MỤC LỤC Trang

Mở đầu 1

Chương 1 Tổng quan 4 1.1. Giới thiệu về protein và axít amin 4

1.2. Định nghĩa và cấu trúc axít amin 13

1.3. Tính chất hóa lý của protein và axít amin 14

1.4. Tổng quan về các phương pháp định lượng protein và axít amin 17

Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 29 2.1. Nội dung và mục tiêu nghiên cứu 30

2.2. Phương pháp nghiên cứu 31

2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thuốc thử sử dụng 42

2.4. Phương pháp thu thập mẫu thực phẩm để phân tích 44

Chương 3.Kết quả và thảo luận 46

3.1. Khảo sát chọn loại chất dẫn xuất cho axít amin 47

3.2. Tối ưu hóa các điều kiện tách và xác định axít amin bằng HPLC 49

3.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng và xây dựng đường

chuẩn của phương pháp phân tích 62

3.4. Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân mẫu 69

3.5. Lược đồ quy trình phân tích đối với các mẫu thực phẩm 84

3.6. Đánh giá thống kê phương pháp phân tích 87

3.7. Phân tích mẫu thực tế 103

Kết luận 133

Danh mục công trình tác giả 114

Tài liệu tham khảo 116

Phụ lục 1 125

Phục lục 2 127

Phục lục 3 128

Phục lục 4 133

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ

ACN Acetonitril

Ala Alanin

AQC Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamat

Arg Arginin

Asp Axít Aspartic

Cys Cystin

FMOC 9-florenylmethylcloroformat

GC Sắc ký khí

Glu Axít Glutamic

Gly Glycin

His Histidin

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Ile Isoleucin

KPH Không phát hiện (dưới ngưỡng phát hiện của phương

pháp)

Leu Leucin

Lys Lysin

Met Methionin

Ninhydrin Tricetohydrinđen hydrat

OPA Ortho-phthalaldehyd / ortho-phthaldialdehyd

Phe Phenylalanin

PITC Phenyl isothiocyanat

Pro Prolin

RP-HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược

Ser Serin

Thr Threonin

Tyr Tyrosin

Val Valin

DANH MỤC CÁC BẢNG Trang

Bảng 1.1: Trị số ước lượng về lượng đòi hỏi các axít amin cần thiết 11

Bảng 1.2: Đối chiếu các loại axít amin thiết yếu 12

Bảng 1.3: Tổng hợp các chất dẫn xuất xác định axít amin bằng RP-HPLC [76] 27

Bảng 3.1: ảnh hưởng pha động đến thời gian lưu của các axít amin 55

Bảng 3.2: Thành phần và tỷ lệ pha động theo chế độ gradient 57

Bảng 3.3: ảnh hưởng của nồng độ trietylamin trong pha động đến thời gian lưu 57

Bảng 3.4: Các điều kiện đo RP-HPLC cho xác định các axít amin 61

Bảng 3.5: Tỷ lệ thành phần pha động 62

Bảng 3.6: Giới hạn phát hiện của các axít amin 64

Bảng 3.7: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 65

Bảng 3.8: Sự phụ thuộc của chiều cao píc sắc ký vào nồng độ của axít amin 67

Bảng 3.9: ảnh hưởng của môi trường đến hiệu suất thủy phân axít amin 70

Bảng 3.10: ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi của axít amin 71

Bảng 3.11: ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của axít amin 73

Bảng 3.12: ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi 75

Bảng 3.13: Sự phụ thuộc của hiệu suất dẫn xuất các axít amin vào pH môi trường

80

Bảng 3.14: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào nhiệt độ tạo dẫn xuất huỳnh

quang 82

Bảng 3.15: Sự phụ thuộc của hiệu suất axít amin vào thời gian dẫn xuất 83

Bảng 3.16: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 1 (150 - 30ppb) 88

Bảng 3.17: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 2 (790 - 80ppb) 89

Bảng 3.18: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 3 (1490 - 150 ppb) 89

Bảng 3.19: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu cá quả 91

Bảng 3.20: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu cá quả 92

Bảng 3.21: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin đối với mẫu cá thu 93

Bảng 3.22: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin đối với mẫu cá thu

93

Bảng 3.23: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu hạt đậu 94

Bảng 3.24: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu tương

95

Bảng 3.25: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu đậu phụ 96

Bảng 3.26: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu phụ 97

Bảng 3.27: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng các axít amin trong mẫu sữa đậu nành 97

Bảng 3.28: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu các axít amin trong mẫu sữa đậu nành

98

Bảng 3.29: Độ thu hồi ở nồng độ thứ nhất 100

Bảng 3.30: Độ thu hồi ở nồng độ thứ hai 101

Bảng 3.31: Độ thu hồi ở nồng độ thứ ba 102

Bảng 3.32: Hàm lượng axít amin trong cá nước ngọt (g/100g) 104

Bảng 3.33: Hàm lượng axít amin trong cá nước mặn (g/100g) 105

Bảng 3.34: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu hạt đậu tương 109

Bảng 3.35: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu đậu phụ 110

Bảng 3.36: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu sữa đậu nành 111

Bảng 3.37: Hàm lượng axít amin trong một số loại thịt (g/100g) 114

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang

Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 32

Hình 2.2: Sắc đồ một chất 32

Hình 2.3 Tính bất đối của píc 34

Hình 3.1: Sắc đồ tách axít amin bằng dẫn xuất OPA trước cột, cột RP18 (150mm x

4,6mm x 5m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 340; em = 455)

47

Hình 3.2: Sắc đồ tách axít amin bằng dẫn xuất AQC trước cột, cột RP18 (150mm x

4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em =

395) 47

Hình 3.3: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 5mM dẫn xuất với AQC

trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ

huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 50

Hình 3.4: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 5mM dẫn xuất với AQC

trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ PDA

(= 254nm) 50

Hình 3.5: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM, cột RP18 (150mm

x 4,6mm x 5m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex=250; em=395)

52

Hình 3.6: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM,cột RP18 (150mm x

4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex=250; em=395)

52

Hình 3.7: Sắc đồ chuẩn axít glutamic, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ

dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 53

Hình 3.8: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m),

tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 53

Hình 3.9: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM khi chạy với pha

động không thêm trietylamin, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng

1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 58

Hình 3.10: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 50 mM khi chạy với pha

động có thêm trietylamin 17mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng

1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 59

Hình 3.11: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1,2ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =

250; em = 395), pha động chạy theo chế độ gradient 60

Hình 3.12: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;

em = 395), pha động theo chế độ gradient 60

Hình 3.13: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 0,8ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =

250; em = 395), pha động theo chế độ gradient 60

Hình 3.14: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 0,5ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =

250; em = 395), pha động theo chế độ gradient 61

Hình 3.15: Đường chuẩn định lượng Asp từ 0,149 đến 1,493 (g/ml) 68

Hình 3.16: Đường chuẩn định lượng His từ 0,015 đến 0,155 (g/ml) 68

Hình 3.17: Đường chuẩn định lượng Arg từ 0,046 đến 0,461 (g/ml) 68

Hình 3.18: Đường chuẩn định lượng Cys từ 0,149 đến 1,49 (g/ml) 68

Hình 3.19: Đường chuẩn định lượng Arg từ 0,092 đến 0,461 (g/ml) 69

Hình 3.20: Đường chuẩn định lượng Cys từ 0,298 đến 1,49 (g/ml) 69

Hình 3.21: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương, thêm

chuẩn ở nồng độ HCl 4,5M, ở 125 oC, trong 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x

3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 71

Hình 3.22: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào nồng độ HCl thủy

phân 72

Hình 3.23: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu đậu tương bằng HCl

6M ở 110 oC, trong 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng

1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 73

Hình 3.24: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào nhiệt độ thủy phân đậu

nành bằng HCl 6M 74

Hình 3.25: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương bằng

HCl 6M, ở 125oC, trong 20 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng

1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 74

Hình 3.26: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào thời gian thủy phân 75

Hình 3.27: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu sữa đậu nành sau khi

được làm giàu bằng cách thuỷ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng

1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 78

Hình 3.28: Sắc đồ 7 chuẩn axít amin được điều chỉnh pH bằng NaOH 0,5M, cột

RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang

(ex=250; em=395) 79

Hình 3.29: Sắc đồ chuẩn 7 axít amin điều chỉnh pH bằng Na2B4O7 0,25M, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex= 250;

em = 395) 80

Hình 3.30: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương được dẫn

xuất ở 65oC, thời gian 10 phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng

1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 81

Hình 3.31: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương được dẫn

xuất ở 65oC, thời gian 5 phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng

1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 83

Hình 3.32: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu cá quả, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;

em = 395) 104

Hình 3.33: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu cá thu, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;

em = 395) 105

Hình 3.34: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương, cột

RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex

= 250; em = 395) 107

Hình 3.35: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu đậu phụ, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;

em = 395) 108

Hình 3.36: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu sữa đậu nành, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;

em = 395) 108

Hình 3.37: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu thịt gà, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;

em = 395) 113

1

MỞ ĐẦU

Hiện nay, không chỉ riêng nước ta mà nhiều nước trên thể giới đang phải tiếp

tục giải quyết tình trạng nghèo đói và suy dinh dưỡng. Trong khi đó, thừa dinh

dưỡng kèm theo các bệnh mãn tính như tim mạch và tiểu đường đang trở nên một

thách thức lớn trong giai đoạn chuyển tiếp hiện nay. Vấn đề thừa cân và béo phì ở

một bộ phận dân cư đô thị (trẻ em, học sinh, lứa tuổi trung niên) và một số bệnh

mãn tính có liên quan đến dinh dưỡng như tăng huyết áp và đái tháo đường đang

nổi lên có ý nghĩa sức khỏe cộng đồng [3]. Để giải quyết vấn đề này cần thiết phải

kết hợp nhiều giải pháp chiến lược, trong đó đảm bảo một chế độ ăn lành mạnh và

phù hợp là một trong những giải pháp rất quan trọng. Các nghiên cứu về vai trò các

chất có hoạt tính sinh học trong chế độ ăn đối với các bệnh mãn tính như tim mạch,

béo phì và tiểu đường là rất cần thiết trong giai đoạn hiện nay. Để thực hiện những

nghiên cứu này, cần thiết phải xây dựng các cơ sở dữ liệu đối với các hoạt chất sinh

học trong tự nhiên như các vitamin và axít amin,...

Giá trị của một loại thức ăn không những phụ thuộc vào số lượng chất đạm

có trong thức ăn ấy mà còn phụ thuộc vào số lượng và tỷ lệ cân đối các axít amin,

nghĩa là chất lượng của protein thức ăn. Đối với các nước đang phát triển, thức ăn

động vật mà protein có chất lượng tốt còn chưa đủ, mà cần bổ sung thêm những loại

thức ăn thực vật giàu protein lại càng cần thiết. Nó giúp chúng ta có định hướng để

phối hợp các thức ăn với nhau nhằm nâng cao chất lượng của protein trong khẩu

phần hàng ngày của người dân.

Hàm lượng protein (chất liệu căn bản của cơ thể) mà mọi người cần được

cung cấp mỗi ngày là 1g/kg trọng lượng cơ thể. Thịt và cá có lượng protein ngang

nhau (15 - 25g) cho 100g thực phẩm ăn vào. Điều cần lưu ý, những loại thịt có màu

đỏ (thịt bò, thịt cừu, thịt ngựa) có chứa nhiều lipít. Một miếng thịt bò 150g chứa

nhiều lipít hơn cả một miếng bơ 10g; còn thịt màu trắng (thịt lợn, thịt bê, thịt gà, thịt

vịt) được xem là ít lipít nhưng lại kém về chất sắt.

Cá là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, lượng protein trong cá giao

động từ 16 - 17g/100g [12]. Cá có các axít béo cần thiết tốt cho phòng chống các

bệnh tim mạch. Đặc biệt mỡ gan cá có chứa nhiều vitamin A và D ngoài ra trong cá

2

cũng có nhiều nhóm vitamin B, axít folic, vitamin B12, vitamin E, bên cạnh đó cá

cũng là nguồn cung cấp các chất khoáng quý, dao động từ 1 - 1,7g/100g, có khi lên

tới 3g/100g, gồm các yếu tố vi lượng như: đồng, kẽm, i ốt. Mỡ cá không những có

đầy đủ thành phần axít béo không no mà nó còn chứa axít béo thiết yếu DHA.

Ngoài ra trong mỡ cá còn chứa axít béo Omega-3, có tác dụng bảo vệ hệ thống tim

mạch. Việc tiêu thụ axít béo này cũng làm giảm nguy cơ xơ cứng động mạch và cao

huyết áp [12]. Theo nhận định của FAO mức tiêu thụ cá tại Việt Nam vào khoảng

18,72 kg/người/năm. Cá là nguồn thực phẩm quý bổ sung lượng protein đáp ứng

nhu cầu sinh hoạt của người dân.

Trong chế độ ăn của người Châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng, các

thực phẩm từ đậu tương chiếm một vị trí quan trọng. Theo kết quả tổng điều tra

dinh dưỡng năm 2000 của Viện Dinh dưỡng, mức tiêu thụ thực phẩm nhóm đậu, đỗ

đã tăng lên đáng kể trong năm 2000, với khoảng 6g/người/ngày so với

2,8g/người/ngày trong năm 1990. Đậu phụ, loại thực phẩm giàu đạm thực vật thông

dụng ở Việt Nam cũng có mức tiêu thụ tăng lên đến 13,4g/người/ngày trong năm

2000 so với 6,8g/người/ngày trong năm 1990 [13].

Axít amin là một thành phần quan trọng của cơ thể. Axít amin tạo nên tế bào,

phục hồi mô, tạo nên các kháng thể chống lại vi khuẩn và virus. Axít amin là một

phần của enzym và hệ thống hormon. Nó tạo nên ARN (axit ribo nucleic), ADN

(axit deoxy nucleic) vận chuyển oxy đi khắp cơ thể và tham gia vào hoạt động của

các cơ. Axít amin cung cấp cho cơ thể từ thực phẩm giàu protein. Protein khi vào cơ

thể được chuyển hóa thành 20 axít amin, trong đó có 8 axít amin thiết yếu không

được tạo ra từ cơ thể, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, threonin,

tryptophan và valin. Sự thiếu hụt axít amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đường huyết,

dị ứng [81].

Trên thế giới, phương pháp truyền thống phân tích axít amin được đưa ra và

phát triển bởi Moore và Stein [63, 64, 65, 66] là tách và xác định các axít amin tự

do bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion với dẫn xuất sau cột (ninhydrin hoặc O-

phtalaldehyd). Kỹ thuật này đã được áp dụng hơn 40 năm cho kết quả tốt trong

giới hạn phân tích. Mặc dù vậy trong thời gian qua đã có nhiều phương pháp áp

3

dụng để phân tích axít amin như điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ

(LC/MS), sắc ký khí (GC/FID), sắc ký khí khối phổ [20, 21, 22, 23, 26, 32, 58].

Nhưng mỗi phương pháp có hạn chế riêng. Trong điều kiện phòng thí nghiệm của

Viện Dinh dưỡng, phương pháp dẫn xuất trước cột với 6-aminoquinolyl-N-

hydroxysuccinimidyl carbamat cho phép xác định cả axít amin bậc 1 và bậc 2 với

detectơ huỳnh quang (ex = 250 nm; em = 395 nm). Trên thế giới AQC chỉ mới

được sử dụng làm dẫn xuất để xác định axít amin trong nhiều đối tượng thực phẩm

phức tạp như xác định axít amin trong thức ăn trẻ em [58].

Tại Việt Nam, việc phân tích các thành phần có hoạt tính sinh học trong thực

phẩm còn hạn chế, chủ yếu mới có số liệu của một số loại carotenoid trong rau, quả.

Số liệu phân tích các axít amin trong thực phẩm Việt Nam còn thiếu, đặc biệt đối

với một số axít amin quan trọng như lysin, cystin,... Những nghiên cứu, phân tích về

thành phần dinh dưỡng và đặc biệt các thành phần có hoạt tính sinh học trong một

số loại thực phẩm như một số loại thịt; một số loại cá nước ngọt, cá nước mặn;

nhóm hạt đậu tương và các sản phẩm chế biến từ hạt đậu tương ở nước ta còn chưa

đầy đủ. Cho đến nay, tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về tách và

xác định đồng thời 17 axít amin trong một số nhóm thực phẩm thông dụng (gồm:

một số loại thịt, một số loại cá nước ngọt, cá nước mặn, cũng như hạt đậu tương và

các sản phẩm chế biến từ đậu tương) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Việc tách và xác định 17 axít amin trong một số loại thịt, một số loại cá nước

ngọt, cá nước mặn, cũng như hạt đậu tương và các sản phẩm chế biến từ đậu tương

giúp chúng ta có được cách phối hợp hiệu quả các thực phẩm với nhau để nâng cao

chất lượng của protein trong khẩu phần và như vậy là vấn đề cần thiết có tính thời

sự và thực tiễn phục vụ cho khảo sát nguồn thực phẩm giàu axít amin ở Việt Nam.

Đồng thời việc này cũng góp phần bổ sung, hoàn thiện số liệu của bảng thành phần

thực phẩm Việt Nam và cung cấp số liệu cho các nghiên cứu dinh dưỡng.

Vì vậy, đề tài này được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu tối ưu hóa các

điều kiện để tách và xác định một số axít amin trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng

hiệu năng cao (HPLC).

4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về protein và axít amin

1.1.1. Lịch sử phát hiện ra protein và axít amin [3, 6, 54]

Khái niệm protein (protit hay đạm) ngày nay rất quen thuộc với chúng ta,

song trước đây chỉ mới đầu thế kỷ thứ 19 người ta vẫn coi protein là một vấn đề bí

ẩn và khó hiểu.

Quan niệm xưa của Hypocrates cho rằng mọi thức ăn chỉ có một chất dinh

dưỡng phổ biến đã tồn tại cho đến thế kỷ 19. Tuy nhiên vào năm 1816 nhà y học

Pháp Franois Magendie (1783-1855) đã chỉ ra rằng các hợp chất chứa nitơ trong

thực phẩm là thiết yếu đối với chó và nhà y học Anh William Prout (1785-1850)

năm 1834 đã phân biệt được saccarin, chất béo và albumin trong nhóm các chất

dinh dưỡng. Nhà hóa học và y học Hà Lan Gerard Mulder (1802-1880) đã dùng

thuật từ protein lần đầu tiên vào năm 1839 (từ tiếng Hy Lạp protos nghĩa là đầu

tiên) từ đó protein được xem là chất dinh dưỡng quan trọng nhất.

Trong thế kỷ 19 phần lớn các axít amin được phân lập và xác định được cấu

trúc. Vào năm 1906, nhà hóa sinh Anh F. G. Hopkins (1861-1947) đã thấy rằng

dùng ngô là nguồn protein duy nhất không thể duy trì sự sống của súc vật thí

nghiệm trừ phi được bổ sung thêm tryptophan, điều đó xác định tính thiết yếu của

một số axít amin. Phát hiện đó đã mở đường cho rất nhiều công trình xác định giá

trị sinh học của protein, chủ yếu bởi các nhà khoa học Mỹ trong khoảng thời gian từ

1890 - 1924 (K. Thomas 1909, Osborn et al. 1919, Mitchell 1924).

Sau khi 2 axít amin cuối cùng được xác định (methionin vào năm 1922 và

threonin vào năm 1935) người ta đã có thể điều chỉnh chất lượng protein dựa vào

thành phần các axít amin cần thiết và tiến hành các thực nghiệm xác định nhu cầu

các axít amin cho động vật thực nghiệm và người (W. C. Rose 1957).

1.1.2. Phân loại protein [6, 54]

Chủng loại protein rất phức tạp, đại đa số các kết cấu hóa học vẫn chưa được

làm rõ, chỉ có thể dựa vào mức độ phức tạp về thành phần hóa học của chúng, mà

5

chia ra thành 2 loại là protein đơn thuần và protein kết hợp. Protein đơn thuần là

loại protein chỉ có các axít amin hợp thành, còn protein kết hợp là do protein đơn

thuần kết hợp với phần không phải protein tạo thành, như các loại liprotein có chứa

lipit, hemoglobin có chứa sắc tố, glycoprotein có chứa đường.

Nếu dựa theo tính chất lý hóa, protein còn có thể được chia thành 7 loại là

anbumin, globulin, prolamin, glutelin, histon, protamin và scleroprotein. Về mặt

dinh dưỡng học, thường dựa vào giá trị dinh dưỡng của protein để chia protein thức

ăn ra thành:

Protein hoàn toàn: Chứa tất cả các loại axít amin cần thiết, số lượng đầy đủ,

tỷ lệ thoả đáng, không chỉ có thể duy trì được sức khoẻ của người lớn, mà còn

có thể thúc đẩy sự sinh trưởng phát triển của trẻ nhỏ. Như casein,

lecithoprotein trong các loại sữa; ovalbumin trong các loại trứng; anbumin,

myoprotein trong các loại thịt; protein trong đậu nành, glutelin trong ngô.

Protein nửa hoàn toàn: Có chứa đủ tất cả các loại axít amin cần thiết, nhưng

có loại số lượng không đủ, tỷ lệ không hợp lý, có thể duy trì được sự sống,

nhưng không thể thúc đẩy sinh trưởng, phát triển, như gliadin trong tiểu mạch,

đại mạch.

Protein không hoàn toàn: Các loại axít amin cần thiết có chứa trong đó không

đầy đủ, vừa không thể duy trì được sự sống lại vừa không thể thúc đẩy được

sự sinh trưởng, phát triển. Như protein trong ngô, protein chất keo trong mô

liên kết và da thịt động vật, legumin trong đậu Hà Lan,...

1.1.3. Sự tiêu hóa và hấp thu protein [6, 54]

Protein phân tử lớn được hấp thu trong ruột, dưới tác dụng của nhiều loại

enzim tiêu hóa (như pepsin, tripsin, peptase) phân giải thành peptid ngắn và axít

amin trong dạ dày. Sau đó được hấp thu trong ruột non, theo tĩnh mạch chủ vào bên

trong gan.

Axít amin trong máu có 3 nguồn là từ protein trong thức ăn, từ sự phân giải

protein mô và từ sự chuyển hóa hydrat carbon và lipit.

Đường đi của axít amin trong máu là:

6

Hợp thành protein mô.

Hợp thành các protein đặc thù như enzim, hormon, kháng thể,…

Sản sinh ra urê, muối amoni và các chất có chứa nitơ khác.

Ôxy hóa thành khí carbonic, nước và urê, đồng thời sinh ra năng lượng.

Trong tình trạng bình thường tốc độ ra vào của các axít amin trong máu gần

như là ngang nhau, cho nên hàm lượng axít amin trong máu của người bình thường

là tương đối ổn định.

1.1.4. Công dụng sinh lý của protein [6, 54]

Chủ yếu có những mặt sau:

Cấu thành và bồi bổ các tổ chức của cơ thể

Thành phần cấu thành các enzim và các hormon

Cấu thành các kháng thể

Điều tiết áp lực thẩm thấu

Cung cấp năng lượng

Thiếu protein sẽ làm cho trẻ nhỏ sinh trưởng, phát triển chậm và không tốt; ở người

lớn sẽ gây sút cân, teo cơ, thiếu máu, dễ mệt mỏi, sức đề kháng thấp dễ bị chấn

thương, gẫy xương lâu liền, sau khi bị bệnh, phục hồi chậm; thiếu protein nặng sẽ

xuất hiện phù nề do dinh dưỡng.

1.1.5. Giá trị dinh dưỡng của protein [6, 54, 68]

Hàm lượng và chất lượng của thức ăn, chủ yếu chỉ giá trị protein trong thức

ăn đó. Thức ăn có hàm lượng cao, chất lượng tốt thì giá trị dinh dưỡng của protein

cao, còn ngược lại sẽ thấp. Giá trị dinh dưỡng của protein thức ăn chủ yếu được

quyết định bởi tỷ lệ hấp thu tiêu hóa và tỷ lệ tận dụng nó trong cơ thể; và tỷ lệ tận

dụng lại được quyết định bởi sự tạo thành các axít amin cần thiết (chủng loại, số

lượng và tỷ lệ của các axít amin cần thiết có trong đó). Khi sự tạo thành axít amin

cần thiết tiếp cận được với nhu cầu của cơ thể thì cả tỷ lệ tận dụng và giá trị dinh

dưỡng đều cao, còn ngược lại sẽ thấp.

Hàm lượng protein thức ăn có thể xác định được bằng việc đo hàm lượng

7

nitơ trong đó. Hàm lượng nitơ trong protein ở thức ăn tương đối ổn định. Nhân

lượng tổng nitơ đo được trong thức ăn với 6,25 sẽ có được hàm lượng protein. Tất

nhiên, hàm lượng nitơ trong các loại protein thức ăn có hơi chênh lệch nhau một

chút.

Tác dụng bổ sung lẫn nhau của protein

Khi ăn hỗn hợp 2 loại hoặc 2 loại protein thức ăn trở lên, giữa các loại axít

amin trong đó sẽ có sự bổ sung cho nhau, từ đó nâng cao được tác dụng của giá trị

dinh dưỡng trong protein thức ăn. Tác dụng bổ sung lẫn nhau này cũng thường

được vận dụng trong cuộc sống thường ngày của con người.

Giá trị dinh dưỡng trong protein thức ăn cao hay thấp sẽ được quyết định

bởi chủng loại, số lượng axít amin tạo thành protein và tỷ lệ tương hỗ giữa

chúng.

Những loại protein có axít amin đầy đủ, số lượng đầy đủ, tỷ lệ tương hỗ giữ

chúng hợp lý, thì giá trị sinh học (tức giá trị dinh dưỡng) sẽ cao. Nếu biết kết hợp ăn

hỗn hợp các protein thức ăn có giá trị sinh học tương đối thấp thì sẽ nâng cao được

giá trị sinh học của chúng. Khi ăn thức ăn hỗn hợp để phát huy được tác dụng tương

hỗ của các loại protein, thường là phải tuân theo một số nguyên tắc sau:

- Thuộc tính sinh học của các loại thức ăn càng xa nhau càng tốt, như khi ăn hỗn

hợp các thức ăn từ động vật và thực vật, thì giá trị sinh học của protein sẽ vượt

quá sự hỗn hợp giữa các loại thức ăn từ thực vật đơn thuần.

- Chủng loại thức ăn phối hợp với nhau càng nhiều càng tốt.

- Các loại thức ăn phải ăn cùng đồng thời, bởi vì sau khi một axít amin đơn nhất

được hấp thu vào cơ thể, thường cần phải dừng lại trong máu gần 4 tiếng; sau

đó đến các cơ quan tổ chức, rồi mới hợp thành protein của các cơ quan tổ chức;

và các axít amin mà protein được hợp thành ở các tổ chức cơ quan đòi hỏi phải

đến một cách đồng thời thì mới phát huy được tác dụng tương hỗ giữa các axít

amin để tạo nên protein của các cơ quan tổ chức.

Lượng cung cấp protein.

Hiện nay vẫn chưa có những chứng cứ đầy đủ cho thấy lượng nhu cầu

8

protein chịu sự ảnh hưởng của cường độ lao động, nhưng khi sự hấp thu năng lượng

từ bữa ăn tăng lên thì lượng hấp thu protein cũng tăng lên. Lượng cung cấp protein

trong bữa ăn hàng ngày do Hiệp hội dinh dưỡng Trung Quốc đề ra được tính toán

dựa theo mức năng lượng chiếm 11- 14% tổng năng lượng, trong đó ở trẻ em và

thanh thiếu niên là 13 - 14%, để đảm bảo cho nhu cầu sinh trưởng phát triển; ở

người lớn là 11 - 12% tức có thể bảo đảm duy trì được chức năng sinh lý bình

thường. Việc bổ sung năng lượng của những người lao động chân tay cực nặng chủ

yếu là từ thức ăn loại hạt cốc, mức protein chiếm trong đó tương đối thấp, nhưng

vẫn có thể đạt được 11% tổng năng lượng.

1.1.6. Nguồn protein [6]

Các thức ăn chủ yếu cung cấp protein cho cơ thể có thể là: các loại thịt gia

cầm, gia súc và các loại thuỷ sản, hàm lượng protein trong đó thường là 10 - 20%;

trong sữa tươi các loại là 1,5 - 3,8%; trong trứng các loại là 11 - 14%; trong đậu khô

các loại là 20 - 40% - là loại có hàm lượng protein tương đối cao trong các loại thức

ăn từ thực vật; các loại quả cứng như lạc, hồ đào, hạt sen,.... cũng chứa 15 - 30%

protein; hạt cốc các loại thường chỉ chứa 6 - 10% protein; khoai các loại chiếm 2 -

3% protein. Về việc cung cấp protein trong bữa ăn hiện nay nên xem xét trên cơ sở

lương thực mà gia giảm thêm một lượng nhất định protein từ động vật và protein từ

đậu các loại. Nếu lượng protein hấp thu mỗi ngày về mặt số lượng đạt tới tiêu chuẩn

lượng cần cung cấp, trong đó có trên 30% có nguồn gốc từ protein động vật và đậu

các loại thì sẽ có thể đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng một cách rất tốt.

1.1.7. Axít amin thiết yếu và không thiết yếu [6]

Cơ thể con người chỉ khi được cung cấp các loại axít amin thì mới có thể hợp

thành được protein. Có những loại axít amin có thể tổng hợp được trong cơ thể, gọi

là các “axít amin không thiết yếu”, có những loại axít amin không thể tổng hợp

được trong cơ thể, hoặc tốc độ tổng hợp không thể đáp ứng được nhu cầu sinh lý

sinh trưởng phát triển bình thường của cơ thể, mà đòi hỏi lấy từ trong thức ăn, gọi là

các “axít amin thiết yếu”.

9

Các axít amin không thiết yếu tuyệt đối không được hiểu lầm là không cần,

mà chỉ vì chúng có thể tổng hợp được trong cơ thể, nếu trong thức ăn có thiếu cũng

không quan trọng lắm. Các axít amin thiết yếu trong cơ thể bao gồm isoleusin,

leucin, valin, lysin, methionin, phenylalanin, threonin, tryptophan. Ngoài ra, histidin

là loại axít amin thiết yếu cho trẻ dưới một tuổi. Axít amin không thiết yếu bao gồm

alanin, arginin, axít aspartic, cystin, axít glutamic, glycin, serin, prolin và tyrosin,...

Công dụng chủ yếu của axít amin trong cơ thể là tạo thành protein. Ngoài ra,

có những loại axít amin còn có những đặc tính quan trọng khác. Xin đưa ra một số

ví dụ:

- Lysin: Một trong những loại axít amin cần thiết. Có thể cung cấp thành phần

cấu tạo hợp thành cytocilin, cytocilin là chất quan trọng thúc đẩy sự hợp thành

các axít béo trong tế bào. Trong phần lớn các loại hạt, hàm lượng lysin tương

đối thấp, thường ảnh hưởng đến tỷ lệ tận dụng sinh học (tức giá trị dinh dưỡng)

protein hạt ngũ cốc. Ngoài ra chất lysin về mặt hóa học có chứa 2 gốc amin, đây

là trường hợp duy nhất trong số các axít amin cần thiết. Một gốc amin thừa ra

trong đó có thể hoàn nguyên thành gốc aldehyd của đường glucose hoặc đường

sữa, tạo thành hợp chất đường amino, là loại mà các enzim tiêu hóa không thể

phân giải được và cũng không thể hấp thu được. Phản ứng này gọi là phản ứng

Melade, xảy ra trong khi tàng trữ và tăng nhiệt quá mức đối với thức ăn, sẽ làm

cho hàm lượng lysin vốn đã có tương đối ít trong sản phẩm hạt ngũ cốc lại càng

giảm xuống. Vì vậy, tăng thêm một lượng lysin thích hợp vào trong thức ăn sẽ

cải thiện được tình trạng dinh dưỡng của những người sống ở vùng dùng hạt

ngũ cốc làm lương thực chính.

- Trytophan: Một trong những loại axít amin cần thiết, một loại chất dẫn truyền

thần kinh quan trọng có thể tạo ra trong não người, chất 5- hydroxytryptamin có

tác dụng trung hoà adrenalin và noradrenalin, đồng thời cải thiện được thời gian

liên tục của giấc ngủ. Khi chất 5-hydroxytryptamin trong não động vật giảm, sẽ

có biểu hiện hành vi không bình thường, kể cả mất ngủ,... Ngoài ra, chất 5-

hydroxytryptamin còn có trong các tổ chức tiểu cầu và tế bào niêm mạc ruột,...

10

có tác dụng làm co mạch máu rất mạnh. Con người khi bị thương trong cơ thể

sẽ phóng thích chất 5-hydroxytryptamin để cầm máu.

- Phenylalanin và tyrosin: Phenylalanin là loại axít amin cần thiết. Cơ thể có thể

chuyển hóa phenylalanin thành tyrosin, nhưng không thể xảy ra phản ứng

ngược lại. Trong những cơ thể bình thường, hầu như tất cả các phenylalanin

chưa được dùng để hợp thành protein đều sẽ chuyển hóa thành tyrosin. Cho

nên, khi tyrosin trong bữa ăn dồi dào thì sẽ tiết kiệm được phenylalanin.

Tyrosin trong cơ thể sẽ chuyển hóa thành noradrenalin và adrenalin do adrenal

medlla tiết ra, và chất mẫn triiodothryonin. Ngoài ra, hắc sắc tố được sinh ra ở

da và võng mạc mắt cũng là do tyrosin chuyển hóa thành nhờ tác dụng của các

enzim. Những người thiếu phenylalanin decarboxylase do nhân tố di truyền sẽ

không thể chuyển hóa phenylalanine thành tyrosine được, và sẽ mắc một loại

bệnh khiếm khuyết bẩm sinh, gọi là chứng phenylceton niệu. Bệnh nhân loại

này không thể tận dụng được protein trong thức ăn và không thể ăn uống được

bình thường.

- Methionin, cystein và cystin. Ba loại axít amin có lưu huỳnh này là nguồn chủ

yếu của lưu huỳnh trong thức ăn. Lưu huỳnh là chất không thể thiếu trong việc

hình thành nên coenzim A và taurin trong cơ thể. Sự chuyển hóa của 3 loại axít

amin này có mối quan hệ tương hỗ với nhau, cystein và cystin có thể chuyển

hoán cho nhau. Trong cơ thể, methionin có thể biến thành cystein và cystin lại

không thể biến thành methionin được, cho nên cystein và cystin là các loại axít

amin không thiết yếu, còn methionin là loại axít amin thiết yếu. Khi cystein và

cystin được cung cấp trong bữa ăn dồi dào thì sẽ tiết kiệm được sự tiêu hao

methionin.

Sự chuyển hóa methionin có liên quan tới rất nhiều quá trình sinh hóa quan

trọng trong quá trình chuyển hóa, trước tiên hình thành một axít amin cung ứng

gốc methyl hoạt tính, đó là S-adenosin methionin (còn gọi là methione hoạt

tính). Theo nghiên cứu, trong cơ thể có 50 loại chất đòi hỏi S-adenosin

methionin cung cấp gốc methyl, như sự sản sinh các chất adrenalin, cholin,

11

creatin,... axit đều có liên quan đến việc di chuyển gốc methyl.

- Isoleucin, leucin và valin: Cả 3 loại này đều là các axít amin thiết yếu. Trong

kết cấu của chúng đều là mạch nhánh (mạch bên hoặc phần nhánh); gọi là các

axít amin mạch nhánh.

Các axít amin mạch nhánh chủ yếu là các axít amin tiến hành sự ôxy hóa ở cơ

xương, còn các axít amin khác phần nhiều là ôxy hóa ở gan. Trong các trạng

thái kích ứng như phẫu thuật, chấn thương,... thì sự hợp thành và phân giải

protein có vai trò quan trọng riêng biệt. Các axít amin mạch nhánh có thể làm

nguyên liệu để tổng hợp protein cơ bắp; và sẽ bị cơ bắp dùng làm nguồn cung

ứng ôxy hóa cho các chất là nguồn năng lượng; ngoài ra, người ta còn phát hiện

thấy leucin có thể kích thích sự tổng hợp riêng protein, đồng thời khống chế sự

phân giải nó, những năm gần đây đã khiến cho rất nhiều học giả phải chú ý tới

trong nghiên cứu về dinh dưỡng ngoại khoa và dinh dưỡng cho vận động viên.

- Axit Glutamic: Là một loại hợp chất có liên quan tới công năng của hệ thần

kinh - tiền chất của r- reanal; dinatri glutamat là loại bột ngọt thường dùng.

- Histidin: Khử carboxyl (khử COOH) dưới tác dụng của histidin decarbo-

xylase để hình thành nên histamin. Histamin có tác dụng giãn mạch rất mạnh,

đồng thời có liên quan tới rất nhiều phản ứng biến thái và chứng viêm.

Lượng nhu cầu các axít amin cần thiết được chỉ ra trong bảng 1.1 sau:

Bảng 1.1: Trị số ước lượng về lượng đòi hỏi các axít amin cần thiết

(mg/kg cân nặng/ngày)

Axít amin Trẻ dưới

1 tuổi Trẻ 2 tuổi

10-12

tuổi Người lớn Tỷ lệ

Histidin 28 ? ? (8- 12) (2,9)

Isoleucin 70 31 30 10 2,9

Leucin 161 73 45 14 4,0

Lysin 103 64 60 12 3,4

Methionin + Cystin 58 27 27 13 3,7

Phenylalanin+ 125 69 27 14 4,0

12

Tyrosin

Threonin 87 37 35 7 2,0

Tryptophan 17 12,5 4 3,5 1,0

Valin 93 38 33 10 2,9

Tổng cộng 714 352 261 84

Theo FAO/ WHO, 1983

* Tính theo người lớn

Trị số ước lượng về lượng nhu cầu axít amin được tổ chức Y tế thế giới

(WHO) và tổ chức Nông nghiệp và Lương thực thế giới (FAO) đưa ra căn cứ theo

các tài liệu nghiên cứu khác nhau, xem bảng 1.1.

Bảng 1.2: Đối chiếu các loại axít amin thiết yếu

Axít amin Gạo Tỷ lệ lượng đòi hỏi các axít

amin thiết yếu ở người lớn

Hàm lượng (%) Tỷ lệ

Ile 5,4 2,1 2,9

Leu 9,0 5,6 4,0

Lys 3,8 2,4 3,4

Met + Cys 4,1 2,7 3,7

Phe + Tyr 4,7 2,9 4,0

Thr 3,9 2,4 2,0

Try 1,6 1,0 1,0

Val 5,5 3,4 2,9

Mô thức axít amin thiết yếu: thường lấy lượng nhu cầu về axít amin trong cơ

thể làm cơ sở. Thường là lấy một axít amin có lượng nhu cầu ít nhất là 1,0 rồi so

sánh với các axít amin cần thiết khác để tìm ra tỷ lệ của mỗi loại. Chẳng hạn như

lấy lượng nhu cầu axít amin cần thiết của người lớn làm ví dụ, thì lượng nhu cầu về

tryptophan là ít nhất, lượng nhu cầu mỗi ngày cho mỗi kilôgam cân nặng là 3,5 mg,

lượng nhu cầu về isoleucin là 10mg, vậy tryptophan : isoleucin = 3,5:10; nếu

13

tryptophan là 1,0 thì isoleucin là 2,8, cứ dựa vào đây mà suy ra (bảng 1.2). Với loại

Protein hấp thu được trong thức ăn, sau khi tiêu hóa, hấp thu mà càng tiếp cận được

với nhu cầu protein được tổng hợp trong cơ thể, thì hiệu suất tận dụng trong cơ thể

sẽ càng cao. Cho nên giá trị dinh dưỡng của protein thức ăn được quyết định bởi

axít amin cần thiết.

Axít amin hạn chế

Chỉ loại axít amin tương đối thiếu hụt khi đối chiếu giữa hàm lượng axít

amin cần thiết trong protein thức ăn, với mô thức axít amin cần thiết, loại axít amin

thiếu hụt nhất trong đó được gọi là axít amin hạn chế thứ nhất, tiếp đó là axít amin

thứ hai, thứ ba. Chẳng hạn các loại axít amin hạn chế thứ nhất, thứ hai, thứ ba trong

gạo sẽ lần lượt là lysin, methionin và phenylalanin (bảng 1.2).

1.2. Định nghĩa và cấu trúc axít amin

Trong hóa học, một axít amin là một phân tử chứa cả nhóm amin và nhóm

carboxyl (nhóm axít). Trong hóa sinh, thuật ngữ này còn để chỉ alpha axít amin:

những axít amin mà trong đó nhóm amin và carboxylic gắn vào cùng một carbon,

gọi là αcarbon.

Công thức tổng quát của một axít amin như sau:

Trong tự nhiên axít amin tồn tại chính ở dạng α-axít amin, phần lớn các axít

amin có bốn phần tử khác nhau có khả năng thay thế ở vị trí C-2 (Cα). Nguyên tử

carbon α không có trung tâm đối xứng nên các axít amin có đồng phân quang học là

L - và D - axít amin, chỉ có glycin là không có đồng phân quang học (R=H). Trong

tự nhiên chủ yếu tìm thấy là dạng L - axít amin, D - axít amin chỉ tìm thấy trong vi

khuẩn, vách tế bào vi khuẩn.

Tất cả các axít amin có ít nhất hai nhóm ion hóa, điện tích chuẩn của axít

amin phụ thuộc vào giá trị pH. Nhóm COOH ở nguyên tử α-C có pKa vào khoảng

1,8 đến 2,8 do đó nó có độ axit hơn các monocarboxylic thông thường khác. Tính

14

bazơ của α-amin cũng thay đổi, pKa vào khoảng 8,8 đến 10,6 tùy thuộc vào từng

axít amin. Bảng chức năng của axít amin và tên gọi, cấu tạo của các axít amin tạo

nên protein được chỉ ra tại Phụ lục 1.

1.3. Tính chất hóa lý của protein và axít amin

1.3.1. Tính chất biến tính

Protein dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như nhiệt độ cao, áp suất lớn

hoặc các tia UV, tia X hoặc các chấn động cơ học, các tác nhân hóa học (kiềm hay

axít) ion kim loại nặng Cu2+

, Pb

2+,… làm cho cấu trúc bậc 2, 3, 4 bị phá huỷ cấu

trúc bậc 1 vẫn giữ nguyên làm cho tính chất của protein bị thay đổi đó là hiện tượng

protein bị biến tính.

Tính chất của protein sau khi biến tính:

- Giảm khả năng hòa tan do làm lộ các nhóm kỵ nước

- Giảm khả năng giữ nước

- Mất các hoạt tính sinh học

- Tăng khả năng tấn công Protease

- Làm giảm sức căng bề mặt

- Tăng độ nhớt nội tại

- Mất khả năng kết dính

1.3.2. Các tác nhân gây biến tính

* Nhiệt độ

Nhiệt độ cao làm biến tính protein làm các mạch của protein bị dãn ra. Vận

tốc biến tính phụ thuộc vào nhiệt độ, vận tốc tăng gấp đôi khi nhiệt độ tăng lên 100C

như vậy năng lượng liên kết làm bền cấu trúc của protein là yếu. Sự biến tính của

protein do nhiệt độ phụ thuộc vào bản chất và nồng độ của protein, hoạt độ nước, độ

pH, bản chất của các ion có mặt trong đó.

Sau khi biến tính nhiệt độ phân huỷ của protein bị giảm xuống là do xuất

hiện các nhóm kỵ nước ở bề mặt phân tử làm cho các phân tử protein bị giãn mạch

và tập hợp lại.

15

* Biến tính do xử lý cơ học

Các xử lý cơ học như nhào trộn cũng làm biến tính protein do phá huỷ cấu

trúc xoắn của protein.

* Biến tính bởi các tia UV, X

Dưới tác dụng của tia UV và tia X các axít amin mạch vòng bị đứt vòng và

đứt liên kết disulfid S S phá huỷ cầu đồng hóa trị tạo thành các gốc protein tự

do gây ra phản ứng trùng hợp protein.

* Biến tính bởi các ion kim loại nặng

Ion kim loại nặng có khả năng tạo phức với nhóm (S H) trong phân tử axít

amin và làm cho protein bị biến tính.

* Biến tính bởi dung môi hữu cơ

Các dung môi hữu cơ làm biến đổi hằng số điện môi của môi trường và như

vậy cũng làm biến đổi lực hút tĩnh điện của protein.

Các dung môi hữu cơ không phân cực sẽ xâm nhập vào các vùng kỵ nước

phá huỷ các tương tác kỵ nước và làm biến tính protein.

Các yếu tố làm biến tính protein thường được để loại bỏ protein ra khỏi dung

dịch và làm ngưng phản ứng enzym.

1.3.4. Tính chất lưỡng tính

Axít amin và protein đều có tính chất lưỡng tính tức là vừa có tính axít vừa

có tính bazơ. Phân tử axít amin có nhóm amin và nhóm carboxyl trong phân tử. Ở

pH trung tính axít amin tồn tại ở dạng ion lưỡng cực và trạng thái ion phụ thuộc vào

pH của môi trường. Khi đặt axít amin trong điện trường thì tuỳ thuộc vào pH mà di

chuyển về catot hay anot, ở một pH nào đó thì axít amin không di chuyển về bên

nào, đó là điểm đẳng điện của axít amin.

Như vậy protein cũng là lưỡng tính vì trong phân tử có nhiều nhóm axít

amin.

1.3.5. Tính kỵ nước

Dựa vào tính kị nước của protein có thể biết được độ lắng của dịch thuỷ phân

16

từ protein hoặc biết được vị trí của protein trong hay ngoài màng phospholipit.

Mức độ kỵ nước trung bình được tính theo công thức

0G = n

G 0

Trong đó: 0G : là năng lượng vận chuyển tự do

n : số gốc axít amin

Nếu

0G > 5.85 kJ thì dịch thuỷ phân có vị đắng

0G < 5.43 kJ thì dịch thuỷ phân không có vị đắng

1.3.6. Tính chất hóa học của protein và axít amin

Do trong phân tử protein có nhiều chuỗi polipeptid nên ta có thể chia thành

các nhóm phản ứng sau:

- Phản ứng của liên kết peptid

- Phản ứng thủy phân bởi enzym

- Phản ứng đặc trưng của một số gốc axít amin trong phân tử

- Phản ứng của nhóm - amin tự do của chuỗi polipeptid

Phản ứng thủy phân bởi enzym

Dưới tác dụng của enzym, protein bị thủy phân thành các axít amin và mỗi

một phản ứng phải cần một enzym đặc hiệu để xúc tác cho phản ứng đó.

Phản ứng Biurê

Phản ứng Biurê là phản ứng đặc trưng của liên kết peptid. Trong môi trường

kiềm mạnh liên kết peptid trong phân tử protein phản ứng với CuSO4 tạo

thành phức chất có màu tím hoặc đỏ. Phản ứng này được dùng để phát hiện

định tính và định lượng Protein.

Phản ứng với thuốc thử Folin

Protein có khả năng phản ứng với thuốc thử Folin tạo thành dung dịch có

màu xanh da trời có cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng protein trong

một giới hạn nhất định và có thể đo được bằng máy đo quang và dựa vào

đường chuẩn ta có thể tính được hàm lượng của protein thành phần.

17

Phản ứng với Ninhydrin:

Đây là phản ứng màu dùng để định tính và định lượng axít amin. Tất cả các

- axít amin của protein đều có phản ứng với ninhydrin tạo thành hợp chất

có màu xanh tím, riêng prolin thì tạo thành màu vàng. Do phản ứng này rất

nhạy, có thể phát hiện đến ppm.

Phản ứng của nhóm - amin với formaldehyd: đây là phản ứng quan trọng

dùng để đánh giá mức độ thủy phân của protein. Phương pháp xác định

nitơ theo phương pháp này gọi là phương pháp định lượng nitơ formol.

Ngoài ra axít amin còn có một số tính chất riêng như sau:

- Axít amin có khả năng kết tinh

- Bền với nhiệt độ khoảng 1000C đến 200

0C trong 2 giờ

- Khá bền trong môi trường axít, không bền trong môi trường kiềm

(trong môi axít chỉ có trytophan bị phá huỷ)

- Tính chất đồng phân quang học (hoạt quang)

- Tất cả các axít amin đều có đồng phân quang học (trừ Glycin)

- Đa số các axít amin tự nhiên đều tồn tại ở dạng L - axít amin (chỉ ở

dạng này thì các axít amin giá trị dinh dưỡng con người và động

vật).

1.4. Tổng quan về các phương pháp định lượng protein và axít amin

Các phương pháp thông thường định lượng axít amin dựa chủ yếu vào sự có

mặt của nitơ trong phân tử axít amin. Vì khối lượng phân tử của các axít amin khác

nhau, nên kết quả thường biểu thị bằng nitơ axít amin.

1.4.1. Định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjeldahl [9]

Phương pháp định lượng nitơ toàn phần đơn giản và chính xác là phương

pháp Kjeldahl. Thực phẩm được vô cơ hóa bằng H2SO4 đậm đặc có chất xúc tác.

Sau khi vô cơ hóa, nitơ tồn tại ở dạng muối amoni sunfat (NH4)2SO4, dùng một

kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 thành NH3 tự do và

định lượng NH3 bằng axit. Từ số ml axít dùng để chuẩn độ tính ra được nitơ toàn

18

phần trong mẫu thử.

Phương pháp Kjeldahl định lượng nitơ toàn phần nghĩa là nitơ của protít thô

(gồm nitơ protein, péptit, polypeptid và nitơ của các chất phi protein).

1.4.2. Định lượng protein hòa tan [9]

Phương pháp định lượng protein hòa tan dựa vào việc tách và kết tủa protein

ra khỏi chất thử, rồi định lượng nitơ trong kết tủa protein theo phương pháp

Kjeldahl.

1.4.2.1. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp thông thường

Phương pháp Stutzer-Barnstein [9]

Chiết protein từ thực phẩm bằng đun sôi với nước. Kết tủa protein bằng CuSO4

trong môi trường kiềm. Tách kết tủa bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sạch tủa

bằng nước cất. Định lượng nitơ toàn phần trong kết tủa bằng phương pháp

Kjeldahl.

Phương pháp dùng axit tricloacetic (theo Greenwald) [9]

Chiết protein từ thực phẩm bằng nước. Kết tủa protein bằng axít tricloacetic để

qua đêm. Tách kết tủa bằng cách lỏng qua giấy lọc, rửa sạch tủa bằng axít

tricloacetic loãng. Định lượng nitơ toàn phần trong kết tủa bằng phương pháp

Kjeldahl.

Phương pháp sử dụng tananh (theo Mothes) [9]

Chiết protein từ thực phẩm bằng nước. Kết tủa protein bằng tananh. Tách kết tủa

bằng cách lỏng qua giấy lọc, rửa sạch tủa bằng nước cất. Định lượng nitơ toàn

phần trong kết tủa bằng phương pháp Kjeldahl.

Phương pháp sử dụng natrisulfat và cồn ở môi trường axit [9]

Kết tủa protein bằng dung dịch natri sulfat bão hòa và cồn 78oC ở môi trường

axit. Định lượng phần nitơ phi protein trong dịch lọc bằng phương pháp

Kjeldahl. Nitơ protein được tính bằng nitơ tổng số trừ nitơ phi protein.

1.4.2.2. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp so màu [9]

Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu2+

thành phức chất màu tím (phản

ứng này còn gọi là phản ứng Biurê) có công thức như sau:

19

N Cu N

OH

OC

NH

OC

NNa

OH

OC

NH

OC

NNa

OH

OH

Màu sắc của phức tỷ lệ với số lượng mạch peptid (-CONH-) của protein và

gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin. Dựa vào

việc so sánh tỷ lệ màu của dãy chuẩn protein và mẫu thử protein đã được tách ra

khỏi thực phẩm bằng máy quang kế ở bước sóng λ = 550 nm tính được hàm lượng

protein hòa tan trong mẫu thực phẩm.

1.4.3. Định lượng protein tiêu hóa bằng pepsin [9]

Mẫu thực phẩm được trộn cùng với men pepsin trong một cốc thủy tinh, ủ

trong tủ ấm 37 - 40OC trong 48 giờ, thỉnh thoảng lắc. Lọc lấy phần không hòa tan

loại protein tiêu hóa bằng pepsin, định lượng nitơ trong phần không hòa tan bằng

phương pháp Kjeldahl. Nitơ của protein tiêu hóa bằng pepsin được tính bằng hiệu

nitơ toàn phần trừ đi nitơ của phần không hòa tan.

1.4.4. Định lượng nitơ axít amin bằng phương pháp chuẩn độ

1.4.4.1. Định lượng nitơ formol [9]

Các axít amin trong dung dịch nước thường trung tính, không những do hai

nhóm chức axit (-COOH) và nhóm amin (-NH2) trung hoà lẫn nhau, mà còn do cả

hai nhóm chức ấy đều yếu, quá trình điện ly rất kém. Khi gặp formol nhóm NH2,

kết hợp với formol thành nhóm metylenic - N = CH2 mất tính chất kiềm, do đó tính

chất của nhóm axit COOH nổi bật lên và có thể định lượng được bằng cách

chuẩn độ kiềm dùng phenolphtalein làm chỉ thị màu. Phản ứng như sau:

R CH COOH

NH2 + OCH2

R CH

N CH2

COOHH2O

20

1.4.4.2. Định lượng nitơ axít amin bằng iốt [9]

Trong môi trường dung dịch đệm borat hoặc phosphat, các axít amin phản

ứng với muối đồng tạo thành một phức chất “axít amin - đồng” hòa tan, theo phản

ứng:

COOH

NH2

R CH Cu2+

COOH

CH

H2N

R CH

NH2

Cu

OC

NH2

CH

CO

O O

RR

Định lượng Cu2+

trong phức chất theo phương pháp định lượng gián tiếp bằng iốt.

2Cu2+ 4KI 2CuI I2

I2 Na2S2O3 Na2S4O62NaI

Từ đó tính ra được hàm lượng nitơ axít amin trong mẫu thử.

1.4.4.3. Định lượng axít amin theo phương pháp Van Slyke [9]

Axít amin trong môi trường axít nitric sẽ phản ứng tạo ra khí N2 ở thể tự do

theo phản ứng:

R CH NH2

COOH

R CH

COOH

OHH2OO N OH N2

Khí N2 giải phóng một nửa là từ axít amin, một nửa từ axit nitric. Xác định thể

tích N2 ở điều kiện nhiệt độ và áp suất, tra bảng tính sẵn, sẽ có trọng lượng nitơ. Từ

đó tính ra hàm lượng nitơ axít amin trong mẫu thử.

1.4.5. Các phương pháp tách và xác định đồng thời axít amin

Nhược điểm của các phương pháp xác định protein và axít amin đã đề cập ở

trên là chỉ xác định được tổng số nitơ mà không thể xác định được riêng rẽ từng axít

amin. Để khắc phục nhược điểm này thì phải tách từng chất nhóm axít amin trước

khi xác định chúng. Điều này ngoài việc xác định được từng axít amin riêng biệt mà

còn tránh được ảnh hưởng của các nitơ khác đến việc xác định axít amin. Có nhiều

phương pháp để định lượng axít amin, mỗi phương pháp có độ nhạy và khả năng

21

phân tích rất khác nhau. Phần lớn các phương pháp phân tích định lượng riêng biệt

từng axít amin dựa trên việc tách axít amin thành dạng tự do bằng sắc ký trao đổi

ion sau đó phát hiện bằng dẫn xuất sau cột hoặc trước cột. Kỹ thuật xác định sau cột

được áp dụng với mẫu có hàm lượng muối tạp thấp. Kỹ thuật tách và xác định axít

amin bằng phản ứng dẫn xuất trước cột và sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng

cao pha ngược cho độ nhạy cao hơn so với dẫn xuất sau cột và đặc biệt là kỹ thuật

trước cột có thể áp dụng phân tích với các mẫu có chứa nhiều muối.

1.4.5.1. Các phương pháp sắc ký cổ điển

1.4.5.1.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng

Phương pháp sắc ký bản mỏng được triển khai bởi Bailey, J. L., [20] rất dễ

thực hiện. Vì thế nó cũng được sử dụng để xác định axít amin. Tác giả Phạm Văn

Sổ và Bùi Thị Như Thuận [9] đã dùng pyridin làm dung môi triển khai chạy sắc ký

bản mỏng, sau khi các axít amin được tách riêng trên bản mỏng, dựa vào chiều cao,

diện tích vết của mẫu so với vết mẫu chuẩn sẽ tính ra được hàm lượng các axít

amin. Phương pháp này tách tốt nhưng phải sử dụng dung môi rất độc, độ chính xác

không cao. Ngày nay với sự phát triển của các phương pháp sắc ký hiện đại, việc

tách và xác định axít amin không áp dụng trên sắc ký lớp mỏng nữa.

1.4.5.1.2. Phương pháp sắc ký cột

Phương pháp sắc ký cột là một phương pháp sắc ký cơ bản đơn giản, nó là

nền tảng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sau này.

Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột dùng ninhydrin đã được áp

dụng xác định axít amin từ những năm 1940 bởi Moore, S., Stein, W. H., [64, 65]

và sau này được nhiều tác giả áp dụng và cải tiến và được áp dụng trong xác định

axít amin ở nhiều đối tượng khác nhau [17, 20, 21, 42, 43, 56, 63, 64, 65, 66, 71,

76]. Nguyên lý cơ bản là axít amin được tách ra bằng cột trao đổi ion, phản ứng với

ninhydrin tạo phức chất màu vàng, đo độ hấp thụ quang của phức màu thu được

bằng quang kế có bước sóng 440 nm và 570 nm cho giới hạn xác định đến 10 pM

với hầu hết các axít amin và 50 pM với prolin. Mặc dù phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao (HPLC) đã thực sự phát triển và áp dụng xác định axít amin ở nhiều

22

đối tượng, nhưng phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột ninhydrin vẫn được

áp dụng và tiếp tục hoàn thiện cho tận đến ngày nay do sử dụng thiết bị rẻ tiền,

thuận tiện cho phân tích lượng lớn. Bằng việc thay chuẩn hóa thời gian, ổn định

nhiệt độ, nhiệt độ dẫn xuất, pH và môi trường đệm chạy sắc ký, đặc biệt là thay thế

dung dịch rửa giải là hỗn hợp lithi hydroxyd/axit acetic được thay thế bằng natri

hydroxyt/axit acetic Shi-Wen Sun, Yi-cheng Lin & cộng sự [73] đã rút ngắn được

thời gian chỉ còn 30 phút khi tách và xác định đồng thời 10 axít amin.

Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột là o-phthalaldehyd (OPA), các

axít amin sau khi được tách ra khỏi cột trao đổi ion được dẫn xuất bằng OPA tạo

phức chất có tính chất phát huỳnh quang, đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích

348nm và bước sóng phát xạ là 450 nm. Phương pháp có thể tách và xác định đồng

thời các axít amin bậc 1 với giới hạn phát hiện đạt tới 20 pM [43]. Dẫn xuất OPA có

hạn chế lớn là không phản ứng được với các axít amin bậc 2.

Phương pháp tách sắc ký cột cổ điển là phương pháp đơn giản có thể áp dụng

cho bất kỳ phòng thí nghiệm nào. Tuy nhiên, do thời gian tách lâu, khả năng tách

không cao so với các kỹ thuật hiện đại nên nó chỉ được áp dụng trong các đối tượng

tách đơn giản.

1.4.5.1.3. Phương pháp chuẩn độ điện thế [19]

Trong phương pháp này, sau quá trình xử lý mẫu để tách các axít amin ra

khỏi nền mẫu và loại các chất ảnh hưởng, các axít amin sẽ được tách trên cột sắc

ký: 500 - 22 mm, 30 ml, Dowex 50W-X8 (dạng H+) và chuẩn độ điện thế theo từng

phân đoạn tách. Ser, Thr, Asp sẽ được rửa giải với HCl 0,8M với tốc độ dòng qua

cột là 0,5ml/phút, sau khi HCl 0,8M đi ra khỏi cột. Thêm HCl 1M và điều chỉnh tốc

độ dòng đến 25-30 giọt/phút để rửa giải Glu và Gly. Các phần dịch rửa giải ở các

phân đoạn khác nhau được được cho vào các cốc thuỷ tinh và điều chỉnh pH=7 với

NaOH 0,1M. Dung dịch HCHO 37% cũng được điều chỉnh về pH=7 với NaOH

0,1M. Sau đó phần mẫu thử và dung dịch HCHO được trộn với nhau theo tỷ lệ 1:9

bằng máy khuấy từ 10 phút. Chuẩn độ hỗn hợp trên bằng phương pháp đo điện thế

với NaOH 0,1M. Song song mẫu trắng được tiến hành bằng việc chuẩn độ tới pH =

23

8,9 hỗn hợp của HCHO với HCl 1M (1:9) đã được trung hòa tới pH = 7.

Từ lượng NaOH 0,1M tiêu tốn để chuẩn độ mẫu thử và mấu trắng tính ra

được hàm lượng các axít amin bằng bảng quy đổi [19].

1.4.5.2. Phương pháp sắc ký khí

Sắc ký khí (Gas chromatography: GC) là một kỹ thuật tách và phân tích đồng

thời các chất trong một hỗn hợp mẫu ở trạng thái khí, phương pháp này rất phát

triển trong những năm gần đây sử dụng để phân tích định tính và định lượng các

chất hữu cơ trong một hỗn hợp mẫu phức tạp.

Tác giả Y. C. Fiamegos, C. D. Stalikas [82] đã tách và xác định được 19 axit

amin trong nước tiểu, nước hoa quả và bột mì bằng phương pháp sắc ký khí với

detectơ khối phổ (GC/MS) và detectơ ion hóa ngọn lửa (GC/FID). Theo phương

pháp này, các axít amin tự do được chuyển thành dạng pentaflorobenzyl nhờ xúc tác

chuyển pha tetrabutylamoni bromua, được dẫn xuất hóa thành dạng dễ bay hơi với

pentaflorobenzyl bromid, chiết bằng diclormetan rồi phân tích bằng phương pháp

GC/MS và GC/FID. Còn đối với các axít amin liên kết với protein sẽ được phân

tích sau bước thủy phân bằng NaOH 5M. Giới hạn phát hiện của phương pháp nằm

trong khoảng 0,7 - 2,3 pM với GC/MS và từ 1,7 - 6,9 pM với GC/FID.

Cũng với detectơ khối phổ nối tiếp, nhưng tách bằng hệ thống sắc ký lỏng

mao quản, tác giả Y. Song và cộng sự [81] đã tách và xác định được 12 axít amin

được dẫn xuất với 7-floro-4-nitrobenzoxadiazol trong các mẫu sinh học. Quá trình

dẫn xuất được thực hiện ở nhiệt độ cao, nồng độ axít amin đem dẫn xuất có thể thấp

tới 2,5 × 10-7

M. Độ thu hồi của phương pháp này đạt trên 97%.

Tác giả H. Ali và cộng sự [36] đã tách và định lượng được các đồng phân

hình học D, L của các axít amin trong thuốc lá và các sản phẩm thuốc lá sử dụng

sắc ký khí khối phổ (GC-SIM-MS). Các axít amin được tách ra khỏi các mẫu thuốc

lá bằng dung dịch metanol 70% và được làm sạch qua cột trao đổi cation. Sau đó,

chúng được chuyển thành dạng este N(O)-pentafloropropionyl axít amin (2)-propyl

và các đồng phân hình học được tách và định lượng bằng GC-SIM-MS trên cột mao

quản Chirasil-L-Val.

24

Phương pháp sắc ký khí là một phương pháp tách rất phát triển và cũng đã

được nhiều tác giả trên thế giới áp dụng để tách và xác định axít amin trong một số

đối tượng khác nhau, nhưng để áp dụng phân tích axít amin thông dụng là rất phức

tạp và giá thành cao do axít amin là hợp chất không dễ bay hơi và không tan tốt

trong các dung môi hữu cơ nên quá trình thực hiện khá phức tạp và tốn dung môi.

Ngoài ra khí mang là Heli là rất tốn kém nên phương pháp sắc ký khí không được

áp dụng rộng rãi trong tách và xác định axít amin.

1.4.5.3. Phương pháp điện di mao quản

Phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao, hay còn gọi là điện di mao

quản thế cao là một kỹ thuật tách và xác định đồng thời các chất trong một hỗn hợp

mẫu dựa theo nguyên lý của sự điện di của các chất trong ống mao quản nhỏ có

chứa dung dịch đệm điện di với giá trị pH nhất định và được điều khiển bởi cường

độ điện trường E do nguồn điện thế cao một chiều V(14-30 KV) đặt vào hai đầu

mao quản. Phương pháp này tách các chất là các ion hoặc các chất không ion nhưng

có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp đặt trong điện

trường, do điện tích và linh độ điện di của các chất khác nhau, chúng di chuyển với

tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

M. Ummadi, B. C. Weimer [59] đã phát triển phương pháp điện di mao quản

huỳnh quang laze (CE-LIF) để phát hiện và định lượng 17 axít amin tại nồng độ

mM. Các axít amin được dẫn xuất với 3-(4-carboxybenzoyl)-2-quinolin-

carboxaldehyd trước khi phân tích bằng CE-LIF. Môi trường tách là hệ đệm chứa:

borat 6,25 mM, SDS 150 mM, và THF 10 mM (pH = 9,66) tại 25oC, điện thế 24

kV. Độ biến động của phương pháp trong giới hạn từ 0,3 - 0,9% trong một ngày và

từ 0,7 - 1,5% giữa các ngày. Các tác giả đã ứng dụng phương pháp này để theo dõi

sự thay đổi nồng độ axít amin trong quá trình chuyển hóa vi khuẩn.

Sử dụng phương pháp điện di mao quản vùng (CZE), G. Zunic và cộng sự

[35] đã tách và định lượng được 30 axít amin tự do và các peptid trong các dịch sinh

lý học, với sự phát hiện gián tiếp thông qua việc theo dõi tính chất của chất nền.

Quá trình xử lý mẫu chỉ yêu cầu bước kết tủa protein và pha loãng. Môi trường tách

25

là đệm axit p-aminosalicylic và natri carbonat tại pH = 10,2 ± 0,1. Quá trình điện di

được thực hiện trong một mao quản (87 cm, đường kính 75 μm) với điện thế không

đổi 15 kV tại 20oC, trong vòng 30 phút. Giới hạn phát hiện từ 1,93 - 20,08 pM/l

(trung bình 6,71 pM/l). Khoảng tuyến tính từ 50 - 200 pM/l.

Cũng với hệ thống điện di mao quản nhưng sử dụng detectơ điện hóa (CE-

ED), J-J. Xu và cộng sự [46] đã cải tiến điện cực làm việc, tìm ra điều kiện tối ưu

cho sự tách và định lượng các axít amin tự nhiên, đại diện để khảo sát là: Arg, Thr,

Glu, Cys; chất nền là Na2B4O7 5,0 mM, pH = 9,3 tại nhiệt độ phòng.

Phương pháp điện di mao quản tuy mới ra đời vào những năm 1995, nhưng

nó đã phát triển rất nhanh ở nhiều nước, hiện tại đã đã được áp dụng ở Việt Nam

nhưng có rất ít các phòng thí nghiệm có thiết bị này nên chưa được phát triển rộng

rãi ở Việt Nam.

1.4.5.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp HPLC là phương pháp hiện đại và phát triển mạnh trong những

năm 80, 90. Nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như sinh

hóa, hóa học, môi trường và đặc biệt với việc phân tích các vitamin và axít amin.

Những nghiên cứu tách và xác định axít amin đã có số lượng lớn các bài báo

công bố với các quy trình tách và xác định axít amin [26, 40, 47, 53, 58, 75, 76, 80,

83].

Đây là phương pháp phổ biến nhất để xác định axít amin. Sau thủy phân các

axít amin sẽ được dẫn xuất để tạo sản phẩm phát huỳnh quang. Các dẫn xuất này sẽ

được tách nhờ hệ thống HPLC, được phát hiện và định lượng bằng detectơ huỳnh

quang (RF).

Bằng phương pháp này, tác giả J. You và cộng sự [47] đã sử dụng tác nhân

huỳnh quang 1,2-benzo-3,4-dihydrocarbazol-9-ethyl cloroformat (BCEOC) để xác

định các axít amin từ thực vật, tinh dịch động vật và sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng

cao (HPLC) với detectơ huỳnh quang và detectơ khối phổ (LC/ESI-MS/MS). Các

axít amin dạng tự do trong tinh dịch được chiết bằng hỗn hợp etanol-nước (60:40,

v/v), còn trong thực vật được thủy phân bằng axít hydrocloric 6 M, ở 110oC trong

26

24 giờ. Sau đó, được dẫn xuất với BCEOC trong môi trường bazơ, loại tác nhân dẫn

xuất dư và phân tích bằng hệ thống HPLC với cột Hypersil BDS C18, với tác nhân

rửa giải: acetonitril, đệm axit formic, nước theo chương trình gradient. Hiệu suất

của phương pháp là 92 - 108%. Giới hạn phát hiện là 6,3 fmol cho Lys và 177,6

fmol cho His.

Cũng bằng phương pháp HPLC/RF, tác giả L. Bosch và cộng sự [58] đã tách

và định lượng được 17 axít amin trong thức ăn trẻ em sử dụng tác nhân dẫn xuất 6-

aminoquinolyl-N-hydroxysccinimidyl carbamat (AQC). Tất cả các axít amin (trừ

Cys và Met) được tách ra khỏi nền mẫu bằng sự thủy phân với HCl 6M trong môi

trường khí trơ, ở 110oC trong 23 giờ. Quá trình dẫn xuất với AQC được thực hiện

trong môi trường bazơ. Các dẫn xuất được tách trên cột Nova-PakTM

, rửa giải bằng

hỗn hợp đệm acetat-phosphat, acetonitril, nước theo chương trình gradient, phát

hiện bằng detectơ huỳnh quang (λex = 250 nm, λem = 395 nm). Khoảng tuyến tính:

0,0025 - 0,2 mM; độ chính xác của phương pháp CV: 0,2 - 3,5% ; hiệu suất dẫn

xuất: 86 - 106%, hiệu suất thu hồi của phương pháp: 88,3 - 118,2%. Giới hạn phát

hiện: 0,016 - 0,367 mM; giới hạn định lượng: 0,044 - 1,073 mM.

Sử dụng hai tác nhân dẫn xuất o-phthalaldehyd-3-mercaptopropionic axit

(OPA) và 9-florenylmethyl cloroformat (FMOC) để dẫn xuất cho cả axít amin bậc 1

và bậc 2, tác giả D. Heems và cộng sự [26] đã tách và định lượng được 25 axít amin

trong thức ăn, đồ uống. Các mẫu sau khi thủy phân axit với HCl 6M, được bay hơi

tới khô dưới chân không, và hòa tan lại cặn bằng HCl 0,1M. Quá trình dẫn xuất

trước cột của các mẫu lỏng được thực hiện tự động bởi thiết bị ASTED, sử dụng

phản ứng kết hợp OPA/FMOC và được làm sạch bởi sự thẩm tích, rồi bơm vào hệ

thống HPLC. Phổ huỳnh quang của các dẫn xuất OPA-3-MPA được ghi lại tại λex

= 335 nm, λem = 440 nm; còn các dẫn xuất FMOC tại λex =260 nm, λem = 315

nm. Với hầu hết các axít amin, giới hạn phát hiện < 100 μg/l, khoảng tuyến tính từ

0,5 - 100 mg/l.

Bằng quá trình dẫn xuất trước cột tự động (SI) kết hợp với sắc ký lỏng (LC),

C. K. Zacharis và cộng sự [23] đã xác định được 14 axít amin trong dược phẩm sử

27

dụng chất dẫn xuất là o-phthaldialdehyd (OPA). Hệ thống SI có tác dụng lấy mẫu

và hóa chất dẫn xuất, trộn và tự động đưa đến hệ thống bơm mẫu của LC. Bằng

phương pháp sắc ký lỏng pha ngược cho phép tách và xác định 14 axít amin trong

vòng 35 phút bằng phổ huỳnh quang với λex = 340 nm, λem = 455 nm. Giới hạn

phát hiện dưới 30 μg/l cho tất cả các axít amin, khoảng tuyến tính 0,05 - 10 mg/l.

Hiệu suất thu hồi của phương pháp nằm trong giới hạn xác định từ 93,8 - 108,6%.

Bảng 1.3: Tổng hợp các chất dẫn xuất xác định axít amin bằng RP-HPLC [76]

TT Dẫn xuất Detectơ LOD Thời

gian tách

Điều kiện

chạy Ưu điểm

1 AQC

Huỳnh

quang

(λex:250nm,

λem:295nm)

UV:254nm

160 fmol

35 phút

Dẫn xuất

trước cột

Gradient

ổn định, tách

tốt. Độ nhạy,

độ đúng, độ

lặp lại cao.

2 Dabsylclorid

(4-4) VIS: 436 nm 200 fmol

44 phút

Dẫn xuất

trước cột

Đẳng

dòng

Ổn ®Þnh,

t¸ch tèt.

§é lÆp

l¹i cao.

3 Dabsylclorid

(5-1)

Huỳnh

quang

(λex:360-

385 nm,

λem:460-495

nm)

UV: 254nm

50 pM

90 phút

Dẫn xuất

trước cột

Đẳng

dòng

Ổn ®Þnh

tèt

4 Fluorescamin

Huỳnh

quang

(λex:390nm,

λem:475nm)

20-100

pM

90 phút

Dẫn xuất

sau cột

Gradient

Phản ứng

nhanh, ổn

định, tách

tốt.

5 FMOC Huỳnh 1 pM 45 phút Gradient Ổn ®Þnh,

28

quang

(λex:265nm,

λem:320nm)

UV:265nm

Dẫn xuất

trước cột

t¸ch tèt.

Sö dông

cïng OPA

®Ó t¸ch

amin bËc

2

6 Ninhydrin

UV-VIS

Amin bậc 1 -

440 nm

Amin bậc 2 -

570 nm

100 pM

30 phút

Dẫn xuất

sau cột

Đẳng

dòng Độ nhạy kém

7 OPA

Huỳnh

quang

(λex:340nm,

λem:455nm)

50 fmol

90 phút

Dẫn xuất

sau cột,

17-35

phút dẫn

xuất

rước cột

Gradient

Ổn ®Þnh

ng¾n,

t¸ch tèt.

8 PITC UV 254 1pM

15-27

phút dẫn

xuất

rước cột

ảnh

hưởng

bởi muối

ổn định, tách

tốt. Độ nhạy,

độ đúng, độ

lặp lại cao.

Dabsylclorid (4-4): 4-N,N-dimethylaminoazobenzen-4-sulfonyl clorid

Dabsylclorid (5-1): 5-N,N-dimethylaminonaphthalen-1-sulfonyl clorid

Fluoreseamin: 4-pheyl-spiro[furan-2(3H),1-phthalan]-3,3-dion

Phương pháp HPLC rất thích hợp để tách và xác định đồng thời nhiều chất

trong các hỗn hợp khó như retinoit, carotenoit, axít amin mà trước đây các phương

pháp khác gặp khó khăn. Ưu điểm nổi bật của HPLC là tốc độ tách nhanh, độ phân

giải tốt, độ nhạy cao, độ lặp lại tốt và có thể phân tích đồng thời nhiều chất. Riêng

đối với việc phân tích axít amin, phương pháp HPLC còn có một số ưu điểm mà ít

29

có phương pháp khác có thể được, đó là quá trình tách và xác định là một hệ thống

kín, quá trình dẫn xuất có thể sử dụng dẫn xuất trước hoặc sau cột, dung môi chạy

chủ yếu là đệm, quá trình thủy phân mẫu và hòa tan mẫu là các axít vô cơ không tốn

kém. Chính vì những ưu điểm trên mà nhiều tác giả cho rằng phương pháp HPLC là

phương pháp tốt nhất để tách và phân tích axít amin. Phương pháp cần được nghiên

cứu và phát triển để ứng dụng phân tích trong mẫu thực phẩm và sinh học.

*

* *

Tóm lại, thông qua việc nghiên cứu tổng quan về protein và axít amin,

chúng tôi nhận thấy. Để có thể xác định được riêng biệt các axít amin cần phải sử

dụng phương pháp tách trước khi xác định. Chúng tôi đã lựa chọn phương pháp

HPLC là phương pháp tốt nhất để tách và phân tích axít amin vì những lý do sau:

- Phương pháp HPLC có một số ưu điểm mà ít có phương pháp khác có thể

được, đó là quá trình tách và xác định là một hệ thống kín, quá trình dẫn xuất có thể

sử dụng dẫn xuất trước hoặc sau cột, dung môi chạy chủ yếu là đệm, quá trình thủy

phân mẫu và hòa tan mẫu là các axít vô cơ không tốn kém.

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp có độ

chọn lọc độ nhạy cao, có thể tự động hóa phân tích hàng loạt mẫu vì thế nó rất

thuận lợi cho việc xác định axít amin trong nghiên cứu điều tra với số lượng lớn

mẫu.

- Mặt khác, HPLC là phương pháp hiện đại, đang phát triển mạnh và được

ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm phân tích của các nước tiên tiến trên

thế giới cũng như các phòng thí nghiệm ở Việt nam.

- Phương pháp này đã được nhiều tác giả áp dụng để phân tích axít amin

trong các mẫu phức tạp, đặt biệt đối với các mẫu thực phẩm phức tạp khác nhau.

30

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nội dung và mục tiêu nghiên cứu

2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Việc phân tích các thành phần dinh dưỡng trong thực phẩm Việt Nam còn

hạn chế, ngoài các thông số cơ bản về chất đạm, đường, chất béo, chất khoáng chủ

yếu mới có số liệu của một số loại carotenoid trong rau, quả. Số liệu phân tích các

axít amin trong thực phẩm Việt Nam còn thiếu, đặc biệt đối với một số axít amin

quan trọng như các axít amin không thay thế. Những nghiên cứu, phân tích về thành

phần dinh dưỡng và đặc biệt các thành phần chất dinh dưỡng thiết yếu trong thực

phẩm ở nước ta còn chưa đầy đủ. Nhằm bổ sung và hoàn thiện số liệu của bảng

thành phần thực phẩm Việt Nam và cung cấp số liệu cho các nghiên cứu dinh

dưỡng, việc xác định thành phần các axít amin quan trọng như lysin, methionin và

một số các axít amin thiết yếu là rất cần thiết.

Vì vậy, mục tiêu của đề tài này là xây dựng phương pháp tách và xác định

đồng thời 17 axít amin trong thực phẩm phục vụ cho công tác nghiên cứu chế độ ăn

trong phòng, điều trị bệnh và cung cấp số liệu cho bảng thành phần dinh dưỡng thực

phẩm do Viện Dinh dưỡng quốc gia biên soạn.

2.1.2. Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, một số vấn đề cần được giải quyết là:

- Tổng kết các tài liệu về các phương pháp phân tích định lượng axít amin

trong nước và trên thế giới từ trước đến nay.

- Nghiên cứu tìm và chọn những điều kiện tối ưu như các thông số máy, cột

tách, pha động,... để xây dựng một phương pháp phân tích tách và xác định

đồng thời 17 axít amin bằng kỹ thuật HPLC.

- Đánh giá thống kê phương pháp phân tích đưa ra.

- Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích một số mẫu thực phẩm đại

diện.

- Đánh giá thành phần axít amin của thực phẩm Việt Nam so với thành phần

31

axít amin của các thực phẩm tương tự trên thế giới.

- Đánh giá chất lượng protein của một số đối tượng thực phẩm dựa vào thành

phần axít amin thiết yếu.

- Kiến nghị cho nhu cầu dinh dưỡng về thực phẩm Việt Nam.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện nhiệm vụ của luận án, chúng tôi chọn phương pháp phân tích là

sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) để

tách xác định thành phần axít amin trong thực phẩm. Đây là phương pháp có hiệu

quả phân tích cao, độ chính xác cao cũng như có thể tự động hóa được trong trường

hợp phân tích hàng loạt mẫu.

Cơ sở lý thuyết của phương pháp được tóm tắt dưới đây:

2.2.1. Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC [8]

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh và pha động.

Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy

sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong

hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất

khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau.

Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Cấu tạo của hệ thống HPLC (hình 2.1)

Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC có thể hình dung gồm

3 phần chính:

- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích.

- Phần tách: là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột

phụ trợ.

- Phần phát hiện và xử lý số liệu: phần này bao gồm các detectơ, phần khuếch

đại, computer và phần mềm xử lý số liệu, bộ phận ghi tín hiệu.

32

Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

Các đại lượng đặc trưng của HPLC

a- Thời gian lưu:

Thời gian lưu tR (phút) là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm

mẫu qua cột sắc ký, tới detectơ và cho píc trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất

hiện đỉnh của píc.

Hình 2.2: Sắc đồ một chất

t0: là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ, nghĩa là tốc độ di chuyển của nó

bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi. t0 còn được gọi là thời

gian chết.

tR càng lớn, chất tan bị lưu giữ càng mạnh và tốc độ di chuyển của nó càng nhỏ.

Bơm

Dung môi

Cột tách

Van bơm mẫu

Detectơ Thải

Ghi nhận

tín hiệu

Hệ thống HPLC Ghi và xử

lý dữ liệu

33

Thời gian lưu hiệu chính '

Rt được tính theo công thức:

'

Rt = tR t0

b- Hệ số phân bố K

Trong quá trình sắc ký, khi một chất đang di chuyển trên cột và phân bố giữa giữa

hai pha, nếu ta cho pha động dừng lại để sự phân bố đạt tới trạng thái cân bằng thì ta có:

K = M

S

C

C

CS và CM là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động. Khi nồng độ chất

không cao quá thì K là một hằng số chỉ phụ thuộc vào bản chất các pha, chất tan và

vào nhiệt độ.

Với một chất, nếu K lớn thì chất đó phân bố nhiều vào pha tĩnh và sẽ di

chuyển chậm, nếu K nhỏ nó sẽ di chuyển nhanh.

c- Thừa số dung lượng k’

Thừa số dung lượng k’ còn gọi là hệ số dung lượng hay hệ số phân bố khối

lượng. Hệ số dung lượng k’ là một đại lượng quan trọng được dùng rộng rãi để mô

tả tốc độ di chuyển của một chất.

k’ = M

S

Q

Q

Trong đó QS, QM là lượng chất tan phân bố trong pha tĩnh và pha động.

Do đó ta có: k’=M

S

MM

SS

V

VK

VC

VC

Trong đó VS, VM là thể tích pha tĩnh, pha động.

Khác với K, k’ không những phụ thuộc bản chất các pha, bản chất của chất

tan, vào nhiệt độ mà còn phụ thuộc vào đặc điểm của cột (tỉ lệ VS / VM của cột).

Với một chất, k’càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp. Để tách một hỗn hợp các chất,

người ta thường chọn cột, pha động, các điều kiện phân tích khác sao cho k’ của các

chất nằm trong khoảng từ 1 đến 8. Nếu k’ lớn hơn 8 thì thời gian phân tích quá dài,

k’ nhỏ hơn 1, píc sẽ xuất hiện quá sớm dễ lẫn với píc các tạp chất.

34

d- Sự doãng píc và hình dáng píc.

Hình dáng của píc và sự doãng píc liên quan chặt chẽ đến sự tách sắc ký.

Hình dáng lý tưởng của píc là píc đối xứng. Trên thực tế píc sắc ký thường chỉ gần

đối xứng. Để đánh giá tính bất đối của píc người ta dùng hệ số bất đối.

(Asymmetry Factor).

AF = b/a

trong đó: b = chiều rộng phía sau của píc

a = chiều rộng phía trước của píc

Chiều rộng của píc được đo ở 1/10 chiều cao của píc. Một cột được nhồi tốt sẽ cho

píc có AF trong khoảng 0,9 -1,1. (xác định AF với píc của các chất tan chuẩn ).

Hình 2.3 Tính bất đối của píc

e- Hiệu lực của cột và đĩa lý thuyết:

Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: số đĩa lý thuyết N và

chiều cao đĩa lý thuyết H (hay HETP).

Nếu cột sắc ký có chiều dài là L và có N đĩa lý thuyết thì mỗi đĩa có chiều

cao là H.

H = L / N

N: là số đĩa lý thuyết của cột.

H: là chiều cao của đĩa lý thuyết.

2

254,5

h

R

WL

tN

35

tR: là khoảng cách dọc theo đường nền của sắc ký đồ tính từ lúc bắt đầu tiêm mẫu

đến chân đường vuông góc hạ từ cực đại của píc cần quan tâm.

L: độ dài cột tính bằng mét

Wh: độ rộng của đáy píc cần quan tâm ở nửa chiều cao píc.

f- Chiều cao đĩa lý thuyết và sự doãng píc.

Với píc sắc ký, chiều rộng của píc (hay độ doãng của píc) được xác định bởi

độ lệch chuẩn : chiều rộng của đáy píc Wb = 4. Như vậy phản ánh chiều rộng

của píc, cũng là phản ánh hiệu lực của cột, vì cột tốt cho píc hẹp. Và hiệu lực của

cột có thể mô tả bằng chiều cao đĩa lý thuyết H.

Vậy theo lý thuyết, ta có thể định nghĩa H theo như sau:

H = L

2

g. Các thông số động học và sự doãng píc

Phương trình Van Deemter mô tả ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động và

các thông số động học khác đến hiệu lực của cột (đến H) trong sắc ký khí. Dạng ban

đầu đơn giản của phương trình Van Deemter là:

H = A + CUU

B

U: vận tốc dài (tốc độ thẳng) trung bình của pha động, là quãng đường đi được

trong một đơn vị thời gian của pha động.

A: ảnh hưởng đến H của sự khuếch tán xoáy.

B / U: ảnh hưởng của sự khuếch tán của các tiểu phân chất tan (ngược và xuôi) theo

phương dòng chảy của pha động.

C: sự không đều của tốc độ di chuyển của các phân tử chất tan trong lòng pha động.

h. Độ phân giải và các yếu tố ảnh hưởng (sự tách hai chất)

Độ phân giải RS đó là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký.

Độ phân giải RS được định nghĩa như sau:

36

RS = AB

R

AB

A,RB,R

WW

t2

WW2/1

tt

Trong đó Rt là khoảng cách giửa hai đỉnh píc.

Ta thấy với hai píc cùng cỡ thì:

Rs = 0,75 hai píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.

Rs = 1,0 hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%

Rs =1,5 hai píc tách hoàn toàn (chỉ xen phủ 0, 3%)

Nếu hai píc có độ lớn khác nhau càng nhiều thì RS càng phải lớn hơn nữa

mới tách được tốt.

2.2.2. Chọn van bơm mẫu

Từ khi sắc ký lỏng ra đời thì phương pháp bơm mẫu theo kiểu xi lanh không

còn phù hợp nữa. Thay vào đó, người ta sử dụng các van bơm mẫu để nạp chính xác

lượng mẫu phân tích vào cột tách. Để đáp ứng được yêu cầu bơm thể tích mẫu

chính xác với sai số rất nhỏ (khoảng 0,05l), người ta sử dụng các vòng mẫu với thể

tích xác định. Nguyên lý cơ bản của hệ bơm mẫu trong sắc ký lỏng là mẫu ban đầu

được nạp vào trong vòng mẫu bằng một xi lanh ở áp suất thường, sau nhờ hệ thống

chuyển van mà mẫu được dòng pha động nạp vào cột tách. Độ chính xác, độ đúng

và lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tách sắc ký không những phụ thuộc vào thiết kế

của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột.

Dựa vào khả năng thay đổi các vòng chứa mẫu khác nhau mà có thể thay đổi

thể tích bơm mẫu vào cột. Một trong những khó khăn của phép tách sắc ký là sự mở

rộng chân píc, dẫn đến hiện tượng chồng píc. Trong đó, lượng mẫu được bơm vào

cột cũng là một nguyên nhân gây ra hiện tượng này. Nếu vòng mẫu quá dài, lượng

mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tượng doãng píc càng lớn và các píc càng chèn

lên nhau.

Ngược lại, nếu thể tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số cũng sẽ rất lớn, ví dụ

nếu sai số của van bơm mẫu là 0,05l, khi bơm thể tích mẫu là 1l thì sai số sẽ là

5%, còn nếu thể tích mẫu bơm là 50l thì sai số là 0,1%.

Trong một giới hạn thể tích mẫu nhỏ hơn một thể tích giới hạn Vo thì tín

37

hiệu hay chiều cao của píc sắc ký sẽ tăng theo sự tăng của thể tích mẫu. Đến một

giới hạn Vs ≥ Vo nào đó nếu ta tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao píc sắc ký

cũng không tăng nữa mà lúc đó píc sắc ký sẽ tù và doãng chân mà không sắc nét

nữa. Vì vậy việc chọn vòng mẫu cũng rất quan trọng.

Bình thường nếu độ nhạy đủ để phân tích thì chúng ta chỉ nên dùng vòng

mẫu càng nhỏ càng tốt để tránh doãng píc và tạo nên píc có độ sắc nét cao. Trong

HPLC người ta thường dùng vòng mẫu 20, 50 và 100 µl, trong đó vòng mẫu 20 µl

được dùng phổ biến nhất. Trong trường hợp phân tích các axít amin để đạt được

hiệu quả tách tốt, chúng tôi đã sử dụng vòng mẫu 20 µl trong suốt quá trình tách và

xác định axít amin.

2.2.3. Pha tĩnh trong HPLC

Một trong những yếu tố rất quan trọng của HPLC đó là cột sắc ký có nhồi

chất nhồi bên trong gọi là pha tĩnh. Việc tách chất có tốt hay không phụ thuộc nhiều

vào pha tĩnh của cột. Nếu xét về trạng thái của pha tĩnh người ta chia sắc ký thành

sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký lỏng - rắn.

Trong hệ sắc ký lỏng thì pha tĩnh là chất lỏng, nó được giữ trong cột tách

bằng một chất mang trơ.

Còn trong hệ sắc ký lỏng - rắn thì pha tĩnh là một chất rắn xốp có hạt chất

nhồi đường kính 3 đến 10 m. Hầu hết các công trình nghiên cứu hiện nay đều sử

dụng loại pha tĩnh rắn. Pha tĩnh rắn được chia làm một số loại như sau: Pha tĩnh trên

nền silica (là chủ yếu), pha tĩnh trên nền nhôm oxit và pha tĩnh trên nền các chất cao

phân tử hữu cơ.

Pha tĩnh trên nền nhôm oxit cho kết quả tách không ổn định do nó có rất

nhiều loại thù hình mà trong đó chỉ có dạng gama mới có tính chất sắc ký tốt. Chính

vì vậy nó chỉ được sử dụng nhiều trong sắc ký hấp phụ cổ điển mà ít được dùng

trong HPLC.

Pha tĩnh trên nền cao phân tử sử dụng cho kỹ thuật HPLC chưa nhiều do việc

úng dụng nó còn nhiều hạn chế. Nhược điểm của loại pha tĩnh loại này là dễ bị

trương nở khi thay đổi thành phần dung môi rửa giải, khả năng chịu áp kém, độ trơ

38

với kiềm và axít không cao, các nhóm amin trong phân tử lại dễ bị phân huỷ, vì thế

người ta chỉ sản xuất một vài loại chất nhồi này cho sắc ký trao đổi ion.

Pha tĩnh trên nền silica là loại được dùng nhiều nhất hiện nay trong HPLC.

Có hai loại silica hấp thu đó là loại pha thường và loại pha ngược.

- Sắc ký pha thường: chất nhồi trong sắc ký phân bố pha thường là các silica

trung tính, trên bề mặt nó có nhóm hoạt động -OH, các chất phân cực (đó là

các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít carbon mang

các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN,...). Do có nhóm này nên chất nhồi cột

loại này là phân cực và nước dẫn đến ảnh hưởng nhiều đến độ lặp lại cũng

như hiệu quả của quá trình tách sắc ký.

- Sắc ký pha ngược: pha tĩnh thường là các silica đã được alkyl hóa, sulfonic

hóa, nitro hóa hay amin hóa các nhóm -OH trên bề mặt silica. Việc alkyl

hóa silica trung tính bằng mạch carbon thẳng như -C2, -C8, -C18 hay các gốc

canbon vòng như nhân phenyl đã tạo ra chất nhồi pha ngược. Gốc alkyl có

thể gắn trực tiếp vào mạch silica hoặc có thể gắn gián tiếp qua nguyên tử O.

Các chất nhồi loại nay dùng để tách các chất không phân cực, phân cực và

sắc ký cặp ion. Dung môi chạy sắc ký là những chất phân cực như nước,

methanol, acetonitril,… Vì pha tĩnh là loại kỵ nước nên bề mặt hoạt động

của nó không bị ảnh hưởng bởi các phân tử nước do vậy sư tách bằng chất

nhồi này có độ lặp lại tốt. Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính

của pha động lại là nước nên rất kinh tế. Hệ này được sử dụng để tách các

chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân

cực [8]. Sắc ký phân bố pha đảo bao gồm cả sắc ký cặp ion: để tách hỗn

hợp các cation hoặc anion nguời ta đưa vào một anion hoặc cation, một đối

ion vào pha động, chất này này liên kết với pha tĩnh không phân cực và

chuyển nó sang dạng trao đổi ion. Khi chất phân tích-đi qua cột, cặp ion

được hình thành và lưu giữ trên pha tĩnh. Quá trình rửa giải đưa chất phân

tích ra khỏi cột theo nguyên tắc sắc ký phân bố pha đảo nhưng phức tạp hơn

vì cân bằng giữa pha tĩnh và thuốc thử tạo cặp ion diễn ra chậm, sự hình

39

thành cặp ion phụ thuộc vào pH dung dịch, nồng độ thuốc thử tạo cặp ion,

nhiệt độ.

Ngày nay, pha tĩnh có nhiều loại nhưng các nghiên cứu ứng dụng tập

trung vào hai loại là chất nhồi pha thường (silica trung tính) và chất nhồi pha

ngược (silica đã được alkyl hóa). Trong hai loại này chất nhồi pha ngược lại

được dùng nhiều hơn cả vì nó có thể tách được cả các chất phân cực, ít phân

cực và không phân cực. Mặt khác pha động của nó là những chất phân cực tan

trong nước (nước cũng có thể là thành phần pha động), vì thế nó rất kinh tế và

phù hợp cho nước có độ ẩm cao và khí hậu không ổn định như Việt Nam.

2.2.4. Pha động trong HPLC [8]

Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các

chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa

giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt nhưng nhìn chung phải đáp ứng được

các điều kiện sau:

- Pha động phải trơ với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh theo bất kỳ một tính

chất nào trong quá trình sắc ký. Không có sự tương tác phụ với pha tĩnh để

sinh ra những sản phẩm khác làm phức tạp quá trình tách.

- Pha động phải hòa tan tốt mẫu phân tích, phải bền vững theo thời gian, nghĩa

là nó không bị ảnh hưởng hay phân huỷ khi chạy sắc ký.

- Pha động phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn mẫu phân

tích, gây sai số cho kết quả tách.

- Pha động phải nhanh đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký, như cân

bằng hấp phụ, phân bố, trao đổi ion tuỳ theo bản chất của từng loại sắc ký.

- Phải phù hợp với loại detectơ dùng để phát hiện các chất phân tích, không

làm hư hại đến flowcell của detectơ. Ví dụ nếu dùng detectơ UV-VIS thì pha

động phải có tính chất trong suốt trong các vùng phổ đó, hay dùng detectơ

huỳnh quang thì pha động phải không có tính chất phát huỳnh quang,…

- Pha động phải không khan hiếm và có tính kinh tế cao.

40

2.2.5. Các loại detectơ trong HPLC

Các chất tách ra khỏi nhau được pha động đẩy đến detectơ để đo, tín hiệu

phát hiện được chỉ thị sang bộ phận ghi nhận kết quả và được biểu diễn dưới dạng

píc sắc ký. Bộ phận phát hiện (detectơ) để phát hiện các chất trong HPLC có nhiều

loại. Tuỳ theo tính chất hóa lý của chất cần phân tích mà người ta sử dụng các loại

detectơ khác nhau. Nhưng dù theo tính chất nào thi nó cũng phải thoả mãn biểu thức

mối quan hệ.

A=k.C (2.2)

Trong đó A là tín hiệu đo của chất phân tích trong mẫu, k là hằng số điều

kiện thực nghiệm của detectơ đã chọn.

Detectơ là bộ phận theo dõi phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc

ký chảy ra một cách liên tục. Nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các chất hay

hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích. Detectơ là một trong

những bộ phận quan trọng của HPLC. Một detectơ lý tưởng trong HPLC phải đạt

được những yêu cầu sau: có độ nhạy phân tích cao, đáp ứng được với các chất cần

phân tích hoặc đặc trưng của chúng, không phá huỷ mẫu, không nhạy cảm với các

thay đổi nhiệt độ và tốc độ dòng của pha động, có thể vận hành liên tục, cho độ lặp

lại tốt và dễ sử dụng. Vì vậy, việc lựa chọn detectơ quyết định sự thành công của

mỗi phương pháp HPLC riêng biệt. Trong số các detectơ được sử dụng bao gồm

detectơ UV, điện hóa, đo độ dẫn điện, khúc xạ, huỳnh quang, và mỗi loại detectơ lại

có ưu điểm và nhược điểm riêng. Hầu hết các chất hay hợp chất phân tích đều có

tính chất hấp thu quang trong vùng UV-VIS vì vậy detectơ UV-VIS hay detectơ

PDA được sử dụng thông dụng trong trong phân tích. Detectơ huỳnh quang có hạn

chế hơn so với UV-VIS do tính chất phát quang của các chất hay nhóm hợp chất

không phải là thông dụng mà chỉ một số ít các chất và hợp chất có phát quang.

Nhưng hạn chế đó cũng là ưu điểm của detectơ huỳnh quang đối với chất hay hợp

chất có tính chất phát quang, nên việc sử dụng detectơ huỳnh quang cho độ nhạy và

độ chọn lọc cao hơn rất nhiều so với detectơ UV - VIS, đối với các chất có huỳnh

quang.

41

- Detectơ quang phổ hấp thu phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả

năng hấp thu ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS).

- Detectơ huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát

huỳnh quang. Nguyên tắc của phép đo huỳnh quang là chiếu một chùm tia

sáng kích thích có bước sóng xác định (EX) phù hợp vào cuvét chứa chất

mẫu phân tích để chất phân tích phát ra chùm tia phát xạ (Em). Sau đó nhờ

hệ thống quang học thu, phân ly tách lấy tia phát xạ huỳnh quang thích hợp

cần đo hướng vào nhân quang điện để đo chúng, khuyếch đại và chỉ thị (biểu

diễn) chúng theo một cách nào đó. Việc phát hiện định lượng ở đây là dựa

trên cơ sở trong một vùng nồng độ C nhất định của chất phân tích, thì cường

độ của tia phát xạ huỳnh quang của chất hay sản phẩm của nó là phụ thuộc

tuyến tính vào nồng độ của nó. Như vậy về nguyên tắc cấu tạo thì detectơ

huỳnh quang khác với detectơ UV-VIS ở chỗ là gồm hai hệ quang. Một hệ

quang cung cấp chùm tia kích thích, một hệ quang thu nhận chùm tia phát xạ

huỳnh quang của chất mẫu được đặt vuông góc với chùm tia kích thích.

Detectơ huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao. Đối với những

chất không có khả phát huỳnh quang, cần phải dẫn xuất hóa chất phân tích,

gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản ứng

với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.

- Detectơ độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hóa: các ion kim loại

chuyển tiếp.

- Detectơ chỉ số khúc xạ: hoạt động của detector theo nguyên lý đo vi sai. Tín

hiệu đo là sự khác nhau giữa chỉ số khúc xạ (RI) của pha động và của pha

động hoà tan chất phân tích. Tín hiệu này có thể có giá trị dương hoặc âm.

- Detectơ tán xạ bay hơi (ELSD): Dịch rửa giải từ cột sắc ký đi vào đầu

detector được trộn lẫn với khí nitơ ở trong bộ phận phun sương. Hỗn hợp đi

qua một kim nhỏ được phân tán thành đám sương mù kích thước đều nhau. ở

đây dung môi được bay hơi loại khỏi hạt sương, hạt rắn mịn được tạo thành.

Các hạt rắn này đi cắt ngang chùm tia laser. Chùm tia laser bị tán xạ bởi các

42

hạt rắn được phát hiện nhờ ống nhân quang. Chất phân tích được phát hiện

nhờ ánh sáng tán xạ tạo ra tín hiệu điện. Đáp ứng của detectơ liên quan đến

khối lượng của chất phân tích - nghĩa là diện tích píc sắc ký tỷ lệ thuận với

khối lượng.

Ngày nay, các detectơ hiện đại ngày càng được cải tiến và mở rộng, như

detectơ mảng diot, detectơ khối phổ (MS), detectơ điện hoá đo dòng, detectơ đo dộ

dẫn điện, detectơ đo thế, detectơ hấp thụ nhiệt, detectơ mảng diot phát quang, và

nhiều detectơ khác như đo độ siêu, đo độ cảm ứng, đo độ linh động của chất,… giúp

người phân tích xác định chính xác chất phân tích theo đúng bản chất và tính chất

đặc trưng của nó.

2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thuốc thử sử dụng

2.3.1. Thiết bị và dụng cụ

Máy móc:

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của hãng Waters (Mỹ), gồm bơm

dung môi model 2690 có bộ phận bơm mẫu tự động, detectơ PDA model

2996, detectơ huỳnh quang model 2475, phần mềm Empower.

- Cột sắc ký là cột Symmetry axít amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m) của

hãng Waters (Mỹ).

- Cột Symmetry Shield RP18 (150mm x 4,6mm x 5m) của hãng Water

- Cân phân tích độ chính xác 0,0001g

- Tủ sấy có thể đặt nhiệt độ lên 280oC

- Máy cất quay chân không Eyela

- Máy đo pH: pH Meter 744

- Máy nghiền mẫu

- Máy lắc Vortex

Dụng cụ

- Pipet Pasteur

- Ống nghiệm có nắp xoáy chịu nhiệt đến 280oC.

43

- Vial (lọ đựng mẫu 1,5ml có nắp)

- Các bình định mức: 5, 10, 20, 50, 100 ml

- Ống đong

- Pipet: 1, 2, 5, 10 ml

2.3.2. Hóa chất

Các loại hóa chất dùng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết phân tích.

Dung dịch chuẩn

- Hỗn hợp chuẩn 17 axít amin của hãng Waters (Mỹ), các chuẩn đơn

từng axít amin của hãng Prolabo (Pháp).

- Chuẩn hỗn hợp (17 axít amin) được pha từ dung dịch có chứa 2,5 mM

cho tất cả các amino axít và 1,25 mM đối với cystin. Hút 40 l dung

dịch chuẩn trên pha loãng bằng HCl 20 mM thành 1ml để được dung

dịch chuẩn làm việc có chứa 100 pmol/l đối với 16 axít amin và 50

pmol/l đối với cystin. Dung dịch chuẩn làm việc được bảo quản

trong lọ màu sẫm bảo quản bằng tủ lạnh âm sâu - 200C dùng được

trong vòng 1 tháng. Các chuẩn đơn được hoà tan trong nước và bảo

quản trong môi trường axít với các điều kiện tương tự như chuẩn hỗn

hợp.

Các loại hóa chất khác:

- Chất tạo dẫn xuất 6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl carbamat của

hãng Waters (Mỹ)

- Chất tạo dẫn xuất O-phthaldialhehyd(OPA)- của hãng Sigma.

- Dinatrihydrophosphat (Na2HPO4.12H2O)

- Dung dịch Na2HPO4 0,5M (cân 179 g Na2HPO4.12H2O hòa tan hoàn toàn

vào 1 lít nước cất)

- Natri acetat trihydrat CH3COONa.3H2O (NaAc)

- Dinatri dihydro ethylendiamin tetra acetat C10H14N2Na2O8.2H2O (EDTA)

- Trietylamin C6H15N

- Dung dịch Triethylamin 17mM (1,7 g C6H15N hòa tan trong 1 lít nước)

44

- Dung dịch đệm pha động A: (179 g Na2HPO4.12H2O + 19,04g/lit

NaOAc.3H2O + 1g/l EDTA + 1,7 g C6H15) hòa tan hoàn toàn trong nước đến

gần 1lít, điều chỉnh về pH = 5,05 bằng axít H3PO4, định mức đến vạch bằng

nước cất.

- Dung môi pha động B: Acetonitril dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Dung môi pha động C: nước cất tinh khiết (nước cất 2 lần lọc qua hệ thống

loạc nước siêu sạch để khử hết các ion còn lại).

- Acetonitril dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Axit hydrocloric 1M

- Natri hydroxit 10M

- Natri hydroxit 1M

- NaOH 0,5M (pha từ dung dịch NaOH 1M)

- Axit phosphoric H3PO4 đặc

- Natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O)

- Dung dịch Na2B4O7 0,25M

2.4. Phương pháp thu thập mẫu thực phẩm để phân tích

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp lấy mẫu phân tầng [38]. Đây là

phương pháp phù hợp nhất trong việc phân tích và xây dựng cơ sở dữ liệu các thành

phần thực phẩm. Mẫu tổng thể thực phẩm được phân tầng theo vùng địa lý, theo

mùa, theo mức độ tiêu thụ, hoặc theo khu vực phân phối trên thị trường, các điểm

bán lẻ,... Trong đề tài này, mẫu được lựa chọn ngẫu nhiên từ các chợ bán lẻ trên thị

trường Hà Nội và số liệu thu được sẽ đại diện cho khu vực này.

Đối tượng mẫu: gồm 3 loại thực phẩm

1. Đậu tương (đậu nành), các sản phẩm chế biến từ đậu tương: đậu phụ, sữa đậu

nành

2. Cá nước ngọt (trắm, trôi, cá quả, rô phi, chép); Cá nước mặn (thu, nục, cá

chim trắng, cá hồng, cá cam)

3. Thịt các loại (thịt lợn, thịt gà, thịt bò, thịt bê).

Cỡ mẫu

45

Cỡ mẫu được tính toán theo công thức sau [38]

N ≥ (t n-1)2 SD

2 / (A x )

2

trong đó: N là cỡ mẫu (số lượng mẫu)

A là độ chính xác của kết quả phân tích (có giá trị 0,1 hoặc 0,05)

là giá trị trung bình (kết quả phân tích) của quần thể, thu được từ

các nghiên cứu trước đây

SD độ lệch chuẩn của giá trị trung bình

t là giá trị thu được từ bảng thống kê chuẩn (bảng Student), với là

giới hạn tin cậy (95% hoặc 99%)

Như vậy, để có số liệu đảm bảo độ chính xác 0,1 cần lấy 17 mẫu phân tích

axít amin. Trong khuôn khổ của đề tài này chúng tôi chọn cỡ mẫu phân tích tối

thiểu là n = 17, với độ chính xác là 0,1.

Các chỉ tiêu phân tích: 17 loại axít amin

Thu thập mẫu

Thu thập mẫu đậu, đỗ, thịt

Mẫu được thu thập bằng cách bốc thăm ngẫu nhiên từ các chợ đại diện cho 9

quận nội thành Hà Nội, gồm Chợ Thái Hà, chợ Hôm, chợ Mơ, chợ Trương Định,

chợ Hàng Da, chợ Ngã Tư Sở, chợ Thành Công, chợ Lê Quý Đôn và chợ Ngô Sĩ

Liên.

Thu thập mẫu cá

Mẫu nghiên cứu gồm 10 loại cá đại diện cho 50 mẫu cá: 5 loại cá nước ngọt

(trắm, trôi, cá quả, rô phi, chép); 5 loại cá nước mặn (thu, nục, cá chim trắng, cá

hồng, cá cam). Mẫu được lấy ngẫu nhiên bằng cách mua tại 5 chợ lớn tại Hà Nội,

mỗi mẫu mua ít nhất 3 con, đưa về phòng thí nghiệm trong thời gian không quá hai

giờ. Ở phòng thí nghiệm mẫu được phân loại, lọc lấy phần ăn được (loại bỏ phủ

tạng, vẩy, vây, xương), sau đó mẫu được xay nhuyễn, làm đồng nhất và tiến hành

thủy phân ngay trong ngày lấy mẫu; phần mẫu lưu cho vào hộp sạch bảo quản trong

tủ lạnh âm sâu - 20oC.

*

46

* *

Tóm lại, thông qua phương pháp nghiên cứu chúng tôi đã đưa ra được hai

mục tiêu nghiên cứu chính như sau:

- Thứ nhất, trên cơ sở lý thuyết của kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, theo

tính chất của chất phân tích và trên cơ sở điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi tập

trung nghiên cứu khảo sát thông số máy, ảnh hưởng của pha tĩnh và pha động đến

quá trình tách và phân tích, chọn phương pháp thuỷ phân, điều kiện dẫn xuất,…

chúng tôi đã xây dựng được phương pháp để tối ưu hóa các điều kiện điều kiện để

tách và xác định đồng thời 17 axít amin trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC).

- Thứ hai, áp dụng phương pháp đã xây dựng trên trong quá trình nghiên

cứu. Trên cơ sở tham khảo các quá trình xử lý mẫu của các tác giả trước đây trên

thế giới, chúng tôi đã cải tiến một số giai đoạn của quá trình xử lý mẫu để áp dụng

tốt tại các phòng thí nghiệm tại Việt Nam khi thiếu các thiết bị hiện đại. Nhưng

đồng thời vẫn phải áp dụng được quy trình đã được thay đổi trên đây để phân tích

trên nhiều đối tượng thực phẩm mà không gây ra sai số và phải có độ lặp lại tốt.

47

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát chọn loại chất dẫn xuất cho axít amin

Để xác định được một số axít amin trong thực phẩm dựa trên những điều

kiện cơ sở của phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành dẫn xuất trước cột các axít

amin chuẩn bằng OPA (ortho-phtalaldehyd) kết quả được chỉ ra trên sắc đồ (hình

3.1) và dẫn xuất bằng AQC (6-aminoquinolin carbamat) kết quả được chỉ ra trên sắc

đồ (hình 3.2).

Hình 3.1: Sắc đồ tách axít amin bằng dẫn xuất OPA trước cột, cột RP18 (150mm x

4,6mm x 5m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 340; em = 455)

Hình 3.2: Sắc đồ tách axít amin bằng dẫn xuất AQC trước cột, cột RP18 (150mm x

4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em =

395)

Flu

ore

scen

ce

48

Theo một số tác giả [76] và kết quả khảo sát về hai dẫn xuất OPA và AQC

cho thấy: OPA có khả năng dẫn xuất được 15 axít amin, không dẫn xuất được các

axít amin bậc 2. Axít amin sau khi dẫn xuất bằng OPA chỉ ổn định trong vòng 20

phút, vì vậy phản ứng dẫn xuất này thuận tiện cho những hệ thống HPLC có bộ

phản ứng sau cột. Cơ chế phản ứng như sơ bộ như sau:

COH

C O

H

R N H

H

..

COH

CH

OH

NH R..

CH

CH

OH

OH

N R

isoindole

OPA

Theo cơ chế trên thì OPA phản ứng bước 1 có thể với cả amin bậc 1 và bậc 2

nhưng chỉ có amin bậc 1 mới cho sản phẩm là isoindol có vòng kín 5 cạnh và phát

huỳnh quang. Vì vậy với việc dẫn xuất bằng OPA không cho phép xác định axít

amin bậc 2. Để xác định được các axít amin bậc 1 bằng OPA phải thực hiện khi có

mặt của axít 3- mercapto propionic (3-MPA) ở pH = 10 cơ chế phản ứng như sau:

CHO

CHO

H2N CH COOH

R

HS CH2 CH2 COOH N

S CH2 CH2 COOH

CH COOH

R

OPA axit amin b1 axit 3-mecapto propionic dan xuat isoindol

Không như những axít amin bậc 1 ban đầu, các dẫn xuất isoindol được tạo

thành sẽ phát huỳnh quang. Bằng cách dẫn xuất các axít amin với OPA và đo ở

bước sóng kích thích 340 nm và bước sóng phát xạ ở 450 nm, kết quả được chỉ ra

trên sắc đồ (hình 3.1).

Chất dẫn xuất AQC có khả năng dẫn xuất cả axít amin bậc 1 và axít amin bậc

49

2 (cystin, prolin) thành sản phẩm phát huỳnh quang với độ ổn định cao (mẫu sau khi

dẫn xuất ổn định trong vòng 1 tuần nếu bảo quản ở 4oC) nên có thể tách được 17

axít amin. Cơ chế phản ứng dẫn xuất như sau:

N

NH O

O

N

O

O

HN

R1

R2 N

HON

O

O

NH N

R1

R2

O

axit amin bac 1, 2 AQC dan xuat axit amin NHS

Chất dẫn suất AQC phản ứng rất nhạy với cả axít amin bậc 1 và axít amin

bậc 2 cho sản phẩm phát huỳnh quang mạnh ở bước sóng 395 nm. Trong quá trình

dẫn xuất AQC có phản ứng phụ khi dư, nó tác dụng với nước tạo hợp chất AMQ

phát quang yếu ở bước sóng 395 nm (đây là điểm để xác định phản ứng dẫn xuất

axít amin đã xảy ra hoàn toàn). Phản ứng diễn ra như sau:

N

NH O

O

N

O

O

O

H

HN

HON

O

O

NH2

CO2

AQC AMQ NHS

Ngoài ra phản ứng dẫn xuất còn có sản phẩm là N-hydroxysuccinimid (NHS)

và CO2, nhưng cả 2 chất này đều không ảnh hưởng đến quá trình phân tích, vì nó

không phát huỳnh quang.

Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi chọn AQC để làm chất dẫn xuất

các axít amin.

3.2. Tối ưu hóa các điều kiện tách và xác định axít amin bằng HPLC

3.2.1. Khảo sát chọn Detectơ

Các axít amin không có tính chất phát huỳnh quang, nhưng khi được kết hợp

với chất dẫn xuất AQC sẽ tạo ra các sản phẩm phát huỳnh quang khi bị kích thích

(ex = 250 nm; em = 395 nm) với độ nhạy và độ chọn lọc cao. Với các axít amin,

có thể phát hiện bằng detectơ mảng diod (PDA) và huỳnh quang. Vì thế, để khẳng

định loại nào phù hợp và tốt chúng tôi đã làm thực nghiệm với cả 2 loại detectơ này.

Kết quả được chỉ ra ở hình 3.3 và hình 3.4.

50

Hình 3.3: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 5mM dẫn xuất với AQC

trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ

huỳnh quang (ex = 250; em = 395)

Hình 3.4: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 5mM dẫn xuất với AQC

trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ PDA

(= 254nm)

Từ 2 sắc đồ nhận được bằng 2 detectơ PDA và huỳnh quang cho thấy, tín

hiệu píc sắc ký phát hiện bằng detectơ huỳnh quang có độ nhạy tốt hơn, píc sắc ký

nét và cân đối hơn nên trong phân tích các axít amin để có được hiệu quả tốt, chúng

Flu

ore

scen

ce

51

tôi đã sử dụng detectơ huỳnh quang với bước sóng kích thích ex=250nm; và bước

sóng phát quang em=395nm trong suốt quá trình tách và xác định axít amin.

3.2.2. Chọn pha tĩnh và cột tách

3.2.2.1. Chọn loại pha tĩnh

Để chọn loại pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân

cực của chất phân tích. Đối tượng phân tích của chúng tôi là các axít amin có gốc cơ

bản là như nhau và nhóm thế khác nhau nhưng do trong phân tử đều có gốc –COOH

và NH2 nên tất cả các axít amin đều là chất phân cực. Vì vậy để tách được các axít

amin chúng tôi chọn pha tĩnh là pha ngược. Hơn nữa khi sử dụng chất nhồi pha

ngược thì hệ dung môi của nó là những chất phân cực có tính kinh tế hơn, ngoài ra

nó còn rất ổn định không phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ và độ ẩm như chất nhồi pha

thường. Chính vì vậy chúng tôi chọn pha tĩnh là RP18 cho nghiên cứu này.

3.2.2.2. Chọn cột và kích thước hạt pha tĩnh

Đầu tiên chúng tôi đã sử dụng cột RP 18 với đường kính hạt pha tĩnh là 5

µm. Sau một thời gian nghiên cứu với hệ dung môi pha động thay đổi khác nhau sự

tách axít amin riêng biệt không đạt được, chỉ tách được 5 axít amin, nhưng độ tách

của các píc cũng không tốt. Chúng tôi phải lựa chọn hạt nhồi nhỏ hơn thì mới đáp

ứng được tách riêng biệt 17 axít amin. Kết quả được chỉ ra trên hình 3.5 và hình

3.6.

Flu

ore

scen

ce

52

Hình 3.5: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM, cột RP18 (150mm

x 4,6mm x 5m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex=250; em=395)

Để tách được các axít amin với tính chất hóa học rất giống nhau thì cột tách

phải có số đĩa lý thuyết lớn (N>9000) mới có khả năng tách được nên chúng tôi

chọn cột là Symmetry axít amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9 µm) để tìm các điều

kiện khác tối ưu hóa việc tách axít amin (hình 3.6).

Hình 3.6: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM,cột RP18 (150mm x

4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex=250; em=395)

3.2.2.3. Tính bất đối xứng của píc

Hình dáng lý tưởng của píc là píc đối xứng. Trên thực tế píc sắc ký thường

chỉ gần đối xứng. Để đánh giá tính bất đối xứng của píc chúng tôi dùng chuẩn phân

tích đơn glutamic và mẫu chuẩn hỗn hợp (hình 3.7 và hình 3.8).

Hệ số đối xứng được tính theo công thức nêu ở

Dược điển Việt Nam III [1] hệ số đối xứng SF = W/2a

(trong đó W = a + b và ở đây W=a+b được đo ở 1/20

chiều cao của píc).

Minutes

Flu

ore

scen

ce

53

Tính toán với glutamic chúng tôi có:

15,119

135,9

GluSF

Hình 3.7: Sắc đồ chuẩn axít glutamic, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ

dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)

Hình 3.8: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m),

tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)

Tính toán với một số axít amin khác trong chuẩn hỗn hợp ta có:

Asp: 04,14,5

9,27,2

AspSF

Ser: 03,14

1,20,2

SerSF

54

His: 00,12,4

1,21,2

HisSF

Met: 03,14,3

8,17,1

MetSF

Lys: 03,10,3

6,15,1

LysSF

Phe: 00,14,4

2,22,2

PheSF

Từ các kết quả trên cho thấy toàn bộ SF của các axít amin được khảo sát đều

nằm trong khoảng 1-1,15, do đó độ cân đối của píc là rất tốt, cột nhồi tốt vì một cột

tốt khi cho píc có SF trong khoảng 0,8 đến 1,2. Kết quả tính toán SF đều nằm trong

khoảng cho phép.

3.2.3. Nghiên cứu chọn hệ dung môi pha động

Trong kỹ thuật RP-HPLC, pha tĩnh ít phân cực và ngược lại pha động là hệ

dung môi phân cực vì thế chất tan ít phân cực sẽ bị lưu giữ trong cột lâu hơn các

chất tan phân cực. Sự lưu giữ chất tan trong hệ pha ngược phụ thuộc nhiều vào kích

thước cấu trúc phân tử chất tan, sau đó là độ phân cực của chúng. Sự lưu giữ của

các chất tan tăng khi kích thước phân tử tăng và độ phân cực giảm. Điều này rất

thích hợp để tách các axít amin. Trong số 17 axít amin chúng có độ dài mạch carbon

chính giống nhau nhưng độ dài và loại nhóm thế khác nhau cho nên chúng có thể

được tách ra khỏi nhau trong hệ sắc ký pha ngược khi có pha động phù hợp. Về mặt

lý thuyết, thời gian lưu của chúng sẽ tăng theo chiều dài mạch carbon của nhóm thế

và số nhóm thế.

Các dung môi acetonitril, đệm, nước là những dung môi hay được sử dụng

như là dung môi cơ bản trong pha động của hệ pha ngược, vì thế trong nghiên cứu

của chúng tôi các dung môi này cũng được sử dụng để khảo sát. Dưới đây là kết quả

nghiên cứu một số hệ pha động và yếu tố ảnh hưởng của thành phần pha động đến

quá trình tách các axít amin.

3.2.3.1. Khảo sát sơ bộ chọn hệ pha động cho sự tách axít amin

55

Qua tham khảo các công trình nghiên cứu và với kinh nghiệm thực tế, dung

môi pha động được lựa chọn là hỗn hợp đệm (Na2HPO4 0,5M + 19,04g/lit

NaOAc.3H2O + 1g/l EDTA (dung dịch A) và acetonitril (dung dịch B), với các tỷ lệ

khác nhau. Hỗn hợp axít amin chuẩn được dẫn xuất với AQC, nồng độ chuẩn

10mM cho 16 axít amin, 5mM đối cystin. Bảng 3.1 chỉ ra thành phần của hệ pha

động và kết quả thời gian lưu của các axít amin, tốc độ dòng pha động 1 ml/phút,

cột Symmetry axít amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), detectơ huỳnh quang.

Bảng 3.1: Ảnh hưởng pha động đến thời gian lưu của các axít amin

Axít amin

Thời gian lưu (phút)

Pha động hệ 1 Pha động hệ 2 Pha động hệ 3

A/B (97:3) A/B (95:5) A/B (90:10)

Asp 9,0 4,0 2,0

Ser 12,0 6,0 2,5

Glu 15,0 7,5 3,0

Gly 15,5 7,7* 3,5

His 19,0 7,5* 4,0

Arg 29* 11,0 4,5*

Thr 29* 11,5* 4,5*

Ala 29* 12,0 5,5

Pro 32 13,5 6,0

Cys 37* 26,5* 7,0

Tyr 37* 26,5* 9,0

Val 37* - 12,0

Met - - 16,0

Lys - - -

Ile - - -

Leu - - -

Phe - - -

56

(-) không xuất hiện píc trước 60 phút; (*) Píc không tách

(Các sắc đồ khảo sát thành phần tỷ lệ pha động tại phụ lục 2).

Từ kết quả thời gian lưu cho thấy tại hệ dung môi 1 tách được 5 axít amin

nhóm đầu tiên nhưng píc không nét, chân doãng, còn 7 axít amin tiếp theo chụm

vào 2 píc ở 29 phút và 37 phút, sở dĩ 7 chất trên không tách được vì nồng độ ACN

quá ít nên Arg, Cys doãng píc quá lớn bao lên các píc còn lại. Còn lại 5 axít amin

tiếp theo không thấy xuất hiện píc trước 60 phút do nồng độ ACN quá nhỏ để có thể

rửa giải được các axít amin có cấu tạo cồng kềnh ra khỏi pha tĩnh. Điều này rất phù

hợp với tăng nồng độ ACN khi chạy hệ thứ 2 và thứ 3.

Trong sắc ký lỏng pha ngược dung môi ACN được dùng làm chất tăng khả

năng rửa giải của các chất có độ phân cực thấp và trung bình cũng như tăng độ nhạy

của nhiều chất phân tích. Tom Teerlink và cộng sự [78] đã nghiên cứu ảnh hưởng

của ACN trong dung môi hòa tan mẫu đến diện tích píc sắc ký của một số chất và

cho thấy khi nồng độ ACN tăng từ 20 - 60% thì diện tích píc tăng 5 lần.

Như vậy với 3 hệ pha động chạy đẳng dòng đã nêu ở trên ta thấy khi tăng

nồng độ ACN thì số píc axít amin tăng lên. Điều này hoàn toàn phù hợp với dự

đoán lý thuyết vì khi thêm ACN sẽ làm cho độ phân cực của pha động giảm đi, sẽ

kéo những chất ít phân cực như dẫn xuất của các axít amin ra khỏi pha tĩnh nhanh

hơn do nó hoà tan chất tan tốt hơn trong pha động nên đi ra nhanh hơn và píc sắc ký

gọn hơn.

Qua kết quả nghiên cứu trên thì chúng tôi thấy khó có thể tách hoàn toàn

được 17 axít amin ra khỏi nhau bằng chạy sắc ký pha động thành phần không đổi

(isocratic). Do đó dựa trên các nghiên cứu về chạy sắc ký pha động thành phần

không đổi nói trên chúng tôi chuyển sang chạy gradient. Đặc biệt là cần thêm một

số chất nhằm giảm sự doãng píc thì mới có khả năng tách được đồng thời 17 axít

amin.

Sau khi thay đổi và chuẩn hóa để tách được đồng thời 17 axít amin (xem sắc

đồ hình 3.7 và hình 3.8) chúng tôi thu được thành phần và tỷ lệ pha động gradient

như bảng 3.2.

57

Bảng 3.2: Thành phần và tỷ lệ pha động theo chế độ gradient

Thời gian

(phút)

Tốc độ dòng

(MP)

(ml/phút)

% Đệm phosphat-

acetat % Acetonitril % H2O

Nền 1,0 100 0 0

0,5 1,0 99 1 0

18,0 1,0 95 5 0

19,0 1,0 91 9 0

29,5 1,0 83 17 0

33,0 1,0 0 60 40

36,0 1,0 100 0 0

40,0 1,0 0 60 40

3.2.3.2. Ảnh hưởng của trietylamin trong pha động

Theo lý thuyết về sự tách các axít amin và một số chất tương tự Lourdes

Bosch & cộng sự [58] đã sử dụng trietylamin để giảm sự doãng píc sắc ký của

những chất ít phân cực trong hệ pha ngược, tăng độ nhạy và có được độ phân giải

tốt hơn. Khi phân tích axít amin, chúng tôi tiến hành thêm trietylamin vào hệ pha

động với nồng độ lần lượt là 8, 10, 12, 14, 16 mM. Kết quả về liên quan giữa lượng

trietylamin và thời gian lưu của các axít amin được chỉ ra ở bảng 3.3.

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ trietylamin trong pha động đến thời gian lưu

Axít

amin

Nồng độ trietylamin (mM) /thời gian lưu (phút)

0 13 15 17 19

Asp 15,6 14,0 13,8 13,3 13,2

Ser 17,1 15,4 15,1 14,5 14,5

Glu 18,0 16,2 15,9 15,6 15,4

Gly 19,2 17,3 16,9 16,9 16,5

His 20,0 18,0 17,6 17,5 17,5

58

Arg 23,7 21,3 20,9 20,9 21,2

Thr 23,9 21,5 21,1 21,1 21,8

Ala 24,7 22,2 21,8 21,8 22,2

Pro 26,0 23,4 22,9 23,1 23,1

Cys 28,6 25,7 26,1 26,0 26,6

Tyr 29,2 26,3 26,7 26,4 27,6

Val 30,4 27,4 27,8 27,5 28,2

Met 30,9 27,8 28,2 28,1 28,7

Lys 33,7 30,3 30,8 30,8 31,2

Ile 34,4 31,0 31,4 31,6 31,9

Leu 34,8 31,3 31,8 32,2 32,6

Phe 35,2 31,7 32,2 33,6 34,1

Minutes

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

Volts

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Volts

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

15

.60

8

12

15

6

Asp

17

.12

5

20

67

2

Ser

18

.00

8

15

83

2

Glu

19

.22

5

19

31

8

Gly

20

.04

2

36

65

6

His

21

.09

2

47

51

1

NH

32

2.3

83

48

12

2

3.7

83

70

28

2

Arg

23

.98

3

76

28

4

Th

r2

4.6

83

59

76

6

Ala

26

.02

5

24

58

4

Pro

27

.17

5

16

02

2

8.6

00

18

17

Cy

s2

9.2

75

52

38

0

Ty

r

29

.72

5

68

18

30

.41

7

72

43

3

Val

30

.97

5

65

73

8

Met

31

.45

8

77

88

33

.75

0

46

05

2

Ly

s3

4.4

25

96

91

4

Ileu

34

.80

8

15

85

47

Leu

35

.21

7

34

59

82

Ph

e

Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)

amino acids

Chuan hon hop_02.11.07.dat

Retention Time

Height

Name

Hình 3.9: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM khi chạy với pha

động không thêm trietylamin, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng

1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)

Nhận xét: Khi thêm trietylamin vào pha động đã làm giảm thời gian lưu của

17 axít amin nhưng làm tăng chiều cao píc do làm giảm độ doãng của píc. Tại nồng

độ trietylamin trong pha động 17 mM cho thấy giới hạn bão hòa có hiệu lực, còn

Flu

ore

scen

ce

Flu

ore

scen

ce

59

nếu tăng hơn nữa thì thời gian lưu của các píc axít amin không giảm thêm nữa. Vì

vậy chúng tôi lựa chọn thêm trietylamin vào pha động với nồng độ 17 mM để tách

17 axít amin trong thực phẩm. Kết quả được chỉ ra trên hình 3.9 và hình 3.10.

Hình 3.10: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 50 mM khi chạy với pha

động có thêm trietylamin 17mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng

1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)

3.2.3.3. Khảo sát tốc độ pha động

Tốc độ pha động cũng góp phần ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký vì nó

liên quan đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan trong hai pha tĩnh và pha

động. Cố định các điều kiện chạy pha động theo chế độ gradient (bảng 3.2), tiến

hành khảo sát các tốc độ pha động khác nhau.

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Volts

0.0

00

.05

0.1

0

Volts

0.00

0.05

0.10

Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)

amino acids

Chuan hon hop_02.11.07.dat

Retention Time

Height

Name

Flu

ore

scen

ce

Flu

ore

scen

ce

60

Hình 3.11: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1,2ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =

250; em = 395), pha động chạy theo chế độ gradient

Chúng tôi bắt đầu với tốc độ dòng từ 1,2 ml/phút; sau đó, giảm tốc độ dòng

xuống 1 ml/phút; 0,8 ml/phút và 0,5 ml/phút. Các kết quả thực nghiệm và sắc đồ

được chỉ ra ở các hình 3.11, hình 3.12, hình 3.13 và hình 3.14.

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40

Volts

0.0

0.1

0.2

0.3

Volts

0.0

0.1

0.2

0.3

15

.60

8

A

sp1

7.1

25

S

er

18

.00

8

Glu

19

.22

5

Gly

20

.04

2

His

21

.09

2

NH

32

2.3

83

23

.78

3

A

rg

23

.98

3

Th

r

24

.68

3

Ala

26

.02

5

P

ro2

7.1

75

28

.60

0

Cy

s

29

.27

5

Ty

r

29

.72

5

30

.41

7

Val

30

.97

5

Met

31

.45

8

33

.75

0

Ly

s

34

.42

5

Ileu

34

.80

8

L

eu

35

.21

7

Ph

e

Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)

amino acids

Chuan hon hop_02.11.07.dat

Retention Time

Name

Hình 3.12: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;

em = 395), pha động theo chế độ gradient

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45

Volts

0.0

0.2

0.4

0.6

Volts

0.0

0.2

0.4

0.6

Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)

amino acids

Chuan hon hop 02.11.07_TF 0.8.dat

Retention Time

Height

Name

Hình 3.13: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18

Flu

ore

scen

ce

Flu

ore

scen

ce

61

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 0,8ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =

250; em = 395), pha động theo chế độ gradient

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Volts

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Volts

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)

amino acids

Chuan hon hop 02.11.07_TF 0.5.dat

Retention Time

Height

Name

Hình 3.14: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 0,5ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =

250; em = 395), pha động theo chế độ gradient

Nhận xét:

Khi tốc độ pha động quá lớn (1,2 ml/phút), các chất trong hỗn hợp mẫu chưa

kịp tách ra khỏi nhau, dẫn đến hiện tượng chồng và chèn píc, nên không tách được

các axít amin (xem hình 3.11). Tại tốc độ dòng 1ml/phút các píc sắc ký vừa đủ để

tách ra khỏi nhau, thời gian 35 phút để tách được 17 axít amin (xem hình 3.12). Còn

nếu tiếp tục giảm tốc độ pha động (0,8 ml/phút và 0,5 ml/phút), thì các píc sắc ký ra

muộn, gây doãng chân píc, nên các axít amin không tách được ra khỏi nhau gây

hiện tượng chồng và chèn píc (xem hình 3.13 và hình 3.14). Vì vậy tốc độ dòng pha

động tối ưu trong nghiên cứu này là 1ml/phút.

3.2.4. Tổng hợp các điều kiện hệ thống RP-HPLC

Từ các kết quả đã nghiên cứu về chọn loại detectơ, bước sóng của detectơ,

loại cột tách, thể tích bơm mẫu, nhiệt độ cột, nhiệt độ mẫu, tốc độ và thành phần

pha động,… các điều kiện phù hợp nhất cho hệ thống RP-HPLC để tách và xác định

17 axít amin được chỉ ra ở bảng 3.4 và bảng 3.5.

Bảng 3.4: Các điều kiện đo RP-HPLC cho xác định các axít amin

Flu

ore

scen

ce

Flu

ore

scen

ce

62

TT Các thông số Các điều kiện được chọn

1 Cột tách RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m)

2 Kích thước hạt pha tĩnh 3,9 m

3 Nhiệt độ cột 37OC

4 Tốc độ dòng pha động 1ml/phút

5 Thể tích bơm mẫu 20l

6 Nhiệt độ mẫu 30OC

7 Detectơ Huỳnh quang

8 Bước sóng ex=250 nm; em=395 nm

9 Thành phần pha động

A: đệm acetat - phosphat pH 5,05

B: acetonitril

C: nước cất tinh khiết

(tỷ lệ trong gradient theo bảng 3.5)

Bảng 3.5: Tỷ lệ thành phần pha động

Thời gian

(phút)

% acetat -

phosphat % Acetonitril % H2O

Nền 100 0 0

0,5 99 1 0

18,0 95 5 0

19,0 91 9 0

29,5 83 17 0

33,0 0 60 40

36,0 100 0 0

3.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng và xây dựng

đường chuẩn của phương pháp phân tích

3.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD)

63

LOD được xác định bằng nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó cho các

píc có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N = 3) [7]. Đây là một thông số đặc

trưng cho độ nhạy của phương pháp. Chất nào nhạy hơn sẽ có giới hạn phát hiện

nhỏ. Thường xác định LOD theo hai cách sau:

a/ Phương pháp trực tiếp

Dùng chính chất phân tích tiến hành pha loãng tới nồng độ nhỏ nhất mà vẫn

thu được tín hiệu lớn gấp 3 lần tín hiệu đường nền (S/N = 3 hay S/N = 2hs/hn).

Do các axít amin được tách đồng thời, các píc sắc ký của axít amin rất sát

nhau, nên để xác định theo cách này sẽ khó thực hiện được vì độ nhạy của từng axít

amin không giống nhau nên khó thực hiện được theo cách trực tiếp mà chúng tôi

tiến hành theo phương pháp tính toán thống kê.

b/ Phương pháp tính toán

hs2

hn3CsLOD

[3.3.1]

Trong đó:

hn là chiều cao nhiễu

Cs là nồng độ từng axít amin,

Hs là chiều cao các píc của từng axít amin ở nồng độ Cs

Theo cách này, chúng tôi đã tiến hành làm thí nghiệm với hỗn hợp chuẩn các

axít amin (17 axít amin) được pha từ dung dịch có chứa 2,5 mM cho tất cả các axít

amin và 1,25 mM đối với cystin. Hút 40 l dung dịch chuẩn trên pha loãng bằng

HCl 20 mM thành 1ml để được dung dịch chuẩn làm việc có chứa 100 pmol/l đối

với 16 axít amin và 50 pmol/l đối với cystin.

Từ dung dịch chuẩn làm việc, chúng tôi chuẩn bị hỗn hợp dung dịch chuẩn

như sau: hút 10 l dung dịch chuẩn làm việc, pha loãng với nước cất tinh khiết để

được chính xác 1 ml, dung dịch này có chứa 1000 pmol/ml đối với 16 axít amin và

500 pmol/ml đối với cystin. Tại nồng độ này chiều cao chất phân tích (cystin) cao

hơn tín hiệu nhiễu đường nền khoan khoảng 20 lần.

64

Tại nồng độ chuẩn đã biết trước cùng với chiều cao píc sắc ký tương ứng và chiều

cao nhiễu đường nền tính được giá trị LOD theo công thức [3.3.1] cho các axít amin

(bảng 3.6).

Bảng 3.6: Giới hạn phát hiện của các axít amin

TT Tên axít

amin

Cs

(g/ml) hs hn

LOD

(g/ml)

1 Axít aspartic 1,33 90155 2043,5 0,045

2 Serin 1,05 116443 2043,5 0,027

3 Axít glutamic 1,47 93744 2043,5 0,048

4 Glycin 0,75 96241 2043,5 0,024

5 Histidin 1,55 163940 2043,5 0,029

6 Arginin 1,74 381922 2043,5 0,014

7 Threonin 1,19 378390 2043,5 0,009

8 Alanin 0,89 308081 2043,5 0,009

9 Prolin 1,15 131771 2043,5 0,027

10 Cystin 0,61 41085 2043,5 0,045

11 Tyrosin 1,81 265700 2043,5 0,021

12 Valin 1,17 425561 2043,5 0,008

13 Methionin 1,50 345018 2043,5 0,013

14 Lysin 1,47 199400 2043,5 0,023

15 Isoleucin 1,31 500714 2043,5 0,008

16 Leucin 1,31 444996 2043,5 0,009

17 Phenylalanin 1,65 466823 2043,5 0,011

3.3.2. Giới hạn định lượng LOQ

Giới hạn định lượng được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích

mà phép phân tích vẫn định lượng được chính xác với độ tin cậy 95%.

65

Theo lý thuyết thống kê trong hóa phân tích thì LOQ là nồng độ chất phân

tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đường nền ( S/N = 10), tức là LOQ = 3,3

LOD. LOQ = LOD3,3 [3.3.2]

Các giá trị LOQ được tính từ giá trị LOD theo công thức [3.3.2] chỉ ra trong

bảng 3.7.

Bảng 3.7: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

TT Axít amin LOD (g/ml) LOQ (g/ml)

1 Axít aspartic 0,045 0,149

2 Serin 0,028 0,091

3 Axít glutamic 0,048 0,159

4 Glycin 0,024 0,079

5 Histidin 0,005 0,015

6 Arginin 0,014 0,046

7 Threonin 0,010 0,032

8 Alanin 0,009 0,029

9 Prolin 0,027 0,088

10 Cystin 0,045 0,149

11 Tyrosin 0,021 0,069

12 Valin 0,008 0,028

13 Methionin 0,013 0,044

14 Lysin 0,023 0,074

15 Isoleucin 0,008 0,026

16 Leucin 0,009 0,030

17 Phenylalanin 0,011 0,036

3.3.3. Xây dựng đường chuẩn

Để tiến hành xây dựng đường chuẩn của phương pháp phân tích, chúng tôi

pha một dãy chuẩn có nồng độ từ 1mM đến 10mM cho 16 axít amin, từ 0,5mM đến

66

5mM đối cystin, để tiến hành xác định khoảng tuyến tính của tất cả 17 axít amin.

Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.8 và các hình 3.15 đến hình 3.18.

67

Bảng 3.8: Sự phụ thuộc của chiều cao píc sắc ký vào nồng độ của axít amin

TT Axít amin (g/ml) mV (g/ml) mV (g/ml) mV (g/ml) mV (g/ml) mV (g/ml) mV

1 Asp 0,149 9125 0,299 18068 0,597 36774 0,896 54476 1,195 73183 1,493 90155

2 Ser 0,091 11786 0,182 23336 0,365 47496 0,547 70361 0,730 94522 0,912 116443

3 Glu 0,159 9488 0,317 18787 0,634 38238 0,952 56645 1,269 76096 1,586 93744

4 Gly 0,079 9741 0,158 19287 0,315 39256 0,473 58154 0,631 78123 0,788 96241

5 His 0,015 11233 0,031 22242 0,062 45271 0,093 67063 0,124 90092 0,155 110986

6 Arg 0,046 38656 0,092 76539 0,185 155784 0,277 230777 0,369 310022 0,461 381922

7 Thr 0,032 38299 0,064 75831 0,127 154343 0,191 228643 0,255 307155 0,318 378390

8 Ala 0,029 31182 0,059 61741 0,117 125665 0,176 186158 0,234 250082 0,293 308081

9 Pro 0,088 13337 0,177 26408 0,354 53749 0,530 79623 0,707 106964 0,884 131771

10 Cys 0,149 4158 0,298 8234 0,596 16758 0,894 24826 1,192 33350 1,490 41085

11 Tyr 0,069 26893 0,138 53248 0,276 108378 0,414 160549 0,552 215680 0,690 265700

12 Val 0,028 43073 0,056 85284 0,111 173584 0,167 257146 0,222 345445 0,278 425561

13 Met 0,044 34921 0,087 69143 0,175 140731 0,262 208477 0,350 280065 0,437 345018

14 Lys 0,074 20182 0,149 39961 0,297 81334 0,446 120488 0,595 161861 0,743 199400

15 Ile 0,026 50680 0,053 100346 0,106 204239 0,159 302557 0,212 406450 0,265 500714

16 Leu 0,030 45040 0,060 89179 0,119 181512 0,179 268889 0,239 361221 0,298 444996

17 Phe 0,036 47249 0,072 93554 0,143 190415 0,215 282078 0,215 378939 0,358 466823

68

Từ kết quả xác định được bảng 3.8 trên, vẽ đồ thị sự phụ thuộc chiều cao

píc vào nồng độ axít amin ta có các đường chuẩn của một số axít amin như sau

(hình 3.15 đến 3.20). Đường chuẩn của các axít amin khác chúng tôi tập hợp tại

Phụ lục 4 của luận án.

y = 16806x - 11856

R2 = 0,9925

0

20000

40000

60000

80000

100000

0,149 0,299 0,597 0,896 1,195 1,493

Nång ®é Asp (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

H×nh 3.15: §­êng chuÈn ®Þnh

l­îng Asp tõ 0,149 ®Õn 1,493

(g/ml)

y = 20689x - 14596

R2 = 0,9925

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

0,015 0,031 0,062 0,093 0,124 0,155

Nång ®é His (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

H×nh 3.16: §­êng chuÈn ®Þnh

l­îng His tõ 0,015 ®Õn 0,155

(g/ml)

y = 71193x - 50227

R2 = 0,9925

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

0,046 0,092 0,185 0,277 0,369 0,461

Nång ®é Arg (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Hình 3.17: Đường chuẩn định lượng Arg từ

0,046 đến 0,461 (g/ml)

y = 7615,7x - 5169,9

R2 = 0,9939

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

0,149 0,298 0,596 0,894 1,129 1,49

Nång ®é Cys (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Hình 3.18: Đường chuẩn định lượng Cys từ

0,149 đến 1,49 (g/ml)

Từ các đồ thị chuẩn, các đường chuẩn của các axít amin đều không đi qua

gốc tọa độ. Về mặt lý thuyết đường chuẩn phải đi qua gốc tọa độ, nhưng trong hầu

hết các trường hợp cũng như trường hợp phân tích axít amin của chúng tôi đường

chuẩn đã không đi qua gốc tọa độ. Thông thường phương trình đường chuẩn sẽ có

dạng y = ax + b. Nếu b = 0 thì đường chuẩn đi qua gốc toạ độ, còn b≠0 thì đường

69

chuẩn không đi qua gốc tọa độ.

Có nhiều lý do làm b≠0. Trước hết, do tín hiệu đo độ phát huỳnh quang của

chất phân tích bị cộng thêm giá trị nhỏ từ phần huỳnh quang từ nền của pha động.

Ngoài ra, theo lý thuyết khi xác định chất phân tích có nồng độ sát với điểm LOQ

thì kết quả thường dao động lớn hơn so với các điểm khác. Do đó, nếu bỏ qua

điểm tại LOQ, thì trên đồ thị tại hình 3.19 và hình 3.20 đường chuẩn tuyến tính

hơn và giá trị R2 cũng tăng lên.

y = 76500x - 74993

R2 = 0,9998

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

0,092 0,185 0,277 0,369 0,461

Nång ®é Arg (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Hình 3.19: Đường chuẩn định lượng Arg từ

0,092 đến 0,461 (g/ml)

y = 8129,4x - 7567

R2 = 0,9998

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

0,298 0,596 0,894 1,129 1,49

Nång ®é Cys (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Hình 3.20: Đường chuẩn định lượng Cys từ

0,298 đến 1,49 (g/ml)

3.4. Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân mẫu

Để thu được các axít amin ở dạng muối hay dạng tự do từ thực phẩm, đặc

biệt thực phẩm có thành phần phức tạp giàu béo, đường và tạp chất, là một công

việc rất khó, dễ mất chất, hay nhiễm bẩn. Do đó phải lựa chọn được loại môi

trường tốt nhất để loại bỏ các thành phần không cần thiết mà vẫn đảm bảo giữ

được hoàn toàn chất cần phân tích. Cụ thể phải tối ưu các vấn đề sau:

- Khảo sát chọn môi trường thuỷ phân

- Khảo sát chọn điều kiện thuỷ phân như: nhiệt độ, thời gian.

Sau đây là các kết quả nghiên cứu:

3.4.1. Khảo sát chọn môi trường thủy phân

Nền mẫu thực phẩm được lựa chọn để nghiên cứu là hạt đậu tương (là loại

thực phẩm giàu đạm, nhiều béo và đường). Tiến hành cân 6 mẫu với khối lượng

70

tương tự như nhau và được thêm một lượng chất chuẩn như nhau (thêm chuẩn đơn

lysin) tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 125oC trong chân không với thời gian 24 giờ

trong môi trường thủy phân NaOH 3M và HCl 6M. Kết quả của hiệu suất thu hồi

được chỉ ra ở bảng 3.9.

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của môi trường đến hiệu suất thủy phân axít amin

Môi trường thủy phân NaOH 3M HCl 6M

Lysin (thêm vào

mg/100g) 0,253 2,502 5,327 0,253 2,502 5,327

Lysin (thu được đã trừ

mẫu gốc mg/100g) 0,076 0,946 1,935 0,231 2,419 5,181

Hiệu suất thu hồi (%) 30,12 37,81 36,32 91,17 96,67 97,25

Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy, thủy phân bằng NaOH cho hiệu suất thấp. Mặt

khác vì môi trường thực hiện phản ứng dẫn xuất là môi trường axít yếu nên sau khi

thủy phân bằng NaOH việc loại bỏ hết NaOH là rất khó khăn, phải thực hiện thêm

phản ứng trung hoà để chuyển về môi trường axít bằng axít HCl. Cách này sẽ làm

cho hỗn hợp mẫu có nhiều muối NaCl bị pha loãng, làm khó khăn cho quá trình

tạo dẫn xuất nên hiệu suất thấp. Vì vậy từ kết quả này chúng tôi chọn axít HCl làm

môi trường thủy phân mẫu.

3.4.2. Khảo sát các điều kiện thủy phân mẫu bằng HCl

* Về nồng độ axít:

Để chọn nồng độ axít HCl phù hợp cho sự thủy phân chúng tôi khảo sát một

dãy mẫu thực (nền mẫu đậu tương) cùng với chuẩn axít amin (Asp, Arg, cys, Lys,

Phe) được thêm vào và tiến hành thủy phân trong môi trường HCl 4, 4,5; 5; 5,5; 6;

6,5M. Ở nhiệt độ thủy phân 125oC, thời gian thủy phân 24 giờ. Các kết quả thực

nghiệm cho thấy, nồng độ axít HCl ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu suất thủy phân. Khi

nồng độ axít HCl quá thấp mẫu không được thủy phân hoàn toàn, hiệu suất thấp;

còn khi nồng độ đủ lớn, mẫu mới thủy phân hoàn toàn (bảng 3.10) và (hình 3.21).

71

Hình 3.21: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương, thêm

chuẩn ở nồng độ HCl 4,5M, ở 125 oC, trong 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x

3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)

(Kết quả các axít amin không được thủy phân hoàn toàn ra khỏi mẫu)

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi của axít amin

Nồng độ HCl (M) 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5

Asp (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447

Asp ( ms) 0,183 0,193 0,347 0,416 0,428 0,425

Hiệu suất (%) 41,02 43,11 77,58 93,17 95,67 95,06

Arg (mos) 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138

Arg ( ms) 0,157 0,142 0,113 0,133 0,132 0,133

Hiệu suất (%) 114,12 103,21 82,17 96,12 95,77 96,26

Cys (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447

Cys ( ms) 0,541 0,514 0,487 0,425 0,431 0,432

Hiệu suất (%) 121 115 109 95,17 96,32 96,59

Lys (mos) 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222

Lys ( ms) 0,233 0,242 0,226 0,216 0,216 0,215

Hiệu suất (%) 105 109 102 97,15 97,24 97,06

Phe (mos) 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108

Phe ( ms) 0,077 0,074 0,096 0,103 0,102 0,104

Hiệu suất (%) 71,12 68,11 88,59 95,32 94,89 95,96

mos: nồng độ chuẩn thêm vào (mg/100g);

ms: nồng độ chuẩn thu được đã trừ mẫu gốc.

72

0

20

40

60

80

100

120

140

4 4,5 5 5,5 6 6,5

Nång ®é HCl (M)

HiÖ

u s

uÊt

(%

)Cys

Arg

Cys

Lys

Phe

Hình 3.22: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào nồng độ HCl thủy

phân

Nhận xét: Từ kết quả thu được và đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu

suất thu hồi axít amin vào nồng độ HCl thủy phân cho thấy: khi nồng độ axít chưa

đủ để thủy phân mẫu phân tích thì các axít amin chưa tách ra khỏi nhau dẫn đến

hiệu suất thu hồi của một số axít amin lớn hơn 100% (do lẫn tạp chất và các píc

khác chưa tách); còn axít amin nào mà tách được thì hiệu suất thu hồi cũng thấp do

vẫn bị lẫn tạp chất. Từ nồng độ HCl 5,5M đến 6,5M hiệu suất thu hồi của các axít

amin ổn định. Từ kết quả này chúng tôi chọn nồng độ axít HCl 6M làm môi trường

thủy phân mẫu phân tích cho các nghiên cứu tiếp theo.

* Khảo sát nhiệt độ thủy phân:

Cũng như với nồng độ HCl môi trường thủy phân mà chưa đủ thì hiệu suất

thu được các axít amin không cao, nhiệt độ thủy phân mẫu phân tích cũng là một

yếu tố quan trọng trong quá trình thủy phân mẫu để tách axít amin. Để chọn nhiệt

độ thủy phân thích hợp chúng tôi khảo sát một dãy mẫu thực cùng nền là đậu

tương được thêm chuẩn (Asp, Arg, cys, Lys, Phe) tiến hành thủy phân trong môi

trường HCl 6M, thời gian thủy phân 24 giờ, nhưng ở nhiệt độ thủy phân khác

nhau: 110, 115, 120, 125, 130, 135oC. Các kết quả thực nghiệm cho thấy, nhiệt độ

ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu suất thủy phân. Khi nhiệt độ chưa đủ để phá vỡ các

chuỗi peptid thì chúng ta thu được dung dịch mẫu không thể tách được riêng biệt

từng axít amin (hình 3.23).

73

Hình 3.23: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu đậu tương bằng HCl

6M ở 110 oC, trong 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng

1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)

(mẫu thủy phân không hoàn toàn)

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của axít amin

Nhiệt độ (oC) 110 115 120 125 130 135

Asp (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447

Asp ( ms) 0,145 0,213 0,350 0,405 0,414 0,416

Hiệu suất (%) 32,36 47,63 78,25 90,71 92,56 93,08

Arg (mos) 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138

Arg ( ms) 0,118 0,121 0,132 0,131 0,133 0,132

Hiệu suất (%) 85,16 87,63 95,67 95,12 96,02 95,82

Cys (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447

Cys ( ms) 0,679 0,501 0,474 0,430 0,434 0,433

Hiệu suất (%) 152 112 106 96,17 97,01 96,79

Lys (mos) 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222

Lys ( ms) 0,170 0,188 0,216 0,213 0,215 0,216

Hiệu suất (%) 76,58 84,76 97,45 96,14 96,75 97,12

Phe (mos) 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108

Phe ( ms) 0,077 0,073 0,097 0,101 0,102 0,102

Hiệu suất (%) 71,12 67,59 90,25 93,62 94,17 94,66

mos:nồng độ chuẩn thêm vào (mg/100g);

ms: nồng độ chuẩn thu được đã trừ mẫu gốc.

74

0

20

40

60

80

100

120

140

160

110 115 120 125 130 135

NhiÖt ®é (oC)

HiÖ

u s

uÊt

(%

)

Asp

Arg

Cys

Lys

Phe

Hình 3.24: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào nhiệt độ thủy phân

đậu nành bằng HCl 6M

Nhận xét: Kết quả bảng 3.11 cho thấy từ nhiệt độ 120OC thì hiệu suất phản

ứng đã đạt được cao nhất. Nên chúng tôi chọn 125OC để thủy phân mẫu thực

phẩm.

* Khảo sát thời gian thủy phân mẫu

Để chọn thời gian thủy phân các axít amin có hiệu suất cao, một dãy chuẩn

axít amin và mẫu thực phẩm được thêm chuẩn trong môi trường HCl 6M, ở nhiệt

độ 125oC, nhưng thời gian thủy phân: 16, 18, 20, 22, 24 và 26 giờ được khảo sát.

Các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.12.

Hình 3.25: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương bằng

HCl 6M, ở 125oC, trong 20 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng

75

1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi

Thời gian (giờ) 16 18 20 22 24 26

Asp (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447

Asp ( ms) 0,514 0,474 0,395 0,423 0,419 0,421

Hiệu suất (%) 115 106 88,28 94,62 93,77 94,11

Arg (mos) 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138

Arg ( ms) 0,203 0,177 0,128 0,129 0,131 0,131

Hiệu suất (%) 147 128 92,76 93,55 95,11 94,72

Cys (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447

Cys ( ms) 0,234 0,306 0,391 0,401 0,396 0,402

Hiệu suất (%) 52,36 68,52 87,56 89,64 88,51 90,01

Lys (mos) 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222

Lys ( ms) 0,153 0,177 0,200 0,215 0,216 0,215

Hiệu suất (%) 68,91 79,63 90,21 96,94 97,2 96,89

Phe (mos) 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108

Phe ( ms) 0,086 0,095 0,103 0,103 0,103 0,104

Hiệu suất (%) 79,89 87,68 95,72 95,68 95,02 96,1

mos: nồng độ chuẩn thêm vào (mg/100g);

ms: nồng độ chuẩn thu được đã trừ mẫu gốc.

0

50

100

150

200

16 18 20 22 24 26

Thêi gian (giê)

HiÖ

u s

uÊt

(%) Cys

Arg

Cys

Lys

Phe

Hình 3.26: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào thời gian thủy phân

Kết quả bảng 3.12 cho thấy thời gian dưới 20 giờ, mẫu chưa được thủy phân

76

hoàn toàn, các axít amin và tạp chất chưa tách được ra khỏi nhau, nên hiệu suất thu

được các axít amin thấp. Khi thời gian thủy phân lớn hơn 20 giờ đủ để tách được

các axít amin ra khỏi nền mẫu, nên hiệu suất phản ứng thu hồi ổn định. Thời gian

thủy phân từ 22-24 giờ cho hiệu suất thu hồi là tốt nhất. Hiệu suất thu hồi đều lớn

hơn 90%. Chúng tôi đã chọn thời gian 23-24 giờ để tiến hành thủy phân mẫu thực

phẩm.

Dựa vào kết quả nghiên cứu chúng tôi đưa ra quy trình dự kiến cho phân

tích axít amin từ thực phẩm như trong sơ đồ sau:

77

QUY TRÌNH DỰ KIẾN TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH 17 AXÍT AMIN TRONG

THỰC PHẨM

Cân chính xác khoảng 1 - 3g (hoăc 10 - 20ml) mẫu đã xử lý

+ HCl 6M

Cho vào ống nghiệm thành dày

Thuỷ phân ở nhiệt độ 125oC trong 24 giờ

Để nguội, mở ống nghiệm, đuổi HCl dư

trong môi trường chân không

Định mức bằng HCl 20 mM

Loại không khí bằng nitơ, hàn

kín ống nghiệm.

Xác định bằng RP-HPLC Detectơ

huỳnh quang

Tạo dẫn xuất với AQC

Lọc qua màng lọc

0,45m

78

Mẫu sau khi thủy phân có các axít amin tồn tại dưới dạng muối, một số tạp

chất và một lượng lớn axít HCl dư. Để tiến hành được phản ứng dẫn xuất phải đuổi

HCl dư hoặc pha loãng mẫu nhiều lần để pH của mẫu nằm ở khoảng 5 và khi thêm

đệm borat thì pH của môi trường dẫn xuất phải đạt từ 8,2 đến 10. Nếu pH của mẫu

sau khi thêm đệm borat nhỏ hơn 6 thì khi tiến hành phản ứng dẫn xuất dung dịch

chuyển thành màu vàng và hiệu suất dẫn xuất thấp. Màu vàng của dung dịch mẫu

phân tích hấp thụ ánh sáng tím của vùng tử ngoại làm hiệu suất của phản ứng dẫn

xuất giảm đi. Do vậy, với những mẫu có hàm lượng đạm cao chỉ cần pha loãng

nhiều lần để đưa về pH cần thiết cho quá trình dẫn xuất vì nếu đuổi HCl bằng môi

trường chân không hoặc không khí sẽ tốn nhiều thời gian và dễ làm mất chất.

Nhưng với những mẫu lỏng ít đạm, nhiều đường, tạp chất và mẫu rắn ít đạm nhiều

tạp chất thì không thể pha loãng mẫu sẽ dẫn đến khó xác định được các axít amin,

vì nồng độ quá thấp nên chúng tôi đã tiến hành một số khảo sát như sau:

3.4.3. Khảo sát điều kiện làm giàu và chuyển mẫu về trung tính sau

thủy phân

3.4.3.1. Khảo sát điều kiện làm giàu mẫu

a/ Với mẫu lỏng ít đạm nhưng lại nhiều đường

Mẫu sữa tươi, sữa đậu nành, mẫu nước men, mẫu philatop: lấy 15-100ml

mẫu cô cách thuỷ ở 100oC, định mức lại thành 10ml. Lấy 2ml + 10ml HCl 6M và

làm như quy trình đã nêu trên đây. Kết quả tuy píc lên đủ, nhưng tách không tốt và

còn nhiều tạp chất xen lẫn (hình 3.27).

Hình 3.27: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu sữa đậu nành sau khi

được làm giàu bằng cách thuỷ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng

79

1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)

b/ Với mẫu rắn, khô, ít đạm (như mẫu rau)

Vì mẫu khô, nên khi cho thêm HCl vào, mẫu hút nước làm giảm thể tích

thậm chí bị khô. Nếu thấm ướt trước khi thêm HCl quá trình thủy phân kém, nồng

độ axit thấp nên tạp chất không được phân huỷ hết, gây ảnh hưởng đến việc nhận

biết và định lượng chất phân tích.

3.4.3.2. Khảo sát điều kiện chuyển mẫu về trung tính sau thuỷ phân

Qua một số khảo sát chúng tôi thấy không thể cô làm giàu mẫu hay làm bay

hơi giảm lượng HCl sau thủy phân mẫu ít đạm nhiều đường và các tạp chất khác.

Do đó, chúng tôi đã tiến hành tìm môi trường để điều chỉnh pH của mẫu. Ở đây

chúng tôi sử dụng NaOH 0,5M và Na2B4O7 0,25M để tiến hành điều chỉnh pH của

dung dịch mẫu chuẩn (hỗn hợp chuẩn gồm 7 chất chuẩn axít amin riêng rẻ 2ppm

nằm ở đoạn đầu, giữa và cuối), sau đó tiến hành thủy phân trong môi trường axít

HCl tương tự như mẫu thử để đánh giá thay đổi thời gian lưu, hiệu suất thu hồi và

đặc biệt khả năng tách. Kết quả khảo sát cho thấy, khả năng tách, thời gian lưu và

đặc biệt độ thu hồi trên mẫu được điều chỉnh pH bằng Na2B4O7 0,25M cho điều

kiện tối ưu nhất chỉ ra trên hình 3.29. Chúng tôi nhận thấy rằng nếu dùng NaOH để

điều chỉnh pH sẽ cho sắc đồ không tốt, thời gian lưu thay đổi, có píc phụ ở 21 phút

(sắc đồ hình 3.28). Còn nếu dùng Na2B4O7 để điều chỉnh pH thì thu được sắc đồ có

píc tách tốt, thời gian lưu ổn định, không có píc tạp chất (sắc đồ hình 3.29). Qua

kết quả trên chúng tôi chọn Na2B4O7 0,25M để điều chỉnh pH mẫu sau khi thủy

phân, tạo pH phù hợp cho phản ứng dẫn xuất các axít amin bằng AQC.

Minutes

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

mA

U

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

mA

U

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Asp Ser

Glu Gly

His

Arg

Phe

RF10AXL (Ex:250nm, Em:395nm)

Amin

Asp-Ser-Glu-Gly-His-Arg-Phe-2ppm-H2O_chinh pH.dat

Name

Hình 3.28: Sắc đồ 7 chuẩn axít amin được điều chỉnh pH bằng NaOH 0,5M, cột

RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang

Flu

ore

scen

ce

80

(ex=250; em=395)

Minutes

16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

mA

U

0.0

0.2

0.4

0.6

mA

U

0.0

0.2

0.4

0.6

Asp Ser

Glu Gly

His Arg

Phe

RF10AXL (Ex:250nm, Em:395nm)

Amin

Asp--Ser-Glu-Gly-His-Arg-Phe_chinhpH=8voi Natriborat.dat

Name

Hình 3.29: Sắc đồ chuẩn 7 axít amin điều chỉnh pH bằng Na2B4O7 0,25M, cột

RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang

(ex= 250; em = 395)

3.4.4. Khảo sát quá trình tạo dẫn xuất huỳnh quang

Mẫu sau khi thủy phân và lọc mẫu qua màng lọc 0,45µm, lấy chính xác 0,5-

1 ml cho vào lọ đựng mẫu có nắp với dung tích 1,5ml, thêm đệm borat Na2B4O7

0,25M để được môi trường mẫu phù hợp, thêm chất dẫn xuất AQC (3mg/ml trong

acetonitril), đậy nắp ngay, lắc đều vài giây. Đặt mẫu vào bể điều nhiệt, thỉnh

thoảng lắc, trong vòng 10 phút. Quá trình dẫn xuất có 2 yếu tố ảnh hưởng lớn đến

kết quả phân tích cần được khảo sát đó là pH của môi trường trước khi dẫn xuất và

nhiệt độ dẫn xuất:

3.4.4.1. Ảnh hưởng của pH môi trường phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh

quang đến hiệu suất thu hồi

Để chọn lượng Na2B4O7 0,25M tạo môi trường pH phù hợp cho phản ứng

dẫn xuất đạt hiệu quả cao chúng tôi tiến hành lấy 1ml (nền mẫu đậu tương) cùng

với chuẩn axít amin (Asp, Arg, cys, Lys, Phe) sau khi thủy phân thêm lần lượt

lượng đệm Na2B4O7 khác nhau, lượng dẫn xuất AQC cho như nhau và tiến hành

dẫn xuất ở cùng các điều kiện như nhau. Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.13.

Bảng 3.13: Sự phụ thuộc của hiệu suất dẫn xuất các axít amin vào pH môi trường

pH 6,1 6,4 7,1 7,7 8,3 9,0

Asp (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447

Asp ( ms) 0,000 0,000 0,213 0,318 0,432 0,431

Flu

ore

scen

ce

81

Hiệu suất (%) 0,0 0,0 47,58 71,23 96,56 96,5

Arg (mos) 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138

Arg ( ms) 0,000 0,000 0,071 0,096 0,132 0,133

Hiệu suất (%) 0,0 0,0 51,24 69,87 95,89 96,05

Cys (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447

Cys ( ms) 0,000 0,000 0,189 0,254 0,423 0,422

Hiệu suất (%) 0,0 0,0 42,31 56,87 94,53 94,49

Lys (mos) 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222

Lys ( ms) 0,000 0,000 0,145 0,180 0,217 0,217

Hiệu suất (%) 0,0 0,0 65,24 81,02 97,59 97,62

Phe (mos) 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108

Phe ( ms) 0,000 0,000 0,077 0,090 0,105 0,105

Hiệu suất (%) 0,0 0,0 71,25 83,07 96,89 97,01

Qua kết quả trên cho thấy thêm 70 l Na2B4O7 0,25M trở lên để đạt được

pH= 8,3 - 9 sẽ cho hiệu suất thu hồi trên 90%. Nếu pH quá thấp (dưới 7) phản ứng

dẫn xuất không diễn ra, pH dưới 8 phản ứng dẫn xuất đạt hiệu quả thấp. Vì vậy

mẫu sau khi thủy phân được điều chỉnh về pH = 5 bằng Na2B4O7 0,25M, sau đó lấy

0,5 - 1ml thêm 75l đệm borat rồi mới tiến hành dẫn xuất. Kết quả này cũng phù

hợp với tác giả L. Bosch [58] đã chọn pH dẫn xuất là 8,2 - 9,7.

3.4.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang đến

hiệu suất thu hồi

Hình 3.30: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương được

82

dẫn xuất ở 65oC, thời gian 10 phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ

dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)

Để chọn được nhiệt độ tốt nhất cho phản ứng dẫn xuất xảy ra hoàn toàn

chúng tôi tiến hành dẫn xuất ở các nhiệt độ khác nhau (30, 40, 50, 55, 60 và 65oC)

trên nền mẫu đậu tương, các điều kiện khác giữ nguyên (như ở mục 3.4.4.). Kết

quả được chỉ ra ở bảng 3.14 và hình 3.30 là kết quả dẫn xuất ở 65oC.

Bảng 3.14: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào nhiệt độ tạo dẫn xuất huỳnh

quang

Nhiệt độ (oC) 30 40 50 55 60 65

Asp (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447

Asp ( ms) 0,000 0,100 0,347 0,431 0,214 0,000

Hiệu suất (%) 0,0 22,36 77,62 96,52 47,82 0,0

Arg (mos) 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138

Arg ( ms) 0,000 0,042 0,110 0,134 0,069 0,000

Hiệu suất (%) 0,0 30,61 80,06 97,02 50,21 0,0

Cys (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447

Cys ( ms) 0,000 0,183 0,307 0,429 0,147 0,000

Hiệu suất (%) 0,0 41,02 68,72 95,89 32,87 0,0

Lys (mos) 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222

Lys ( ms) 0,000 0,086 0,146 0,214 0,135 0,000

Hiệu suất (%) 0,0 38,69 65,81 96,22 61,02 0,0

Phe (mos) 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108

Phe ( ms) 0,000 0,044 0,081 0,106 0,062 0,000

Hiệu suất (%) 0,0 40,71 75,36 98,13 57,63 0,0

Các kết quả đã nêu ở trên cho thấy ở nhiệt độ 55oC cho hiệu suất dẫn xuất

tốt nhất (>95%). Nếu nhiệt độ chưa đủ hoặc nhiệt độ quá cao sẽ dẫn đến phản ứng

dẫn xuất chưa diễn ra hoặc chất bị phân huỷ. Vì vậy chúng tôi chọn nhiệt độ để

dẫn xuất là 55oC. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của tác giả L. Bosch [58]

đã chọn nhiệt độ dẫn xuất ở 55oC.

3.4.4.3. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang

đến hiệu suất thu hồi

83

Để chọn thời gian phù hợp cho phản ứng dẫn xuất xảy ra hoàn toàn chúng

tôi tiến hành phản ứng dẫn xuất ở các thời gian khác nhau (5, 8, 10, 12, 14 và 16

phút), các điều kiện khác của quá trình dẫn xuất giữ nguyên như ở mục 3.4.4. Kết

quả được chỉ ra ở bảng 3.15 và hình 3.31.

Hình 3.31: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương được

dẫn xuất ở 65oC, thời gian 5 phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ

dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)

Bảng 3.15: Sự phụ thuộc của hiệu suất axít amin vào thời gian dẫn xuất

Thời gian (phút) 5 8 10 12 14 16

Asp (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447

Asp ( ms) 0,293 0,426 0,430 0,429 0,316 0,168

Hiệu suất (%) 65,61 95,25 96,12 96,02 70,72 37,62

Arg (mos) 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138

Arg ( ms) 0,098 0,132 0,132 0,133 0,100 0,057

Hiệu suất (%) 71,02 95,78 95,76 96,25 72,68 41,02

Cys (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447

Cys ( ms) 0,307 0,428 0,429 0,428 0,306 0,173

Hiệu suất (%) 68,72 95,83 96,02 95,64 68,35 38,64

Lys (mos) 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222

Lys ( ms) 0,156 0,213 0,213 0,213 0,178 0,078

Hiệu suất (%) 70,21 96,12 96,08 95,78 80,12 35,24

Phe (mos) 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108

84

Phe ( ms) 0,069 0,104 0,105 0,104 0,086 0,041

Hiệu suất (%) 64,35 96,75 96,81 96,69 79,86 37,54

Qua kết quả trên cho thấy ở thời gian 5 phút phản ứng xẩy ra chưa hoàn

toàn nên hiệu suất phản ứng kém. Từ 8 - 12 phút hiệu suất cao và ổn định (>95%).

Sau 12 phút hiệu suất phản ứng giảm. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian thực hiện

quá trình dẫn xuất là 10 phút. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của tác giả L.

Bosch [58] với thời gian dẫn xuất là 10 phút và sản phẩm dẫn xuất có thể ổn định

trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ phòng.

3.5. Lược đồ quy trình phân tích đối với các mẫu thực phẩm

Từ các kết quả thu được đã trình bày ở trên chúng tôi đề xuất 2 lược đồ quy

trình cho từng đối tượng mẫu để tách và xác định các axít amin trong thực phẩm

như sau:

85

LƯỢC ĐỒ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 1

Quy trình tách và xác định các axít amin trong mẫu thực phẩm có hàm lượng

protein nhỏ hơn 10%

Cân chính xác khoảng 2 - 3g (hoặc 10 - 20ml) mẫu đã xử lý

+ HCl đậm đặc, để được môi trường thủy

phân có nồng độ HCl là 15% (6M)

Cho vào ống nghiệm thành dày

Thuỷ phân ở nhiệt độ 125oC trong tủ sấy, 24 giờ

Để nguội, mở ống, điều chỉnh pH = 5

bằng Na2B4O7 0,25M

Định mức vào bình 50ml với nước cất

Loại không khí bằng nitơ, hàn

kín ống nghiệm.

Bơm 20l vào hệ thống RP-HPLC

Detectơ huỳnh quang

Cách thuỷ 10 phút ở 55oC

Lọc qua giấy lọc thường

Lấy mẫu ra khỏi tủ sấy

Lọc qua màng lọc 0,45m

(hút 1ml mẫu cho vào vial)

+75 l đệm borat (lắc đều)

+ 20 l AQC (3mg/ml)

86

LƯỢC ĐỒ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 2

Quy trình tách và xác định các axít amin trong mẫu thực phẩm có hàm lượng

protein lớn hơn 10%

Cân chính xác khoảng 1g (hoặc 10 ml) mẫu đã xử lý

+ HCl đậm đặc, để được môi trường

thủy phân có nồng độ HCl là 15% (6M)

Cho vào ống nghiệm thành dày

Thuỷ phân ở nhiệt độ 125oC trong tủ sấy, 24

giờ

Để nguội, mở ống, định mức 100 ml

Hút 1ml cho vào bình định mức 50ml,

định mức tới vạch bằng nước cất

Loại không khí bằng nitơ, hàn

kín ống nghiệm.

Bơm 20l vào hệ thống RP-HPLC

Detectơ huỳnh quang

Cách thuỷ 10 phút ở 55oC

Lọc qua giấy lọc thường

Lấy mẫu ra khỏi tủ sấy

Lọc qua màng lọc 0,45m

(hút 0,5ml mẫu cho vào vial)

+75 l đệm borat (lắc đều)

+ 20 l AQC (3mg/ml)

87

3.6. Đánh giá thống kê phương pháp phân tích

3.6.1. Độ đúng của phương pháp

Độ đúng của phép đo được đánh giá thông qua phần trăm sai số. Để đánh

giá sai số của phương pháp phân tích chúng tôi pha 3 hỗn hợp mẫu chuẩn có các

axít amin nằm ở khoảng đầu, giữ và đoạn cuối của đường chuẩn và khảo sát trên

nền mẫu thực là hạt đậu tương. Các mẫu chuẩn phân tích được pha từ chuẩn gốc có

nồng độ như sau:

Chuẩn hỗn hợp (17 axít amin) được pha từ dung dịch có chứa 2,5 mM cho

tất cả các axít amin và 1,25 mM đối với cystin. Hút 40 l dung dịch chuẩn trên pha

loãng bằng HCl 20 mM thành 1ml để được dung dịch chuẩn làm việc có chứa 100

pmol/l đối với 16 axít amin và 50 pmol/l đối với cystin.

Từ dung dịch chuẩn làm việc, chúng tôi chuẩn bị 3 hỗn hợp dung dịch

chuẩn có nồng độ là:

- Nồng độ thứ 1: hút 10 l dung dịch chuẩn làm việc, pha loãng với nước

cất tinh khiết để được chính xác 1 ml, dung dịch này có chứa 1000

pmol/ml đối với 16 axít amin và 500 pmol/ml đối với cystin.

- Nồng độ thứ 2: hút 50 l dung dịch chuẩn làm việc, pha loãng với nước

cất tinh khiết để được dung dịch chính xác 1ml, dung dịch này có chứa

5000 pmol/ml đối với 16 axít amin và 2500 pmol/ml đối với cystin.

- Nồng độ thứ 3: hút 100 l dung dịch chuẩn làm việc,pha loãng với nước

cất tinh khiết để được dung dịch chính xác 1ml, dung dịch này có chứa

10000 pmol/ml đối với 16 axít amin và 5000 pmol/ml đối với cystin.

Tiến hành phân tích theo lược đồ quy trình phân tích 2 mục 3.5 trên đây.

Từ chiều cao píc sắc ký cho từng lần đo, áp vào đường chuẩn để tính ra

nồng độ từng axít amin trong mẫu phân tích (Cpt) và trong mẫu phân tích thêm

chuẩn (C(s + pt)) của mỗi lần chạy sắc ký. Từ đó nồng độ của mẫu chuẩn đã thêm

vào mẫu phân tích được tìm thấy theo công thức sau:

Ci = C(pt +s) - C pt (1)

Từ giá trị Ci tìm được so sánh với giá trị nồng độ chất chuẩn ban đầu (Ct) đã

thêm vào mẫu phân tích để tính sai số cho từng axít amin theo công thức sau [4,

10]:

88

100%

t

it

C

CCX (2)

Trong đó:

- %X: sai số phần trăm tương đối

- Ct: Nồng độ thực của chuẩn cho thêm vào mẫu phân tích

- Ci: Nồng độ chuẩn tìm được ứng axít amin thứ i

Bảng 3.16: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 1 (150 - 30ppb)

TT Các axít

amin

Các thông số

Ct (mg/100g) C(mẫu pt ) + s Cmẫu pt (mg/100g) %X

1 Asp 0,015 3,112 3,096 6,09

2 Ser 0,009 1,548 1,538 7,29

3 Glu 0,016 6,607 6,59 6,91

4 Gly 0,008 2,237 2,229 7,52

5 His 0,002 2,034 2,032 8,31

6 Arg 0,005 4,212 4,207 9,09

7 Thr 0,003 2,037 2,033 9,78

8 Ala 0,003 1,936 1,933 6,36

9 Pro 0,009 2,267 2,257 8,36

10 Cys 0,015 0,202 0,186 7,73

11 Tyr 0,007 1,899 1,892 8,41

12 Val 0,003 1,774 1,771 7,03

13 Met 0,004 0,907 0,902 9,87

14 Lys 0,007 0,975 0,967 7,86

15 Ile 0,003 1,651 1,648 6,87

16 Leu 0,003 2,939 2,936 8,04

17 Phe 0,004 3,763 3,759 6,78

Nhận xét: Theo AOAC [19] sai số cho phép ở cấp nồng độ 200 -10 ppb lớn

nhất là 15 -20%. Như vậy, ở mức (200 - 10 ppb) phương pháp cho xác định các

axít amin đã nêu ra có độ đúng cao, sai số đều thấp hơn 10%.

89

Bảng 3.17: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 2 (790 - 80ppb)

TT Các axít

amin

Các thông số

Ct (mg/100g) C(mẫu pt ) + s Cmẫu pt (mg/100g) %X

1 Asp 0,075 3,173 3,096 3,17

2 Ser 0,046 1,586 1,538 4,21

3 Glu 0,079 6,673 6,59 4,38

4 Gly 0,039 2,270 2,229 3,04

5 His 0,008 2,040 2,032 4,01

6 Arg 0,023 4,231 4,207 5,24

7 Thr 0,016 2,050 2,033 5,26

8 Ala 0,015 1,948 1,933 4,66

9 Pro 0,044 2,304 2,257 5,32

10 Cys 0,074 0,263 0,186 3,15

11 Tyr 0,034 1,928 1,892 4,07

12 Val 0,014 1,785 1,771 3,89

13 Met 0,022 0,925 0,902 4,11

14 Lys 0,037 1,005 0,967 3,21

15 Ile 0,013 1,662 1,648 3,47

16 Leu 0,015 2,951 2,936 2,98

17 Phe 0,018 3,777 3,759 3,05

Nhận xét: Theo AOAC [19] sai số của phương pháp ở cấp nồng độ

1000ppb lớn nhất là 15%. Như vậy, ở mức hàm lượng này phương pháp xác

định các axít amin của chúng tôi cũng có độ đúng cao, sai số đều nhỏ hơn đều nhỏ

hơn 6%.

Bảng 3.18: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 3 (1490 - 150 ppb)

TT Các axít

amin

Các thông số

Ct (mg/100g) C(mẫu pt ) + s Cmẫu pt (mg/100g) %X

1 Asp 0,149 3,253 3,096 5,02

2 Ser 0,091 1,635 1,538 6,21

90

3 Glu 0,159 6,757 6,59 5,59

4 Gly 0,079 2,312 2,229 5,89

5 His 0,015 2,048 2,032 6,02

6 Arg 0,046 4,256 4,207 7,11

7 Thr 0,032 2,067 2,033 7,02

8 Ala 0,029 1,964 1,933 5,21

9 Pro 0,088 2,351 2,257 6,06

10 Cys 0,149 0,344 0,186 5,87

11 Tyr 0,069 1,965 1,892 6,41

12 Val 0,028 1,800 1,771 5,32

13 Met 0,044 0,948 0,902 6,25

14 Lys 0,074 1,046 0,967 5,87

15 Ile 0,026 1,676 1,648 4,97

16 Leu 0,030 2,968 2,936 6,54

17 Phe 0,036 3,797 3,759 5,26

Nhận xét: Theo AOAC [19] sai số cho phương pháp ở mức nồng độ 100

ppb - 1000 ppb là 15 - 11%. Do đó, độ chính xác của phương pháp xác định các

axít amin ở nồng độ này cũng rất cao.

Ở cận dưới của đường chuẩn tuy có mắc phải sai số lớn nhất, nhưng vẫn

dưới giới hạn cho phép. Như vậy, tại mọi điểm trên đường chuẩn, sai số của

phương pháp đều nằm trong giới hạn cho phép.

3.6.2. Độ lặp lại của phương pháp

Để khảo sát độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm

trên cá quả, cá thu, sữa đậu nành, đậu phụ và hạt đậu tương. Mẫu cá quả, cá thu,

đậu phụ và hạt đậu tương (đại diện cho các loại thực phẩm giàu đạm) được tiến

hành phân tích theo lược đồ quy trình phân tích 2 tại mục 3.5. Mẫu sữa đậu nành

(đại diện cho mẫu ít đạm) được tiến hành phân tích theo lược đồ quy trình phân

tích 1 tại mục 3.5. Mỗi loại thực phẩm tiến hành phân tích 6 mẫu. Cụ thể ở đây

chúng tôi xem xét độ lệch chuẩn để xác định độ lặp lại về hàm lượng và thời gian

lưu của từng axít amin đối với các mẫu.

* Độ lệch chuẩn về hàm lượng được tính theo công thức sau:

)1(

)(1

2

2

n

xx

SS

n

i

tbi

x

91

Độ lệch chuẩn tương đối về hàm lượng được tính theo công thức sau:

RSDx = Sx100/xtb

Trong đó:

Sx: Độ lệch chuẩn về hàm lượng

xi: Hàm lượng của từng axít amin trong mẫu ở lần đo thứ i

xtb: Hàm lượng trung bình của từng axít amin trong mẫu

RSDx: Độ lệch chuẩn tương đối về hàm lượng

* Độ lệch chuẩn về thời gian lưu được tính theo công thức sau:

)1(

)(1

2

2

n

tt

SS

n

i

tbi

t

Độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu được tính theo công thức sau:

RSDt = St100/ttb

Trong đó:

St: Độ lệch chuẩn về thời gian lưu

ti: Thời gian lưu của từng axít amin trong mẫu phân tích ở lần đo thứ i

ttb: Thời gian lưu trung bình của từng axít amin trong mẫu phân tích

RSDt: Độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu

Các kết quả khảo sát được chỉ ra trong các bảng từ 3.19 đến bảng 3.26.

Bảng 3.19: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu cá quả

Các axít amin Hàm lượng axít amin xi (g/100g) xtb

(g/100g) Sx RSDx (%)

Asp 0,72 0,69 0,72 0,70 0,74 0,74 0,72 0,02 2,88

Ser 0,79 0,77 0,79 0,77 0,78 0,80 0,79 0,01 1,39

Glu 1,23 1,43 1,24 1,23 1,35 1,34 1,31 0,08 6,22

Gly 1,86 1,78 1,69 1,69 1,72 1,89 1,77 0,09 4,89

His 0,65 0,70 0,62 0,64 0,66 0,67 0,66 0,03 4,04

Arg 1,87 1,88 1,91 1,92 1,87 1,92 1,90 0,03 1,42

Thr 0,87 0,83 0,86 0,88 0,86 0,86 0,86 0,02 1,93

Ala 0,63 0,60 0,63 0,60 0,64 0,67 0,63 0,03 4,47

92

Pro 0,73 0,74 0,75 0,77 0,76 0,76 0,75 0,01 1,71

Cys 0,24 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,01 1,86

Tyr 0,94 0,93 0,90 0,92 0,88 0,95 0,92 0,03 2,98

Val 0,45 0,40 0,51 0,44 0,46 0,47 0,46 0,04 8,38

Met 0,67 0,71 0,69 0,70 0,71 0,69 0,70 0,01 2,05

Lys 0,30 0,32 0,30 0,35 0,32 0,33 0,32 0,02 6,38

Ile 0,42 0,40 0,43 0,40 0,43 0,43 0,42 0,02 3,91

Leu 0,84 0,84 0,84 0,85 0,80 0,80 0,83 0,02 2,86

Phe 1,26 1,23 1,12 1,21 1,13 1,12 1,18 0,06 5,22

Nhận xét: Độ lặp lại hàm lượng của các axít amin trong mẫu cá quả có độ

lệch chuẩn tương đối giao động từ 1,39 đến 8,38%. Tuy độ lệch chuẩn tương đối

không tốt, nhưng vẫn có thể chấp nhận được khi phân tích ở nồng độ này vì còn

nằm dưới ngưỡng cho phép (10%).

Bảng 3.20: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu cá quả

Các axít amin Thời gian lưu ti (phút) ttb (phút) St RSDt (%)

Asp 13,82 13,69 13,63 13,75 13,66 13,65 13,70 0,07 0,51

Ser 15,34 15,14 15,11 15,26 15,12 15,12 15,18 0,09 0,62

Glu 16,18 16,36 15,93 16,11 15,94 15,94 16,07 0,17 1,08

Gly 17,47 17,22 17,20 17,40 17,19 17,22 17,28 0,12 0,70

His 18,12 17,84 17,80 18,02 18,29 17,82 17,98 0,20 1,11

Arg 21,18 21,09 21,08 21,15 21,09 21,09 21,11 0,04 0,21

Thr 21,40 21,31 21,31 21,39 21,31 21,31 21,34 0,04 0,19

Ala 22,02 21,93 21,92 21,98 21,93 21,93 21,95 0,04 0,18

Pro 23,35 23,25 23,23 23,28 23,25 23,26 23,27 0,04 0,18

Cys 26,47 26,63 26,60 26,47 26,65 26,65 26,58 0,09 0,33

Tyr 26,74 27,12 27,09 26,63 27,13 27,13 26,97 0,23 0,84

Val 27,92 27,89 27,78 27,82 27,82 27,82 27,84 0,05 0,18

Met 28,47 28,35 28,33 28,37 28,37 28,37 28,38 0,05 0,16

Lys 31,12 31,00 30,99 31,02 31,02 31,02 31,03 0,05 0,16

Ile 31,95 31,82 31,82 31,85 31,84 31,85 31,86 0,05 0,15

Leu 32,56 32,42 32,41 32,45 32,44 32,45 32,45 0,05 0,17

93

Phe 34,03 33,85 33,84 33,89 33,87 33,89 33,89 0,07 0,20

Nhận xét: Độ lặp lại về thời gian lưu (ti) của các axít amin trong mẫu cá

quả rất tốt và điều đó cho thấy cho thấy các điều kiện đã lựa chọn là phù hợp và

cho độ ổn định rất cao.

Bảng 3.21: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin đối với mẫu cá thu

Các axít amin Hàm lượng axít amin xi (g/100g) xtb

(g/100g) Sx

RSDx

(%)

Asp 0,93 0,92 0,90 0,89 0,92 0,93 0,91 0,02 1,82

Ser 0,87 0,86 0,84 0,87 0,90 0,86 0,87 0,02 2,48

Glu 1,65 1,60 1,70 1,69 1,63 1,66 1,66 0,04 2,26

Gly 1,30 1,39 1,36 1,40 1,39 1,28 1,35 0,05 3,81

His 1,13 0,99 1,13 0,99 0,98 1,02 1,04 0,07 6,70

Arg 1,79 1,90 1,78 1,86 1,80 1,91 1,84 0,06 3,09

Thr 1,11 1,23 1,30 1,10 1,16 1,24 1,19 0,08 6,88

Ala 0,76 0,76 0,80 0,81 0,79 0,75 0,78 0,03 3,49

Pro 0,60 0,61 0,63 0,60 0,69 0,59 0,62 0,04 6,06

Cys 2,64 2,57 2,70 2,56 2,32 2,66 2,58 0,14 5,32

Tyr 0,11 0,13 0,14 0,13 0,12 0,12 0,13 0,01 7,00

Val 0,66 0,68 0,60 0,65 0,70 0,58 0,65 0,05 7,32

Met 0,82 0,80 0,86 0,78 0,80 0,81 0,81 0,03 3,27

Lys 0,55 0,50 0,58 0,58 0,61 0,54 0,56 0,04 6,91

Ile 0,62 0,59 0,62 0,61 0,61 0,60 0,61 0,01 2,24

Leu 1,12 1,21 1,22 1,03 1,23 1,16 1,16 0,08 6,53

Phe 1,32 1,30 1,40 1,19 1,30 1,33 1,31 0,07 5,24

Nhận xét: Độ lặp lại hàm lượng của các axít amin trong mẫu cá thu có độ

lệch chuẩn tương đối giao động từ 1,82 đến 7,32%. Độ lệch chuẩn tương đối trong

mẫu cá thu có ổn định hơn trong mẫu cá quả vì trong thành phần thịt cá thu có hàm

lượng đạm tương đối cao.

Bảng 3.22: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin đối với mẫu cá thu

94

Các axít amin Thời gian lưu ti (phút) ttb (phút) St RSDt

(%)

Asp 13,72 13,63 13,79 13,76 13,77 13,69 13,73 0,06 0,45

Ser 15,18 15,09 15,28 15,21 15,24 15,35 15,22 0,09 0,57

Glu 16,01 15,90 16,12 16,07 16,08 15,94 16,02 0,09 0,53

Gly 17,28 17,17 17,39 17,32 17,35 17,20 17,28 0,29 1,80

His 17,90 17,79 18,03 17,95 17,98 17,82 17,91 0,73 4,45

Arg 21,11 21,07 21,16 21,14 21,15 21,09 21,12 0,10 0,52

Thr 21,34 21,29 21,38 21,35 21,37 21,31 21,34 0,26 1,34

Ala 21,96 21,91 22,00 21,98 21,99 21,93 21,96 0,55 2,73

Pro 23,28 23,23 23,33 23,30 23,31 23,26 23,28 1,29 6,06

Cys 26,67 26,61 26,47 26,44 26,71 26,65 26,59 0,09 0,39

Tyr 27,16 27,09 26,74 26,71 27,19 27,13 27,00 0,37 1,60

Val 27,85 27,78 27,91 27,88 27,88 27,82 27,85 0,24 0,94

Met 28,40 28,33 28,47 28,43 28,43 28,37 28,41 1,32 5,09

Lys 31,05 30,98 31,13 31,63 31,09 31,02 31,15 0,36 1,18

Ile 31,87 31,81 31,95 31,93 31,91 31,85 31,89 0,26 0,88

Leu 32,48 32,40 32,56 32,50 32,52 32,45 32,48 0,48 1,62

Phe 33,92 33,83 34,03 33,65 33,97 33,84 33,87 0,85 0,26

Nhận xét: Độ lặp lại về thời gian lưu của các axít amin trong mẫu cá thu có

độ lệch chuẩn giao động từ 0,2 đến 5,9 (%) và không ổn định như mẫu cá quả, vì

hàm lượng protein của cá thu cao nên có sự đẩy píc.

Bảng 3.23: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu hạt đậu

Các axít amin Hàm lượng axít amin xi (g/100g) xtb

(g/100g) Sx

RSDx

(%)

Asp 4,444 4,435 4,511 4,421 4,431 4,507 4,453 0,040 0,91

Ser 1,615 1,627 1,634 1,594 1,605 1,629 1,613 0,016 1,01

Glu 8,97 8,952 9,105 8,82 8,943 9,078 8,988 0,104 1,15

Gly 2,406 2,431 2,442 2,382 2,399 2,435 2,411 0,024 1,01

His 1,879 1,875 1,907 1,816 1,873 1,901 1,882 0,033 1,76

Arg 4,01 4,051 4,073 3,969 3,997 4,058 4,018 0,042 1,03

95

Thr 2,062 2,058 2,093 2,041 2,056 2,087 2,066 0,020 0,96

Ala 2,564 2,559 2,603 2,539 2,557 2,595 2,569 0,024 0,95

Pro 2,77 2,765 2,812 2,742 2,762 2,803 2,776 0,027 0,96

Cys 0,172 0,171 0,174 0,173 0,169 0,174 0,172 0,002 1,13

Tyr 1,702 1,699 1,728 1,685 1,697 1,723 1,706 0,016 0,97

Val 2,108 2,104 2,146 2,087 2,152 2,134 2,112 0,028 1,33

Met 0,902 0,9 0,915 0,893 0,899 0,913 0,904 0,009 0,95

Lys 1,849 1,845 1,877 1,781 1,843 1,903 1,853 0,041 2,22

Ile 2,002 1,998 2,032 1,982 1,996 2,026 2,006 0,019 0,95

Leu 3,582 3,575 3,636 3,547 3,572 3,625 3,59 0,034 0,95

Phe 3,468 3,461 3,52 3,433 3,457 3,509 3,475 0,033 0,96

Nhận xét: Độ lặp lại hàm lượng của các axít amin trong mẫu hạt đậu tương

đối có độ lệch chuẩn tương đối giao động từ 0,9 đến 2,2%. Độ lệch chuẩn về hàm

lượng của chất phân tích trong mẫu hạt đậu tương cao và ổn định.

Bảng 3.24: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu tương

Các axít amin Thời gian lưu ti (phút) ttb (phút) St RSDt (%)

Asp 14,12 14,16 14,24 14,29 14,13 14,23 14,20 0,07 0,48

Ser 15,64 15,69 15,77 15,82 15,59 15,66 15,69 0,09 0,55

Glu 16,46 16,52 16,60 16,66 16,53 16,54 16,55 0,07 0,42

Gly 17,76 17,35 17,91 17,95 17,65 17,77 17,73 0,22 1,22

His 18,41 18,49 18,58 18,64 18,59 18,58 18,55 0,08 0,45

Arg 21,26 21,29 21,31 21,33 21,27 21,32 21,30 0,03 0,13

Thr 21,42 21,50 21,48 21,53 21,53 21,47 21,49 0,04 0,19

Ala 22,07 22,10 22,13 22,14 22,18 22,12 22,12 0,04 0,17

Pro 23,37 23,40 23,42 23,42 23,39 23,41 23,40 0,02 0,08

Cys 26,42 26,13 26,16 26,45 26,13 26,16 26,24 0,15 0,57

Tyr 26,76 26,80 26,82 26,80 26,75 26,78 26,79 0,03 0,10

Val 27,90 27,93 27,96 27,95 27,94 27,95 27,94 0,02 0,08

Met 28,46 28,50 28,52 28,51 28,51 28,53 28,50 0,02 0,09

Lys 31,12 31,15 31,17 31,16 31,14 31,16 31,15 0,02 0,06

Ile 31,91 31,94 31,96 31,96 31,95 31,95 31,95 0,02 0,06

96

Leu 32,51 32,55 32,57 32,56 32,56 32,56 32,55 0,02 0,07

Phe 33,99 34,04 34,06 34,05 34,05 34,06 34,04 0,03 0,08

Nhận xét: Độ lặp lại về thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu

tương có độ lệch chuẩn giao động từ 0,08 đến 1,2% và hoàn toàn chấp nhận được.

Bảng 3.25: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu đậu phụ

Các axít amin Hàm lượng axít amin xi (g/100g) xtb

(g/100g) Sx

RSDx

(%)

Asp 0,303 0,312 0,307 0,290 0,302 0,306 0,303 0,008 2,51

Ser 0,371 0,370 0,367 0,367 0,369 0,375 0,370 0,003 0,80

Glu 1,071 1,069 1,087 1,102 1,068 1,084 1,080 0,014 1,25

Gly 0,379 0,379 0,385 0,376 0,368 0,384 0,379 0,006 1,62

His 0,435 0,434 0,454 0,431 0,434 0,440 0,438 0,008 1,93

Arg 1,514 1,511 1,505 1,499 1,509 1,532 1,512 0,011 0,74

Thr 0,612 0,611 0,621 0,606 0,610 0,619 0,613 0,006 0,95

Ala 0,162 0,161 0,164 0,157 0,161 0,164 0,162 0,003 1,61

Pro 0,235 0,234 0,238 0,221 0,234 0,237 0,233 0,006 2,71

Cys 0,068 0,068 0,069 0,066 0,068 0,069 0,068 0,001 1,41

Tyr 0,601 0,600 0,610 0,589 0,599 0,608 0,601 0,008 1,25

Val 0,204 0,204 0,207 0,212 0,204 0,207 0,206 0,003 1,58

Met 0,070 0,070 0,071 0,068 0,070 0,071 0,070 0,001 1,91

Lys 0,413 0,412 0,419 0,409 0,412 0,418 0,414 0,004 0,95

Ile 0,213 0,212 0,216 0,221 0,212 0,215 0,215 0,003 1,51

Leu 0,349 0,348 0,354 0,356 0,348 0,353 0,351 0,003 0,95

Phe 0,752 0,751 0,763 0,756 0,750 0,761 0,755 0,006 0,75

Nhận xét: Độ lặp lại hàm lượng của các axít amin trong mẫu đậu phụ có độ

lệch chuẩn giao động từ 0,75 đến 2,71%. Độ lệch chuẩn về hàm lượng của mẫu

đậu phụ cũng ổn định, điều này có thể giải thích là do đậu phụ được chế biến nên

97

có độ tinh khiết hơn loại khác.

Bảng 3.26: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu phụ

Các axít amin Thời gian lưu ti (phút) ttb (phút) St RSDt (%)

Asp 13,91 13,98 13,89 14,10 13,58 13,71 13,86 0,19 1,36

Ser 15,50 15,57 15,47 15,64 15,13 15,26 15,43 0,20 1,27

Glu 16,35 16,42 16,30 16,45 15,94 16,07 16,26 0,21 1,26

Gly 17,22 17,30 17,17 17,32 16,80 16,94 17,13 0,21 1,21

His 18,41 18,49 18,34 18,44 17,95 18,08 18,28 0,22 1,20

Arg 21,30 21,31 21,28 21,30 21,15 21,18 21,25 0,07 0,32

Thr 21,48 21,49 21,46 21,50 21,33 21,14 21,40 0,14 0,67

Ala 22,13 22,13 22,10 22,13 21,98 22,02 22,08 0,07 0,31

Pro 23,43 23,41 23,40 23,45 23,29 23,34 23,39 0,06 0,26

Cys 26,14 26,10 26,11 26,16 25,99 26,04 26,09 0,06 0,24

Tyr 26,80 26,75 26,77 26,80 26,32 26,69 26,69 0,19 0,70

Val 27,94 27,90 27,91 27,97 27,79 27,85 27,89 0,06 0,23

Met 28,51 28,47 28,47 28,52 28,36 28,40 28,45 0,06 0,22

Lys 31,73 31,67 31,69 31,74 30,97 31,07 31,48 0,36 1,13

Ile 31,96 31,88 31,91 31,97 31,77 31,85 31,89 0,07 0,23

Leu 32,57 32,48 32,51 32,57 32,37 32,44 32,49 0,08 0,24

Phe 34,06 33,94 33,97 34,04 33,79 33,88 33,95 0,10 0,30

Nhận xét: Độ lặp lại về thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu phụ

có độ lệch chuẩn tương đối giao động từ 0,26 đến 1,2% và như thế là bình thường.

Bảng 3.27: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng các axít amin trong mẫu sữa đậu nành

Các axít amin Hàm lượng axít amin xi (g/100g) xtb

(g/100g) Sx

RSDx

(%)

Asp 0,433 0,432 0,430 0,429 0,432 0,438 0,432 0,003 0,78

Ser 0,508 0,507 0,515 0,522 0,506 0,514 0,512 0,006 1,20

Glu 1,228 1,226 1,247 1,226 1,225 1,243 1,232 0,010 0,79

Gly 0,540 0,539 0,548 0,554 0,538 0,546 0,544 0,006 1,18

His 0,528 0,527 0,535 0,532 0,526 0,534 0,530 0,004 0,77

Arg 1,916 1,912 1,944 1,996 1,910 1,939 1,936 0,033 1,70

98

Thr 0,701 0,699 0,711 0,679 0,699 0,709 0,700 0,011 1,61

Ala 0,287 0,287 0,292 0,274 0,286 0,291 0,286 0,006 2,15

Pro 0,409 0,408 0,415 0,405 0,417 0,414 0,411 0,005 1,19

Cys 0,051 0,051 0,052 0,050 0,061 0,051 0,053 0,004 7,59

Tyr 1,032 1,030 1,048 1,022 1,129 1,044 1,051 0,039 3,76

Val 0,329 0,328 0,334 0,326 0,338 0,333 0,331 0,004 1,35

Met 0,220 0,219 0,223 0,217 0,229 0,222 0,222 0,004 1,84

Lys 0,678 0,677 0,688 0,671 0,686 0,686 0,681 0,007 0,99

Ile 0,324 0,324 0,329 0,321 0,323 0,328 0,325 0,003 0,95

Leu 0,567 0,566 0,576 0,561 0,545 0,574 0,565 0,011 1,93

Phe 1,168 1,166 1,185 1,156 1,064 1,182 1,154 0,045 3,90

Nhận xét: Độ lặp lại hàm lượng của các axít amin trong mẫu sữa đậu nành

có độ lệch chuẩn giao động từ 0,7 đến 7,6%. Độ lệch chuẩn về hàm lượng kém ổn

định hơn so với đậu phụ, do hàm lượng protein trong sữa đậu nành thấp hơn nhiều.

Bảng 3.28: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu các axít amin trong mẫu sữa đậu nành

Các axít amin Thời gian lưu ti (phút) ttb

(phút) St RSDt (%)

Asp 13,74 13,87 13,84 13,85 13,86 13,72 13,81 0,07 0,48

Ser 15,30 15,44 15,41 15,43 15,45 15,31 15,39 0,07 0,44

Glu 16,11 16,27 16,24 16,27 16,26 16,12 16,21 0,08 0,46

Gly 16,99 17,12 17,10 17,14 17,12 17,09 17,09 0,05 0,31

His 18,13 18,28 18,26 18,32 18,28 18,19 18,24 0,07 0,39

Arg 21,20 21,24 21,25 21,26 21,23 21,18 21,23 0,03 0,15

Thr 21,42 21,42 21,43 21,44 21,42 21,43 21,43 0,01 0,04

Ala 22,03 22,06 22,07 22,09 22,06 22,12 22,07 0,03 0,14

Pro 23,34 23,36 23,37 23,39 23,37 23,34 23,36 0,02 0,08

Cys 26,06 26,07 26,08 26,10 26,07 26,04 26,07 0,02 0,07

Tyr 26,70 26,75 26,76 26,76 26,75 26,69 26,73 0,03 0,12

Val 27,87 27,89 27,91 27,91 27,89 27,78 27,87 0,05 0,17

Met 28,44 28,47 28,49 28,48 28,45 28,42 28,46 0,03 0,09

Lys 31,06 31,66 31,68 31,69 31,68 31,05 31,47 0,32 1,03

99

Ile 31,86 31,89 31,91 31,91 31,79 31,84 31,87 0,05 0,15

Leu 32,47 32,49 32,52 32,52 32,43 32,43 32,47 0,04 0,12

Phe 33,91 33,95 33,99 33,99 33,89 33,97 33,95 0,04 0,12

Nhận xét: Khác với độ lặp lại về hàm lượng thì độ lặp lại về thời gian lưu

trong mẫu sữa đậu nành có độ lệch chuẩn tương đối rất tốt do hàm lượng protein

thấp nên không có sự đẩy píc.

Tóm lại: Từ các kết quả nghiên cứu (bảng 3.19 đến bảng 3.28) đã nêu ở

trên cho thấy độ lặp lại hàm lượng của các axít amin trong các mẫu giàu đạm

nhưng có chứa nhiều tạp chất như cá quả, cá thu, hạt đậu tương có độ lệch chuẩn

tương đối RSDx (%) dao động từ 0,9 - 8,38% và với các mẫu thực phẩm có hàm

lượng đạm thấp như sữa đậu nành có độ dao động về hàm lượng đối với từng axít

amin là 0,7-7,6%. Độ lặp lại hàm lượng trên mẫu đậu phụ có độ lệch chuẩn chỉ dao

động từ 0,75 đến 2,71%, do quá trình chế biến đậu phụ đã loại được một phần tạp

chất.

Còn độ lặp lại về thời gian lưu của các axít amin cho thấy: các mẫu thực

phẩm có tổng đạm nhỏ hơn thì có độ ổn định hơn so với những mẫu giàu đạm.

Nhưng mức giao động của độ lệch chuẩn đối với tất cả các đối tượng mẫu đã

nghiên cứu là chấp nhận được, vì đều còn nhỏ hơn 10%, cận cho phép của cấp hàm

lượng cỡ mg/kg (ppm).

3.6.3. Xác định hiệu suất thu hồi của phương pháp

Đây là một thông số không thể thiếu được khi đánh giá một phương pháp

phân tích.

Dựa vào việc thêm chuẩn vào mẫu thực, cùng với việc tiến hành làm mẫu

thực không có thêm chuẩn song song chúng tôi tiến hành tính độ thu hồi như sau.

100%

so

maumaus

C

CCH

Trong đó:

%H: hiệu suất thu hồi

Cs+mẫu: nồng độ tổng chuẩn thêm vào và mẫu thực có đo được

Cmẫu: nồng độ mẫu thực đo được

Cso: nồng độ chuẩn biết trước

100

Dựa vào đường chuẩn làm song song với mẫu thực chúng tôi thu được kết

quả của mẫu thêm chuẩn và đem so với giá trị cho vào, mỗi nồng độ làm 3 mẫu và

lấy kết quả trung bình. Các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.29, bảng 3.30 và bảng

3.31 với các nền mẫu là sữa đậu nành.

Chuẩn hỗn hợp (17 axít amin) được pha từ dung dịch có chứa 2,5 mM cho

tất cả các axít amin và 1,25 mM đối với cystin trong HCl 20 mM. Hút 40 l hỗn

hợp dung dịch trên pha loãng với nước cất tinh khiết thành 1 ml, được dung dịch

chuẩn làm việc có chứa 100 pmol/l đối với 16 axít amin và 50 pmol/l đối với

cystin.

Từ dung dịch chuẩn làm việc, chúng tôi chuẩn bị 3 hỗn hợp dung dịch

chuẩn có nồng độ là:

- Nồng độ thứ 1: hút 10 l dung dịch chuẩn làm việc, pha loãng với nước

cất tinh khiết để được chính xác 1 ml, dung dịch này có chứa 1000

pmol/ml đối với 16 axít amin và 500 pmol/ml đối với cystin.

- Nồng độ thứ 2: hút 50 l dung dịch chuẩn làm việc, pha loãng với nước

cất tinh khiết để được dung dịch chính xác 1ml, dung dịch này có chứa

5000 pmol/ml đối với 16 axít amin và 2500 pmol/ml đối với cystin.

- Nồng độ thứ 3: hút 100 l dung dịch chuẩn làm việc,pha loãng với nước

cất tinh khiết để được dung dịch chính xác 1ml, dung dịch này có chứa

10000 pmol/ml đối với 16 axít amin và 5000 pmol/ml đối với cystin.

Bảng 3.29: Độ thu hồi ở nồng độ thứ nhất

Các axít

amin

Các thông số

Cs+mẫu (mg/100g)

n = 3

Cmẫu (mg/100g)

n = 3

Cso (mg/100g)

H (%)

Asp 0,066 0,052 0,015 93,5

Ser 0,072 0,064 0,009 90,6

Glu 0,174 0,159 0,016 92,7

Gly 0,073 0,066 0,008 91,9

His 0,070 0,069 0,002 89,7

Arg 0,203 0,199 0,005 91,2

101

Thr 0,080 0,077 0,003 92,8

Ala 0,031 0,028 0,003 93,6

Pro 0,054 0,046 0,009 92,8

Cys 0,021 0,008 0,015 88,5

Tyr 0,127 0,121 0,007 92,3

Val 0,037 0,034 0,003 92,2

Met 0,030 0,026 0,004 93,1

Lys 0,092 0,085 0,007 92,7

Ile 0,037 0,035 0,003 92,6

Leu 0,065 0,062 0,003 93,2

Phe 0,142 0,139 0,004 93,4

Bảng 3.30: Độ thu hồi ở nồng độ thứ hai

Các axít

amin

Các thông số

Cs+mẫu (mg/100g)

n = 3

Cmẫu (mg/100g)

n = 3

Cso (mg/100g)

H (%)

Asp 0,123 0,052 0,075 94,7

Ser 0,108 0,064 0,046 95,4

Glu 0,234 0,159 0,079 94,2

Gly 0,103 0,066 0,039 94,1

His 0,076 0,069 0,008 95,4

Arg 0,221 0,199 0,023 94,3

Thr 0,092 0,077 0,016 95,7

Ala 0,042 0,028 0,015 96,2

Pro 0,088 0,046 0,044 96,1

Cys 0,077 0,008 0,074 92,3

Tyr 0,154 0,121 0,034 95,6

102

Val 0,047 0,034 0,014 96,2

Met 0,047 0,026 0,022 96,1

Lys 0,120 0,085 0,037 95,2

Ile 0,048 0,035 0,013 96,2

Leu 0,076 0,062 0,015 96,1

Phe 0,156 0,139 0,018 95,9

Bảng 3.31: Độ thu hồi ở nồng độ thứ ba

Các axít

amin

Các thông số

Cs+mẫu (mg/100g)

n = 3

Cmẫu (mg/100g)

n = 3

Cso (mg/100g)

H (%)

Asp 0,196 0,052 0,149 93,4

Ser 0,152 0,064 0,091 92,7

Glu 0,312 0,159 0,159 94,0

Gly 0,142 0,066 0,079 90,8

His 0,084 0,069 0,015 91,6

Arg 0,243 0,199 0,046 94,6

Thr 0,108 0,077 0,032 94,2

Ala 0,056 0,028 0,029 95,1

Pro 0,131 0,046 0,088 96,2

Cys 0,147 0,008 0,149 90,3

Tyr 0,187 0,121 0,069 96,4

Val 0,061 0,034 0,028 95,3

Met 0,068 0,026 0,044 95,4

Lys 0,157 0,085 0,074 96,7

Ile 0,061 0,035 0,026 97,2

Leu 0,091 0,062 0,030 98,1

Phe 0,173 0,139 0,036 97,8

Các kết quả về hiệu suất thu hồi của cả 3 vùng nồng độ đều trên 90% trong

khoảng tuyến tính và độ thu hồi càng cao khi thêm nồng độ chuẩn cao. Do đó có

thể kết luận, phương pháp cho phép xác định hàm lượng các axít amin có độ thu

103

hồi trong khoảng 89 - 98%. Độ thu hồi này đều tốt hơn so với độ thu hồi cho phép

(85%) khi xác định các chất có hàm lượng từ 10 - 1000 ppb.

3.7. Phân tích mẫu thực tế

Sau khi tìm được các điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý mẫu phân tích axít

amin trong thực phẩm với các đối tượng mẫu khác nhau. Đánh giá thống kê quy

trình phân tích axít amin đều đạt được trong giới hạn cho phép, chúng tôi tiến hành

áp dụng phân tích mẫu thực tế, gồm 50 mẫu cá, 51 mẫu đậu tương và đậu phụ, 12

mẫu thịt các loại. Kết quả phân tích cụ thể như sau.

3.7.1. Kết quả phân tích mẫu cá (phân tích mẫu theo lược đồ quy

trình 2 tại mục 3.5)

Mẫu nghiên cứu gồm 10 loại cá đại diện cho 50 mẫu cá: 5 loại cá nước ngọt

(trắm, trôi, cá quả, rô phi, chép); 5 loại cá nước mặn (thu, nục, cá chim trắng, cá

hồng, cá cam). Mẫu được lấy ngẫu nhiên bằng cách mua tại 5 chợ lớn tại Hà Nội,

mỗi mẫu mua ít nhất 3 con, đưa về phòng thí nghiệm trong thời gian không quá hai

giờ. Ở phòng thí nghiệm mẫu được phân loại, lọc lấy phần ăn được (loại bỏ phủ

tạng, vẩy, vây, xương), sau đó mẫu được xay nhuyễn, làm đồng nhất và tiến hành

thủy phân ngay trong ngày lấy mẫu, phần mẫu lưu cho vào hộp sạch bảo quản

trong tủ lạnh âm sâu - 20oC.

Bảng 3.32 và bảng 3.33 là hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu cá

nước ngọt và cá nước mặn với n = 5 và hình 3.32 là sắc đồ các axít amin trong cá

quả, còn sắc đồ 3.33 là của cá thu.

104

Hình 3.32: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu cá quả, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =

250; em = 395)

Bảng 3.32: Hàm lượng axít amin trong cá nước ngọt (g/100g)

TT Tên đầy đủ Viết tắt Cá trôi Cá trắm Cá quả Cá rô

phi Cá chép

Cá chép

USA

1 Axít Aspartic Asp KPH 0,28 0,72 1,05 0,75 1,82

2 Serin Ser KPH 0,34 0,79 1,00 0,57 0,73

3 Axít Glutamic Glu 0,38 0,52 1,30 1,85 1,30 2,66

4 Glycin Gly KPH 0,58 1,77 1,83 1,07 0,86

5 Histidin His 0,24 0,36 0,66 0,86 0,52 0,52

6 Arginin Arg 1,31 0,83 1,90 2,09 1,20 1,07

7 Threonin Thr 0,70 0,43 0,86 1,12 0,66 0,78

8 Alanin Ala 0,26 0,25 0,63 0,84 0.59 1,08

9 Prolin Pro 1,03 0,23 0,75 0,75 0,51 0,63

10 Cystin Cys 1,69 KPH 0,25 2,50 1,40 0,19

11 Tyrosin Tyr 0,08 0,46 0,92 0,11 0,05 0,60

12 Valin Val 0,30 0,22 0,45 0,68 0,46 0,91

13 Methionin Met 0,44 0,29 0,70 0,83 0,50 0,52

105

14 Lysin Lys 0,11 0,16 0,32 0,58 0,52 1,63

15 Isoleucin Ile 0,25 0,20 0,42 0,62 0,40 0,82

16 Leucin Leu 0,49 0,39 0,83 1,27 0,81 1,50

17 Phenylalanin Phe 0,84 0,52 1,18 1,42 0,77 0,69

Tổng 8,20 6,12 14,61 19,52 12,18 17,01

Kết quả ở bảng 3.32 cho thấy, trong thành phần của cá có đủ các axít amin

thiết yếu cho cơ thể. Trong 5 loại cá nước ngọt, cá rô phi có tổng hàm lượng các

axít amin cao nhất 19,52 g/100g, thấp nhất là cá trắm 6,12 g/100g. Hàm lượng

axít Aspartic, Serin, Glycin trong cá trôi và hàm lượng Cystin trong cá trắm quá

nhỏ nên không xác định được.

Hình 3.33: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu cá thu, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =

250; em = 395)

Bảng 3.33: Hàm lượng axít amin trong cá nước mặn (g/100g)

TT Tên đầy đủ Viết tắt Cá thu

USA Cá thu Cá nục

Cá

chim

trắng

Cá hồng Cá cam

1 Axít Aspartic Asp 2,08 0,91 1,00 0,77 0,97 0,81

2 Serin Ser 0,83 0,87 0,94 0,75 0,82 0,76

3 Axít Glutamic Glu 3,03 1,66 1,71 1,40 1,67 1,35

4 Glycin Gly 0,97 1,35 1,40 1,40 1,08 1,36

106

5 Histidin His 0,60 1,04 2,18 0,65 0,05 1,05

6 Arginin Arg 1,21 1,84 1,99 1,72 1,62 1,63

7 Threonin Thr 0,89 1,19 1,14 0,88 0,89 0,90

8 Alanin Ala 1,23 0,78 0,78 0,65 0,68 0,68

9 Prolin Pro 0,2 0,62 0,63 0,57 0,53 0,60

10 Cystin Cys 0,22 2,58 3,03 0,17 2,22 2,19

11 Tyrosin Tyr 0,69 0,13 0,12 0,87 0,09 0,11

12 Valin Val 1,05 0,64 0,76 0,51 0,60 0,57

13 Methionin Met 0,60 0,81 0,92 0,62 0,70 0,72

14 Lysin Lys 1,86 0,56 0,54 0,44 0,60 0,46

15 Isoleucin Ile 0,94 0,61 0,66 0,46 0,54 0,50

16 Leucin Leu 1,65 1,16 1,27 0,94 1,10 0,99

17 Phenylalanin Phe 0,79 1,31 1,52 1,04 1,10 1,11

Tæng 18,84 18,20 20,74 13,94 15,40 15,89

KÕt qu¶ ë b¶ng 3.33 cho thÊy, hµm l­îng tæng c¸c

axÝt amin trong c¸ n­íc mÆn n»m trong kho¶ng 14-

21g/100g. TÊt c¶ 17 lo¹i axÝt amin ®Òu t×m thÊy trong 5

mÉu c¸ n­íc mÆn ®­îc ph©n tÝch. Trong 5 lo¹i c¸ n­íc

mÆn ®­îc nghiªn cøu, c¸ nôc cã hµm l­îng axÝt amin cao

nhÊt 20,74 g/100g, sau ®ã lµ c¸ thu 18,20 g/100g, thÊp

nhÊt lµ c¸ chim tr¾ng 13,94 g/100g. So s¸nh b¶ng 3.32

víi b¶ng 3.33 cho thÊy tæng hµm l­îng axÝt amin trong

c¸ n­íc mÆn cao h¬n trong c¸ n­íc ngät.

NhËn xÐt: Qua kÕt qu¶ ph©n tÝch axÝt amin trong 10

lo¹i c¸ (5 lo¹i n­íc ngät, 5 lo¹i n­íc mÆn) cho thÊy:

Trong c¸ n­íc ngät hµm l­îng tæng axÝt amin tõ

6,12- 19,52 g/100g, c¸ r« phi cã tæng hµm l­îng c¸c

axÝt amin cao nhÊt (19,52 g/100g), thÊp nhÊt lµ c¸ tr«i

víi 8,2 g/100g.

Hµm l­îng tæng c¸c axÝt amin trong c¸ n­íc mÆn n»m

trong kho¶ng 13-21g/100g. C¸ nôc cã hµm l­îng tæng c¸c

107

axÝt amin cao nhÊt 20,74 g/100g, sau ®ã lµ c¸ thu 18,20

g/100g, thÊp nhÊt lµ c¸ chim tr¾ng 13,94 g/100g.

Nh×n chung hµm l­îng c¸c axÝt amin trong c¸ n­íc

mÆn th­êng cao h¬n c¸ n­íc ngät. Nh­ vËy ¨n c¸ rÊt tèt

cho c¬ thÓ, kh«ng chØ lµ mét nguån thùc phÈm cung cÊp

hµm l­îng protein cao mµ chÊt l­îng cña protit trong

thÞt c¸ rÊt tèt. §Æc biÖt hµm l­îng cholesterol trong

c¸ kh«ng ®¸ng kÓ, mì c¸ gióp ng¨n ngõa ®­îc rÊt nhiÒu

bÖnh tËt.

3.6.2. Kết quả phân tích mẫu đậu tương, đậu phụ và sữa đậu nành

Tổng số mẫu phân tích cho 3 loại thực phẩm là 17 x 3 = 51 mẫu.

Mẫu được thu thập bằng cách bốc thăm ngẫu nhiên từ các chợ đại diện cho 9 quận

nội thành Hà Nội, gồm chợ Thái Hà, chợ Hôm, chợ Mơ, chợ Trương Định, chợ

Hàng Da, chợ Ngã Tư Sở, chợ Thành Công, chợ Lê Quý Đôn và chợ Ngô Sĩ Liên.

Kết quả xác định hàm lượng các axít amin trong 3 loại mẫu thực phẩm loại

này được chỉ ra ở các bảng 3.34; bảng 3.35 và bảng 3.36 và một số sắc đồ được chỉ

ra trong các hình 3.34, hình 3.35 và hình 3.36 ở trang sau.

Hình 3.34: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương, cột

RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex

= 250; em = 395)

108

Hình 3.35: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu đậu phụ, cột RP18

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =

250; em = 395)

Hình 3.36: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu sữa đậu nành, cột

RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex

= 250; em = 395)

Bảng 3.34: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu hạt đậu tương

Tên mẫu Hàm lượng các axít amin (g/100g)

Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys Ile Leu Phe

Đậu mơ Hải Dương, chợ Mơ 2,59 1,44 6,01 1,91 1,80 3,63 1,87 1,63 2,01 0,15 1,82 1,55 0,82 0,83 1,48 2,57 3,45

Đậu Hưng Yên, chợ Mơ 2,51 1,40 5,82 1,85 1,74 3,52 1,81 1,58 1,95 0,15 1,76 1,50 0,79 0,80 1,43 2,49 3,35

Đậu Thường Tín, chợ Mơ 2,77 1,54 6,43 2,04 1,92 3,89 2,00 1,74 2,15 0,16 1,94 1,66 0,87 0,88 1,58 2,75 2,69

Đậu mơ Hà Bắc, chợ Mơ 2,84 1,58 6,58 2,09 1,97 3,98 2,05 1,78 2,20 0,16 1,99 1,70 0,89 0,91 1,62 2,82 2,78

Đậu tương, chợ Hàng Da 2,80 1,55 6,49 2,06 1,94 3,93 2,02 1,76 2,17 0,16 1,96 1,67 0,88 0,89 1,60 2,78 3,73

Đậu Hải Dương, chợ Thái Hà 2,39 1,55 6,21 1,69 1,88 2,62 1,78 1,39 1,76 0,19 1,85 1,51 0,71 1,02 1,47 2,47 2,86

Đậu mơ Hưng Yên, chợ Thái Hà 2,47 1,60 6,43 1,75 1,53 2,71 1,84 1,44 1,82 0,09 1,40 1,56 0,73 1,06 1,52 2,56 2,96

Đậu Hà Bắc, chợ Thái Hà 2,33 1,51 6,05 1,65 1,44 2,55 1,74 1,36 1,72 0,09 1,32 1,47 0,69 0,99 1,43 2,41 2,79

Đậu Đông Anh, chợ Lê Quý Đôn 2,35 1,82 6,57 1,67 1,33 3,26 2,46 1,38 2,05 0,11 2,12 1,63 0,59 1,63 1,57 2,59 2,65

Đậu Hưng Yên, chợ Lê Quý Đôn 2,88 1,23 6,05 2,05 1,63 3,99 3,01 1,69 1,51 0,13 2,60 2,00 0,72 0,95 1,92 2,17 2,25

Đậu tương, chợ Lê Quý Đôn 2,87 2,22 6,01 2,04 1,62 3,98 2,89 1,68 2,50 0,13 2,59 1,99 0,72 1,99 1,91 2,16 2,23

Đậu mơ Hà Bắc, chợ Hôm 2,74 2,12 7,65 1,94 1,55 3,80 2,86 1,61 2,39 0,13 2,47 1,90 0,69 1,90 1,83 2,02 2,09

Đậu tương, chợ Hôm (1) 3,10 1,54 6,59 2,20 2,03 4,21 2,03 1,93 2,26 0,19 1,89 1,77 0,90 0,97 1,65 2,94 2,76

Đậu tương chợ Hôm (2) 3,19 1,59 6,79 2,27 2,09 4,34 2,09 1,99 2,33 0,20 1,95 1,82 0,93 1,00 1,70 2,03 3,87

Đậu Bắc Ninh, chợ Ô chợ Dừa 2,12 2,16 6,03 1,83 1,78 3,77 2,01 1,07 1,63 0,10 2,74 1,44 0,71 0,73 1,34 2,31 3,51

Đậu tương, chợ Ngô Sĩ Liên (1) 2,86 2,92 6,14 2,47 2,40 4,09 2,71 1,44 2,20 0,14 2,70 1,94 0,96 0,99 1,81 2,12 2,74

Đậu tương, chợ Ngô Sĩ Liên (2) 2,22 2,26 6,30 1,91 1,86 3,94 2,10 1,12 1,70 0,10 2,86 1,50 0,74 0,76 1,40 2,41 3,07

Đậu tương (USA) [38] 4,59 2,12 7,01 1,68 0,98 2,83 1,59 1,71 2,13 0,59 1,38 1,82 0,49 2,43 1,77 2,97 1,90

110

Bảng 3.35: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu đậu phụ

Tên mẫu Hàm lượng các axít amin trong đậu phụ (g/100g)

Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys Ile Leu Phe

Đậu phụ chợ Hôm 1 0,46 0,37 1,44 0,31 0,37 1,32 0,59 0,27 0,35 0,07 0,51 0,27 0,12 0,24 0,28 0,50 0,67

Đậu phụ chợ Hôm 2 0,45 0,36 1,40 0,30 0,36 1,28 0,57 0,26 0,34 0,07 0,49 0,26 0,12 0,23 0,27 0,49 0,65

Đậu phụ chợ Thành Công 1 0,30 0,37 1,07 0,38 0,44 1,51 0,61 0,16 0,24 0,07 0,60 0,20 0,07 0,41 0,21 0,35 0,75

Đậu phụ chợ Thành Công 2 0,31 0,36 1,05 0,37 0,43 1,48 0,60 0,16 0,23 0,07 0,59 0,20 0,07 0,40 0,21 0,34 0,73

Đậu phụ chợ Thành Công 3 0,32 0,40 1,15 0,41 0,47 1,62 0,66 0,17 0,26 0,08 0,65 0,22 0,08 0,44 0,23 0,38 0,81

Đậu phụ chợ Thành Công 4 0,30 0,36 1,05 0,37 0,43 1,49 0,60 0,16 0,24 0,07 0,59 0,20 0,07 0,40 0,21 0,34 0,74

Đậu phụ chợ Trương Định 1 0,31 0,38 1,09 0,39 0,45 1,54 0,62 0,16 0,24 0,07 0,61 0,20 0,07 0,42 0,21 0,36 0,76

Đậu phụ chợ Trương Định 2 0,29 0,36 1,03 0,36 0,42 1,45 0,59 0,15 0,23 0,07 0,58 0,19 0,07 0,39 0,20 0,34 0,72

Đậu phụ chợ Trương Định 3 0,34 0,42 1,21 0,43 0,50 1,71 0,69 0,18 0,27 0,08 0,68 0,23 0,08 0,46 0,24 0,40 0,85

Đậu phụ chợ Mơ 1 0,66 0,48 2,13 0,34 0,46 1,53 0,69 0,32 0,41 0,05 0,54 0,33 0,10 0,38 0,35 0,60 0,82

Đậu phụ chợ Mơ 2 0,68 0,50 2,21 0,35 0,48 1,58 0,71 0,33 0,42 0,05 0,56 0,34 0,10 0,39 0,36 0,62 0,85

Đậu phụ Thái Hà 1 0,29 0,34 1,04 0,35 0,39 1,33 0,56 0,16 0,23 0,06 0,55 0,20 0,10 0,37 0,21 0,34 0,68

Đậu phụ Thái Hà 2 0,30 0,36 1,09 0,37 0,41 1,39 0,59 0,17 0,24 0,06 0,57 0,21 0,10 0,39 0,22 0,36 0,71

Đậu phụ Thái Hà 3 0,29 0,37 1,12 0,38 0,42 1,43 0,60 0,17 0,25 0,06 0,59 0,22 0,11 0,40 0,23 0,37 0,73

Đậu phụ Hàng Da 1 0,40 0,47 1,40 0,47 0,53 1,87 0,77 0,22 0,32 0,10 0,65 0,27 0,11 0,56 0,29 0,47 0,95

Đậu phụ Hàng Da 2 0,37 0,44 1,31 0,44 0,50 1,75 0,72 0,21 0,30 0,09 0,61 0,25 0,10 0,52 0,27 0,44 0,89

Đậu phụ Hàng Da 3 0,38 0,45 1,33 0,45 0,50 1,78 0,73 0,21 0,30 0,10 0,62 0,26 0,10 0,53 0,28 0,45 0,99

Đậu phụ (USA) [38] 1,74 0,74 2,72 0,62 0,46 1,05 0,64 0,65 0,85 0,22 0,53 0,79 0,20 1,03 0,78 1,12 0,76

111

Bảng 3.36: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu sữa đậu nành

Tên mẫu Hàm lượng các axít amin trong sữa đậu nành (mg/l)

Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys Ile Leu Phe

Sữa đậu nành Văn Chương 1 0,43 0,51 1,23 0,54 0,53 1,92 0,70 0,29 0,41 0,05 1,03 0,33 0,22 0,68 0,32 0,57 1,17

Sữa đậu nành Văn Chương 2 0,42 0,49 1,19 0,52 0,51 1,86 0,68 0,28 0,40 0,05 1,00 0,32 0,21 0,66 0,31 0,55 1,13

Sữa đậu nành Văn Chương 3 0,39 0,46 1,11 0,49 0,48 1,73 0,63 0,26 0,37 0,05 0,93 0,30 0,20 0,61 0,29 0,51 1,05

Sữa đậu nành Nguyễn Cao 1 0,52 0,64 1,57 0,66 0,69 2,00 0,77 0,28 0,46 0,08 1,21 0,34 0,26 0,85 0,35 0,62 1,39

Sữa đậu nành Nguyễn Cao 2 0,42 0,49 1,19 0,52 0,51 1,86 0,68 0,28 0,40 0,05 1,00 0,32 0,21 0,66 0,31 0,55 1,13

Sữa đậu nành Nguyễn Cao 3 0,46 0,55 1,33 0,58 0,57 2,07 0,76 0,31 0,44 0,05 1,11 0,36 0,24 0,73 0,35 0,62 1,26

Sữa đậu nành Ngã Tư Sở 1 0,51 0,63 1,56 0,65 0,67 1,95 0,75 0,28 0,45 0,07 1,18 0,33 0,25 0,83 0,34 0,60 1,36

Sữa đậu nành Ngã Tư Sở 2 0,50 0,61 1,52 0,63 0,65 1,90 0,73 0,27 0,44 0,07 1,15 0,32 0,24 0,81 0,33 0,59 1,33

Sữa đậu nành chợ Mơ 1 1,11 0,98 3,01 0,79 0,84 2,15 0,93 0,58 0,81 0,05 1,41 0,61 0,35 0,73 0,60 1,13 1,65

Sữa đậu nành chợ Mơ 2 1,05 0,93 2,86 0,75 0,80 2,04 0,88 0,55 0,77 0,05 1,34 0,58 0,33 0,69 0,57 1,07 1,57

Sữa đậu nành chợ Mơ 3 1,09 0,96 2,96 0,78 0,83 2,12 0,91 0,57 0,80 0,05 1,39 0,60 0,34 0,72 0,59 1,11 1,62

Sữa đậu nành đóng chai 1 0,97 0,85 2,62 0,69 0,73 1,87 0,81 0,50 0,70 0,04 1,23 0,53 0,30 0,64 0,52 0,98 1,44

Sữa đậu nành Trương Định 1 1,01 0,89 2,74 0,72 0,76 1,95 0,85 0,53 0,74 0,05 1,28 0,55 0,32 0,66 0,55 1,03 1,50

Sữa đậu nành Trương Định 2 0,98 0,92 2,82 0,74 0,79 2,01 0,87 0,54 0,76 0,05 1,32 0,57 0,33 0,68 0,56 1,06 1,55

Sữa đậu nành Hàng Da 1 0,53 0,66 1,64 0,68 0,70 2,04 0,79 0,29 0,47 0,07 1,24 0,35 0,26 0,87 0,36 0,63 1,43

Sữa đậu nành Hàng Da 2 0,49 0,60 1,50 0,62 0,64 1,87 0,72 0,27 0,43 0,07 1,13 0,32 0,24 0,80 0,33 0,58 1,30

Sữa đậu nành Thái Hà 1 0,51 0,64 1,57 0,64 0,66 1,92 0,75 0,29 0,46 0,07 1,12 0,34 0,26 0,77 0,35 0,62 1,31

Sữa đậu nành Thái Hà 2 0,59 0,74 1,81 0,74 0,76 2,21 0,86 0,33 0,53 0,08 1,29 0,39 0,30 0,89 0,40 0,71 1,51

Sữa đậu nành (USA)[38] (g/100g) 0,38 0,18 0,64 0,64 0,08 0,25 0,14 0,14 0,19 0,00 0,11 0,15 0,04 0,17 0,15 0,24 0,15

112

Kết quả ở bảng 3.34 cho thấy, trong thành phần của hạt đậu tương có đủ các

axít amin thiết yếu cho cơ thể. Trong 7 chợ được tiến hành thu thập mẫu, phân tích

và lấy giá trị trung bình cho thấy hàm lượng tổng 17 axít amin nằm trong khoảng

33 - 40g/100g. Trong đó ngoài axít glutamic có tỷ lệ cao nhất, một số axít amin

không thay thế cũng có hàm lượng khá cao như phenylalanin, leucin, isoleucin,

threonin, valin và lysin. Kết quả hàm lượng tổng 17 axít amin trong hạt đậu tương

theo bảng thành phần của Mỹ là 37,99g/100g. Như vậy đậu tương của ta cũng có

hàm lượng các axít amin cao.

Kết quả ở bảng 3.35 cho thấy, trong thành phần của đậu phụ cũng có đủ các

axít amin thiết yếu cho cơ thể. Trong 6 chợ được tiến hành thu thập mẫu, phân tích

và lấy giá trị trung bình cho thấy tổng hàm lượng 17 axít amin nằm trong khoảng 7

- 10g/100g. Trong đó ngoài axít glutamic có tỷ lệ cao nhất, một số axít amin không

thay thế cũng có hàm lượng khá cao như phenylalanin, leucin, isoleucin, tyrosin và

lysin. Đặc biệt đậu phụ mua ở chợ Mơ cho thấy có hàm lượng tổng axít amin là cao

nhất so với đậu ở các chợ khác 10,6g/100g. Kết quả hàm lượng tổng 17 axít amin

trong đậu phụ theo bảng thành phần của Mỹ là 14,9g/100g. Như vậy đậu tương của

ta và của USA có hàm lượng tổng các axít amin như nhau, song đậu phụ của ta có

tổng hàm lượng các axít amin nhỏ hơn của USA, điều này có nghĩa là trong quá

trình chế biến đậu tương thành đậu phụ đã bị mất một lượng axít amin.

Kết quả ở bảng 3.36 cho thấy, trong thành phần sữa đậu nành có đủ các axít

amin thiết yếu cho cơ thể. Trong 8 chợ được tiến hành thu thập mẫu, phân tích và

lấy giá trị trung bình cho thấy hàm lượng tổng 17 axít amin nằm trong khoảng 11 -

18mg/lit. Trong đó ngoài axít glutamic có tỷ lệ cao nhất, một số axít amin không

thay thế cũng có hàm lượng khá cao như arginin, phenylalanin, leucin, tyrosin,

threonin và lysin. Kết quả hàm lượng tổng 17 axít amin trong sữa đậu nành theo

bảng thành phần của Mỹ là 3,65g/100g. Có sự sai lệch lớn về nồng độ tổng 17 axít

amin so với bảng thành phần của Mỹ là do độ đậm đặc của sữa đậu nành nước ta

và do có sự khác nhau về đơn vị khi phân tích (mg/lit so với g/100g của Mỹ).

113

Đậu đỗ là nhóm thực phẩm quan trọng cung cấp một lượng đáng kể protein

cho cơ thể. Theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi hạt đậu khô chiếm tới 33 -

40g/100g là tổng các axít amin, đậu phụ có tổng axít amin 7 - 10g/100g. Ngoài ra,

trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng tích cực của các chất hóa thực vật

trong các cây họ đậu [3] và các thực phẩm họ đậu còn cung cấp một lượng xơ đáng

kể cho cơ thể. Đặc biệt protein trong các thực phẩm họ đậu là nguồn protein thực

vật vô cùng quý giá giúp cho cơ thể dễ hấp thụ và không mang theo những chất béo

no gây nên những bệnh mãn tính.

3.6.3. Kết quả phân tích mẫu thịt các loại

Mẫu nghiên cứu gồm 4 loại thịt đại diện cho 20 mẫu thịt: 5 mẫu thăn thịt bò,

5 mẫu thăn bê, 5 mẫu thịt gà công nghiệp và 5 mẫu thịt lợn. Các mẫu thịt được lấy

ngẫu nhiên bằng cách mua tại một số chợ tại Hà Nội, mỗi mẫu mua ít nhất 500 g,

đưa về phòng thí nghiệm. Ở phßng thÝ nghiÖm mÉu ®­îc ph©n lo¹i,

läc phÇn n¹c (lo¹i mì, g©n,...), sau ®ã mÉu ®­îc xay

nhuyÔn, lµm ®ång nhÊt vµ tiÕn hµnh thñy ph©n ngay trong

ngµy lÊy mÉu, phÇn mÉu l­u cho vµo hép s¹ch b¶o qu¶n

trong tñ l¹nh ©m s©u - 20oC. KÕt qu¶ ph©n tÝch ®­îc chØ

ra ë b¶ng 3.37.

Minutes

7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0

Volts

0.0

00

.05

0.1

00

.15

Volts

0.00

0.05

0.10

0.15

15

.57

5

A

sp1

7.1

25

S

er

18

.00

0

Glu

18

.85

0

Gly

19

.20

0

20

.03

3

His

21

.10

0

NH

32

2.2

50

23

.79

2

A

rg

24

.00

0

Th

r2

4.6

92

Ala

25

.40

0

26

.03

3

P

ro2

6.8

17

Cy

s

29

.29

2

Ty

r

29

.71

7

30

.45

0

Val

31

.00

0

Met

31

.45

8

33

.78

3

Ly

s3

4.4

67

Ileu

34

.82

5

L

eu

Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)

amino acids

Mau thit lon_1.0119g-100-1-50.dat

Retention Time

Name

Hình 3.37: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu thịt gà, cột RP18

Flu

ore

scen

ce

Flu

ore

scen

ce

114

(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;

em = 395)

Bảng 3.37: Hàm lượng axít amin trong một số loại thịt (g/100g)

TT Viết

tắt Thịt bò

Thịt bò

USA Thịt bê

Thịt gà

công

nghiệp

Thịt

gà

USA

Thịt lợn Thịt lợn

USA

1 Asp 0,36 1,62 0,35 0,30 1,89 0,72 1,97

2 Ser 1,99 0,76 1,92 0,25 0,73 0,45 0,88

3 Glu 5,54 2,62 5,34 0,59 3,18 1,34 3,22

4 Gly 0,49 1,80 0,47 0,53 1,04 0,79 1,17

5 His 0,35 0,50 0,34 0,43 0,66 0,75 0,98

6 Arg 0,72 1,32 0,70 0,74 1,29 1,09 1,44

7 Thr 0,74 0,74 0,72 0,47 0,90 0,73 1,00

8 Ala 0,70 1,31 0,67 0,25 1,16 0,43 1,33

9 Pro 0,50 1,25 0,48 0,21 0,87 0,36 0,97

10 Cys KPH 0,19 KPH 1,00 0,27 2,70 0,25

11 Tyr 0,32 0,51 0,30 1,22 0,71 1,50 0,73

12 Val 0,56 0,82 0,54 0,36 1,05 0,62 1,14

13 Met 0,27 0,42 0,26 0,41 0,59 0,60 0,54

14 Lys 1,58 1,46 1,53 0,12 1,81 0,33 1,90

15 Ile 0,50 0,71 0,48 0,37 1,12 0,62 1,02

16 Leu 0,85 1,31 0,82 0,57 1,59 0,97 1,80

17 Phe 2,52 0,67 2,43 0,81 0,84 1,02 0,90

Tổng 18,00 18,01 17,36 8,64 19,70 15,06 21,24

Kết quả ở bảng 3.37 cho thấy, hàm lượng tổng các axít amin trong thịt bò

cao hơn hàm lượng axít amin trong thịt lợn; hàm lượng tổng các axít amin trong thịt

gà công nghiệp là thấp nhất 8,64 g/100g. Mặc dù hàm lượng tổng các axít amin

trong mẫu thịt bò là cao nhất, nhưng không có đầy đủ 17 axít amin như thịt lợn và

115

thịt gà. Cụ thể trong thịt bò và bê hàm lượng Cys quá nhỏ nên không thể định lượng

được.

Hiện nay, không chỉ riêng nước ta mà nhiều nước khác trên thể giới phải tiếp

tục giải quyết tình trạng nghèo đói và suy dinh dưỡng. Trong khi đó, thừa dinh

dưỡng kèm theo các bệnh mãn tính như tim mạch và tiểu đường đang trở nên một

thách thức lớn trong giai đoạn chuyển tiếp hiện nay.

Qua kết quả phân tích hàm lượng các axít amin trong các loại thực phẩm

cho thấy, tổng hàm lượng axít amin trong các loại thực phẩm như hạt đậu tương

(33 - 40g/100g), đậu phụ (7 - 10g/100g), thịt (8,6 - 18 g/100g) và cá (8 - 21 g/100g)

không có sự chênh lệch đáng kể. Thành phần các loại thực phẩm đã nghiên cứu có

đủ các axít amin cần thiết cho cơ thể.

Từ kết quả nghiên cứu này, chúng ta có thể tuyên truyền, khuyến cáo giúp

cho ngưòi dân có cái nhìn tổng quát hơn về chất lượng của các loại thực phẩm, có

thể tính khẩu phần ăn, cân đối và lựa chọn nguồn thực phẩm giàu đạm và phối hợp

các loại thực phẩm khác nhau vẫn đủ dinh dưỡng mà giảm được nguy cơ của các

bệnh mãn tính hình thành do quá trình ăn uống. Để đáp ứng đủ nhu cầu dinh dưỡng

và đồng thời tiết kiệm được chi phí, người dân nên tăng cường ăn các loại cá và các

sản phẩm nhóm đậu đỗ thay vì thường xuyên sử dụng các loại thịt như thói quen

thông thường trước đây.

Tóm lại: kết quả nghiên cứu đã thu được như sau:

Qua khảo sát nghiên cứu, lựa chọn và áp dụng một số quy trình phân tích axít

amin trên thế giới, chúng tôi đã đưa được ra một quy trình có hệ thống để phân

tích 17 axít amin trong các đối tượng thực phẩm khác nhau với điều kiện thí

nghiệm hiện nay ở Việt Nam.

Đơn giản bớt công đoạn của quá trình xử lý mẫu mà vẫn đảm bảo đáp ứng được

các yêu cầu về độ chính xác, độ thu hồi và độ lặp lại so với phương pháp phân

116

tích hiện được áp dụng trên thế giới. Và như vậy có thể áp dụng một cách đơn

giản, thuận tiện tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam trong điều kiện chưa được

trang bị đầy đủ các thiết bị hiện đại.

117

KẾT LUẬN

Trên cơ sở những kết quả đã nghiên cứu với mục đích là nghiên cứu tối ưu

quy trình xác định đồng thời 17 axít amin trong các đối tượng thực phẩm khác nhau,

chúng tôi đã đạt được kết quả như sau:

1. Nghiên cứu và khảo sát một cách có hệ thống và chọn được các điều kiện thích

hợp nhất của hệ RP-HPLC như các thông số máy, thể tích bơm mẫu, loại

detectơ, bước sóng; loại pha tĩnh, cỡ hạt, loại pha động, thành phần và tốc độ

pha động, rút ngắn được thời gian phân tích, làm tăng độ nhạy cho việc tách và

xác định đồng thời 17 axít amin.

2. Nghiên cứu chọn được các điều kiện để thuỷ phân xử lý mẫu, các điều kiện

chuyển mẫu về môi trường phù hợp trước khi chuẩn bị dẫn xuất mà không nhất

thiết phải đuổi hết axít còn dư khi thủy phân mẫu, tiết kiệm thời gian cũng như

tránh sự mất mát axít amin (đưa ra 2 lược đồ quy trình thuỷ phân).

3. Nghiên cứu áp dụng một cách hệ thống kỹ thuật dẫn xuất với chất dẫn xuất

(AQC) để cho sản phẩm của quá trình sau dẫn xuất có thời gian ổn định lâu,

tách tốt và có độ nhạy, độ lặp lại cao.

4. Quy trình phân tích đưa ra đã được đánh giá bằng đường chuẩn, sai số, độ lặp

lại và hệ số thu hồi. Độ thu hồi đối với các loại axít amin nằm trong khoảng 89 -

98% trong vùng đường chuẩn tuyến tính.

5. Lần đầu tiên ở Việt Nam, đã đưa ra quy trình phân tích xác định đồng thời 17

axít amin trong nhiều loại thực phẩm thông dụng đại diện mà nhân dân ta

thường dùng, cụ thể đã phân tích 51 mẫu gồm đậu tương, đậu phụ và sữa đậu

nành, 50 mẫu cá các loại và 20 mẫu thịt các loại.

6. Phương pháp phân tích đồng thời 17 axít amin đã được chuẩn hóa và các số liệu

phân tích hàm lượng 17 axít amin trong đậu tương, đậu phụ, sữa đậu nành, cá

và thịt các loại có thể sử dụng trong việc cập nhật số liệu vào bảng thành phần

thực phẩm Việt Nam. Đề nghị được áp dụng phương pháp phân tích axít amin

đã được chuẩn hóa này cho nhiều đối tượng thực phẩm khác nhau nhằm cung

118

cấp thêm số liệu vào bảng thành phần thực phẩm của Việt Nam và số liệu cho

các nghiên cứu dinh dưỡng cũng như cho chế độ ăn dùng cho người bệnh./.

119

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

1. Ha Thi Anh Dao, Le Thi Hong Hao, Nguyen Thanh Huong, Nguyen Thi Dung

(2003), “The nutritive quality of selected street foods in Hanoi”, ASEAN food

science and technology: cooperation and integration for development,

proceedings of the 8th

ASEAN food conference, agriculture puslishing house-

Hanoi, pp. 228-233.

2. Lê Thị Hồng Hảo, Hà Thị Anh Đào, Nguyễn Thuý Dung (2004), “Hàm lượng

axít amin trong một số loại cá Việt Nam”, Tạp chí Y học thực hành, số 496,

trang 92-95.

3. Lê Thị Hồng Hảo, Phạm Luận, Nguyễn Xuân Trung (2006), “Ứng dụng kỹ

thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với dẫn suất trước cột AQC để tách và xác

định đồng thời 17 axít amin trong cá”, Tạp chí phân tích Hoá, Lý và Sinh học,

Tập 11, Số 4/2006, trang 15 - 23.

4. Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Thuý Dung (2007), “Đánh giá chất lượng Protein

trong đậu tương, đậu phụ và sữa đậu nành trên thị trường Hà Nội” , Kỷ yếu

hội nghị khoa học vệ sinh an toàn thực phẩm lần thứ 4 - 2007, Nhà xuất bản y

học, trang 281 - 286.

5. Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Thuý Dung (2007), “ Xác định hàm lượng một số

acid amin trong đậu tương và sản phẩm chế biến bằng kỹ thuật sắc ký lỏng

hiệu năng cao’’, Tạp chí dinh dưỡng và thực phẩm, Tập 3 - Số 4 - Tháng 12

năm 2007, trang 68 - 77.

6. Lê Thị Hồng Hảo (2004), “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC) tối ưu hoá các điều kiện phân tích một số axít amin trong

120

cá”, Giấy chứng nhận đăng ký kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ số:

2006-64-095/KQ của Trung tâm thông tin khoa học và công nghệ quốc gia, Bộ

khoa học và công nghệ.

7. Lê Hồng Dũng, Lê Thị Hồng Hảo (2007), “Bước đầu xác định hàm lượng

Daidzein, genistein và 17 axít amin trong đậu tương và sản phẩm chế biến”,

Giấy chứng nhận đăng ký kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ số:

2007-64-329/KQNC của Trung tâm thông tin khoa học và công nghệ quốc gia,

Bộ khoa học và công nghệ.

121

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam - lần xuất bản thứ 3, Nhà xuất bản Y

học, Hà Nội.

2. Hà Huy Khôi & CS (1996), Dinh dưỡng và an toàn thực phẩm, Nhà xuất bản

Y học.

3. Hà Huy Khôi (2004), Những đường biên mới của dinh dưỡng học, Nhà xuất

bản Y học, Tr 28-54.

4. Lê Thị Huyền Dương (2001), Nghiên cứu tách và xác định retinoit bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Luận án tiến sỹ hóa học.

5. Nguyễn Văn Ri (2004), Chuyên đề các phương pháp tách chiết, Khoa hóa,

Trường ĐHKHTN Hà Nội.

6. Nguyễn Trung Thuần, Phạm Thị Thu, (2002), Bách khoa Dinh Dưỡng, Nhà

xuất bản Phụ Nữ - Hà Nội, trang 28 - 52.

7. Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết sắc ký điện di mao quản hiệu suất cao,

Khoa Hóa học, Trường ĐHKHTN Hà Nội.

8. Phạm Luận (1987), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Khoa Hóa học,

Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội.

9. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Như Thuận (1978), Kiểm nghiệm Lương thực

Thực phẩm, Nhà suất bản Khoa Học và Kỹ Thuật - Hà Nội, trang 128-

183.

10. Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích, Khoa

hóa, Trường ĐHKHTN Hà Nội.

11. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003),

Hóa học phân tích - Phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Khoa Hóa

học, Trường ĐHKHTN Hà Nội.

12. Viện Dinh dưỡng - Bộ Y tế (2000), Bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm

122

Việt Nam, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.

13. Viện Dinh dưỡng (2000), Tổng điều tra dinh dưỡng, Nhà xuất bản Y học Hà

nội.

14. Vũ Thị Như và cộng sự (1986), Chất lượng dinh dưỡng protein trong hạt một

số cây trồng thuộc họ đậu đỗ Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

15. Vũ Thị Như, Nguyễn Ngọc Tâm (1987), Kết quả nghiên cứu về phẩm chất hạt

của các giống đậu tương, Tạp chí KHKTNN, số 315, trang 119-121.

Tiếng Anh

16. A.P. Wilkinson, K. Wahala, G. Williamson (2002). Review: Identification

and quantification of polyphenol phytoestrogens in foods and human

biological fluids. Journal of Chromatography B, 777: pp. 93-109.

17. Alexander, R.R., Griffiths, J.M., Wilkinson, M.L., (1985). Identification of

amino acids by thin-layer chromatography. In: Basic Biochemical Methods.

Wiley, New York, pp. 24–28.

18. Amin, A.S., Zaky, M., El-Beshbeshy, A.M., (2000), Colorimetric estimation

of melatonin in pharmaceutical formulations. Mikrochimica Acta 135, 81 - 85.

19. AOAC Official Method (2000), Monosodium Glutamate in Food.

Potentiometric Titration Method, C. 970.37.

20. Bailey, J.L., (1962), Estimation of amino acids by ninhydrin. In: Techniques in

Protein Chemistry. Elsevier, Amsterdam, pp. 73 - 81.

21. Brewer, J.M., Roberts, C.W., Stimson, W.H., Alexander, J., (1995), Accurate

Determination of Adjuvant-Associated Protein or Peptide by Ninhydrin Assay,

vol. 13. Butterworth-Heinemann, Stoneham,MA (pp. 1441 - 1444).

22. Carla prata, Pierre Bonnafous, Nicolas Fraysse, Michel treihou, Verena

Poinsot, Francois Couderc (2001), Recent advances in amino acid analysis by

capillary electrophoresis, University Paul Sabatier, 22, 4129 - 4188.

23. Constantinos K. Zacharis, Georgios A. Theodoridis , Anastasios N.

Voulgaropoulos, (2005), Coupling of sequential injection with liquid

chromatography for the automated derivatization and on-line determination of

123

amino acids, Talanta 68, pp. 448 - 458.

24. Coral A. Lamartiniere, Michelle S. Cotroneo, Wayne A. Fritz, Jun Wang,

Roycelynn Mentor - Marcel and Ada Elgavish (2002), Genistein

Chemoprevention: Timing and Mechanisms of Action in Murine Mammary

and Prostate, Journal of Nutrition, 132: 552S - 558S.

25. Curotto, E., Aros, F., (1993), Quantitative determination of chitosan and the

percentage of free amino groups. Analytical Biochemistry 211, 240 - 241.

26. Dany Heems, Genevieve Luck, Christophe Fraudeau, Eric Verette (1998).

Fully automated precolumn derivatization, on-line dialysis and high-

performance liquid chromatographic analysis of amino acids in food,

beverages and feedstuff. Journal of Chromatography A, 798, p. 9 - 17.

27. Divi, R. L. and Doerge, D. R. (1996). Inhibition of thyroid peroxidase by

dietary favonoids. Chem. Res. Toxicol. 9, p. 16 - 23.

28. Fang, G.Z., Liu, N., (2001), Determination of eight essential amino acids in

mixtures by chemometrics-spectrophotometry without separation. Analytica

Chimica Acta 445, 245 - 253.

29. Fini C., Floridi A., Fnelli V.N., & et (1990), Amino acid analysis and protein

sequencing, Laboratory methodology in Biochemistry.

30. Fisher, G.H., Arias, I., Quesada, I., D’Aniello, S., Errico, F., Di Fiore, M.M.,

D’Aniello, A., (2001) A fast and sensitive method for measuring picomole

levels of total free amino acids in very small amounts of biological tissues.

Amino acids 20, 163 - 173.

31. Fort, P., Moses, N., Fasano, M., Goldberg, T. and Lifshitz, F. (1990). Breast

and soy-formula feeding in early infancy and the prevalence of autoimmune

thyroid disease in children. J. Am. Coll. Nutr. 9, 164 - 167.

32. Fountoulakis M., Lahm H, -W, (1998), Hydrolysis and aminoacid composition

analysis of protein, Journal of chromatography A, 826, p 109.

33. Fruchter, R.G., Crestfield, A.M., (1965), Preparation and properties of two

active forms of ribonuclease dimer, Journal of Biological Chemistry 240, 3868

- 3874.

124

34. Frutos, P., Torrado, S., Perez-Lorenzo, M.E., Frutos, G., (2000). A validated

quantitative colorimetric assay for gentamicin. Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis 21, 1149 - 1159.

35. Gordana Zunic, Zorana Jelic-Ivanovic, Miodrag Colic, Slavica Apasis (2002)

Optimization of a free separation of 30 free amino acids and peptides by

capillary zone electrophoresis with indirect absorbance detection: a potential

for quantification in physiological fluids. Journal of Chromatography B, 772,

P. 19 - 33.

36. H. Ali, R. Patzold, H. Bruckner (2005) Determination of L- and D-amino

acids in smokeless tobacco products and tobacco. Food Chemistry.

Department of food sciences, Institute of Nutrition Science, Interdisciplinary

Reseach center, Justus-Liebig-University of Giessen, Germany, p. 1 - 10.

37. H. C. Hsieh, T.H. Kao, B.H. Chen (2004). A fast HPLC method for analysis of

issoflavones in soybean. Journal of Liquid Chromatography & Related

Technologies, Volume 27, issue 2, p 315-324.

38. H. Greenfield and D.A.T Southgate (2003), Food Composition Data:

Production, Management and Use, Second edition, p 114-156.

39. H. L. A. Tarr, (1958), Biochemistry of Fishes. Ann. Rev. Biochem, 27: p 223-

244.

40. Haynes P. A., Sheumack D., Greig L. G. Kibby J., Redwood J. W. (1991),

Application of automated amino acid analysis using 9-fluorenylmethyl

cloroformate, Journal of chromatography A, 588, p 107.

41. Hirs, C.H.W., (1967), Detection of peptides by chemical methods. In:

,Methods in Enzymology, Enzyme Structure, vol. XI. Academic Press, San

Diego, pp. 325 - 329.

42. Hurst, P.L., Sinclair, B.K., Eason, J.R., (1995), Amino acids interfere with the

ninhydrin assay for asparagines, Food Chemistry 53, 467 - 469.

43. I. Molnar-Per (2000) Role of chromatography in the analysis of sugars,

carboxylic acids and amino acid in food, Journal of Chromatography A, 891,

p. 1 - 32.

44. IEH (2000) Phytoestrogens in the Human Diet (Web Report W3), Leicester,

125

UK, Institute for Environment and Health, posted October 2000 at

http://www.le.ac.uk/ieh/webpub/webpub.html.

45. Jabbar, M. A., Larrea, J. and Shaw, R. A. (1997). Abnormal thyroid function

tests in infants with congenital hypothyroidism: the infuence of soy-based

formula. J. Am. Coll. Nutr. 16, p. 280 - 282.

46. Jing-Joan Xu, Ying Peng, Ning Bao, Xing-Hua Xia, Hong-Yuan Chen (2005)

Simple method for the separation and detection of native amino acids and the

identification of electroactive and non-electroactive analytes. Journal of

Chromatography A, 1095, p. 193 - 196.

47. Jinmao You, Yongfei Ming, Yunwei Shi, Xianen Zhao, Yourui Suo, Honglun

Wang, Yulin Li, Jing Sun (2005). Development of a sensitive fluorescent

derivatization reagent 1,2-benzo-3,4-dihydrocarbazole-9-ethyl cloroformate

(BCEOC) and its application for determination of amino acids from seeds and

bryophyte plants using high-performance liquid chromatography with

fluorescence detection and identification with electrospray ionization mass

spectrometry. Talanta, 68, p. 448 - 458

48. Joel T.Smith (1997), Development in amino acid analysis using capillary

electrophoresis, University, Durant, OK, USA, 18, p. 2377 - 2392.

49. Jose L. Penalvo, Tarja Nurmi, Herman Adlercreutz (2004), A simplified

HPLC method for total isoflavons in soy products. Food Chemistry 87: p. 297

- 305.

50. Julie A. Ross and Christine M. Kasum (2002), DIETARY FLAVONOIDS:

Bioavailability, Metabolic Effects, and Safety. Annual Review of Nutrition 22:

p.19 - 34.

51. Julie H. Mitchell, Elizabeth Cawood, David Kinniburgh, Anne Provan,

Andrew R. Collins and D. Stewart Irvine (2001). Effect of a phytoestrogen

food supplement on reproductive health in normal males. Clinical Science

100, p. 613 - 618.

52. Julie Maubach, Marc E. Bracke, Arne Heyerick, Herman T. Depypere,

Rudolphe F. Serreyn, Marc M. Mareel, Denis De Keukeleire (2003).

Quantitation of soy-derived phytoestrogens in human breast tissue and

126

biological fluids by high-performance liquid chromatography. Journal of

Chromatography B, 784: p. 137 - 144.

53. Kang-Lyung Woo, Que-Chung Hwang, Hyung-Su Kim (1996), Determination

of amino acids in the foods by reversed-phase high-performance liquid

chromatography with a new precolumn derivative, butylthiocarbamyl amino

acid, compare to the convention phenylthiocarbamyl derivatives and ion-

exchange chromatography. Journal of Chromatography A, 740, p. 31 - 40.

54. Kenneth J. Carpenter 1994), Protein and energy, Cambridge university press,

p. 119 - 177.

55. Kurie Mitani, Shizuo Narimatsu, Hiroyuki Kataoka (2003). Determination of

daidzein and genistein in soybean foods by automated on-line in-tube solid-

phase microextraction coupled to high-performance liquid chromatography.

Journal of Chromatography A, 986: p. 169 - 177.

56. Laskar, S., Sinhababu, A., Hazra, K.M., (2001), A modified spray reagent for

the detection of amino acid on thin layer chromatography plates. Amino

Acids 21, p. 201 - 204.

57. Liisa M. Valsta, Annamari Kilkkinen, Witold Mazur, Tarja Nurmi, Anna-

Maija Lampi, Marja-Leena Ovaskainen1, Tommi Korhonen1, Herman

Adlercreutz and Pirjo Pietinen (2003). Phytooestrogen database of foods and

average intake in Finland. British Journal of Nutrition, 89, Suppl. 1, S31- S38.

58. Lourdes Bosch, Amparo Alegria, Rosaura Farre (2006) Application of the 6-

aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) reagent to the RP-

HPLC determination of amino acids in infant foods. Journal of

Chromatography B, 831, p. 176 - 183

59. M. Ummadi, B. C.Weimer (2002), Use of capillary electrophoresis and laser-

induced fluorescence for attomole detection of amino acids, Journal of

chromatography A, 964, p. 243 - 253.

60. Mark Messina, Christoper Gardner and Stephen Barnes (2002). Gaining

Insight into the Health Effects of Soy but a Long Way Still to Go: Commentary

on the Fourth International Symposium on the Role of Soy in Preventing and

127

Treating Chronic Disease. Journal of Nutrition, 132: 547S - 551S.

61. Mazur, W. and H. Adlercreutz. (1998). Naturally occuring estrogens in food.

Pure & Applied Chemistry 70: p. 1759 - 1776.

62. Mindy S. Kurzer (2002). Hormonal Effects of Soy in Premenopausal Women

and Men. Journal of Nutrition, 132: 570S - 573S.

63. Moore, S., (1968), Amino acid analysis; aqueous dimethyl sulfoxide as solvent

for the ninhydrin reaction. Journal of Biological Chemistry 243, 6281- 6283.

64. Moore, S., Stein, W.H., (1948), Photometric ninhydrin method for use in the

chromatography of amino acids, Journal of Biological Chemistry 176, p. 367 -

388.

65. Moore, S., Stein, W.H., (1954), A modified ninhydrin reagent for the

photometric determination of amino acids and related compounds, Journal of

Biological Chemistry 211, p. 907 - 913.

66. Moore, W.H. Stein, (1951) , Determination amino acid by post-columm

derivatization, J. Biol. Chem. 192, 663.

67. Morris J. Bradley (2004), Legumes: Nutraceutical and Pharmaceutical Uses.

Published in Encyclopedia of Plant and Crop Science, ISBN: 0-8247-4268-0,

p. 651 - 655.

68. Owen R. Fennenma (1985), Food chemistry-second edition, revised and

expanded, New York and Basel, p. 245 - 370.

69. Panasiuk, R., Amarowicz, R., Kostyra, H., Sijtsma, L., (1998), Determination

of -amino nitrogen in pea protein hydrolysates: a comparison of three

analytical methods, Food Chemistry 62, p. 363 - 367.

70. Patricia A. Murphy, Tongtong Song, Gwen Buseman, and Kobita Barua

(1997). Isoflavones in Soy-Based Infant Formulas. Journal of Agriculture and

Food Chemistry 45, p. 4635 - 4638.

71. Prochazkova, S., Varum, K.M., Ostgaard, K., (1999), Quantitative

determination of chitosans by ninhydrin, Carbohydrate Polymers 38, p. 115 -

122.

128

72. R. Draisci, L. Giannetti, P. Boria, L. Lucentini, L. Palleschi, S. Cavalli (1998).

Improved ion chromatography-integrated pulsed amperometric detection

method for the evaluation of biogenic in food of vegetable or animal origin

and in fermented foods. Journal of Chromatography A, 798, p. 109 - 116.

73. Shih-Wen Sun, Yi-Cheng Lin, Yih-Ming Weng, Min-Jane Chen (2006),

Effciency improvement on ninhydrin method for amino acid quantification,

Journal of food and analysis 19, p 112 - 117.

74. Starcher, B (2001), A ninhydrin-based assay to quantitate the total protein

content of tissue samples, Analytical Biochemistry 292, p. 125 - 129.

75. Strydom D. J., Andersen T.T., Apostol I., Fox J.W., Paxton R. J, Crabb J. W.

(1993), Cystein and trytophan amino acid analysis, Techniques in protein

chemistry IV, Hogue Angeletti R. Academic Press, San Diego, p. 279 - 288.

76. Susana Maria Halpine (2006), Amino acid analysis by HPLC, Encyclopedia of

chromatography.

77. Thomas M. Badger, Martin J. J. Ronis, Reza Hakkak, J. Craig Rowlands and

Soheila Korourian (2002). The Health Consequences of Early Soy

Consumption. Journal of Nutrition, 132: 559S - 565S.

78. Tom Teerlink, Marcel P. Copper, Ingeborg Klaassen, Boudewijin J.M.

Braakhuit (1997), Simultanaeus analysis of retinol, all trans- and 13 cis-

retinoic acid and 13-cis-4-oxoretinoic acid in plasma by liquid

chromatography using on-column concentration after single-phase fluid

extraction, Journal of chromatography B, 694, p. 83 - 92.

79. Tyson, Don (1999). Metabolism and Analysis amino acids. Interpretation

Guide.

80. U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service (2002).

USDA-Iowa State University Database on the Isoflavone Content of Foods,

Release 1.3 - 2002. Nutrient Data Laboratory Web site:

http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/Data/isoflav/isoflav.html.

81. Yaru Song, Ming Shenwu, Shulin Zhao, Dongyan Hou, Yi-Ming Liu (2005)

Enantiomeric separation of amino acids derivatized with 7-fluoro-4-

129

nitrobenzoxadiazole by capillary liquid chromatography/tandem mass

spectrometry. Journal of Chromatography A, 1091, p. 102 - 109.

82. Yiannis C. Fiamegos, Constantine D. Stalikas (2006) Gas chromatographic

determination of amino acids via one-step phase-transfer catalytic

pentafluorobenzylation-preconcentration. Journal of Chromatography A.

83. Yin, J., Tomycz, L., Bonner, G., Wang, D.I.C., (2002), A simple and rapid

assay of collagen-like polymer in crude lysate from Escherichia coli. Journal

of Microbiological Methods 49, p. 321 - 323.

84. Yukio Yokoyama, Sachiyo Tsuji, Hisakuni Sato (2005), Simultaneous

determination of creatinine, creatin, and UV-absorbing amino acids using

dual-mode gradient low-capacity cation-exchange chromatography, Journal of

Neuroscience Methods 144, pp. 63 - 71.

130

PHỤ LỤC 1

Chức năng và đặc tính lý hoá của axít amin

131

Axít amin tạo protein

Axít amin mạch thẳng AA chứa nhóm S

Axít amin thơm Axít amin vòng Axít amin trung tính

Axít amin trung tính Axít amin axit Axít amin bazơ

132

PHỤ LỤC 2 Khảo sát thành phần tỷ lệ pha động rửa giải đẳng dòng

(A: dung dịch đệm acetat phosphat pH=5,05; B: ACN) A:B = 97 : 3

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Volts

0.0

00.0

10.0

20.0

3

Volts

0.00

0.01

0.02

0.03

(Asp

)

(Ser)

(Glu

)

(Gly

)

(His

)

(Arg

)

(Ph

e)

Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)

amino acids

Chuan hon hop MP 97-3.dat

Retention Time

Area

Name

A:B = 95 : 5

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Volts

0.0

00.0

20.0

4

Volts

0.00

0.02

0.04

Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)

amino acids

Chuan hon hop MP 95-5.dat

Retention Time

Area

Name

A:B = 90 : 10

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Volts

0.0

00

.01

0.0

20

.03

0.0

4

Volts

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)

amino acids

Chuan hon hop MP 90-10.dat

Retention Time

Area

Height

Name

133

PHỤ LỤC 3 MỘT SỐ SẮC ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU THỰC

Sắc đồ phân tích mẫu cá:

134

135

136

Sắc đồ phân tích đậu tương:

137

Sắc đồ phân tích mẫu thịt:

Chuẩn hỗn hợp

Minutes

7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0

Volts

0.0

00

.05

0.1

00

.15

Volts

0.00

0.05

0.10

0.15

15

.60

8

A

sp1

7.1

25

S

er

18

.00

8

Glu

19

.22

5

Gly

20

.04

2

His

21

.09

2

NH

32

2.3

83

23

.78

3

A

rg

23

.98

3

Th

r2

4.6

83

Ala

26

.02

5

P

ro2

7.1

75

28

.60

0

Cy

s2

9.2

75

Ty

r

29

.72

5

30

.41

7

Val

30

.97

5

Met

31

.45

8

33

.75

0

Ly

s3

4.4

25

Ileu

34

.80

8

L

eu

Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)

amino acids

Chuan hon hop_02.11.07.dat

Retention Time

Name

Mẫu thịt gà: 1.3026g + 10ml HCl 6N - thủy phân - định mức 100 - pha loãng 50 lần.

Lấy 0,5 ml dịch pha loãng + 100µl đem + 30 µl dẫn xuất

Minutes

7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0

Volts

0.0

00

.05

0.1

00

.15

Volts

0.00

0.05

0.10

0.15

15

.57

5

A

sp1

7.1

25

S

er

18

.00

0

Glu

18

.85

0

Gly

19

.20

0

20

.03

3

His

21

.10

0

NH

32

2.2

50

23

.79

2

A

rg

24

.00

0

Th

r2

4.6

92

Ala

25

.40

0

26

.03

3

P

ro2

6.8

17

Cy

s

29

.29

2

Ty

r

29

.71

7

30

.45

0

Val

31

.00

0

Met

31

.45

8

33

.78

3

Ly

s3

4.4

67

Ileu

34

.82

5

L

eu

Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)

amino acids

Mau thit lon_1.0119g-100-1-50.dat

Retention Time

Name

Mẫu thịt lợn: 1.0119g + 10ml HCl 6N - thủy phân - định mức 100 - pha loãng 50

lần. Lấy 0,5 ml dịch pha loãng + 100µl đem + 30 µl dẫn xuất

Minutes

7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0

Volts

0.0

00

.05

0.1

00

.15

Volts

0.00

0.05

0.10

0.15

14

.85

8

A

sp1

6.5

50

S

er

17

.45

8

Glu18

.37

5

Gly

18

.75

8

19

.63

3

His

20

.75

8

NH

32

1.5

75

23

.67

5

A

rg

23

.90

0

Th

r2

4.6

25

Ala

25

.34

2

26

.00

8

P

ro2

6.8

00

Cy

s

29

.30

0

Ty

r

29

.72

5

30

.45

0

Val

31

.00

8

Met

31

.47

5

33

.78

3

Ly

s3

4.4

67

Ileu

34

.83

3

L

eu

Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)

amino acids

Mau thit ga_1.3026g-100-1-50.dat

Retention Time

Name

138

PHỤ LỤC 4

ĐƯỜNG CHUẨN ĐỊNH LƯỢNG CỦA CÁC AXÍT AMIN

y = 21449x - 13913

R2 = 0,995

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

0.091 0.182 0.365 0.547 0.73 0.912

Nång ®é Ser (mcg/ml)

§é h

Êp thô (m

V)

Đường chuẩn định lượng Ser từ

0,091 đến 0,912 (g/ml)

y = 17389x - 11862

R2 = 0,9937

0

20000

40000

60000

80000

100000

0.159 0.317 0.634 0.952 1.269 1.586

Nång ®é Glu (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Glu từ

0,159 đến 1,568 (g/ml)

y = 17683x - 11257

R2 = 0,9954

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

0.079 0.158 0.315 0.473 0631 0.788

Nång ®é Gly (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Gly từ

0,079 đến 0,788 (g/ml)

y = 69592x - 44629

R2 = 0,9953

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

0,032 0,074 0,127 0,191 0,255 0,318

Nång ®é Thr (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Thr từ 0,032

đến 0,318 (g/ml)

y = 57257x - 39583

R2 = 0,9933

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

0.029 0.059 0.117 0.176 0.234 0.293

Nång ®é Ala (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Ala từ

0,079 đến 0,788 (g/ml)

y = 24392x - 16396

R2 = 0,9942

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

0.088 0.177 0.354 0.53 0.707 0.884

Nång ®é Pro (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Pro từ

0,032 đến 0,318 (g/ml)

139

y = 49271x - 33542

R2 = 0,9938

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

0.069 0.138 0.271 0.414 0.552 0.69

Nång ®é Tyr (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Tyr từ

0,069 đến 0,69 (g/ml)

y = 79214x - 55233

R2 = 0,9937

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

0.028 0.056 0.111 0.167 0.222 0.278

Nång ®é Val (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Val từ

0,028 đến 0,278 (g/ml)

y = 65486x - 50641

R2 = 0,9971

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

0.044 0.087 0.175 0.262 0.35 0.437

Nång ®é Met (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Met từ

0,044 đến 0,437 (g/ml)

y = 36827x - 24357

R2 = 0,9946

0

50000

100000

150000

200000

250000

0.028 0.056 0.111 0.167 0.222 0.278

Nång ®é Lys (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Lys từ

0,028 đến 0,278 (g/ml)

y = 87623x - 32516

R2 = 0,9961

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

0.026 0.053 0.106 0.159 0.212 0.265

Nång ®é I le (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Ile từ 0,026

đến 0,265 (g/ml)

y = 82351x - 55255

R2 = 0,9942

0

100000

200000

300000

400000

500000

0.03 0.06 0.119 0.179 0.239 0.298

Nång ®é leu (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Leu từ 0,03

đến 0,298 (g/ml)

140

y = 16806x - 11856

R2 = 0,9925

0

20000

40000

60000

80000

100000

0,149 0,299 0,597 0,896 1,195 1,493

Nång ®é Asp (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Asp từ

0,149 đến 1,493 (g/ml)

y = 20689x - 14596

R2 = 0,9925

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

0,015 0,031 0,062 0,093 0,124 0,155

Nång ®é His (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng His từ

0,015 đến 0,155 (g/ml)

y = 71193x - 50227

R2 = 0,9925

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

0,046 0,092 0,185 0,277 0,369 0,461

Nång ®é Arg (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Arg từ

0,046 đến 0,461 (g/ml)

y = 7615,7x - 5169,9

R2 = 0,9939

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

0,149 0,298 0,596 0,894 1,129 1,49

Nång ®é Cys (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Cys từ

0,149 đến 1,49 (g/ml)

y = 86505x - 58592

R2 = 0,9939

0

100000

200000

300000

400000

500000

0.036 0.072 0.143 0.215 0.275 0.358

Nång ®é Phe (mcg/ml)

ChiÒ

u c

ao p

ic (m

V)

Đường chuẩn định lượng Phe từ 0,036

đến 0,358 (g/ml)