Mario VaneechoutteLaboratorium Bacteriologie Research

RAPD of AP-PCRvoor de genotypering van bacteriën

19 april 2012Staf Microbiologie

UZ Gent

Dia’s beschikbaar op:http://users.ugent.be/~mvaneech/LBR.htm

I. RAPD: NomenclatuurAP-PCR: arbitrarily primed PCR

of?RAPD: randomly amplified polymorphic DNA analysis

2

3

II. RAPD: Principe

Eén korte primer +Lage annealingst°= veel random priming

II. RAPD: PrincipeHoe mutaties aanleiding geven tot verschillende RAPD fingerprints

4

Isolaat 2

PCR met korte primer (5’AGTCAGCCAC)bij lage annealing temperatuur

Elektroforese

Isolaat 1

opgezuiverd genomisch DNA

II. RAPD: Principe

5

1. Start from pure culture

2. Extract DNA for PCR: Crude cell extract 30 mintake 1-3 small colonies heat in 100 μl water for 15 min at 95Cdilute 1:10 in distilled watercentrifuge for 30"use supernatant as DNA-extract

3. PCR-mixture preparation - adding DNA (30 isolates): 30 minPCR ready mix with dNTP, polyme rase, bufferAdd primer at final concentration of 0.1-1 µMAdd 1 μl of DNA-targetFinal volume per reaction: 10 μl

4. PCR-cycling – preparing agarose gel: 2 hours

5. 3% Agarose gel electrophoresis at 7 V/cm 1 hour

Total time (1 – 30 isolates) 4 hours

III. RAPD: Praktisch

6

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M

IV. RAPD: PCR + Electroforese

1. Agarose gel electroforese

7

IV. RAPD: PCR + Electroforese2. Capillair electroforese (fluo primer, ABI3130) Hogere resolutie: 1 bp Automatische digitalisatie

El Aila et al. 2009. Genotyping of Streptococcus agalactiae (group B streptococci) isolated from vaginal and rectal swabs of women at 35-37 weeks of pregnancy. BMC Infect. Dis. 2009, 9: 153.

8

B

C

C

C

A

IV. RAPD: PCR + Smelt curve analyse (MCA)3. McRAPD

Geen electroforese Automatische analyse Praktischer – sneller - goedkoper dan electroforese

Deschaght et al. 2011. Rapid genotyping of Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia isolates using melting curve analysis of RAPD-generated DNA-fragments (McRAPD). Res. Microbiol. 162: 386-392.

9

IV. RAPD: PCR + Smelt curve analyse (MCA)3. McRAPD

Geen electroforese Automatische analyse Praktischer – sneller - goedkoper dan electroforese

Deschaght et al. 2011. Rapid genotyping of Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia isolates using melting curve analysis of RAPD-generated DNA-fragments (McRAPD). Res. Microbiol. 162: 386-392.

A A A’ B B C C C C C D D

10

Typering van Sphingomonas paucimobilis met 2 afzonderlijke random primers: PH1, M13

Andere primers = andere patronen, maar zelfde clusteringAndere run met zelfde primer = andere patronen, maar zelfde clustering RAPD fingerprints zijn reproduceerbaar binnen 1 run: beperkt aantal stammen/test

V. RAPD: reproduceerbaarheid?

Lemaitre et al. 1996. Tracheal colonization with Sphingomonas paucimobilis in mechanically ventilated neonates due to contaminated ventilator temperature probes. J. Hosp. Infection 32: 199-206.

11

Set up: 40 clinical Acinetobacter isolates - 7 laboratoriesDNA-extraction in each labReady-to-Go RAPD beads (Pharmacia)Analysis of profiles on agarose gel in each labAnalysis of profiles on high resolution gels on ALF Express (Phar

macia) in one lab

Results1. Highly comparable profiles between labs2. Clustering reproducibility

On agarose gels: identical in 4 labs 3 other labs: 1, 2, 4 isolates wrongly

clusteredOn ALF express: identical for all 7 labs

Conclusions1. High interlaboratory reproducibility of (profiles and) clustering2. Interpretation and reproducibility problems are due to agarose gel electrophoresis

V. RAPD: Interlaboratorium-reproduceerbaarheid?

12

Grundmann et al. 1997. Multicenter study using standardized protocols and reagents for evaluation of reproducibility of PCR-based fingerprinting of Acinetobacter spp. J Clin Microbiol 35: 3071-3077.

13

V. RAPD: Interlaboratorium-reproduceerbaarheid?

Van Belkum et al. 1995. Multicenter evaluation of arbitrarily primed PCR for typing of Staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol 33: 1537-1547.

Set up: 60 isolaten, 7 laboratoriaResultaten: geen volledige overeenstemming met PFGE 16-30 types naargelang laboratorium toch epidemiologisch correct clusteren (?)

Com parison of RAPD with other methods for ty ping of Gram-negati ves

Species Technique compared with PublicationA. baumannii Macrorestriction analysis Struelens et al. (1993)A. baumannii SDS PAGE protein profiles Vaneechoutte et al. (1995)E. cloacae Ribotyping Grattard et al. (1994)K. pneumoniae Macrorestriction analysis Gori et al. (1996)P. aeruginosa Serotyping Elaichouni et al. (1994) Phage typing Elaichouni et al. (1994)

Results1. Whatever primer was used: nearly identical clustering with all primers2. Almost perfect correspondence with other techniques3. Almost perfect correspondence with epidemiological data

ConclusionAll DNA-fingerprinting techniques, included RAPD, perform wellCertainly for Gram-negatives

VI. RAPD: vergelijking met andere genotyperingstechnieken

14

VII. RAPD: Toepassingen

1. Opsporen contaminatiebronNosocomiale outbreaksBron Pseudomonas aeruginosa besmetting bij muco-patiënten

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiëntSoort Patiënten LocatieHaemophilus influenzae otitis prone children keel-oorVaginale soorten zwangere vrouwen rectaal-vaginaalPseudomonas aeruginosa muco-patiënten sputum eradicatiesucces monitoren voor elke patiënt slechts de verschillende stammen verder typeren (AFLP)

3. Herkennen van virulente stammenStaphylococcus aureus bij konijnenStreptococcus gallolyticus bij duiven

15

VII. RAPD: Toepassingen1. Opsporen contaminatiebron. Nosocomiale outbreaks

PH1 M13

16

17

VII. RAPD: Toepassingen1. Opsporen contaminatiebron. Nosocomiale outbreaks

Lemaitre et al. 1996. Tracheal colonization with Sphingomonas paucimobilis in mechanically ventilated neonates due to contaminated ventilator temperature probes. J. Hosp. Infection 32: 199-206.

18

VII. RAPD: Toepassingen1. Opsporen contaminatiebron. Oorsprong P. aeruginosa stam bij nieuw-geïnfecteerde muco-patiënten

Schelstraete et al. 2008. Pseudomonas aeruginosa in the home environment of newly infected cystic fibrosis patients. Eur Respir J 31: 822-829.

50 huizen van nieuw-geïnfecteerden18 huizen: P. aeruginosa positief (vnl. badkamers)9 stammen identiek aan stam van de patiënt

Besluit: maximum 1 op 5 CF patiënten werd thuis besmet?

Large genetic diversity: all individuals had different strainsExcept for the 3 sibling pairs: both siblings same strain in throatPaired isolates from nasopharynx and middle ear: 66% of pairs, strain identicalAfter one month interval of sampling: different strains in same patients

Easy transmission between individuals and within individualsRapid turnover = replacement: developing immunity?

19

VII. RAPD: Toepassingen2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiëntHaemophilus influenzae bij otitis-gevoelige kinderen:

vergelijking van keel-oor isolaten

Dhooge et al. 2000. Turnover of Haemophilus influenzae isolates in otitis-prone children. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 54: 7-12.

20

: keel: oor (L resp. R)

VII. RAPD: Toepassingen2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiëntHaemophilus influenzae bij otitis-gevoelige kinderen:

vergelijking van keel-oor isolaten

Dhooge et al. 2000. Turnover of Haemophilus influenzae isolates in otitis-prone children. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 54: 7-12.

21

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiëntVaginale soorten bij zwangere vrouwen: recto-vaginale staalnames 37 weken

El Aila et al. 2009. Genotyping of Streptococcus agalactiae (group B streptococci) isolated from vaginal and rectal swabs of women at 35-37 weeks of pregnancy. BMC Infect. Dis. 2009, 9: 153. 22

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiëntVaginale soorten bij zwangere vrouwen: recto-vaginale staalnames 37 wekenGBS

B

C

C

C

A NT

II

III

III

III

R

R

R

V

V

23

50 x zelfde soort V & R34 x ook zelfde stam

El Aila et al. 2009. Identification and genotyping of bacteria from paired vaginal and rectal samples from pregnant women indicates similarity between vaginal and rectal microflora. BMC Infect. Dis. 2009, 9: 167.

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiëntVaginale soorten bij zwangere vrouwen: recto-vaginale staalnames 37 wekenLactobacillus crispatus

24

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiëntVaginale soorten bij zwangere vrouwen: recto-vaginale staalnames 37 wekenEnterococcus faecalis

R1

R2

R3

R4

V1

V2

El Aila et al. 2009. Identification and genotyping of bacteria from paired vaginal and rectal samples from pregnant women indicates similarity between vaginal and rectal microflora. BMC Infect. Dis. 2009, 9: 167.

25

Schelstraete, P., P. Deschaght, L. Van Simaey, S. Van daele, F. Haerynck, M. Vaneechoutte, and F. De Baets. 2010. Genotype based evaluation of Pseudomonas aeruginosa eradication treatment success in cystic fibrosis patients. J Cystic Fibrosis 9: 99–103.

Methods:January 2003 - December 2008: respiratory samples cultured from 41 patients with a first ever P. aeruginosa isolate and with early aggressive eradication therapy.

Sixteen patients immediately rescued: no further positive cultures

Twenty five patients had at least one subsequent isolate: re-infection with other strain or chronic colonization with same strain?

Clinical criteria: 3 positive cultures within 6 months 11 chronically colonized < 3 positive cultures within 6 months 14 intermittently colonized

Genotypic criteria: 11 chronically colonized: confirmed 7 of 14 ‘intermittently colonized’ are probably also chronically colonized

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiëntMonitoring van het eradicatiesucces van AB-behandeling bij nieuw-geïnfecteerde muco-patiënten

Intermittently colonized: < 3 + cultures in last 6 months

Chronically colonized: 3 + cultures in last 6 months

12 months

24 months

36 months

60 months

Patient 17

Patient 22

Patient 29Patient 30

Patient 31Patient 32Patient 33Patient 34Patient 35Patient 36Patient 37Patient 38Patient 39Patient 40Patient 41

Patient 21

Patient 27Patient 26

Patient 23

Patient 25Patient 24

Patient 18Patient 19Patient 20

Patient 28

26

Same genotype: 100%

Same genotype: 50%

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiëntMonitoring van het eradicatiesucces van AB-behandeling bij nieuw-geïnfecteerde muco-patiënten

27

Van daele S, M. Vaneechoutte, K. De Boeck, C. Knoop, A. Malfroot, P. Lebecque, J. Leclercq-Foucart, L. Van Schil, K. Desager, and F. De Baets. 2006. Survey of Pseudomonas aeruginosa genotypes in Belgian colonised cystic fibrosis patients. Eur Resp J 28: 740-747.

Nationale studie: ‘AFLP’ fingerprinting + digitale electroforese276 patiënten in 2003 en daarvan 95 nog eens in 2004AFLP: duur en omslachtig Om werk en kosten te sparen per patiënt alle isolaten vergelijken met RAPD per patiënt van elke RAPD genotype slechts 1 stam meenemen in AFLP

Conclusies (op basis van RAPD & AFLP):totaal 910 isolaten, 163 genotypes: veel diversiteit in CF

populatie80% van 95 patiënten hebben zelfde stam nog in 200475 % van de patiënten hebben slechts 1 stamslechts 10-tal clusters, sommige clusters multicentrischgrootste cluster: 10 patiënten

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiëntPseudomonas aeruginosa in sputum van gekoloniseerde muco-patiënten

Set up: 53 S. aureus stammen uit 13 verschillende kwekerijen13 RAPD-types

Type Stammen Gerelateerd aan chronische stafylococcosea 23 +b 13 -c-m 1 of 2 -NT 1 -

Geen type a stammen in kwekerijen zonder chronische infectieBetere overeenstemming met epidemiologie dan faag-biotypering

28

VII. RAPD: Toepassingen3. Herkennen virulente stammen: S. aureus bij konijnen

Hermans et al. 2000. Differentation between high and low virulence Staphylococcus aureus strains from rabbits by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD)-analysis. Vet. Microbiol. 72: 311-319.

Baele et al. 2000. Genomic fingerprinting of pigeon Streptococcus gallolyticus strains of differing virulence by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Vet. Microbiol. 71: 103-111.

Met dank aan Leen Van Simaey & Bart Saerens

Laboratorium Bacteriologie Research

RAPD of AP-PCRvoor de genotypering van bacteriën

19 april 2012Staf Microbiologie

UZ Gent

Dia’s beschikbaar op:http://users.ugent.be/~mvaneech/LBR.htm