Laporan KULTUR JARINGAN

5/23/2018 Laporan KULTUR JARINGAN

1/51

1

I PENDAHULUANA Latar Belakang

Bioteknologi di bidang pertanian telah berkembang pesat, salah satu

contohnya adalah kultur jaringan. Kultur jaringan tanaman merupakan

teknik menumbuh kembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan atau organ

tanaman dalam kondisi aseptis secara in vitro. Ciri teknik ini adalah kondisi kultur

yang aseptis, penggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap, dan

kondisi lingkungan kultur yang sesuai. Lingkungan yang sesuai dapat dipenuhi

dengan menentukan media tumbuh yang sesuai dan penempatan pada kondisi yang

terkendali berkaitan dengan intensitas dan periodisitas, cahaya, temperatur, dan

kelembaban serta keharusan sterilisasi.

Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari

tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta

menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat

memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali (Sany, 2007).

Konsep awal dari kultur jarngan adalah diketahuinya kemempuan totipotensi dari sel

tumbuhan. Totipotensi sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki

potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi

menjadi tanaman lengkap.

Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus

dilakukan ditempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang

juga steril. Seperti disebutkan sebelumnya bahwa kondisi yang aseptic merupakan

syarat yang mutlak dalam tahapan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan.

Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur

jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha

sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur.


2/51

2

Tidak hanya terbatas pada peralatan, namun ruangan yang akan digunakan

pun harus dalam kondisi aseptic. Tujuan utama dari sterilisasi ruangan maupun

peralatan kultur pada dasarnya untuk menghindari kontaminasi oleh mikro organisme

yang ada di peralatan maupun di udara bebas sekitar ruangan. Perlakuan tersebut

mutlak dilakukan terutama pada ruang penabur atau tempat yang digunakan untuk

penanaman eksplan.

B TujuanTujuan dari acara ini adalah untuk meningkatkan ketrampilan mahasiswa

dalam melakukan sterilisasi peralatan dengan menggunakan autoklaf.


3/51

3

II TINJAUAN PRAKTIKUMSterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang

terdapat pada atau di dalam suatu benda. Sterilisasi basah dapat digunakanuntuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat tembus uap air dan tidak rusak bila

dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara 110-121. Sterilisasi yang umum

dilakukan dapat berupa:

a. Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang

dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah

atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas,

dipergunakan alat bejana/ruang panas (oven dengan temperatur 170180dan

waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas).

b. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan

alkohol,larutan formalin).

c. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat

pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah

dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalahmelakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah

mikroba).

Sterilisasi dengan autoklaf adalah salah satu metode sterilisasi dengan uap

air di bawah tekanan. Kapas penyumbat, kasa, perlatan laboratorium, plastik

penutup, peralatan gelas, penyaring, air, dan media nutrisi dapat disterilisasi dengan

autoklaf. Hampir semua mikroba mati bila terkena uap yang sangat panas dari

autoklaf selama 10-15 menit/ semua obyek hendaknya disterilisasi pada suhu 121C

dan tekanan 15 Psiselama 15-20 menit. (Torres, 1989).

Sebagai syarat mutlak suksesnya kultur jaringan tanaman, biasanya sterilisasi

dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Bahkan autoklaf juga dapat digunakan


4/51

4

untuk sterilisasi media tumbuh kultur jaringan. Tipe autoklaf yang dapat

digunakan untuk sterilisasi sangatlah beragam macamnya, mulai dari yang sederhana

sampai digital (terprogram) (Gunawan, 1988).

Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang

ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api

Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah

panas dari api. Kelemahan dari autoklaf ini adalah bahwa perlu adanya penjagaan dan

pengaturan panas secara manual dan terkontrol, selama masa sterilisasi dilakukan.

Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan, yaitu: lebih sederhana sederhana, harga

relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema

untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik

yang seukuran dan setaraf.

Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya

dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatis ini berjalan dengan

baik. Maka autoklaf dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain.

Kelemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan

persiapan media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakkan totalpada autoklaf. Sebagai sumber uap, juga berasal dari air yang ditambahkan ke dalam

autoklaf dan didihkan.

Biasanya untuk laboratorium komersial, menurut Gunawan (1988), diperlukan

autoklaf dengan kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah.

Autoklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam waktu sterilisasi serta waktu

pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai, temperatur dan tekanan

autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan dalam waktu 15-20 menit. Pada autoklaf

yang programmable (memiliki program yang dapat diatur), panas ini diatur secara

atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.


5/51

5

III MATERI PRAKTIKUM

A Alat dan BahanBahan dan peralatan yang digunakan pada acara praktikum ini antara

lain autoklaf, kompor serta gas, peralatan kaca/Glass ware (seperti botol

kultur, Erlenmeyer, petridish, gelas piala), peralatan penanaman /Dissecting

kit (seperti pinset, scalpel), aluminium foil, kertas paying, karet gelang, kertas

merang, kertas pembungkus,plastic seal.

B Prosedur Kerja1. Glass ware dandissesting kitdicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan air

lalu dikeringkan. Setel;ah kering mulut botol ditutup dengan aluminium foil

dan dieratkan dengan plastic seal (segel plastik). Pinset dan scalpel dibungkus

dengan kertas aluminium foil.

2. Glass ware dandissesting kit disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 120oCpada tekanan 17,5 psi selama 30 menit.

3. Selama proses sterilisasi berlangsung, autoklaf ditutup rapat sehingga tekanandidalam autoklaf naik. Tekanan tinggi tersebut dipertahankan selama 30 menit

dengan mengecilkan api, dilakukan selama tiga kali.

4. Kompor dimatikan setelah proses sterilisasi selesai katup dibuka untukmembuang uap air hingga tekanan 0 psi.

5. Autoklaf dibuka dan peralatan yang disterilisasi diambil.6. Peralatan disimpan di tempat yang bersih.


6/51

6

IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A HasilNo. Nama Alat Gambar Keterangan

1 Autoclave Alat sterilisasi

peralatan dan media

kultur jaringan

2 TimbanganAnalitik

Untuk menimbangbahan dalampembuatan media

kultur jaringan

3 pH Meter Untuk mengukurpH media kultur

jaringan

4 Magnetik Stirer Untuk mengaduk

larutan dan

memanaskanlarutan

5 Botol Kultur Untuk tempat

menanam eksplan


7/51

7

6 LAF Untuk tempat

penanaman eksplan

7 Gelas ukur Untuk mengukursuatu larutan

8 Erlenmeyer Untuk menampung

larutan

9 Seal Untuk merekatkan

alumunium foilpada botol kultur

10 Pipet Untukmemindahkanlarutan

11 Suntikan Untukmemindahkan

larutan dengan

skala yang kecildan terukur


8/51

8

12 Pembakar Bunsen Untuk sterilisasi

eksplan dan alat

13 Petridish Untuk meletakaneksplan yang akar

di kultur

14 Pinset Untuk mengambil

eksplan

15 Pengaduk Kaca Untuk mengaduk

larutan dalampembuatan media

kultur

16 Sarung Tangan(Gloves)

Untuk melindungitangan dari panas

17 Karet Gelang Unttuk mengikatalat-alat yang akan

disterilkan


9/51

9

18 Aluminium foil Untuk menutup

botol kultur

19 Beker Glass Untuk tempat

membuat

media/tempat

melarutkan larutan

20 Kertas Payung Untukmembungkus alat-alat yang akan di

sterilisasi

B PembahasanSterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus

dilakukan ditempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yangjuga steril. Seperti disebutkan sebelumnya bahwa kondisi yang aseptic merupakan

syarat yang mutlak dalam tahapan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan.

Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur

jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha

sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur.

Autoclave adalah alat yang digunakan untuk sterilisasi media mikrobiologi,

peralatan gelas laboratorium dan dekontaminasi atau membunuh bakteri. Pada

prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air.

Temperature sterilasi biasanya 1210C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5

psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume


10/51

10

dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit

tergantung dari volume bahan yang disterilkan.

Prinsip kerja autocalve:

oProses Sterilisasi pada Autoclave adalah memanfaatkan panas dan tekananuap dalam chamber.

oPanas dan tekanan tersebut dihasilkan oleh pemanasan elemen di dalamchamber yang dikondisikan menjadi hampa udara.

osemakin besar setting waktu dan suhu yang digunakan maka semakin besartekanan yang dihasilkan dalam chamber sehingga proses sterilisasi akan lebih

cepat selesai.

oTetapi dalam proses sterilisasi sudah ditentukan besarnya suhu dan lamanyawaktu sterilisasi, tergantung pada hasil kualifikasi nya dan dari setiap bahan /

alat yang akan disterilkan.

Adapun cara kerja yang baik dalam menggunakan autocalve antara lain,

sebagai berikut :

oSebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jikaair kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas

tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya

kerak dan karat.

oMasukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol bertutup ulir, makatutup harus dikendorkan.

oTutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak adauap yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkanterlebih dahulu.

oNyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu121oC.


11/51

11

oTunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemenautoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman

ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu

15dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm.

oJika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartementurun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure

gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan

keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.

Bagian-bagian autoklaf :

1. Panci luar.

2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap.

3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.

4. Katup pengeluaran uap.

5. Pengunci atau klem.

Komponen-komponen utama autoclave :

1. Pressure Gauge (Pengukur Tekanan Gas/Uap) ; tekanan yang disarankan

1,05-1,2 kg/cm2

2. Thermometer (Pengukur Suhu) ; suhu yang disarankan 121o-125

oC

3. Exhaust Valve

a. Saat sterilisasi dimulai, valve dinuka sampai ada uap air yang keluar danmenetes kemudian valve ditutup, tujuannya untuk kesempurnaan

sterilisasi (pada saat velve dibuka gas/udara yang tidak steril keluar)

b. Setelah sterilisasi selesai (tekanan menunjukan angka 0), valve dibukakembali untuk mengeluarkan gas/uap yang tersisa

4. Automatic Pressure Regulating Valve (Sefety Valve) ; menjaga tekanan

uap/gas tetap pada tekanan yang disarankan


12/51

12

Alat-alat logam dan gelas yang digunakan pada saat penanaman dapat

disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga

disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator ataupun

pembakar bunsen.

Menurut Anonim (2009), khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan

dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila

dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya

dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

Sebelum dimasukkan petridish, pisau scalpel , pinset, dan alat-alat yang lain

(alat-alat logam dan gelas) terlebih dahulu dibungkus dengan kertas agar tidak kontak

langsung dengan uap air autocalve. Petridish akan mudah rusak (pecah) jika

mengalami kontak langsung dengan uap air yang panas. Sedangkan alat-alat seperti

pisau scalpel dan pinset akan mudah berkarat jika berkontak langsung dengan uap air.

Bagian yang ada tulisan dari kertas pembungkus harus diletakkan di bagian luar agar

tinta yang larut nanti tidak mengotori alat yang ada di dalamnya.

Peralatan Kultur Jaringan

o Cawan petri: Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi)mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan

bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran,

diameter cawanyang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak

15-20 ml,sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media

sebanyak 10 ml.

o Botol kul tur: Umumnya botol-botol kultur terbuat dari bahan yang tahan panas. Syaratbotol kultur adalah dasarnya lebar dan mulutnya kecil, karena mulut botol yang lebar

memungkinkan kontaminasi yang lebih besar. Sama seperti glassware yang lain

sterilisasi botol kultur dengan autoclave tetapi sebelumnya dicuci bersih dengan deterjen

dan dikeringkan. Ketika dimasukkan ke dalam autoclave mulut botol kultur ditutup

dengan plastik dan diikat dengan karet gelang.


13/51

13

o Alumunium foil: adalah Alumunium foil lembaran aluminium tipis yang dapatdipakai untuk berbagai macam aplikasi memasak ataupun lainnya. Salah satu

keuntungan dari menggunakan aluminium foil adalah karena sifatnya yang dapat

digunakan kembali hingga beberapa kali. Di dalam kultur jaringan aluminium foil

berfungsi untuk menutup botol kultur.

o Seal : Seal digunakan untuk menutup botol kultur atau botol ukur. Tujuannyaadalah untuk meminimalisir masuknya kontaminan ke dalam botol kultur atau

bisa juga untuk mencegah bahan-bahan atau larutan dalam botol tumpah.

o Kertas payung: Kertas ini digunakan untuk membungkus alat alat kultur danpetridish sebelum disterillisasikan.

oKaret gelang: Karet gelang digunakan sebagai pengikat penutup botol yakniplastik atau juga untuk mengikat kertas pembungkus petridish dan dissecting kit

selama proses sterilisasi dengan autoclave.

o Suntikan: Jarum injeksi digunakan untuk mengambil larutan stok dalampembuatan media atau untuk memasukkan larutan (enzim) dalam pekerjaan

isolasi protoplas ataupun untuk keperluan lain. Jarum injeksi ada dua macam

yaitu yang terbuat dari plastik dan yang terbuat dari kaca. Jarum injeksi ada yang

dapat disterilisasi dengan autoclave ada juga yang dengan mengganti jarum

suntiknya.

o Scalpel:scalpel atau pisau dalam kultur jaringan digunakan untuk mengiris ataumemotong eksplan. Scalpel ada dua macam yaitu scalpel biasa yang dapat dipakai

seterusnya (selalu disterilkan dengan autoclave) dan scalpel blits. Scalpel jenis

blits mata pisaunya dapat dipasang menurut ukuran yang dikehendaki.

Tangkainya dapat disterilkan dengan autoclave sedangkan mata pisaunya hanya

sekali dipakai. Scalpel blits digunakan untuk mengiris bahan isolasi protoplas

karena membutuhkan irisan yang sangat tipis (Daisy dan Ari, 2002).

o pH meter : pH meter yang dipakai pada praktikum kali ini menggunakan pHmeter otomatis. Pengukuran pH media, ujung sensor dimasukkan ke dalam

larutan media, pada monitor akan muncul nilai pH media. Tinggal kita tambahkan

NaOH jika terlalu asam dan HCl jika terlalu basa.


14/51

14

o Gelas ukur:Berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labuerlenmeyer, gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya.

Pada saat mengukur volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan

berdasarkan meniskus cekung larutan.

o Er lenmeyer :Alat ini digunakan dalam kultur jaringan tanaman sebagai saranamenuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan.

o Laminar Ai r F low Cabinet (LAFC): Alat ini letaknya di ruang penabur, yaituruang yang selalu harus dalam keadaan steril. Alat ini digunakan sebagai tahap

perlakuan penanaman.

o Shaker (penggojok) : Merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diaturmenurut kemauan kita.

o Sarung tangan: Sarung tangan adalah sejenispakaian yang menutupitangan,baik secara sebagian ataupun secara keseluruhan. Fungsi sarung tangan ialah

untuk melindungi sang pemakai dari pengaruh lingkungan sekitarnya atau

melindungi lingkungan sekitar dari tangan sang pemakai.

o Timbangan Analitik :jenis alat ini bermacam-macam, tetapi yang penting adalahtimbangan yang dapat dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang sangat

keil. Alat ini berfungsi sebagai alat untuk menimbang bahan-bahan kimia yang

digunakan untuk kultur jaringan.

o Stirer : Alat ini berfungsi untuk menggojok dengan pemanas. Denganmenggunakan listrik, alat ini berfungsi sebagai kompor di samping sebagai

penggojok.

o Pembakar spir itus: Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisiyang steril adalah pembakar spiritus. Api yang menyala dapat membuat aliran

udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut

terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang

lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang

berwarna biru (paling panas). Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar

gas atau metanol.
http://id.wikipedia.org/wiki/Pakaianhttp://id.wikipedia.org/wiki/Tanganhttp://id.wikipedia.org/wiki/Tanganhttp://id.wikipedia.org/wiki/Pakaian


15/51

15

o Tabung Reaksi: Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan untuk uji-ujibiokimiawi dan menumbuhkan mikroba. Tabung reaksi dapat diisi media padat

maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik

atau aluminium foil. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur

menjadi 2 bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak ( deep tube agar )

dan agar miring(slants agar ). Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan

tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak

terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat

dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alas an

efisiensi, media yang ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung.

oPipet Tetes: Fungsinya sama dengan pipet ukur yaitu digunakan untukmemindahkan suatu cairan atau larutan, namun volume yang dipindahkan tidak

diketahui. Salah satu penerapannya adalah dalam menambahkan HCl / NaOH

saat mengatur pH media, penambahan reagen ada uji biokimia, dll.

o Autoclave: Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat danbahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air

panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 psi atau sekitar 2

atm dandengan suhu 121oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh

permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi 2(15 psi = 15 pounds per square inch).

Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC.

1. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau

aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan aluminium foil).

Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang autoclave, jangan tutup terlalu

kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian.

2. Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting,

gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong, jarum dan pipet.

3. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh

dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum


16/51

16

dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai

pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat

sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan

kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap

sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.

4. Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas

merang.

5. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan alat-alat

yang akan digunakan untuk menanam eksplan, adalah 121pada tekanan 15

psi (pound per square inch) atau 1 atm selama 30-60 menit. Penghitungan

waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan dan temperatur yang diinginkan

tercapai.

Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari

uap air. Temperature sterilasi biasanya 121, tekanan yang biasa digunakan antara

15-17,5 psi( pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari

volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-

40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang

terlalu lama menyebabkan :

1. Penguraian gula.

2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.

3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.

4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.

( Lydiane Kyte & John Kleyn. 1996 : 169).


17/51

17

Suhu sterilisasi yang disarankan adalah 121C, hal ini dikarenakan suhu

tersebut merupakan suhu kritis, dimana seluruh bentuk kontaminan tidak dapat

bertahan hidup/mati. Sedangkan khusus untuk lama sterilisasi sifatnya disesuaikan

dengan volume media yang disterilisasi dan besarnya suhu yang diinginkan,

Semakin banyak volume media maka semakin lama masa sterilisasinya. Biasanya

untuk lama sterilisasi 20 menit, volume media yang digunakan berkisar 20-30

ml/botol atau 70-100ml/cup plastik atau 1 liter botol Schoolt atau 4 liter botol

Erlenmeyer.

V SIMPULAN DAN SARAN


18/51

18

A SIMPULAN Berdasarkan data hasil pengamatan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa

sterilisasi peralatan kultur dilakukan sebagai salah satu syarat utama

suksesnya kegiatan kultur jaringan yang perlu diterapkan dengan sungguh-

sungguh, salah satunya dengan menggunakan autoclave pada suhu 1210C

pada tekanan 15-17,5 psi. selama 30 menit. Beberapa peralatan yang di

sterilisasi menggunakan autoklaf antara lain botol kultur, petridish,

Erlenmeyer, aluminium foil, scalpel, dan pinset.

Bagian-bagian autoklaf :1. Panci luar.

2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap.

3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.

4. Katup pengeluaran uap.

5. Pengunci atau klem.

Alat-alat logam dan gelas yang digunakan pada saat penanaman dapatdisterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat jugadisterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator

ataupun pembakar bunsen. Khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan

dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila

dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya

dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan

kaporit.

B SARANSterilisasi alat harus dilakukan sesuai prosedur dan teliti agar tidak terjadi

kontaminasi


19/51

19

I PENDAHULUAN

A Latar BelakangKultur jaringan tanaman merupakan bagian suatu teknik perbanyakan

vegetatif nonkonvensional. Perbedaan teknik ini dibandingkan dengan teknik

perbanyakan vegetative konvensional biasanya terletak dalam situasi dan lokasi yang

berbeda. Penerapan teknikkultur jaringan tanaman mensyaratkan kondisi di dalam

ruangan (laboratorium) dan sifatnyaaseptik (steril dari patogen). Bermuara dalam

kondisi yang aseptic, maka perlu dijelaskan bahwa segala aktifitas yang berkaitandengan jaringan harus dalam kondisi aseptik. Kondisi ini dimulai dari cara:

1. Penyiapan peralatan (alat tanam berbahan logam ataupun gelas).

2. Pembuatan media penanaman.

3. Penanaman (inisiasi dan pemilihan: a. perbanyakan; b.perakaran).

Selain peralatan kultur jaringan, media merupakan salah satu factor utama

dalam keberhasilan kultur. Media kultur jaringan tanaman harus berisi semua zat

yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan yang ditanam. Media kultur

jaringan memiliki karakteristik masing-masing. Artinya tidak semua media dapat

digunakan pada semua kultur tanaman. Karena beberapa media yang ada memiliki

perbedaan kandungan dan konsentrasi zat-zat yang diperlukan atau digunakan pada

kultur.

Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.

Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur

jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur

jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan

serta bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu, berbagai komposisi media kultur


20/51

20

telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan

tanaman yang dikulturkan. Media kultur fisiknya dapat berbentuk padat atau cair.

Media berbentuk padat menggunakan pemadat media seperti agar. Media kultur

yang memenuhi syarat adalah yang mengandung nutrient makro dan mikro dalam

kadar dan perbandingan tertentu, sumber energi (sukrosa), serta mengandung

berbagai macam vitamin dan ZPT.

B TujuanPraktikum ini bertujaun untuk:

1.

Mengetahi dan mempraktikan cara membuat larutan stok2. Mengetahui dan mempraktikan cara membuat medium MS (Murashige &

Skoog)

3. Melakukan sterilisasi medium


21/51

21

II TINJAUAN PRAKTIKUMMedia kultur jaringan merupakan faktor penting penentu

keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Media tanam harus berisisemua zat yang diperlukan untuk menjamin kebutuhan eksplan. Bahan-bahan yang

diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula,

protein, vitamin, dan hormon tumbuhan. Berhasilnya kultur jaringan banyak

ditentukan selain kondisi aseptic juga oleh media tanam. Campuran media yang satu,

dapat cocok untuk jenis tanaman tertentu, tetapi dapat kurang cocok untuk jenis

tanaman yang lain.

Dalam kultur jaringan, unsur-unsur diberikan tidak dalam bentuk unsure

murni, tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum dicampurkan kedalam

media tumbuh, garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulu dilarutkan dalam

konsentrasi tertentu, sehingga dalam media tumbuh nantinya jumlah tiap gram benar

sesuai dengan ketentuan sebagai pelarut dipakai akuades (Rahardja, 1995)

Faktor-faktor yang perlu diperhatikan untuk keberhasilan kultur jaringan yaitu

bahan sterilisasinya, kandungan unsur kimia dalam media, hormon yang digunakan,

substansi organik yang ditambahkan dan terang atau gelapnya saat inkubasi. Dari

sekian banyak permasalahan yang harus diteliti dan diperhatikan adalah komposisi

media tumbuh pada kultur jaringan karena sangat besar pengaruhnya terhadap

pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya (Daisy 1994).

Teknik aseptik merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam kutur jaringan.

Keaseptikan harus dijaga dalam proses pengkulturan, selain itu juga termasuk

sterilisasi bahan tanaman (eksplan). Pada tahap ini dilakukan berbagai perlakuan

untuk membersihkan kotoran yang ada di permukaan bahan tanaman (disinfestasi).

Selain itu, zat pengatur tumbuh adalah senyawa organik bukan hara yang dalam

jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi

tanaman. (Prawitasari 2005)


22/51

22


A Alat dan Bahan1 Bahan: Media MS

a. Unsur hara makro :

- KNO3 = 1.900 mg/l

- NH4NO3 = 1.650 mg/l

- CaCl2.2H2O = 440 mg/l

- MgSO4.7H2O = 370 mg/l- KH2PO4 = 170 mg/l

b. Unsur hara mikro :

- MnSO4.4H2O = 22,3 mg/l

- ZnSO4.7H2O = 8,6 mg/l

- MoBO3 = 6,2 mg/l

- KI = 0,83 mg/l

- Na2MoO4.2 H2O = 0,25 mg/l

- CuSO4.5H2O = 0,025 mg/l

c. Besi :

- FeSO4.7H2O = 27,8 mg/l

- Na2-EDTA.2H2O = 37,3 mg/l

d. Vitamin :

- Mio-inositol = 100 mg/l

- Thiamin HCl = 0,1 mg/l

- Asam nikotinat = 0,5 mg/l

- Piridoksin HCl = 0,5 mg/l

- Glisin = 2 mg/l

e. ZPT :

- Sitokinin = 1 mg/l


23/51

23

- Auksin = 1 mg/l

f. Bahan pemadat : agar = 7 g/l

g. Sukrosa = 30 g/l

h. KOH atau NaOH = 1 M

i. HCl = 1 M

2 Alat:a. Tabung erlenmeyer h. Timbangan analitik

b. Gelas ukur i. Botol kultur

c. Pipet j. Otoklaf (autoclave)

d. Pengaduk kaca k. Aluminium foil

e. Magnetic stirrer l. Karet gelangf. Kompor m. Kertas payung

g. pH meter

B. Cara Kerja

1 Pembuatan larutan stoka. Larutan stok A, merupakan larutan unsur hara makro, dibuat 10 kali dilarutkan

dalam 1000 ml aquades.

b. Larutan stok B, merupakan larutan hara mikro, dibuat 1000 kali dalam 100 ml

aquades.

c. Larutan stok C, merupakan campuaran FeSO4.7H2O dan Na-EDTA, dibuat 100

kali dan dilarutkan ke dalam 200 ml aquades.

d. Larutan stok D, merupakan larutan vitamin kecuali mio-inositol, dibuat 100 kali

ke dalam 200 ml aquades.

e. Larutan stok E, merupakan larutan mio-inositol, dibuat 100 kali dan dilarutkan

ke dalam 100 ml aquades.

f. Larutan Stok F, merupakan larutan ZPT, dibuat 100 kali dilarutkan ke dalam

500 ml aquades.


24/51

24

2 Pembuatan Medium Kultura. Aquades sebanyak 500 ml disiapkan di dalam erlenmeyer berukuran 1000 ml.

Untuk pembuatan 1 liter medium, ditambahkan stok A 100 ml, stok B 5 ml,

stok C 50 ml, stok D 50 ml, stok E 2 ml dan stok F : IAA (air kelapa) 15 ml.

b. Sukrosa ditimbang sebanyak 30 gram dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer

sambil diaduk.

c. Aquades ditambahkan samapai volumenya 1000 ml.

d. pH larutan diukur menggunakan pH meter elektrik hingga mencapai pH yang

dibutuhkan yaitu 5,75,8. Jika terlalu asam tambahkan NaOH atau KOH 1 M,

dan jika terlalu basa tambahkan HCl 1 M.e. Sebanyak 7 gram agar-agar ditambahkan ke dalam larutan, lalu dpanaskan

sampai mendidih sambil diaduk-aduk.

f. Medium dituangkan ke dalam botol sekitar 20 ml.

g. Botol ditutup menggunakan aluminium foil dan seal.

3 Sterilisasi Mediaa. Botol kultur yang sudah berisi medium dimasukkan ke dalam autoclavedengan

tekanan 15 - 17,5 psi pada suhu 120oC selama 20 menit, sampai tiga kali.

b. Botol diangkat dan disimpan dalam ruang inkubasi sampai siap digunakan.

c. Medium siap digunakan.


25/51

25

IV HASIL DAN PEMBAHASANA HasilMedia MS

B PembahasanPembuatan media harus berdasarkan perhitungan konsentrasi yang tepat.

Karena akan mempengaruhi keberhasilan tumbuh eksplan. Media yang digunakan

merupakan media Ms (Murashige dan Skoog). Pada proses pembuatannya, unsure

makro diencerkan sebanyak 5 kali, unsure mikro 100 kali, stok Fe 200 kali, vitamin

10 kali, ZPT 100 kali. Ditambakan pula sukrosa yang bertujuan untuk memberikan

bahan baku metabolisme eksplan karena eksplan beum mampu menghasilkan asimilat

seperti tumbuhan pada umumnya. Selanjutnya ditambahkan pemadat berupa agar

swallow untuk memadatkan media.

Pada umumnya komposisi utama media tanam kultur jaringan, terdiri dari

hormon (zat pengatur tumbuh) dan sejumlah unsur yang biasanya terdapat di dalam

tanah yang dikelompokkan ke dalam unsur makro dan unsur mikro. Hasil yang lebih

baik akan dapat kita peroleh bila, kedalam media tersebut, ditambahkan vitamin,

asam amino, dan hormon, bahan pemadat media (agar), glukosa dalam bentuk gula

maupun sukrosa, air destilata (akuades), dan bahan organik tambahan (Gunawan,

1988).

o Gula digunakan sebagai sumber energi dalam media kultur, karena umumnyabagian tanaman atau eksplan yang dikulturkan tidak autotrof dan mempunyai

laju fotosintesis yang rendah. Oleh sebab itu tanaman kultur jaringan

membutuhkan karbohidart yang cukup sebagai sumber energi. Menurut

Gautheret dalam Gunawan (1992), sukrosa adalah sumber karbohidrat

penghasil energi yang terbaik melebihi glukosa, maltosa, rafinosa. Namun

jika tidak terdapat sukrosa, sumber karbohidrat tersebut dapat digantikan


26/51

26

dengan gula pasir. Gula pasir cukup memenuhi syarat untuk mendukung

pertumbuhan kultur. Selain sebagai sumber energi, gula juga berfungsi

sebagai tekanan osmotik media.

o Asam amino merupakan sumber N organik. Asam amino yang seringdigunakan adalah glutamine, asparagin, sistein, dan glisin.

o Vitamin berfungsi sebagai katalisator dalam system enzim dan diperlukandalam jumlah kecil. Vitamin yang dibutuhkan pada sebagian besar kultur

jaringan tumbuhanadalah thiamin, yang diberikan dalam bentuk Thiamin-

HCl. Vitamin lain yang biasa digunakan adalah asam nikotinat dan piridoksin

HCl (vitamin B6).

Pembuatan larutan stok pada dasarnya ditujukan untuk menyediakan bahan-

bahan yang diperlukan pada pembuatan media dengan konsentrasi yang tepat. Karena

media-media yang digunakan pada kultur jaringan diperlukan unsure-unsur dengan

konsentrasi yang sangat kecil. Karena tidak dimungkinkan menimbang unsure dengan

konsentrasi yang sangat kecil, maka dibuat lah larutan stok dengan menggunakan

konsep kalibrasi, sehingga pada pembuatan media, unsure-unsur tersebut dapat

digunakan seusia dengan konsentrasi yang diinginkan (Sriyanti, 2002).

Selain media MS yang digunakan, terdapat pula beberapa jenis media lain,

diantaranya (Raharja, 1995):

1. Heler2. White3. Nitsch & Nitsch4. Hildebrandt, Riker dan Duggar5. Gautheret6. Knudson7. VAcin dan Went8. Miller9. Linsmaier & Skoog


27/51

27

10.Gamborg11.Murashige & Skoog12.White, diperkaya dengan fosfat dan diperkuat dengan senyawa organic

seumber N serta asam amino.

Media nomor 1 sampai dengan nomor 5 adalah media dasar yang hanya berisi

unsure makro dan unsure mikro. Untuk keperluan kultur jarigan, media tersebut

masih perlu ditambahkan bahan pelengkap berupa asam amino, vitamin, gula dan

hormone tumbuhan. pH disesuaikan sehingga nilainya berkisar sekitar 5,6. Bahan-

bahan lain yang dapat ditambahkan sebagai pelengkap misalnya ekstrak tauge,

ekstrak ujunga kecambah jagung dan air kelapa muda (Raharja, 1995).

Beberapa media dasar yang banyak digunakan antara lain media dasar

Murashige dan Skoog (1962) yang dapat digunakan untuk hampir semua jenis kultur,

media dasar B5 untuk kultur sel kedelai dan legume lainnya, media dasar White

(1934) sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat, media dasar Vacin dan Went

(1949) digunakan untuk kultur jaringan anggrek, media dasar Nitsch dan Nitsch

(1969) digunakan dalam kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel, media

dasar Schenk dan Hildebrandt (1972) untuk kultur jaringan tanaman monokotil,

media dasar WPM (Woody Plant Medium, 1981) khusus untuk tanaman berkayu,

media dasar N6(1975) untuk serealia terutama padi. Untuk eksplan dari tanaman

keras sering menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim

(sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Medium Kundson C

cocok untuk menanam eksplan kelapa kopyor dan anggrek. Dari sekian banyak media

dasar di atas, yang paling banyak digunakan adalah media Murashige dan Skoog

(MS).

Keasaman pH adalah nilai derajat keasaman atau kebasaan dari larutan dalam

air. Keasaman (pH) suatu larutan menyatakan kadar dari ion H dalam larutan. Nilai di

dalam pH berkisar antara 0 (sangat asam) sampai 14 (sangat basa), sedangkan titk

netral adalah pH pada 7. Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur


28/51

28

jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH

5,0-6,0. Bila eksplan mulai tumbuh, pH dalam lingkungan kultur jaringan tanaman

umumnya akan naik apabila nutrein habis terpakai. Pengukuran pH dapat dilakukan

dengan menggunakan pH meter, atau bila menginginkan yang lebih praktis dan

murah dapat digunakan kertas pH. Bila ternyata pH medium masih kurang normal,

maka dapat ditambah KOH 1-2 tetes. Sedangkan apabila pH melampaui batas normal

dinetralkan dengan penambahan HCL.

Menurut Gamborg dan Shyluk (1981) dalam Gunawan (1988), sel-sel

tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5,55,8. Pengaturan pH,

biasa dilakukan dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH)

atau HCL pada waktu semua komponen sudah dicampurkan .

Faktor pH dalam media juga perlu mendapat perhatian khusus. pH tesebut

harus diatur sedemikian rupa, hal ini ditujukan agar tidak mengganggu fungsi

membran sel dan pH dari sitoplasma, sehingga media yang dibuat sesuai dengan

kondisi yang menjadi syarat untuk tumbuhnya eksplan dalam kultur jaringan. Selain

itu, jika pH lebih tinggi dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH

kurang dari 5.2, agar tidak dapat memadat. Pengaturan pH selain memperhatikan

kepentingan beberapa fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor:

o Kelarutan dari garam-garam penyusun media.o Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garamgaram lain.o Efisiensi pembekuan agar-agar.

Bahan pemadat media yang paling banyak digunakan adalah agar-agar. Agar-

agar adalah campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae. Dalam

analisa unsur, diperoleh data bahwa agar-agar mengandung sedikit unsur Ca, Mg, K,

dan Na (Debergh, 1982 dalam Gunawan, 1992). Keuntungan dari pemakaian agar-

agar adalah :


29/51

29

o Agar-agar membeku pada suhu 45 C dan mencair pada suhu 100C sehinggadalam kisaran suhu kultur, agar-agar akan berada dalam keadaan beku yang

stabil.

o Tidak dicerna oleh enzim tanaman.o Tidak bereaksi dengan persenyawaan - persenyawaan penyusun media.

Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan

perbanyakantanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah

diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman

yang dikulturkan. Contohnya komposisi Knudson C (1946), Heller (1953), Nitsch

dan Nitsch (1972),Gamborg dkk B5 (1976), Linsmaier dan Skoog-LS (1965),

Murashige dan Skoog MS(1962) serta woody plant medium-WPM (Lloyd dan Mc

Known, 1980). Komponen media kultur yang lengkap dan yang harus diperhatikan

dalam pembuatan media kultur adalah sebagai berikut :

o Air distilata (akuades) atau air bebas ion sebagai pelarut atau solven.o Hara-hara makro dan mikro.o Gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energy.o Vitamin, asam amino dan bahan organic lain.o Zat pengatur tumbuh.o Suplemen berupa bahan-bahan alami, jika diperlukan.o Agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media.( Endang Yuniastuti. 2008: 5)

Untuk memenuhi factor pertumbuhan tanaman, maka factor factor yang

harus diperhatikan dalam pembuatan media kultur jaringan yang baik adalah media

yang mengandung:

1. Hara anorganik. Ada 12 hara mineral yang penting untuk pertumbuhan

tanaman dan beberapa hara yang dilaporkan mempengaruhi pertumbuhan in

vitro. Untuk pertumbuhan normal dalam kultur jaringan, unsur unsur

penting ini harus dimasukkan dalam media kultur. Perbandingan 5 media pada

Tabel 12.1 memperlihatkan bahwa unsur esensial ini dimasukkan pada masing


30/51

30

masing media tapi konsentrasinya berbeda karena diberikan dalam bentuk

yang berbeda.

2. Hara organic. Tanaman yang tumbuh dalam kondisi normal bersifat autotrofdan dapat mensintesa semua kebutuhan bahan organiknya. Meskipun tanaman

in vitro dapat mensintesa senyawa ini, diperkirakan mereka tidak

menghasilkan vitamin dalam jumlah yang cukup untuk pertumbuhan yang

sehat dan satu atau lebih vitamin mesti ditambahkan ke media. Thiamin

merupakan vitamin yang penting, selain itu asam nikotin, piridoksin dan

inositol biasanya ditambahkan. Selain bahan organik tersebut, bahan

kompleks seringkali ditambahkan, termasuk ekstrak ragi, casein hydrolysate,

air kelapa, jus jeruk, jaringan pisang, dan lain lain. Penambahan bahan

kompleks ini menghasilkan media yang tak terdefinisi. Dengan penelitian

yang cukup, semestinya bahan kompleks ini dapat diganti dengan zat tertentu,

mungkin tambahan suatu vitamin atau asam amino.

3. Sumber karbon. Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan

karena mereka tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya, maka sukrosa

harus ditambahkan ke dalam media. Sumber karbon ini menyediakan energybagi pertumbuhan tanaman dan juga sebagai bahan pembangun untuk

memproduksi molekul yang lebih besar yang diperlukan untuk tumbuh.

Biasanya sukrosa pada konsentrasi 1 5% digunakan sebagai sumber karbon

tapi sumber karbon lain seperti glukosa, maltosa, galaktosa dan laktosa juga

digunakan. Ketika sukrosa diautoklaf, terjadi hidrolisis untuk menghasilkan

glukosa dan fruktosa yang dapat digunakan lebih efisien oleh tanaman dalam

kultur.

4. Agar. Umumnya jaringan dikulturkan pada media padat yang dibuat seperti gel

dengan menggunakan agar atau pengganti agar sperti Gelrite atau Phytagel.

Konsentrasi agar yang digunakan berkisar antara 0.71.0%. Pada konsentrasi

tinggi agar menjadi sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga


31/51

31

difusi hara ke tanaman sangat buruk. Agar dengan kualitas tinggi seperti

Difco BiTek mahal harganya tapi lebih murni, tidak mengandung bahan lain

yang mungkin mengganggu pertumbuhan. Pengganti lain seperti gelatin

kadang kadang digunakan pada lab komersial. Gel sintetis diketahui dapat

menyebabkan hyperhidration (vitrifikasi) yang merupakan problem fisiologis

yang terjadi pada kultur. Untuk mengatasi masalah ini, produk baru bernaman

Agargel telah diproduksi ole Sigma. Produk ini merupakan campuran agar

dan gel sintetis dan menawarkan kelebihan kedua produk sekaligus

mengurangi problem vitrifikasi. Produk ini dapat dibuat di lab dengan

mencampurkan 1 g Gelrite (Phytagel) dengan 4 g agar sebagai agen pengental

untuk 1 L media.

5. pH. media biasanya diatur pada kisaran 5.6 5.8 tapi tanaman yang berbeda

mungkin memerlukan pH yang berbeda untuk pertumbuhan optimum. Jika pH

lebih tinggi dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang

dari 5.2, agar tidak dapat memadat.

6. Zat Pengatur Tumbuh. Pada media umumnya ditambahkan zat pengatur

tumbuh. Zat pengatur tumbuh akan dibahas tersendiri pada minggu 13.

7. Air. distilata biasanya digunakan dalam kultur jaringan, dan banyak lab

menggunakan aquabides (air destilata ganda). Beberapa lab, dengan alasan

ekonomi, menggunakan air hujan, tapi ini menyebabkan sulit mengontrol

kandungan bahan organik dan non-organik pada media.

8. Pemilihan Media. Jika tidak ada informasi awal, biasanya mulai dengan media

MS (Murashige dan Skoog 1962). Media ini mengandung konsentrasi garamdan nitrat yang lebih tinggi dibandingkan media lain, dan telah sukses

digunakan pada berbagai tanaman dikotil. Untuk inisiasi kalus, 2.4-D

ditambahkan ke media dengan konsentrasi 1 5 mgL-1. Untuk multiplikasi

tunas, sitokinin seperti BAP ditambahkan dan juga diberi auksin, seperti NAA


32/51

32

pada konsentrasi yang rendah. Untuk inisiasi akar, IBA pada konsentrasi 12

mgL-1 ditambahkan. Faktor yang paling sulit ditentukan dalam kultur

jaringan adalah zat pengatur tumbuh dan biasanya perlu melakukan penelitian

kecil untuk menentukan konsentrasi terbaik yang akan digunakan. Ada 2

pendekatan: Pendekatan pertaman adalah dengan menggunakan media dasar

MS dan meneliti kisaran dua zat pengatur tumbuh yang berbeda pada media

tersebut. (Anonimous, 2009).

Seperti halnya peralatan kultur, media yang digunakan juga perlu dilakukan

sterilisasi untuk menciptakan kondisi lingkungan yang aseptic bagi eksplan. Untuk

media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi

dilakukan dengan autoklaf pada temperature 121Oc, tekanan antara 15 psi atau 1 atm

dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media.

Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 50-100 ml,

sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol

volume 1 liter membutuhkan waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume

2 liter memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52 menit.

Dengan waktu yang lebih lama.

Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang

diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara

mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan

meluap (bubbled up). Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan,

sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran

pori 0.20-0.22 um. Diameter filter yang bermacam-macam tergantung dari volume

larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang

dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain : GA3, Thiamin-

HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin (Anonimous, 2009).


33/51

33


A SIMPILANBerdasarkan hasil pengamatan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa:

1. Media kultur jaringan merupakan faktor penting penentukeberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Media tanam harus

berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin kebutuhan eksplan. Bahan-

bahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan

unsur mikro, gula, protein, vitamin, dan hormon tumbuhan. Berhasilnya kulturjaringan banyak ditentukan selain kondisi aseptic juga oleh media tanam.

2. Pembuatan larutan stok dilakukan dengan mengencerkan menggunakanaquades. unsure makro diencerkan sebanyak 5 kali, unsure mikro 100 kali,

stok Fe 200 kali, vitamin 10 kali, ZPT berupa IAA dan Kinetin 100 kali.

3. Pembuatan medium MS dilakukan dengan mencampurkan stok yang telahdibuat. Untuk pembuatan 1L medium, maka stok unsure makro diambil

sebanyak 100 ml, stok unsure mikro diambil 5 ml, stok Fe diambil 5 ml, stok

vitamin diambil 50 ml, stok ZPT untuk auksin dan sitokinin masing-masing 1

ml.

4. Sterilisasi medium dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 1210Cpada tekanan 15-17,5 psi selama 20 menit.

B SARAN1. Pembuatan larutan stok mikro dan stok mikro dalam media MS harus

dilakukan dengan teliti agar eksplan dapat tumbuh dengan baik.

2. Sterilisasi media harus dilakukan dengan baik, agar tidak terjadi kontaminasi.


34/51

34

1 PENDAHULUAN

A Latar BelakangKultur jaringan merupakan salah satu tekhnik memperbanyak suatu tanaman

dengan cara menanam sebagian kecil jaringan pada medium yang sudah dalam

keadaan steril. Teknik kultur jaringan bukan hanya digunakan untuk beberapa tujuan

seperti mendapatkan produksi metabolit sekunder, mendapatkan keragaman seleksi

dan pemuliaan tanaman.

Pada dasarnya langkah-langkah dalam melakukan proses kultur jaringan ada 3

tahap, yaitu :

1. Tahap I atau disebut juga tahap persiapan eksplan2. Tahap II atau disebut juga tahap penggandaan.3. Tahap III atau disebut juga tahap penndewasaan.( D.F. Wetherell,1976).

Langkah pertama yang harus dilakukan apabila akan melakukan kultur

jaringan adalah menentukan tujuan yang ingin dicapai, karena akan menyangkut

materi yang akan digunakan. Misalnya tujuannya ingin memperbanyak tanaman

dengan hasil yang sesuai dengan induknya, maka dilakukan kultur meristem atau

kultur kalur. Apabila tujuannya ingin mendapatkan tanaman yang homozigot,

dilakukan kultur anther. Langkah berikutnya adalah menentukan medium yang akan

digunakan dengan menambahkan ZPT vitamin dan suplemen lainnya. Selanjutnya

adalah tahap kerja di laboratorium.

Proses pelaksanaan kultur jaringan yang dapat dikatakan proses terakhir yaitu

penanaman eksplan. Syarat pertama kultur jaringan juga masih digunakan pada

pelaksanaan ini yaitu kondisi yang aseptic. Pada pross penanaman eksplan,

lingkungan yang digunakan haruslah benar-benar dalam kondisi yang aseptic. Oleh

karenanya penanaman biasanya dilakukan di Enkas, sebuah kotak dengan tepi yang

transparan dan terdapat lubang untuk tangan, atau dengan menggunakan LAF

(Laminar Air Flow).


35/51

35

Penanaman eksplan harus dilakukan pada ruangan yang harus steril, dan

eksplan juga dalam keadaan yang steril pula. Penanaman dapat dilakukan pada

ruangan tertutup atau ruangan penabur dalam Laminair Air Flow (LAF). Ruangan

digunakan, setelah dilakukan sterilisasi dengan menggunakan larutan alkohol 96 %

pada lantai dan dinding ruangan, dan membiarkan ruangan selama 30 menit dengan

sinar UV yang menyala.

Kontaminasi yang terjadi pada kultur jaringan merupakan momok yang cukup

mengganggu proses kultur jaringan. Namun kontaminasi juga dapat dicegah dengan

perlakuan-perlakuan yang aseptic. Stelah dua acara praktikum diatas dilakukan

sterilisasi terhadap peralatan kultur dan media kultur, tanaman atau eksplan yang

akan ditanam juga harus dalam keadaan steril dan sehat artinya eksplan tidak

terserang penyakit ataupun terkena serangan mikroba.

Keberadaan kontaminan yang berasal dari spora maupun mikroba lainnya

sangat sulit dihindari termasuk juga di dalam ruang kultur. Untuk itu sterilisasi

ruangan juga perlu dilakukan tentunya dengan tujuan untuk menciptakan lingkungan

yang aseptic dan menghilangkan mikroba maupun spora penyebab kontaminan.

B Tujuan1. Mengetahui dan mempraktikan cara menanam eksplan dan sub kultur.2. Mengamati pertumbuhan eksplan.3. Mencari factor-faktor penyebab kontaminasi dalam kultur jaringan.


36/51

36

II TINJAUAN PRAKTIKUM

Dengan semakin berkembangnya usaha di bidang pertanian maka kebutuhan

bibit semakin meningkat. Melalui perbanyakan konvensional sangat sulit untuk

memenuhi kebutuhan bibit yang sangat banyak dengan waktu relatif cepat. Dengan

demikian, teknologi kultur jaringan telah terbukti dapat digunakan sebagai teknologi

pilihan.( Mariska, 2008 ).

Menurut Sriyanti (1994), kultur jaringan adalah suatu metode untuk

mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan

dan organ, serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian

tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap

kembali. Tujuan dari Kultur jaringan diantaranya menciptakan tanaman baru bebas

penyakit, memperbanyak tanaman yang sukar diperbanyak secara seksual, dan

menghasilkan tanaman baru sepanjang tahun (Hendaryono,1994).

Kultur jaringan atau biakan jaringan merupakan teknik pemeliharaan jaringan

atau bagian dari individu secara buatan (artifisial). Yang dimaksud secara buatan

adalah dilakukan di luar individu yang bersangkutan. Karena itu teknik ini sering kali

disebut kultur in vitro, sebagai lawan dari in vivo. Dikatakan in vitro (bahasa Latin,

berarti "di dalam kaca") karena jaringan dibiakkan di dalam tabung inkubasi atau

cawan petri dari kaca atau material tembus pandang lainnya. Kultur jaringan secara

teoretis dapat dilakukan untuk semua jaringan, baik dari tumbuhan maupun hewan

(termasuk manusia) namun masing-masing jaringan memerlukan komposisi media

tertentu (Hendra, 2007).

Pertumbuhan dan perkembangan dalam kultur in vitro dipengaruhi oleh

beberapa faktor, diantaranya: faktor genetik, media tumbuh, faktor lingkungan, dan

zat pengatur tumbuh. Menurut Wetherell (1982), zat pengatur tumbuh (ZPT) di dalam


37/51

37

dalam media berfungsi untuk mengatur pertumbuhan dan perkembangan tanaman

pada setiap tingkat pertumbuhan dan perkembangan.

Di dalam tanaman terdapat fitohormon yang mendorong pertumbuhan dan

perkembangan, serta fitohormon yang menghambat. ZPT akan bekerja secara aditif

(sinergis) dengan fitohormon (pendorong) atau antagonis dengan fitohormon yang

menghambat. Resultan dari interaksi ini akan tampil dalam pertumbuhan dan

perkembangan tanaman. Menurut Gardner (1991) tanaman pada kultur jaringan tidak

dapat menghasilkan karbohidrat sendiri dalam jumlah cukup sehingga perlu diberikan

sumber energi karbon dalam media berupa sukrosa.

Proses perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan terdiri atas seleksi pohoninduk (sumber eksplan), sterilisasi eksplan, inisiasi tunas, multiplikasi, perakaran, dan

aklimatisasi. Eksplan berupa mata tunas, diambil dari pohon induk yang fisiknya

sehat. Tunas tersebut selanjutnya disterilkan dengan alkohol 70%, HgCl2 0,2%, dan

Clorox 30%. Inisiasi tunas. Eksplan yang telah disterilkan di-kulturkan dalam media

kultur (MS + BAP). Setelah terbentuk tunas, tunas tersebut disubkultur dalam media

multiplikasi (MS + BAP) dan beberapa komponen organik lainnya. Multiplikasi

dilakukan secara berulang sampai diperoleh jumlah tanaman yang dikehendaki,

sesuai dengan kapasitas laborato-rium. Setiap siklus multiplikasi berlangsung selama

23 bulan. Untuk biakan (tunas) yang telah responsif stater cultur, dalam periode

tersebut dari 1 tunas dapat dihasilkan 10-20 tunas baru. Setelah tunas mencapai

jumlah yang diinginkan, biakan dipindahkan (dikulturkan) pada media perakaran (

Biogen, 2008 ).

Untuk perakaran digunakan media MS + NAA. Proses perakaran pada

umumnya berlangsung selama 1 bulan. Planlet (tunas yang telah berakar)

diaklimatisasikan sampai bibit cukup kuat untuk ditanam di lapang. Aklimatisasi.

Dapat dilakukan di rumah kaca, rumah kasa atau pesemaian, yang kondisinya

(terutama kelembaban) dapat dikendalikan. Planlet dapat ditanam dalam dua cara.

Pertama, planlet ditanam dalam polibag diameter 10 cm yang berisi media (tanah +


38/51

38

pupuk kandang) yang telah disterilkan. Planlet (dalam polibag) dipelihara di rumah

kaca atau rumah kasa. Kedua, bibit ditaruh di atas bedengan yang dinaungi dengan

plastik. Lebar pesemaian 1-1,2 m, panjangnya tergantung keadaan tempat. Dua

sampai tiga minggu sebelum tanam, bedengan dipupuk dengan pupuk kandang (4

kg/m2) dan disterilkan dengan formalin 4%. Planlet ditanam dengan jarak 20 cm x 20

cm. Aklimatisasi berlangsung selama 2-3 bulan. Aklimatisasi cara pertama dapat

dilakukan bila lokasi pertanaman letaknya jauh dari pesemaian dan cara kedua

dilakukan bila pesemaian berada di sekitar areal pertanaman ( Biogen, 2008 ).


39/51

39


A Bahan dan Alat : Bahan

a. Bahan eksplan yang dapat berupa daun muda, tunas, pucuk tanamanb. Media tumbuhc. Sterilan : alcohol, sublimat, Cloroxd. Aquades steril

Alata. Laminar Air Flowb. Erlenmeyerc. Handsprayer

B Prosedur Kerja Persiapan ruang penabur

1. Sebelum digunakan ruang penabur disterilkan dengan sinar UV selama

30 menit atau dengan menyemprotkan alcohol 96% ke bagian tangan

dan botol yang berisi media

2. Alat-alat yang digunakan diatur dengan rapi pada LAF, posisi scalpel

dan pinset serta alcohol 96% yang digunakan untuk mensterilkan

dissecting kit (scalpel dan pinset) disebelah kiri Bunsen sedangkan botol

kultur disebelah kanan.

3. Petridish diletakan dibagian tengah, setiap selesai eksplant dipotong

petridish ditutup kembali untuk menghindari kontaminasi.


40/51

40

4. Selesai digunakan alat disterilkan dengan alkohok dan dibakar dengan

Bunsen.

5. Sebelum masuk kedalam LAF semua seperti botol dan tangan harusdisterilkan dengan alcohol 96%.

6. Setiap selesai menggunakan pinset maupun scalpel, lalu dicelupkan

kedalam alkohol, lalu dibakar pada nyala api bunsen.

Penyiapan EksplanEksplan adalah bahan tanaman yang akan dikulturkan, dapat berupa daun,

tunas, pucuk, bunga, endosperm, buah muda, sel, protoplas dan yang

lainnya.

Penanaman Eksplana. Disiapkan alat-alat yang akan digunakan untuk penanaman eksplan.

b. Diambil potongan eksplan yang sudah siap untuk ditanam denganpinset.

c. Dibuka botol kultur yang telah berisi media dan dibakar bagian mulutbotol.

d. Diletakan eksplan kedalam media dengan hati-hati.e. Botol ditutup dengan kertas aluminium foil dan diseal.f. Diletakan pada ruang inkubasi.g. Diamati perkembangan eksplan.


41/51

41

IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A Hasil

B PembahasanKultur jaringan merupakan salah satu teknik memperbanyak suatu tanaman

dengan cara menanam sebagian kecil jaringan pada medium yang sudah dalam

keadaan steril. Dalam melakukan proses kultur jaringan ada beberapa langkah yang

harus dilakukan diantaranya adalah menentukan tujuan yang ingin dicapai hal ini

penting karena menyangkut materi yang akan digunakan. Setelah mengetahui tujuan

yang aingin dicapai langkah yang dilakukan berikutnya adalah menentukan medium

yang akan digunakan.( Nasir,2001)

Hari / Tanggal

Pengamatan

No Botol Eksplan Keterangan

1 2 3 1 2 3

Kamis, 15

Desember 2011

Belum

Tumbuh

Belum

Tumbuh

Belum

Tumbu

h

Eksplan,

media

(baik)

Eksplan,

media

(baik)

Eksplan,

media

(baik)

Senin, 19Desember 2011

BelumTumbuh

BelumTumbuh

BelumTumbu

h

Kontam(jamur)

Kontam(jamur)

Kontam(jamur)

Rabu, 21

Desember 2011

Belum

Tumbuh

Belum

Tumbuh

Belum

Tumbu

h

Kontam

(jamur)

Kontam

(jamur)

Kontam

(jamur)


42/51

42

Proses kultur jaringan tidak bisa dilakukan di temapt yang sembarangan, akan

tetapi dilaksanakan pada laboratorium tertentu. Proses penyimpanan eksplan

dilakukan di dalam ruang penabur. Dimana ruang penabur merupakan kunci

keberhasilan budidaya in-vitro. Didalam ruangan ini semua dilakukan dengan steril,

dan pengawasan kesterilan di ruang penabur tersebut sangat ketat.( Moeso S,1996 )

LAF cabinet merupakan suatu kotak tempat sterilisasi dan penanaman eksplan

( bahan tanam ). Di dalam laminar, terdapat blower dan lampu ultra violet. Blower

menghembuskan udara halus melalui suatu kotak filter yang fungsi untuk mencegah

kontaminan yang berasal dari udara. Sementara itu, lampu ultra violet berfungsi untuk

mematikan kontaminan yang berada di permukaan dalam laminar, permukaan dalam

laminar dilap dengan kapas atau tissu yang sebelumnya dicelupkan dalam alkohol

70% dan lampu ultra violetnya dinyalakan selama 0,5-1jam (Hendaryono,1994 ).

Prinsip kerja Laminar Air Flow Cabinet

Lamianar Air Flow Cabinet digunakan sebagai meja kerja steril untukkegiatan inokulasi/ penanaman.

Laminar Air Flow Cabinet mengutamakan adanya hembusan udara steril yangdigerakkan oleh blower yang disaring oleh HEPA Filter.

Sebelum dioperasikan Laminar Air Flow Cabinet harus dinyalakan minimal30 menit dan harus dilakukan penyemprotan dengan alcohol agar alat dan

ruang kerja tersebut terjamin kesterilannya.

Pada saat melaksanakan pekerjaan, harus dinyalakan blowernya yangberfungsi sebagai penghembus udara steril dan lampu TL sebagai penerang.

Agar Laminar Air Flow Cabinet dapat difungsikan setiap saat, pemeliharaandan perawatan alat harus selalu dilakukan.

Cara kerja Laminar Air Flow Cabinet

Bersihkan meja kerja dengan menggunakan tissue, Semprot meja kerjadengan menggunakan alkohol tanpa mengenai bagian filter HEPA.


43/51

43

Tutup kaca Laminar Air Flow Cabinet, kemudian nyalakan lampu UV selama30 menit.

Setelah minimum 30 menit, matikan lampu UV dan buka kaca laminar airflow cabinet serta nyalakan lampu TL dan blower.

Siapkan pisau scalpel dan pinset pada meja kerja steril Semprotkan alattersebut dengan menggunakan alcohol.

Bakarlah alat tersebut dengan menggunakan nyala api lampu spirtus. Lakukankegiatan inokulasi dengan hati-hati dan cermat sesuai dengan petunjuk kerja.

Bersihkan kembali Laminar air flow cabinet sehingga dalam kondis siappakai. Matikan blower dan lampu TL, tutup kembali pintu kaca meja steril.

Pada laminar air flow cabinet, terdapat 2 macam filter :

o Pre-filter, yang menggunakan saringan pertama terhadap debu-debu danbenda-benda yang kasar. Pori-porinya kira-kira 5mm sehingga efisiensinya

dapat mencapai 95mm untuk objek-objek yang >5mm.

o HEPA filter dengan pori-pori 0.3 m dan terdapat pada bidang keluar udarakearah permukaan tempat kerja.

Pre-filter harus sering dibersihkan dengan vacum cleaner dan sebaiknya

diganti 1 tahun sekali. Namun HEPA filter diganti setelah melalui pemeriksaan

dengan particulate count atau dengan alat yang disebut magnehelic gauge. Laminar

air flow cabinet ada yang dilengkapi dengan lampu UV, ada juga yang tidak. Pada

laminar air flow cabinet yang tidak dilengkapi dengan lampu UV, blower harus

dijalankan terus menerus walaupun laminar air flow cabinet tersebut sedang tidak

dipergunakan. Hal ini dilakukan untuk menjaga kebersihan ruang kerja didalam

laminar air flow tersebut. Pada laminar air flow yang dilengkapi dengan lampu UV.

dianjurkan agar menyalakan lampu UV. minimum 30 menit sebelum laminar air flow

digunakan. Ketika laminar air flow sedang digunakan, lampu UV harus dimatikan,

sedangkan blower dijalankan. Blower pada laminar air flow cabinet yang dilengkapi

dengan lampu UV, hanya dijalankan pada saat laminar air flow sedang digunakan. (

D.F.Wetherell,1976 )


44/51

44

Ukuran :

Panjang total : 80 cm Lebar total : 75 cm Tinggi total : 95 cm Ruang kerja LAFC :

Panjang : 77 cm Lebar : 42 cm Tinggi : 61 cm

Bobot Total sekitar 75 kg.

Komponen dan bahan.

Sentrifugal Blower 90 watt, dengan setting dua kekuatan. Lampu Ultra violet 15 watt, panjang gelombang < 320 nanometer (khusus

untuk sterilisasi).

Lampu neon 20 watt. Bahan pelapis luar dan ruang kerja bagian dalam adalah plat Almunium. Komponen dasar Mulipel blok. Lapisan bagian dalam diberi lapisan peredam suara, sehingga suara mesin

sangat halus. lantai kerja almunium dilapis kaca tebal 5 mm di cat bagian

bawahnya putih.

Rangka luar filter Kawat persegi aluminium versi baru. Komponen penutup ruang kerja adalah akrilik kualitas prima/bening. Bagian dalam dilengkapi lapisan kaca setengah bagian untuk mengurangi

kontaminasi dari luar.

Dilengkapi dengan rangka meja besi yang kokoh khusus untuk meletakkanLAFC.


45/51

45

Sterilisasi eksplan dapat dilakukan atau dilaksanakan dengan dua cara yaitu

secara mekanik dan secara kimia.

a. Sterilisasi eksplan secara mekanis. Cara ini digunakan untuk eksaplan yangkeras atau berdaging, yaitu dengan membakar eksplan tersebut diatas lampu

spirtus sebanyak tiga kali. Eksplan keras yang disterilkan dengan cara ini

adalah tebu, biki salak, bung, buah anggrek, akapulaga dan sebagainya.

Sterilisasi eksplan dengan cara kimiawi.

b. Sterilisasi secara kimiawi digunakan untuk eksplan yang lunak seperti daun,tangkai daun, dan sebagainya. Bahan kimia yang sering dipakai untuk

disinfestasi adalah alkohol seperti etil, metil, atau isopropyl-alkohol dengan

konsentrasi 70-80%, Ca-hipoklorit atau Na- hipoklorit.

Macam-macam bahan untuk sterilisasi dan fungsinya:

1. Deterjen (Membershkan kotora/debu dari eksplan)

2. Fungisida (Memberihkan jamur/cendawan)

3. Bakterisida (Membersihkan bakteri)

4. Alkohol 70% dan 95%

5. Sodium hipoklorik dengan nama dagang clorox atau bayclin

6. Mercury chlorit dengan nama dagang sublima 0,05 %

7. Tween -20 (Agen pembasah)

8. Antibiotik

9. Iodine/betadine Antiseptik

Satu hal yang penting dalam sterilisasi permukaan eksplan adalah

mengkompromikan antara usaha untuk mendapatkan eksplan yang steril dan menjaga

agar jaringan eksplan tidak rusak akibat tingginya konsentrasi disinfektan. Untuk

meminimalkan tingkat kontaminasi dan mendapatkan pertumbuhan eksplan yang

cepat, beberapa perlakuan (threatment) terhadap tanaman induk sumber eksplan dapat

diterapkan sebagai berikut:


46/51

46

o Pemeliharaan tanaman induk di rumah kaca dengan pengendalian hama danpenyakit tanaman secra intensif.

o Pemangkasan tanaman induk diikuti pemupukan yang seimbang. Flush atautrubusan baru yang tumbuh setelah pemangkasan digunakan sebagai eksplan.

Flush yang tumbuh tersebut sebaiknya disemrot dengan fungisida sistemik (

Benlate) dan bakterisida ( Agrept) agar tumbuhnya lebih sehat.

o Perlakuan tanaman induk dengan temperatur yang tertentu seperti suhu rendah(4oC) atau suhu tinggi (35oC).

o Perlakuan tanaman induk dengan ZPT seperti sitokonin atau giberelin.Sitokonin untuk merangsang tumbuhnya tunas-tunas aksilar, sedangkan

giberelin untuk merangsang pemanjangan tunas.Pemeliharaan tanaman induk dalam keadaan yang lebih higienis yaitu dengan

menumbuhkannya di dalam rumah kaca dengan pengendalian hama dan penyakit

tanaman yang intensif membuktikan dapat mengurangi tingkat kontaminasi eksplan

yang diambil dari tanaman tersebut, terutama yang disebabkan oleh cendawan.

Namun, cara ini sulit diterapkan untuk kontaminasi yang disebabkan oleh

mikroorganisme endofilik, terutama bakteri.

Eksplan atau kultur dapat terkontaminasi oleh berbagai mikrooganisme sepertijamur, bakteri, serangga atau virus. Namun, sumber utama kontaminan adalah spora

jamur dan bakteri yang membentuk bagian alami dari atmosfer. Banyak yang bersifat

non-patogenik, artinya mereka tidak menyebabkan bahaya bagi tanaman inang pada

kondisi normal. Kontaminasi permukaan dapat diatasi dengan cara pencucian

menggunakan berbagai perlakuan bahan kimia. Keterbatasan utama adalah untuk

memberikan perlakuan yang cukup kuat untuk mengeliminasi kontaminasi tanpa

merusak jaringan tanaman. Ini biasanya dicapai dengan menambahkan detergen,

agitasi (digoyang goyang), atau membenamkan eksplan dengan sedikit tekanan

untuk mengilangkan gelembung udara yang mungkin mengandung mikroorganisme

(Hendaryono, 1994).


47/51

47

Kontaminasi yang disebabkan oleh mikroorganisme endofilik (organisme

yang hidup di dalam sel atau ruang antar sel tanaman) yang sering merupakan biote

dari tanaman sumber eksplan, sulit diatasi dengan sterilisasi permukaan. Keadaan ini

disebabkan oleh koloni baktri sering tidak muncul pada saat eksplan baru dikulturkan

pertama kali, tetapi beberapa minggu kemudian muncul koloni bakteri. Bakteri

tersebut tetap ada setelah disubkulturkan berkali-kali, karena hidupnya memang

secara epifit di dalam jaringan tanaman.

Eksudasi dari eksplan merupakan tipe kontaminasi yang lain, bukan dari

organisme lain. Ketika jaringan tanaman terluka, dengan cara pemotongan atau

perlakuan bahan kimia seperti larutan klorin, reaksi fisiologis terjadi pada sel sekitar

luka. Salah satu prosesnya adalah produksi bahan biokimia apakah sebagai produk

pecahan atau sintesa sebagai mekanisme perlindungan. Keluarnya substansi dari

jaringan akan terjadi. Bahan kimia ini mungkin atau mungkin tidak memberi

pengaruh mematikan pada pertumbuhan kultur (Imron, 2007).

Eksplan sendiri adalah bagian tanaman yang dipakai untuk bahan budidaya

atau kultur jaringan. Eksplan yang baik adalah :

a) Bagian tanaman yang masih mudab) Diambil dari tanaman yang tumbuh subur dan sehatc) Dinding sel amsih tipis dan belum berpembuluh kayud) Bersifat merismatik atau meristemoid.

Sterilisasi sangat penting karena :

a) Jasad renik yang terbawa eksplan akan tumbuh menutupi eksplan danmedia sehingga dapat menghancurkan jaringan yang akan ditanam.

b) Adanya jasad renik akan mengubah lingkungan karena hilangnya zatmakanan di media dan dilepaskan produk metabolit tambahan ke

dalam media dan dilepaskannya produk metabolit tambahan ke dalam

media, sehingga dapat menghancurkan eksplan yang akan ditanam.


48/51

48

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam kegiatan inisiasi/penanaman yakni

sebagai berikut : ( Hawaauriz, 2009 ).

1. Alat dan bahan yang dimasukkan dalam laminar harus dipastikan dalamkeadaan steril sehingga perlu dilakukan penyemprotan dengan alkohol 70

%.

2. Untuk mengurangi masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan,sebelum membuka tabung kultur sebaiknya mulut tabung digarang pada api

terlebih dahulu

3. Kegiatan penanaman diusahakan dilakukan dengan cepat, karena semakincepat dilakukan penanaman maka eksplan tidak akan terlalu lama berikatan

dengan oksigen sehingga kemungkinan untuk browning semakin kecil.

Sebagai sumber utama kontaminan, eksplan memiliki perlakuan khusus pada

proses sterilisasinya. Diantranya adalah pencucian dengan menggunakan deterjen

ditujukan untuk menghilangkan sisia-sisa tanah pada umbi eksplan. Selanjutnya di

rendam dalah alcohol untuk menghilangkan atau membunuh kuman. Selanjutnya

dicelupkan pada larutan klorok untuk membunuh mikroba terutama yang ada di

bagian dalam eksplan. Digunakan pula fungisida untuk membunuh spora ataupun

cendawan yang diperkirakan ada pada eksplan.

Praktikum kultur jaringan kali ini, eksplan yang digunakan adalah daun bunga

begonia dan ditanam pada media yang telah dibuat sebelumnya yaitu Media MS.

Setelah dilkukan penanaman, eksplan tersebut diamati selama kurang lebih 2 minggu,

untuk mengetahui apakah terjadi kontaminasi pada eksplan ataupun media.

Adapun kontaminasi yang sering terjadi pada kultur jaringan tanaman terdiri

atas dua jenis yaitu kontamiasi oleh bakteri dan kontaminasi oleh jamur. Untuk

membedakan kedua jenis kontaminasi ini, dapat dilihat dari ciri-ciri fisik yang

muncul pada eksplan maupun media kultur. Bila terkena kontaminasi bakteri maka

tanaman akan basah atau menyebabkan adanya lendir, hal ini dikarenakan bakteri

langsung menyerang terhadap jaringan dari tubuh tumbuhan itu sendiri. Sedangkan


49/51

49

bila terkontaminasi oleh jamur, tanaman akan lebih kering dan akan muncul hifa

jamur pada tanaman yang terserang dan biasanya dapat dicirikan dengan adanya garis

garis (seperti benang) yang berwarna putih sampai abuabu. Penyebab terjadinya

kontaminasi bisa diakibatkan karena kesalahan pada saat penanaman, saat sterilisasi

media dan eksplan atau bahkan pada saat pembuatan media.

Berdasarkan pengamatan dilakukan selama 2 minggu (3 kali pengamatan)

ternyata ketiga eksplan terkontaminasi. Adapun pada pengamatan pertama (2 hari

setelah penanaman) kondisi eksplan dan media tumbuh kultur masih dalam keadaan

baik. Sedangkan pada pengamatan kedua, eksplan dan media kultur telah

terkontaminasi oleh jamur. Hal ini ditunjukkan dengan adanya kontaminan yang

berwarna putih dan membentuk seperti benang (hifa). Begitupun pada pengamatan

selanjutnya, kontaminasi yang terjadi oleh jamur makin jelas dan terlihat begitu nyata

karena hampir seluruh bagian permukaan eksplan dan media kultur ditumbuhi oleh

jamur. Kontaminasi bisa terjadi dikarenakan adanya kesalahan atupun kurang

optimalnya dalam penanaman maupun melakukan hal lain yang dapat mendukung

keberhasilan kultur jaringan tersebut, terutama dalam hal sterilisasi.


50/51

50


A SIMPULANBerdasarkan hasil pengamatan dan pelaksanaan praktikum kultur jaringan

tanaman acara Penanaman Eksplan dapat diperoleh beberapa simpulan sebagai

berikut :

1. Penanaman eksplan dilakukan di LAF (Laminar Air Flow). Penggunaan alat

sebelumnya sudah dalam keadaan steril. Penanaman dilakukan dengan cara

mencelupkan scalpel dan pinset ke dalam alcohol 96% lalu dibakar pada nyala

api Bunsen. Setelah itu alat baru bisa digunakan untuk menanam. Pada setiap

botol kultur, diisi 1 potong eksplan.

2. Pada eksplan daun begoniaterjadi kontaminasi oleh jamur, hal ini ditunjukkan

dengan adanya kontaminan yang berwarna putih dan membentuk seperti

benang (hifa).

3. Kontaminasi bisa terjadi dikarenakan adanya kesalahan atupun kurang

optimalnya dalam penanaman maupun melakukan hal lain yang dapat

mendukung keberhasilan kultur jaringan tersebut, terutama dalam hal sterilisasi.

B SARANDalam pemilihan eksplan terutama eksplan yang berasal dari daun, sebaiknya

memilih daun yang bertekstur lebih keras / kaku. Begitu juga dalam hal pemotongan

eksplan, sebaiknya dibentuk lebih lancip untuk bagian yang akan ditanam guna

memudahkan dalam proses penanaman eksplan.


51/51

51

Documents

Laporan KULTUR JARINGAN