MỤC LỤC

MỤC LỤC............................................................................................1LỜI NÓI ĐẦU.....................................................................................2NỘI DUNG TIỂU LUẬN....................................................................4

1. Lược sử ra đời của kỹ thuật ADN tái tổ hợp..............................................................42. Kỹ thuật ADN tái tổ hợp và một số ứng dụng............................................................4

2.1. Kỹ thuật ADN tái tổ hợp............................................................................................42.1.1. Các enzym chủ yếu dùng trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp...............................6

2.1.1.1. Các enzym giới hạn......................................................................................62.1.1.2. Các enzym polymerase................................................................................72.1.1.3. Các enzym nối (Ligase)................................................................................82.1.1.4. Các nuclease..................................................................................................9

2.1.2. Các vector sử dụng trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp.......................................102.1.2.1. Các vector plasmid.....................................................................................112.1.2.2. Các vector phage........................................................................................142.1.2.3. Cosmid vector.............................................................................................152.1.2.4. Các vector khác..........................................................................................16

2.1.3 Các loại tế bào chủ.............................................................................................162.1.3.1. Tế bào chủ nhân sơ.....................................................................................172.1.3.2. Tế bào chủ nhân chuẩn..............................................................................18

2.1.4 Tạo, tách và chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp.....................................................192.1.4.1 Tạo plasmid tái tổ hợp................................................................................192.1.4.2. Tách dòng ADN tái tổ hợp.........................................................................202.1.4.3 Chọn lọc dòng ADN đặc hiệu và biểu hiện gen.........................................20

2.2. Ứng dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp........................................................................212.2.1. Ứng dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp đối với con người.......................................21

2.2.1.1. Sản xuất vaccine tải tổ hợp........................................................................212.2.2.1. Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ và nâng cao chất lượng cuộc sống.......................................................................................................262.2.1.3. Chuẩn đoán mầm bệnh.............................................................................272.2.1.4. Liệu pháp gen.............................................................................................27

2.2.2 Chuyển gen tạo các động, thực vật có năng suất chất lượng cao...................282.2.2.1 Động vật chuyển gen...................................................................................282.2.2.2 Thực vật chuyển gen...................................................................................30

TÓM LẠI...........................................................................................33TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................34

1

LỜI NÓI ĐẦU

Công nghệ sinh học (Biotechnology) là một lĩnh vực công nghệ cao, công

nghệ của thế kỷ XXI. Ít năm trước đây, trước thềm của thế kỷ XXI, đã có nhiều

ý kiến nhận định, phán đoán của các nhà khoa học, các nhà nghiên cứu chiến

lược, các nhà hoạch định chính sách,… về một ngành khoa học mũi nhọn có thế

sẽ được phát triển trong tương lai.

   Có ý kiến thì cho rằng ngành khoa học mũi nhọn trong tương lai ở thế kỷ

XXI sẽ là ngành công nghệ thông tin. Một số ý kiến khác lại cho rằng phải là

ngành công nghệ điện tử viễn thông hay của các cuộc hành trình bay vào vũ trụ,

v.v...Mỗi người một ý, chẳng ai chịu ai. Mỗi người, mỗi nhóm đều cố gắng đưa

ra những dẫn chứng có tính thuyết phục cao nhất, nhằm chứng minh cho nhận

định của mình là đúng, là có lý. Thế nhưng, gần đây, tất cả đã cùng đồng ý với

nhau rằng: Thế kỷ XXI này chắc chắn sẽ là thế kỷ của Công nghệ sinh học!

Thực vậy, công nghệ sinh học (CNSH) là một bước tiến mới nhất trong nỗ

lực lâu dài chinh phục tự nhiên để nâng cao điều kiện sống của con người.

Những năm gần đây, trong bản đại hợp tấu khoa học và công nghệ, bộ đàn dây

CNSH đã bắt đầu tấu lên những khúc nhạc mới lạ, với nhiều cung bậc, nhiều tiết

tấu mà thậm chí chúng ta chưa từng nghe. Những khúc nhạc mới lạ này đã thực

sự có những đóng góp tích cực, quan trọng trong việc tạo ra nhiều của cải vật

chất, các phương tiện tồn tại và phát triển của xã hội loài người. CNSH đã được

phát triển và ứng dụng trong nhiều ngành, nhiều lĩnh vực của cuộc sống. Chúng

ta đã sử dụng CNSH trong lĩnh vực nông-lâm - ngư nghiệp, lĩnh vực y-dược, bảo

vệ môi trường,…thậm trí là cả trong lĩnh vực thể thao. Trong mỗi lĩnh vực,

CNSH đều đã mở ra được các cách thức, phương thức làm cho cuộc sống an

toàn hơn, mạnh khoẻ hơn và năng suất cao hơn.

Từ xa xưa, công nghệ sinh học (CNSH cổ truyền và CNSH cận đại) đã

được loài người ứng dụng phục vụ nhiều nhu cầu cuộc sống. Từ những thao tác

rất nhỏ trong cuộc sống như muối dưa, muối cà đến việc sản xuất ở qui mô công

2

nghiệp các sản phẩm của công nghệ lên men, công nghệ vi sinh như các đồ uống

có cồn (rượu, bia ), các dung môi hữu cơ, các vitamin, các loại vaccine, thuốc

trừ sâu sinh học, phân bón sinh học, … Vài thập kỷ gần đây, với sự ra đời của

CNSH hiện đại ( gồm: Công nghệ di truyền - Genetic engineering, công nghệ tế

bào - Cell engineering, công nghệ vi sinh vật/ công nghệ lên men - Microbial

engineering/ Fementation engineering, công nghệ enzym/ protein - Enzym/

Protein engineering và CNSH môi trường - Environmental biotechnology ), loài

người đã và đang có thể sửa chữa, trao đổi, cải tạo, tạo mới vật chất di chuyền ở

cấp độ phân tử. Thực tế phát triển và ứng dụng CNSH hiện đại trên cơ sở kế

thừa và phát huy CNSH cổ truyền và cận đại, những năm gần đây, loài người đã

có thể tuyển chọn và dần tạo thêm được nhiều giống cây trồng, vật nuôi mới có

năng suất, chất lượng cao, sức chống chịu tốt; Đã và đang có thể chuẩn đoán,

phòng ngừa hay cứu chữa các bệnh hiểm nghèo, bệnh di truyền như bệnh tiểu

đường, khối u, ung thư, lùn bẩm sinh, thiếu máu; các bệnh nhiễm sắc thể thường

và nhiễm sắc thể giới tính; viêm gan B, viêm não Nhật Bản, bại liệt, sốt rét, …;

Đã có thể tạo ra ngày một nhiều các chủng, loài vi sinh vật mới hoặc chỉ định

các vi sinh vật này tạo ra các protein, enzim có hoạt tính cao hơn hay các sản

phẩm khác mà vốn dĩ trước đây chúng ta không làm được…

ADN tái tổ hợp là kỹ thuật đầu tiên của hàng loại kỹ thuật Công nghệ sinh

học hiện đại khác, tập hợp lại gọi là Công nghệ di truyền (Genetic technology)

…

3

NỘI DUNG TIỂU LUẬN

1. Lược sử ra đời của kỹ thuật ADN tái tổ hợp

Năm 1972 các phân tử ADN tái tổ hợp đầu tiên được tạo ra tại trường

Đại học Stanford ( Mỹ ) do nhà khoa học Paul Berg và các cộng sự thực hiện

bằng cách sử dụng đặc tính cắt của enzym giới hạn (Restriction enzym) và khả

năng nối các mạch ADN với nhau của enzym nối ligase. Nhờ kỹ thuật này vật

chất di truyền thường là một hay và gen có thể lắp ghép vào phân tử ADN có

nguồn gốc khác ( ví dụ lắp ghép gen của động vật, thực vật vào plasmid của vi

khuẩn hoặc vào phagơ ) để hình thành ADN tái tổ hợp. Khi các cơ thể ADN tái

tổ hợp được tạo thành có thể được chuyển từ cơ thể này ( cơ thể cho ) sang cơ

thể hoặc tế bào khác ( cơ thể nhận hoặc tế bào nhận ). Điều cơ bản và quan trọng

là các gen tái tổ hợp này vẫn di trì chức năng cũ của nó trong cơ thể, hoặc tế bào

nhận.

Năm 1973 các nhà khoa học đã nối nhiều đoạn ADN vào plasmid được

tách ra từ vi khuẩn E.coli. Plasmid này có thể hoạt động, tự sao chép khi đưa vào

tế bào vi khuẩn E.coli, từ đó tạo ra công nghệ quan trọng trong công nghệ di

truyền là tách dòng gen.

Thành tựu đầu tiên của kỹ thuật ADN tái tổ hợp là việc sản xuất ra

hoocmon sinh trưởng người (hGH-human growth hoocmon) nhờ vi sinh vật

nhận là Escherichia coli (E.coli). Các nhà khoa học đưa được gen mã hoá hGH

vào E.coli. E.coli có ADN tái tổ hợp đã sản sinh ra một lượng rất lớn hoocmon

sinh trưởng người và được sử dụng vào thực tiễn y học.

Vào những năm đầu của thập kỷ 80 thế kỷ XX, nhờ kỹ thuật ADN tái tổ

hợp, người ta đã sản xuất interferol, sản xuất protein chống đông máu v.v…

2. Kỹ thuật ADN tái tổ hợp và một số ứng dụng.

2.1. Kỹ thuật ADN tái tổ hợp.

ADN tái tổ hợp (recombinant DNA) là ADN được tạo ra từ hai hay nhiều

nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử ADN tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ

4

thuật ghép nối các đoạn ADN của các cá thể khác nhau trong cùng một loài,

hoặc của các loài khác nhau.

Kỹ thuật tái tổ hợp ADN được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp,

tinh vi, thực chất là một công nghệ gồm các bước chủ yếu sau:

Bước 1: Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gen và nuôi tế bào cho (ví

dụ tế bào của người) để cung cấp ADN.

Bước 2: Tách chiết ADN plasmid và ADN tế bào cho. Bước này còn được gọi là

phân lập gen.

Bước 3: Cắt cả hai loại ADN (ADN plasmid và ADN tế bào cho) bằng cùng một

loại enzym giới hạn (restriction enzym-RE). Ví dụ, sử dụng enzym giới hạn

endonuclease EcoRI tạo ra các đầu so le.

Bước 4: Trộn chung ADN plasmid đã bị cắt với ADN tế bào cho cũng đã bị cắt

bởi một loại enzym giới hạn như đã nêu trên.

Bước 5: Bổ sung enzym nối ligase để tạo ra ADN tái tổ hợp hoàn chỉnh.

Bước 6: Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ (ví dụ vi khuân E.coli) và nhân

dòng.

Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ (vi khuẩn) mang ADN tái tổ hợp và

theo dõi hoạt động, biểu hiện của gen thông qua sản phẩm của gen lấy từ tế bào

cho.

5

2.1.1. Các enzym chủ yếu dùng trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp

2.1.1.1. Các enzym giới hạn

Trong công nghệ di truyền muốn tạo ra ADN tái tổ hợp để đưa vào tế bào

chủ cần phải có công cụ cắt plasmid hình vòng và đoạn ADN của tế bào rồi cho

chúng nối lại với nhau. Công cụ cắt ADN là các enzym giới hạn

a) Khái niệm về enzym giới hạn

Thông thường tế bào vi khuẩn bị nhiễm phagơ (thể thực khuẩn) thì vi

khuẩn đó bị phagơ phá huỷ. Một số chủng vi khuẩn sau khi bị nhiễm phagơ lại

không bị phá huỷ, do trong tế bào vi khuẩn này có loại enzym có khả năng cắt

ADN phagơ thành những đoạn nhỏ. Năm 1970, Hamilton Smith là người đầu

6

tiên tách được loại enzym này từ loại vi khuẩn Haemiphilus influenzae được gọi

tên là HinII. Ngay sau đó, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng, phần lớn các loài

vi khuẩn mang loại enzym có chức năng cắt ADN lạ xâm nhập để bảo vệ tế bào

khỏi bị xâm nhập của các ADN lạ. Những enzym đó được gọi là enzym giới

hạn.

Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự ADN

nhất định và cắt ADN ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận. Tuỳ theo

phương thức cắt và nguồi gốc của enzym giới hạn mà người ta phân loại và đặt

tên cho các enzym giới hạn đó

b) Phân loại enzym giới hạn

Các enzym giới hạn được phân thành 3 kiểu I, II và III. Các enzym giới

hạn thường dùng phổ biến trong công nghệ ADN tái tổ hợp, công nghệ di truyền

thuộc kiểu II. Các enzym này cắt bên trong mạch ADN (không phân huỷ từ 2

đầu của ADN) nên còn được gọi là enzym endonuclease. Enzym giới hạn kiểu II

thực chất là endonuclease giơi hạn kiểu II.

Các enzym giới hạn kiểu II: Cách gọi tên các enzym giới hạn kiểu II cũng

như các enzym giới hạn khác dựa trên quy ước chung. Tên enzym giới hạn được

ghép bởi chữ cái đẩu tiên là tên chi và hai chữ tiếp theo là hai chữ cái tên loài

của vi sinh vật mà enzym được tách chiết. Nhưng chữ và số La mã tiếp theo là

tên của chủng và dòng của loài sinh vật cụ thể đã tách chiết enzym:

Ví dụ: E.coRI (thuộc chi Escherichia, loài coli, chủng Ry 13) Một số loại

khác như E.coRV, BamHI, HaeIII, Smal, …

2.1.1.2. Các enzym polymerase

a) Khái niệm

Các enzym polymerase xúc tác cho quá trình sao chép các axit nucleic

(ADN, hoặc ARN) được sử dụng nhiều trong Công nghệ di truyền. Khi nói về

một enzym polymerase nào đó, người ta thường dùng thuật ngữ “ phụ thuộc

ADN ” hoặc “ phụ thuộc ARN ” để chỉ axit nucleic mà enzym này xúc tác cho

7

việc sao chép. ADN polymerase phụ thuộc ADN thì sao chép ADN sang ADN;

ADN polymerase phụ thuộc ARN thì sao chép ARN sang ADN, còn enzym

ARN polymerase phụ thuộc ADN thì phiên mã ADN sang ARN. Các enzym này

tổng hợp axit nucleic bằng cách nối các nucleotit với nhau theo nguyên tắc bổ

sung dựa theo mạch khuôn. Quá trình tổng hợp mạch mới bổ sung diễn ra theo

chiều 5’-3’ và sự khởi đầu cần có đầu 3’-OH tự do.

b) Phân loại

Các ADN polymerase: (Enzym ADN polymerase I, Enzym T4 ADN

polymerase, Enzym Taq polymerase …) Hiện nay còn có nhiều loại ADN

polymerase khác lưu hành trên thị trường như T7 ADN polymerase, Vent ADN

polymerase …

Các enzym ARN polymerase: Có ba loại enzym ARN polymerase thường

được dùng trong thực tế, đó là SP6 ARN polymerase, T3 ARN polymerase và T7

ARN polymerase …

Enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase): Có khả năng tổng hợp

ADN một mạch gọi là ADN bổ trợ (cADN) từ khuôn mARN, hoặc từ một đoạn

polynucleotit được tổng hợp bằng con đường hóa học. Nhờ có con đường phiên

mã ngược này mà có thể tổng hợp được hầu hết các gen riêng biệt nào đó nếu

như có mặt mARN của gen đó. Các cADN mạch đơn có thể biến thành mạch

kép nhờ ADN polymerase và được gọi là cADN mạch kép (c-DNA duplex).

Đoạn cADN mạch kép có thể gắn vào plasmid rồi biến nạp vào vi khuẩn, từ đó

tạo dòng c-ADN. Nếu cADN có nguồn gốc từ một gen thì ta tạo được dòng gen.

Trong trường hợp mARN trưởng thành khi đã ở ngoài nhân thì ta sẽ thu được

dòng gen chỉ chứa những đoạn mã hóa (exon). Không có đoạn không mã hóa

(intron).

2.1.1.3. Các enzym nối (Ligase)

Enzym ligase là enzym nối quan trọng trong tế bào. Các enzym này xúc

tác hình thành các liên kết phosphodiester để nối các đoạn axit nucleic với nhau.

8

ADN ligase xúc tác nối hai đoạn ADN với nhau, ARN ligase là enzym chủ yếu

được sử dụng rộng rãi. Có một số loại enzym nối khác nhau, nhưng enzym T4

ADN ligase là enzym chủ yếu được sử dụng rộng rãi nhất trong các phòng thí

nghiệm về công nghệ di truyền.

Có 3 loại enzym nối thường dùng trong Công nghệ di truyền. Enzym

E.coli ADN ligase được tách chiết từ vi khuẩn E.coli, xúc tác phản ứng nối hai

đoạn trình tự ADN có đầu sole. Enzym T4 ADN ligase được tách chiết từ phage

T4 xâm nhiễm vào E.coli, có chức năng giống như E.coli ADN ligase nhưng lại

có khả năng nối hai đoạn trình tự ADN có đầu bằng và là enzym nối được ưa

chuộng nhất hiện nay. Enzym T4 ARN ligase tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm

E.coli, có khả năng nối hai trình tự ARN bằng các liên kết phosphodiester.

Ngoài các loại enzym nối kể trên, hiện nay người ta còn sử dụng các đoạn

nối (đầu dính–adaptor) cho các enzym cắt đầu bằng. Adaptor xúc tác nối các

đoạn ADN do có các enzym giới hạn cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu so le. Mỗi

đoạn enzym cắt đầu bằng đều có các loại adaptor đặc trưng riêng.

2.1.1.4. Các nuclease

Các enzym nuclease phân hủy các axit nucleic bằng cách làm đứt các liên

kết phosphodieste là liên kết nối các nucleotit cùng một mạch với nhau. Ngoài

các enzym giới hạn đã nêu ở trên còn có các loại nuclease chủ yếu sau:

Enzym ADNase I (endonuclease) tách chiết từ tụy của bò, xúc tác phản

ứng thủy phân các liên kết ngay sau một bazo nito ở cả mạch đơn và mạch kép

hoàn toàn ngẫu nhiên.

Enzym S1 nuclease (endonuclease) là enzym tách chiết từ nấm mốc

Aspegillus oryzae. S1 nuclease BAL 3 (endonuclease) phân cắt cả 2 đầu 5’ và 3’

của ADN và không có khả năng cắt nội liên kết.

Enzym exonuclease III là một 3’ exonuclease cắt đầu 3’ của mạch đơn và

tạo thành các đoạn ADN có đầu 5’ nhô ra.

9

Enzym ARNase tách chiết từ tụy bò. Enzym này thường được sử dụng để

loại bỏ ARN trong hỗn hợp ADN và ARN.

Enzym ARNase H dùng để loại bỏ ARN trong các phân tử lai ADN-ARN,

nhất là sau phản ứng phiên mã ngược để hình thành mạch thứ hai của cADN, từ

đó tạo nên phân tử cADN kép.

2.1.2. Các vector sử dụng trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp

Muốn chuyển được gen mong muốn từ thể cho sang vật chủ nhận (thể

nhận), hoặc tách dòng gen, điều cơ bản là cần phải có vật chuyển gen (vector

chuyển gen). Vector chuyển gen là phân tử ADN nhỏ có khả năng mang được

gen cần thiết. Vector chuyển gen phải có các đặc điểm quan trọng cần thiết sau:

Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication – ori) để tự sao chép mà

tồn tại độc lập trong tế bào.

Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzym giới hạn cắt rồi để hở tạo nơi

lắp ráp các đoạn gen lạ.

Có trình tự khởi điểm (promoter).

Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong

tế bào chủ nhận. Thông thường dấu chuẩn chọn lọc là các gen kháng chất kháng

sinh, hoặc gen tổng hợp chất màu.

Để đảm bảo cho được tính bền vững của ADN tái tổ hợp, ngoài các đặc

điểm trên vector chuyển gen cũng cần có những đặc tính khác để cho việc tạo,

tách dòng dễ thực hiên như:

Chứa các gen vô hiệu hóa các đoạn ADN không mong muốn bị gắn nhầm

vào.

Có khả năng tạo nhiều bản sao để khi tách khỏi tế bào được số lượng lớn,

đảm bảo sự khuếch đại của gen lạ mong muốn được gắn vào.

Giá trị của các vector chuyển gen ở chỗ nó được cấu tạo thuận tiện cho

mục đích sử dụng. Hiện tại chưa có loại vector chuyển gen toàn năng, mà cần

10

phải lựa chọn vector chuyển gen cho tưng đối tượng và tùy thuộc và kích thước

của đoạn gen cần được chuyển.

Các vector chuyển gen có các ứng dụng chủ yếu:

Tạo dòng, nhân dòng các đoạn trình tự, hoặc gen để tạo nhiều bản sao

giống nhau.

Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự ADN, hoặc một gen.

Chuyển gen vào tế bào vi sinh vật khác (vật chủ nhận).

Sản xuất các ARN.

Sản xuất protein được tổng hợp từ gen đã được tạo dòng. Do tính chất

quan trọng và nhiều ứng dụng nên các vector chuyển gen ngày càng được

khám phá, hoàn thiện không ngừng. Từ những vector chuyển gen sẵn có

trong tự nhiên như plasmid ở vi khuẩn, ngày nay người ta đã tạo ra nhiều

loại vector phức tạp ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau, thậm chí tạo

ra cả nhiễm sắc thể nhân tạo.

2.1.2.1. Các vector plasmid

Nhiều loại plasmid được tim thấy trong tự nhiên ở các vi khuẩn và trong

một số nấm men. Chúng là những phân tử ADN mạch vòng, tương đối nhỏ so

với nhiễm sắc thể của tế bào vật chủ. Các plasmid tồn tại chủ yếu ở trạng thái

ngoài nhiễm sắc thể. Mặc dù các plasmid nói chung có thể bỏ qua (chúng không

cần thiết cho các quá trình sinh trưởng và phân chia của tế bào) nhưng chúng

thường truyền các tính trạng (chẳng hạn: tính bền vững với kháng sinh) cho vật

chủ, do vậy giúp cho việc lựa chọn dể dàng trong những điều kiện xác định. Các

gen bền vững với kháng sinh do ADN plasmid mã hóa thường được sử dụng

trong công việc thiết kế các vector dùng trong kỹ thuật di truyền vì chúng cung

cấp một phương tiện thuận lợi để lựa chọn các tế bào có mang plasmid.

Mỗi tế bào vi khuẩn có trung bình khoảng 20 plasmid. Các plasmid có thể

chia thành 2 nhóm:

Tiếp hợp

11

Không tiếp hợp

Các plasmid tiếp hợp có thể tự truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác

thông qua quá trình tiếp hợp. Quá trình này đòi hỏi các chức năng của các đoạn

đặc thù tra (transfer) và mob (mobilising) nằm trên plasmid.

Các plasmid không tiếp hợp thì không tự truyền đi được để vào vật nhận.

Plasmid không tiếp hợp thường nhỏ, sao chép một cách thoải mái và tồn tại

trong tế bào với số bản sao lớn hơn so với plasmid tiếp hợp. Các plasmid luôn

được cải biến để ngày càng hoàn thiện hơn qua nhiều thế hệ, thuận tiện cho công

nghệ ADN tái tổ hợp.

Plasmid thế hệ thứ nhất là những plasmid đầu tiên được sử dụng để tách

dòng như pSC1001, ColE1 …

12

Plasmid thế hệ thứ 2 được tạo ra bằng cách kết hợp các đặc tính quý của

nhiều plasmid tự nhiên, gắn thêm gen chỉ thị để tạo nên một plasmid mới. Điển

hình cho plasmid thế hệ thứ hai và cũng là một trong những plasmid được sử

dụng rộng rãi nhất trong Công nghệ di truyền, đó là plasmid pBR322

Plasmid nhân tạo thế hệ thứ 3 rất mạnh, có kích thước nhỏ và có một đoạn

đa liên kết (polylinker), hoặc điểm đa tách dòng (multiple cloning site). Đoạn đa

liên kết là đoạn polynucleotit tổng hợp, mang một chuỗi các vị trí nhận biết của

nhiểu loại enzym giới hạn. Nhóm plasmid này là các plasmid pUC và điển hình

là pUC18.

13

Plasmid pUC18 được cải tiến từ pBR322 có kích thước là 2688 bp.

Plasmid pUC18 có điểm khởi đầu sao chép (ori) mang gen kháng sinh

ampicilline (Ampr). Ngoài ra nó còn có gen ức chế lac (lacI), đoạn đa liên kết

(MCS) và gen lacZ’. Đoạn đa liên kết gồm nhiều vị trí nhận biết của các enzym

giới hạn.(theo hinh vẽ)

2.1.2.2. Các vector phage

Các phage (vi rut của vi khuẩn) được dùng làm vector chuyển gen do khả

năng thực hiện việc mang gen từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào chủ nhận (tải

nạp).

Các phage sử dụng làm vector tách dòng hiện nay phần lớn bắt nguồn từ

phage lamda (phage ) có nhiều loại phage như: EMBL3, EMBL4, GEM11,

14

phage M13… Phage M13 thường được sử dụng làm vector tách dòng nó có

ADN sợi đơn chứa 10 gen, có kích thước khoảng 6400 bp, chỉ sâm nhiễm vào

E.coli

2.1.2.3. Cosmid vector

Cosmid vector được thiết kế để nhân dòng những đoạn ADN lớn (khoảng

40-45 kb). Đây là loại vector nhân tạo kết hợp các thuộc tính của plasmid với

phage. Cosmid vector có chứa đầu cos (đầu dính) của phage giúp ADN của

phage từ dạng thẳng nối lại thành vòng tròn nên có thể gói bọc dễ dàng trong

phần đầu của phage. Mặt khác cosmid vector lại có phần gốc plasmid, do vậy

chúng có khả năng tự nhân đôi như những plasmid của vi khuẩn. Do hầu như

toàn bộ phần ADN của phage đã được cắt bỏ, nên chúng có khả năng mang đoạn

ADN ngoại lai có kích thước lớn. Khi đoạn ADN ngoại lai được ghép nối, các

cosmid tái tổ hợp sẽ được gói bọc trong phage. Phage mang ADN tái tổ hợp

không tự nhân lên được vì phần ADN phage đã bị loại bỏ nhưng chúng vẫn có

khả năng lây nhiễm vào vi khuẩn. Tuy nhiên sau khi vào vi khuẩn, chúng lại có

khả năng tự nhân lên do bản thân trong vi khuẩn đã có plasmid bình thường.

15

Cosmid mang đoạn gen lạ có thể dài đến 45 kb dùng để lập thư viện gen ở ruồi

giấm, chuột, thậm chí cả ở người.

2.1.2.4. Các vector khác

a) Plasmid Ti: Được sử dụng rộng dãi trong việc chuyển gen ở thực vật.

Plasmid Ti bắt nguồn từ vi khuẩn trong đất, loài Agrobacterium tumifaciens gây

bệnh tạo khối u (tumor) ở thực vật

b) Vector nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC: Nấm men là đối tượng

quan trọng trong Công nghệ di truyền. Các plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn

đưa vào nấm men hoạt động thường không hiệu quả. Ngược lại plasmid có

nguồn gốc nấm men đưa vào tế bào vi khuẩn lại không hoạt động. Cho tới nay ở

vi sinh vật nhân chuẩn (eukaryota) mới chỉ tìm được một loại plasmid duy nhất,

đó là plasmid hình vòng có kích thước khoảng 2 micromet, có nhiều trong tế bào

nấm men Sacchromyces cerevisiae.

c) Vector là virus của tế bào eukaryote:

Các vector virus thường được sử dụng là các loại virus SV40 (Smian

virus) adenovirus, retrovirus, baculovirus, và virus herpes … Các vector nhóm

này được sử dụng trong tách dòng gen và chuyển gen ở tế bào động thực vật bậc

cao.

Nhìn chung có nhiểu loại vector khác nhau được dùng trong Công nghệ di

truyền. Mỗi loại vector có tế bào chủ đặc trưng và khả năng xen đoạn ADN có

kích thước khác nhau.

2.1.3 Các loại tế bào chủ

Nhiều loại tế bào chủ khác nhau được sử dụng phụ thuộc vào mục đích sử

dụng như:

Nuôi số lượng lớn để tách plasmid cho thí nghiệm tao dòng. Hệ thống tế

bào chủ này cần đơn giản, dễ sử dụng.

Dùng để biểu hiện gen, đặc biệt ở sinh vật nhân chuẩn bậc cao như động

vật, thực vật. Hệ thống tế bào chủ này cần mang tính đặc thù.

16

Dùng để sản xuất protein tái tổ hợp.

Tùy theo mục đích sử dụng mà chọn một tế bào chủ thích hợp. Các tế bào

chủ có thể chia làm hai hệ thống chính, đó là tế bào chủ nhân sơ và tế bào

chủ nhân chuẩn.

2.1.3.1. Tế bào chủ nhân sơ

Một loại tế bào chủ lý tưởng là tế bào cần phải dễ nuôi cấy, dễ giữ và

nhân giống, lại chấp nhận được nhiều loại vector. Vi khuẩn E.coli đáp ứng các

yêu cầu của tế bào chủ lý tưởng và được sử dụng nhiều trong kỹ thuật tạo và

tách dòng gen. Do tính chất đặc biệt của tế bào chủ lý tưởng nên E.coli được

nghiên cứu tỷ mỷ về cơ chế di truyền, phân lập và tạo nên nhiều chủng khác

nhau. Các nghiên cứu đó là cơ sở cho kỹ thuật ADN tái tổ hợp và Công nghệ di

truyền.

Vi khuẩn E.coli

Ngoài E.coli một số vi khuẩn khác cũng được dùng làm tế bào chủ cho

các thí nghiệm tách dòng gen như: Bacillus, Pseudomonas và Streptomyces…

tuy nhiên những tế bào chủ này có những hạn chế nhất định. Những tế bào chủ

17

này cần đòi hỏi những vector thích hợp, nên việc đưa các ADN tái tổ hợp vào

chúng gặp nhiều khó khăn.

2.1.3.2. Tế bào chủ nhân chuẩn

Một trong những nhược điểm cơ bản khi sử dụng E.coli làm tế bào chủ để

tách dòng gen vì nó là sinh vật nhân sơ không có màng nhân bao bọc NST. Do

vậy các gen ở sinh vật nhân chuẩn không thể được biểu hiện được trong E.coli vì

môi trường khác với môi trường bình thường của sinh vật nhân chuẩn. Như vậy,

nếu chúng ta muốn sản xuất một loại protein nhân chuẩn trong một thí nghiệm

tách dòng thì khó có thể tin rằng E.coli mang ADN tái tổ hợp có thể sản sinh ra

protein có chức năng đầy đủ như protein nhân chuẩn mong muốn.

Các tế bào chủ nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các vi sinh vật nhân

chuẩn bậc thấp như nấm men, nấm mốc, tảo cho đến các tế bào sinh vật đa bào

phức tạp như động vật, thực vật.

a) Tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae)

Nấm men S.cerevisiae là vi sinh vật nhân chuẩn đơn bào (kích thước

khoảng 5 micromet) dễ nuôi cấy với quy mô lớn, có điểm khởi đầu (promotor)

mạnh và có plasmid dùng làm vector YAC biểu hiện gen, … S. cerevisiae có rất

nhiều đặc điểm phù hợp để người ta chọn làm tế bào chủ phù hợp nhất.

Ngoài ra các nấm men khác cũng được dùng làm tế bào chủ trong các thí

nghiệm tạo dòng gen như nấm mốc Aspergillus nidulans, Neurospora crassa

hoặc Pechia pastoris

b) Tế bào thực vật

Một số loại tế bào thực vật được sử dụng làm tế bào chủ thực vật trong

các phòng thí nghiệm thao tác gen. Tảo đơn bào, ví dụ như loài Chramydomonas

rainhardii có tất cả những đặc tính ưu việt của vi sinh vật cộng với cấu trúc và

chức năng của tế bào thực vật. Do vậy tảo đơn bào được sử dụng ngày càng

nhiều trong các thí nghiệm thao tác di truyền, trong công nghệ di truyền. Tuy

18

nhiên, người ta cũng còn dùng các tế bào thực vật nuôi cấy trong những môi

trường thích hợp có thể dùng làm tế bào chủ.

c) Các tế bào chủ động vật

Các tế bào động vật nuôi rất phức tạp, nhưng trong những điều kiện cần

thiết cho sự biểu hiện ra các protein có hoạt tính sinh học, người ta vẫn sử dụng

tế bào chủ động vật. Các loại tế bào chủ động vật bao gồm:

Tế bào thận của khỉ xanh Châu Phi.

Tế bào thận chuột đồng nhỏ.

Tế bào thận phôi người.

Tế bào tử cung chuột bạch.

Tế bào côn trùng để nuôi Baculovirus biểu hiện protein người.

Tế bào tuyến côn trùng Caenorhabditis elegans.

2.1.4 Tạo, tách và chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp

Hai yếu tố quan trọng trong công nghệ ADN tái tổ hợp là: khả năng sử

dụng các enzym để cắt nối các phân tử ADN invitro và hệ thống các tế bào vật

chủ để đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ nhằm nhân lên với một số lượng lớn

bản sao trong tế bào chủ. Mỗi tế bào chủ khi phân bào tạo nên một dòng tế bào

chứa bản sao của một gen cần thiết, đó là tách dòng gen (gene cloning). Một thí

nghiệm tách dòng phụ thuộc thuộc vào mục tiêu chủ đạo của thí nghiệm và

nguồn nguyên liệu dùng để tách chiết axit nucleic cho việc tách dòng.

2.1.4.1 Tạo plasmid tái tổ hợp

a) Tạo nguồn gen

Bước đầu của việc tạo plasmid tái tổ hợp là cần phải thu được nguồn gen.

Có ba loại phương pháp khác nhau để thu nhận gen:

Thu nhận ADN từ hệ gen ( thư viên ADN).

Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học.

Lập ngân hàng ADN bổ trợ (cADN).

b) Tạo plasmid tái tổ hợp

19

Khi có các đoạn ADN hay cADN mong muốn. Bước tiếp theo là gắn

chúng vào vector chuyển gen để tạo ra plasmid tái tổ hợp. Có nhiều phương

pháp gắn các đoạn ADN, hoặc cADN vào plasmid, hoặc các vector chuyển gen

khác.

Phương pháp dùng đầu dính.

Phương pháp dùng đoạn nối (linkers).

Phương pháp dùng enzym terminal transferase:

2.1.4.2. Tách dòng ADN tái tổ hợp

Sau khi plasmid tái tổ hợp,hoặc vector tái tổ hợp được tạo thành, bước

tiếp theo là biến nạp chúng vào tế bào chưa mang plasmid chứa gen lạ, ví dụ

biến nạp vào E.coli. Biến nạp được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác

nhau

Xử lý tế bào chủ nhận bằng hóa chất.

Phương pháp xung điện.

Phương pháp vi tiêm.

Phương pháp dùng súng bắn ADN.

Ngoài ra còn một số phương pháp khác đưa ADN vào tế bào chủ...

2.1.4.3 Chọn lọc dòng ADN đặc hiệu và biểu hiện gen

Sau khi biến nạp ADN (gen) vào tế bào chủ nhận thì ở trong tế bào nhận,

ADN biến nạp được nhân bản, từ đó chúng tạo ra được dòng ADN (gen). Bước

tiếp theo chúng ta cần kiểm tra, chọn lọc đúng dòng gen mong muốn và sau đó

tạo điều kiện cho gen biểu hiện.

a) Chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp đặc hiệu

Trong nhiều trường hợp, do sử dụng các loại enzym giới hạn khác nhau

nên tạo ra số lượng dòng ADN rất lớn, hoặc một loại enzym giới hạn có thể cắt

ra những đoạn gen không mong muốn. Trong khi đó nhà nguyên cứu lại chỉ

muốn tách một dòng ADN cụ thể đặc hiệu. Có 3 hướng chính để chọn lọc dòng

20

ADN là lai axitnucleic dùng mẫu ARN dò đặc hiệu, phát hiện bằng kiểu hình,

hoặc phát hiện bằng phản ứng miễn nhiễm tùy theo tính chất của dòng gen.

b) Biểu hiện của gen mong muốn

Muốn gen đã tạo dòng biểu hiện ra các protein cần phải có vector biểu

hiện mang đầy đủ yếu tố phiên mã và dịch mã. Đối với các dòng gen ở động vật

có vú tạo ra sản phẩm là các protein có hoạt tính sinh học, chúng ta cần với số

lượng lớn và có giá trị thương mại. Sự biểu hiện của các gen này trong tế bào

E.coli cần lưu ý một số nhân tố sau:

Số lượng bản sao của plasmid tái tổ hợp trong tế bào E.coli cần hợp lý.

Phải có khởi điểm (promotor) phiên mã mạnh.

Có trình tự thuận lợi cho ribosome bám khi khởi đầu dịch mã.

ADN tái tổ hợp có sự ổn định lâu dài trong E.coli.

Không có sự phân giải protein của các enzym trong tế bào chủ.

2.2. Ứng dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp

2.2.1. Ứng dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp đối với con người

2.2.1.1. Sản xuất vaccine tải tổ hợp

Vaccine được đưa vào cơ thể với mục đích làm tăng khả năng đáp ứng

miễn dịch, đặc biệt với các tác nhân gây bệnh si sinh vật. Những vaccine kinh

điển được sản xuất dựa trên vi khuẩn, virus đã bị chết hoặc độc lực của chúng bị

suy giảm để không gây bệnh. Tuy nhiên, những vaccine kinh điển này vẫn có

một tỷ lệ nhỏ tác hại không mong muốn cho người sử dụng. Vì vậy, vaccine thế

hệ mới sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để thu nhận vaccine có hoạt tính đặc

hiệu cao và đảm bảo an toàn. Công nghệ ADN tái tổ hợp được sử dụng vào sản

xuất vaccine gồm những bước cơ bản sau:

Đưa gen mã hóa kháng nguyên của vi khuẩn hoặc víu gây bệnh vào vector

biểu hiện có promoter mạnh; rồi đưa vector vào tế bào nhận. Tế bào nhận

có thể là prokaryot hoặc tế bào động vật nuôi cấy, thu nhận và tinh sạch

kháng nguyên từ những tế bào này để sản xuất vaccine.

21

Gây đột biến, hoặc loại bỏ các gen quy định độc tính của chủng vi khuẩn

hoặc virus gây bệnh. Nhờ đó những chủng đột biến không còn nguy hiểm

nhưng vẫn có khả năng tạo kháng nguyên đặc hiệu cao. Chúng được sử

dụng để sản xuất các vaccine.

Sau đây là một số thành tựu trong sản xuất vaccine đã đạt được:

Vaccine viêm gan A do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương bào chế.

Các nhà khoa học thuộc Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã nghiên cứu

xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vaccine viêm gan A và viêm gan B tái tổ

hợp đạt tiêu chuẩn quốc tế ở quy mô phòng thí nghiệm và trên thực địa lâm

sàng. Thành công này có ý nghĩa quan trọng khi có khoảng 10% người Việt

Nam nhiễm viêm gan B và 90% dân số đến độ tuổi 50-60 nhiễm viêm gan A. 

Công trình nghiên cứu trên do Phó Giáo Sư, Tiến sĩ khoa học Nguyễn Thu

Vân làm chủ nhiệm cùng với cộng sự của Tiến sĩ Ngô Thuỳ Anh và Tiến sĩ

Nguyễn Tuyết Nga. Họ đã sản xuất thành công 5 loạt vaccine viêm gan B tái tổ

hợp với số lượng là 20.000 liều ở quy mô phòng thí nghiệm, đạt các tiêu chuẩn

của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đề ra cho loại vaccine này. Đó là tính an toàn

(trong phòng thí nghiệm và trên thực địa lâm sàng), vô khuẩn, các thành phần

hoá học, các tính chất vật lý và công hiệu.

22

Để bào chế vaccine viêm gan A, nhóm nghiên cứu đã nuôi cấy tế bào thận

khỉ tiên phát Macacca mulatta. Trên thế giới hiện nay người ta dùng dòng tế bào

được gọi là tế bào thường trực, chi phí rất cao. Việt Nam có đảo khỉ ở Hòn Gai,

Quảng Ninh nên sử dụng tế bào thận khỉ giúp hạ giá thành mà hiệu quả lại tốt.

Còn đối với vaccine viêm gan B tái tổ hợp, các nhà nghiên cứu áp dụng công

nghệ gene, gài đặt thành công đoạn ADN mã hoá sinh tổng hợp HBsAg vào

vectơ (plasmid) và sau đó chuyển nạp vào tế bào nấm men Pichia pastoris. Sau

đó, họ nhân tế bào trong nồi lên men, có thể nhân lên bao nhiêu tuỳ ý, để chủ

động nguồn nguyên liệu. Tiếp theo là khâu tách kháng nguyên ra khỏi tế bào

nấm men, tinh khiết, bất hoạt, li tâm, lọc... để có kháng nguyên tinh khiết sản

xuất vaccine. 

Vaccine viêm gan B tái tổ hợp do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương sản xuất.

Tiến sĩ Nguyễn Thu Vân cho biết: ''Bộ Khoa học và Công nghệ tiếp tục

đầu tư để triển khai đề tài này thành 2 dự án: sản xuất vaccine viêm gan B tái tổ

hợp và vaccine viêm gan A với 100.000 liều/năm, sau đó sẽ đầu tư tiếp để mở

rộng sản xuất, đáp ứng nhu cầu trong nước. Đối với vaccine viêm gan B tái tổ

hợp, nhu cầu trong nưjớc rất lớn, phải nhập nhiều. Hy vọng là với công nghệ đã

23

phát triển được như thế này, chúng ta có thể sản xuất vaccine viêm gan B tái tổ

hợp với giá thành hạ hơn''.

Sản xuất vaccine viêm gan B tái tổ hợp trên tế bào nấm men P.pastoris tại

Việt Nam là khả thi, có giá trị về mặt thực tiễn và kinh tế hơn rất nhiều so với

việc phải nhập khẩu. Giá thành ước tính có thể chưa đến 10.000 VNĐ/liều cho

trẻ em, thấp hơn 3 lần vaccine nhập ngoại. Hiện chưa có vaccine viêm gan A của

nước ngoài tại thị trường Việt Nam bởi giá thành cao, khoảng 200.000

VNĐ/mũi và mỗi người phải tiêm 2 mũi. Nếu sản xuất được vaccine này trong

nước bằng công nghệ trên, giá thành giảm 10 lần, chỉ khoảng 20.000 VNĐ/mũi.

Tiến sĩ Nguyễn Thu Vân cho biết: ''Đây là công nghệ chúng tôi bắt đầu từ

đầu nên phải làm từ A đến Z, từ những khâu gọi là tạo ra chủng mới cho tới khi

tạo thành vaccine, có thể tiêm được cho người. Để có được quy trình công nghệ

này chúng tôi phải tự đọc tài liệu, tự tham khảo các quy trình công nghệ của một

số cơ sở mà họ đã sản xuất hai loại vaccine trên''.

Với những kinh nghiệm sẵn có trong việc phát triển vaccine mới, kỹ thuật

nắm được, trong vòng 4 năm, các nhà khoa học Việt Nam đã bào chế thành công

vaccine viêm gan A và viêm gan B tái tổ hợp, có hiệu quả tốt khi được đánh giá

và thử nghiệm trên thực địa lâm sàng. Vaccine viêm gan B tái tổ hợp đảm bảo

tính an toàn, không gây các tác dụng phụ. 95,39% số người được tiêm có đáp

ứng miễn dịch sau 3 mũi tiêm với hiệu giá kháng thể cao là 448mIU/ml (nồng độ

kháng thể đủ bảo vệ là 10mIU/ml). Công trình nghiên cứu đoạt giải nhì (không

có giải nhất) Giải thưởng sáng tạo KH-CN Việt Nam (VIFOTEC) 2002 trong

lĩnh vực sinh học phục vụ sản xuất và đời sống.

Từ khi xảy ra vụ dịch cúm gia cầm H5N1 tới nay có rất nhiều nước tham

gia nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh cúm H5N1 như Trung Quốc, Hàn

Quốc, Pháp, Úc, Việt Nam…, từ loại vaccine truyền thống (vaccine bất hoạt và

vaccine giảm độc lực), đến các loại vaccine thế hệ mới (vaccine virus tái tổ hợp;

24

các loại vaccine tiểu đơn vị như vaccine DNA, vaccine vector, vaccine protein

tái tổ hợp, split vaccine).  

 

Hình 1. Cấu trúc virus cúm A

Tuy nhiên, để kịp thời có vaccine tiêm chủng phòng bệnh cho vật nuôi thì

chiến lược sản xuất vaccine virus tái tổ hợp là một phương thức hiệu quả. Bằng

công nghệ di truyền ngược (reverse genetics), vaccine được tạo ra theo hệ

thống 8 plasmid (rescue plasmid system) mà nhóm tác giả Hoffmann và cộng sự

thực hiện năm 2002. Hai plasmid mang gene HA và NA bắt nguồn từ chủng

virus A/Vietnam/1203/04 (H5N1) mà Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến

cáo dùng làm vaccine. Và các gene còn lại (M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) từ

chủng virus cúm A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Gene HA được biến đổi di

truyềnđể làm giảm tính độc lực của virus cúm bằng cách cắt bỏ ba acid amin

Arginine (R), 1 acid amin Lysine (K) và thay thế 1 acid amin Lysine (K) bằng 1

acid amin Threonine (T), ở vị trí 327-328, vị trí phân cắt HA1 và HA2 của gene

HA, vị trí góp phần tính độc lực cao của virus cúm. Biến nạp 2 plasmid mang

gene HA và NA từ chủng A/Vietnam/1203/04 (H5N1) và  6 plasmid mang các

25

gene còn lại (M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) từ chủng virus cúm A/Puerto

Rico/8/34 (H1N1) vào tế bào nuôi cấy (phôi trứng gà, hoặc tế bào Vero, tế bào

MDCK,…). Virus tái tổ hợp này sẽ có đặc điểm kháng nguyên bề mặt giống với

chủng hoang dại A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Sau đó chọn lọc dòng virus tái tổ

hợp này làm vaccine phòng cúm H5N1.

  

Hình vẽ. Nguyên tắc tạo vaccine virus H5N1 tái tổ hợp và cơ chế loại bỏ độc

tính ở gene HA của chủng virus cúm H5N1

2.2.2.1. Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ và nâng cao

chất lượng cuộc sống

- Sản xuất kháng sinh: Nguồn kháng sinh trong tự nhiên được tìm thấy chủ

yếu trong vi sinh vật. Quá trình chọn lọc môi trường nuôi cấy cũng như sàng

lọc các chủng vi sinh vật cho kháng sinh đặc hiệu và có năng suất cao rất tốn

công sức và chi phí. Kỹ thuật tách dòng ADN cho phép tạo ra toàn bộ các

dòng gồm những gen tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh. Nhờ vậy,

chúng ta kiểm soát và điều chỉnh một cách chủ động toàn bộ quy trình sản

xuất kháng sinh ở quy mô công nghiệp.

26

- Sản xuất hoocmon: Một số bệnh di truyền gây ra do đột biến ở gen mã cho

hoocmon gây thiếu hụt hoocmon. Kỹ thuật gen đã phân lập cADN của những

gen mã cho các hoocmon đó và đưa chúng vào vector có promoter mạnh.

Vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào nhận; từ đó các protein tương ứng

được tách triết và tinh sạch.

- Sản xuất kháng thể đơn dòng: Kháng thể đơn dòng có rất nhiểu ứng dụng

trong chuẩn đoán và điều trị bệnh, đặc biệt là điều trị ung thư. Chúng ta có

thể phân biệt tế bào ung thư với tế bào lành nhờ kháng nguyên trên bề mặt tế

bào ung thư. Kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên được sản xuất

nhờ kỹ nghệ ADN tái tổ hợp. Kháng thể này được ghép nối với độc tố, hoặc

với đồng vị phóng xạ rồi được đưa vào cơ thể. Nhờ kháng thể chỉ liên kết đặc

hiệu với kháng nguyên trên bề mặt tế bào ung thư nên chỉ những tế bào này

bị tiêu diệt.

2.2.1.3. Chuẩn đoán mầm bệnh

Chuẩn bệnh truyền nhiễm: Hiện nay nhờ các kỹ thuật PCR, kỹ thuật lai

được áp dụng để xét nghiệm nhanh, chính sác sự có mặt của vi sinh vật gây

bệnh.

Chuẩn đoán các đột biến gen và tư vấn trước sinh: Các bệnh di truyền gây

ra do đột biến gen hầu hết là đột biến lặn và thường để lại hậu quả hết sức nặng

nề cho gia đìn và xã hội. Vì vậy, chuẩn đoán các đột biến gen ở giai đoạn thai

nhi sớm rất có ý nghĩa trong tư vấn di truyền trước sinh đối với các gia đình có

tiền sử bệnh.

2.2.1.4. Liệu pháp gen

Liệu pháp gen được hiểu là thay thế gen hỏng (gây bệnh) bằng gen lành.

Liệu pháp gen có thể thực hiện ở hai mức độ: thực hiện với tế bào soma (tế bào

sinh dưỡng) hoặc trên tế bào sinh dục.

Liệu pháp gen thực hiện với tế bào soma người được thực hiện lần đầu

tiên vào năm 1990. Một bé gái 4 tuổi mắc bệnh không có khả năng đáp ứng

27

miễn dịch do đột biến gen mã hóa cho enzym adenosine deaminase (ADA). Khi

không có gen này, tế bào lympho T bị chết do cơ chất tích tụ. Tế bào bạch cầu

của bé gái được nuôi cấy và nhận gen lành mã hóa cho enzym. Sau đó những tế

bào chuyển gen được truyền cho bé. Em bé này đã nhận dòng tế bào của chính

mình, những tế bào có khả năng tổng hợp enzym ADA. Nhờ đó khả năng đáp

ứng miễn dịch của bé gái trở nên bình thường.

Tiếp sau đó, nhiều bệnh nhân của căn bệnh này cũng được điều trị bằng

liệu pháp gen. Do thời gian sống của tế bào bạch cầu ngắn nên bệnh nhân phải

được truyền tế bào liên tục. Để khắc phục nhược điểm này, tế bào mầm tủy

xương được lấy ra từ bệnh nhân và được chuyển gen ADA. Sau đó những tế bào

mầm đã nhận gen được đưa trở lại bệnh nhân. Đây là những tế bào có khả năng

sản sinh ra các tế bào bạch cầu mới. Liệu pháp gen với tế bào mầm đã được áp

dụng thành công trong điều trị cho 2 bệnh nhi vào năm 1993. Cho đến nay Liệu

pháp gen đang là một biện pháp chữa bệnh thu hút sự chú ý của các nhà khoa

học…

2.2.2 Chuyển gen tạo các động, thực vật có năng suất chất lượng cao

2.2.2.1 Động vật chuyển gen

28

Chuột chuyển gen là động vật mô hình sử dụng trong nghiên cứu phục vụ

y học như tác dụng của thuốc, miễn dịch, cấy ghép tạng, tìm hiểu cơ chế gây

bệnh, các biện pháp gen…

Ngoài ra còn sử dụng một số động vật như bò, cừu, cá …Chuyển gen thể

hiện những tính trạng mong muốn như chất lượng thịt và sữa tốt, sản lượng lông

tăng cao, tăng trưởng nhanh…

Nhân bản thành công lợn mang gien người

Con lợn nhân bản mang gien người

Các nhà khoa học Hàn Quốc vừa nhân bản thành công một con lợn mang

gien người. Đây là một bước tiến lớn trong nỗ lực cấy ghép nội tạng lợn cho

người mà không gây biến chứng.

Theo TS Park Kwang-Wook, trưởng nhóm nghiên cứu, những con lợn

nhân bản này đã được chuyển gien để mang gien HLA-G của người. Gien HLA-

G sẽ giúp cơ quan nội tạng của lợn có cơ hội được chấp nhận cao hơn nếu được

ghép cho người.

Nhóm nghiên cứu đã nhân bản lợn bằng cách lấy tế bào từ một con lợn

lùn (loại lợn này được sử dụng để tạo cơ quan cấy ghép). Tiếp đến, họ tiêm gien

HLA-G vào tế bào rồi cấy tế bào vào tử cung của một con lợn cái. Kết quả là 5

29

con lợn chào đời bằng phương pháp mổ đẻ song chỉ có một con sống sót.

Đào thải miễn dịch là một trở ngại lớn trong cấy ghép nội tạng cho người. Hệ

miễn dịch của người tấn công các cơ quan được cấy ghép bởi nó coi những cơ

quan này là kẻ xâm nhập. Thường thì tiến trình đó được khống chế bằng cách

cho bệnh nhân uống thuốc chống thải ghép. Theo nhóm nghiên cứu, các tế bào

từ con lợn nhân bản nói trên sẽ làm giảm 60-70% sức mạnh tiêu diệt cơ quan cấy

ghép của các kháng thể người.

Con lợn đầu tiên mang gien HLA-G trên thế giới là sản phẩm của sự hợp

tác giữa Công ty MGenbio và Viện nghiên cứu chăn nuôi quốc gia Hàn Quốc.

Nhóm nghiên cứu cho rằng cần phải tiếp tục nghiên cứu để bổ sung thêm 3-5

gien miễn dịch nữa thì mới có thể làm cho cơ quan của lợn thực sự phù hợp với

người.

2.2.2.2 Thực vật chuyển gen

Thực vật chuyển gen thể hiện những tính trạng mong muốn như có năng

suất cao, có tính chống chịu sâu bệnh hay điều kiện môi trường (hạn, mặn…)

khắc nhiệt. Những gen quy định tính trạng này được phân lập từ vi sinh vật hay

thực vật khác loài và được đưa vào tế bào thực vật chủ yếu thông qua

Agrobacterium tumerfaciens. Ví dụ, các gen cry quy định tính kháng côn trùng

sâu bệnh phân lập từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis được chuyển vào nhiều loài

thực vật như bông, thuốc lá, khoai tây … tạo nên các giống có tính chống chịu

sâu bệnh cao.

Khoai tây chuyển gen (GM) áp dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp.

30

Khoai tây chứa vắc-xin.

Khoai tây chuyển đổi gien (GM), chứa vắc-xin ngừa viêm gan B, đã thúc

đẩy thành công khả năng miễn dịch trong các cuộc thử nghiệm lâm sàng đầu

tiên. Trong nghiên cứu, hơn 60% tình nguyện viên ăn khoai tây GM, tương

đương ba liều vắc xin. Kết quả là cơ thể họ tạo thêm một lượng lớn kháng thể

chống lại virus. Tình nguyện viên ăn khoai tây bình thường không sinh thêm

kháng thể. Tuy nhiên, do những người ăn sống khoai tây GM đã được tiêm vắc-

xin viêm gan B thông thường nên vắc-xin khoai tây chỉ tăng cường khả năng

miễn dịch của họ.Để tạo vắc-xin trong khoai tây, nhóm nghiên cứu do Charles

Arntzen thuộc ĐH Arizona (Mỹ) đứng đầu đã bổ sung vào cây khoai tây thông

thường một protein của virus viêm gan B. Khi con người ăn khoai tây này,

protein sẽ giúp hệ miễn dịch nhận ra và tiêu diệt mọi virus viêm gan B trong

tương lai.

Theo Arntzen, biến thực phẩm thành nguồn vắc-xin rẻ tiền rất hữu ích đối

với các nước nghèo vì không phải bỏ ra nhiều chi phí bảo quản lạnh hoặc mua

kim tiêm. Tuy nhiên, điều không may là các nhà phát triển dược phẩm đang từ

bỏ việc bào chế vắc-xin trong các loại thực phẩm cơ bản chẳng hạn như chuối,

cà chua và khoai tây. Nguyên nhân là họ lo ngại khả năng thực phẩm chứa vắc-

xin có thể bị lẫn vào thực phẩm trong siêu thị hoặc cửa hàng. Nếu điều này xảy

ra, hậu quả sẽ khôn lường.

Thay vào đó, các nhà bào chế thuốc đang tập trung vào sản xuất vắc-xin

trong lá cây ăn được song thực vật đó không được bán làm thực phẩm. Nhóm

nghiên cứu của Arntzen đang điều tra một số thực vật và hứa hẹn nhất là

Nicotiana benthamiana, họ hàng của cây thuốc lá. Lá được thu hoạch, rửa sạch,

nghiền rồi ướp lạnh-sấy khô để bảo quản trước khi đóng vào các viên con nhộng.

Ướp lạnh- sấy khô có nghĩa là vắc-xin tồn tại trong thời tiết nóng, không cần bảo

quản lạnh giống như vắc-xin thông thường. Ngoài ra, đóng vắc-xin thành viên

con nhộng đảm bảo liều lượng thống nhất. Martin Friede thuộc Tổ chức Y tế thế

31

giới (WHO) cho biết: ""Chúng tôi rất quan tâm tới phương pháp bào chế vắc-xin

dạng này và kết quả rất hứa hẹn. Tuy nhiên, vẫn chưa rõ liệu vắc-xin có an toàn

và hiệu quả đối với người hay không. Số người không phản ứng với vắc-xin

trong thực vật chuyển gien cao hơn nhiều so với vắc-xin thông thường.

Lúa chuyển gen được áp dụng nhờ kỹ thuật ADN tái tổ hợp.

Lai tạo giống lúa giàu chất dinh dưỡng từ công nghệ gen

Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long vừa công bố đã nghiên cứu ứng

dụng thành công công nghệ chuyển nạp gen tạo ra giống lúa mới giàu vi chất

dinh dưỡng từ 3 giống lúa IR64, MTL250 (indica) và Taipei 309

Như vậy, lần đầu tiên ở Việt Nam, các nhà khoa học ở Viện Lúa Đồng

bằng sông Cửu Long đã tạo bước đột phá khi ứng dụng thành công tạo ra giống

lúa giàu vi chất dinh dưỡng, ưu việt hơn so với các giống lúa truyền thống.

Tiến sĩ Trần Thị Cúc Hòa, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học của Viện,

cho biết đặc tính ưu điểm vượt trội của giống lúa mới này là có hàm lượng cao

các vi chất như Vitamine A, E, chất sắt, kẽm - những vi chất rất cần thiết đối với

con người. Ngoài ra, dòng lúa biến đổi gien còn gia tăng đáng kể chất oryzanol -

chất quan trọng hơn cả vitamin E có tác dụng chống ôxy hóa, giúp làm giảm

hàm lượng cholesterol trong máu.

Dòng lúa biến đổi gen này còn có các ưu điểm kháng sâu bệnh, đảm bảo

tính an toàn sinh học, dễ trồng, có thể đưa vào sản xuất lúa hàng hoá vì chúng

32

khắc phục được những khiếm khuyết về tính không ổn định thường gặp ở cây

biến đổi gien.

Theo Giáo sư-Tiến sĩ Bùi Chí Bửu, Viện trưởng Viện lúa Đồng bằng sông

Cửu Long, trước mắt giống lúa này sẽ được ứng dụng ở các vùng sâu, vùng xa,

các tỉnh thành trong khu vực và cả nước, giúp tăng chất lượng bữa ăn hàng ngày

trong cộng đồng chứ chưa

TÓM LẠI

Tóm lại, CNSH mà đỉnh cao là CNSH hiện đại đã và đang ngày càng tỏ ra

thực sự có ý nghĩa đối với con người

Nhận thức được tầm quan trọng có tính chiến lược của CNSH đối với sự

phát triển kinh tế - xã hội, giờ đây, hầu như mọi quốc gia trên thế giới đều đã

dành những khoản kinh phí rất lớn để đầu tư cho việc nghiên cứu - phát triển

lĩnh vực này. Những năm gần đây, trên thế giới, càng ngày có nhiều các trường

đại học, viện nghiên cứu, các trung tâm nghiên cứu - phát triển, các phòng thí

nghiệm về CNSH được nâng cấp và lập mới, với các trang thiết bị tiên tiến nhất,

hiện đại nhất; Đã có hàng ngàn kỹ sư, thạc sĩ, tiến sỹ có trình độ cao, tay nghề

vững được đào tạo mỗi năm, bổ sung kịp thời cho đội ngũ cán bộ làm công tác

nghiên cứu - phát triển lĩnh vực CNSH. Cùng với sự phát triển như vũ bão của

nhiều ngành khoa học, sự trợ giúp của các trang thiết bị nghiên cứu hiện đại và

xu hướng hội nhập, quốc tế hoá, toàn cầu hoá, hẳn là loài người sẽ có thể tiến

hành dễ dàng hơn, nhanh chóng hơn những nghiên cứu, thử nghiệm về lĩnh vực

CNSH ở qui mô rộng lớn hơn, phức tạp hơn. Đó là điều khẳng định. Và điều đó

cho phép chúng ta hoàn toàn có thể tin tưởng vào triển vọng phát triển và những

đóng góp tích cực hơn nữa của CNSH cho cuộc sống loài người trong tương lai

không xa …

33

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.Trịnh Đình Đạt, 2007. Công nghệ sinh học tập bốn công nghệ di truyền. Nxb Giáo dục, Hà Nội.

2.Lê Trần Bình (đồng tác giả), 1997. Công nghệ sinh học trong cải tiến giống cây trồng. Nxb Nông nghiệp.

3.Lê Đình Lương-Quyền Đình Thi, 2004. Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, Nxb ĐHQG Hà Nội.

4.Võ Thị Thương Lan, 2005. Sinh học phân tử, Nxb ĐHQG Hà Nội.5.Võ Thị Thương Lan, 2006. Sinh học phân tử tế bào và ứng dụng, Nxb

Giáo dục, Hà Nội.6.Chu Hoàng Mậu, 2005. Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử, Nxb

ĐHSP Thái Nguyên.7.Khuất Hữu Thanh, 2006. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, Nxb

ĐHBK Hà Nội.8.Phạm Thành Hổ, 2005. Nhập môn công nghệ sinh học. Nxb Giáo dục,

Hà Nội.9.Phạm Thành Hổ, 2004. Di Truyền Học. Nxb Giáo dục, Hà Nội.10. http://www.google.com.vn/11.http://www.vnn.vn/khoahoc/2003/3/5460/ 12.http://images.google.com.vn/imgres?imgurl=http://

sinhhocvietnam.com/vn13.www.3nha.com.vn/detail.aspx?param=10C5Z3JvdXB 14.http://images.google.com.vn ……

34