött anti-immunglobulin vagy protein A/G bakteriális fehérjék segítségével oldhatatlan formában izolálják. A szilárd fázishoz kötött immunkomplexek további elúciós lépések eredményeként, oldott állapotban visszanyerhetők.(lásd a következő szemináriumon/gyakorlaton)

Rakétaelektroforézis

A rakéta alakú precipitációs csúcsok magassága arányos az antigén koncentrációjával

Szerológiai módszerek alkalmazása

Immundiffúzió: pl: bakteriális, virális és gomba antigének jellemzésére- radiális egyszerű (Mancini-módszer): antigének mennyiségének

összehasonlító vizsgálata, szérum fehérjék (immunoglobulin izotípusok [IgM, IgG, IgA], akut fázis fehérjék, transzferrin, komplement komponensek) mennyiségi meghatározása különböző testfolyadékokban, ellenanyagok mennyiségi meghatározása

- radiális kettős (Ouchterlony-módszer): precipitációs ekvivalencia zóna becslése, precipitáló ellenanyagok relatív szintjének (titerének) meghatározása, állandó ellenanyag koncentráció mellett az antigén mennyisége is megbecsülhető

Elektroforézis:- immunoelektroforézis: szérum fehérjék frakciókra való elválasztása,

plazmasejt diszkráziák (mielóma multiplex, Waldenström makroglobulinémia, elsődleges amiloidózis) során képződő, monoklonális eredetű immunoglobulinok kimutatása

- rakéta elektroforézis: antigén/ellenanyag koncentráció meghatározása- két-dimenziós elektroforézis: elektroforetikus mobilitás alapján

szétválasztott frakciók koncentrációjának meghatározása; szérum, vizelet, cerebrospinális folyadék fehérjeösszetételének kvantitatív és kvalitatív vizsgálata

Turbidimetria: (érzékenység: 50 µg/ml) szérumban, liquorban nagy mennyiségben jelen lévő fehérjék vizsgálata

Nefelometria: (érzékenység: 1 µg/ml) kis koncentrációjú szérum és liquor fehérjék, gyógyszer szintek mérése

Agglutináció típusai, gyakorlati alkalmazásA vörös- és fehérvérsejtek valamint baktériumok sejtfelszíni antigénjeivel (legalább mikroszkópikus méretű antigének) reagáló ellenanyagok a sejtek összeállását, agglutinációját idézhetik elő.

Fajtái:

• direkt: Ellenanyagok kötődését az antigénhez a sejtek összecsapódása kíséri (pl. AB0 vércsoport antigének) - főleg IgM

• indirekt : Az antigén determinánsok elrendeződése nem teszi lehetővé az direkt összecsapódást. DE! A sejtek összecsapódása a kötött ellenanyagok Fc részéhez kötődő második ellenanyaggal kiváltható (pl. D vércsoport antigén (Rh)) - főleg IgG

• passzív: Megfelelően kezelt vörösvértestekhez vagy latex részecskékhez haptének vagy antigének kapcsolhatók, és ezekre specifikus ellenanyaggal agglutinálhatók rheumatiod arthritis: A szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM és IgG autoellenanyagok (RF= rheuma faktor) jelennek meg.

- reakció

gyors ülepedés

- reakció

gyors ülepedés

+ reakció

lassú ülepedés

vörös-vértest

Direkt agglutináció

pl. AB0 vércsoport meghatározás

Az ABO vércsoportantigének szerkezete

A fenotípusok kialakulását kodominánsan öröklődő specifikus enzimek irányítják.

O ANTIGÉN A ANTIGÉN B ANTIGÉN

SZÉNHIDRÁT TÍPUSÚ ANTIGÉNEK

Donorválasztás az ABO-vércsoport antigének alapjánMa már csak elvi lehetőség, rutinban kizárólag csoportazonos (AB0 és Rh) vér transzfundálható!

Vércsoport meghatározás

Ágy melletti gyorsteszt Microplate-s meghatározás

Hagyományos csempés meghatározás Gélkártyás technika

Kvantitatív hemagglutinációs teszt

Egy adott antigénre specifikus antitestek számának (antitest titer) meghatározása. Az antigén lehet a vvt. vagy a baktérium felszínén.

Indirekt agglutináció

pl. Rh vércsoport meghatározás

primer AT

szekunder AT

A Rhesus (Rh) vércsoportantigén (D)

IgG típusú ellenanyag

direkt agglutinációt nem vált ki (inkomplett ellenanyag),de emberi immunglobulinokkal reagáló

2. ellenanyaggal az agglutináció kiváltható

indirekt agglutináció

FEHÉRJE ANTIGÉN

citoplazmamembrán

extracelluláris tér

intracelluláris tér

Az agglutináció in vivo következményei

ABO inkompatibilitás intravascularis haemolysis(komplement mediálta hemolízis)

Rh inkompatibilitás erythroblastosis fetalis(vvt-ek opszonizálása, majd MF-ok,

granulociták általi fagocitózis)

Rh profilaxis

Ha az első Rh+ magzat születését követően 72 órán belül az anyai szervezetbe anti-D Ea-tjuttatnak, megelőzhető az anyai ellenanyagokképződése.

Erythroblastosis foetalis

Hemolysis

Anémia– Erythroblast szám– Hepatosplenomegália– Sápadtság– Ödéma– Szívelégtelenség

Vérképzés a tüdőben

Erythroblastok a csontvelőben

Sárgaság

Újszülöttek hemolítikus anémiájaMiért nem alakul ki az első Rh+ magzattal szemben immunreakció?

- Mert csak a szülés kapcsán kerül elegendő antigénstimulust jelentő vvt az anyai keringésbe. (Immunogenitást meghatározó tényező az antigén mennyisége!)

Van-e kivétel az előző szabály alól, miért van/nincs?

- 20. hét utáni vetélés, amniocentesis, transplacentaris vérzéssel járó más szülészeti beavatkozás, ok: ld. előző magyarázat!

Miért adunk anti-D IgG-t profilaktikusan?

- Mert a bekerülő Rh+ vörösvértesteket azonnal eliminálja, mintegy „elrejti” az anyai immunrendszer elől.

Miért véd az AB0-inkompatibilitás az Rh-inkompatibilitás következményeitől?

- Mert az anti-A és anti-B ellenanyagok természetesen is állandóan jelen vannak (ezen antigének pl. a érendothelen, a bélbaktériumokon is kifejeződnek), és azonnal eliminálják az inkompatibilis vörösvértesteket. (maszkírozás, ld. előző magyarázat!)

Miért ritkább az AB0-inkompatibilitásból eredő hemolítikus betegség?

- Mert az AB0-antigének szénhidrátok, IgM izotípusú ellenanyagok termelődnek ellenük. Az IgM ellenanyagok nem jutnak át a placentán.

Passzív agglutináció(diagnosztikai/indikátor módszer)

Rheumatoid arthiritis: a szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM autoellenanyagok(RF = reuma faktor) jelennek meg.

Humán immunglobulin antigéneket fixálva latex gyöngyök / vvt-k felszínére és ezeket az RA-s beteg szérumával reagáltatva agglutináció következik be, ha a szérumban RFvan jelen.

Passzív hemagglutináció gátlása oldott Ag-nel

Oldott haptén vagy Ag gátolja az agglutinációt. pl. Monoteszt terhességi teszt: vvt-k felszínéhez hCG-t kapcsolnak és hormon specifikus ellenanyaggal váltják ki az agglutinációt. Ha ehhez a rendszerhez terhes nő vizeletét adjuk (oldott hCG!), akkor gátoljuk az agglutinációt.

Hemagglutináció ellenanyagok jelenléte nélkül?

Igen, virális fehérjékkelpl.: influenza, mumpsz

pl. vírus ellenes ellenanyagok kimutatása

Az agglutinációt gátló ellenanyagok a receptor kötést (sziálsav) is gátolják, tehát vírusneutralizáló sajátságúak

(Nem immunológiai reakció!!!)

Gyakorlati alkalmazás

direkt agglutináció: ABO vércsoport meghatározásWidal-teszt: tiphoid láz, febris undulans

indirekt agglutináció: anti-D Ea jelenlétének kimutatásadirekt Coombs-teszt:

vércsop. inkompatibilitás, autoimmun hemolitikus anémia

indirekt Coombs-teszt:transzfúzió előtt, terhesség alatt

passzív agglutináció: rheuma faktor kimutatása terhességi monoteszt

Az immunoesszék érzékenysége