1

OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2012

1.1. Festékpróbák az anyagtudományban (KM), szept. 25.

1.2. Nem-lineáris lézerspektroszkópia (KT)

1. 3. Fotodinamikus terápia (VT)

1.4. Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia (KM)

1. 5. Fotokróm anyagok (BP)

2

ALAPISMERETEK(vizsgára, doktori szigorlatra átismételni)

Kémiai anyagszerkezettan

V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp05)

VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo05)

VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo05)

VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel05)

X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer05)

3

Festékpróbák

Abszorbeáló próbák Fluoreszkáló próbák

4

Reichardt’s dye

N Ph

Ph

Ph

PhPh

O

+

_

5

N Ph

Ph

Ph

PhPh

O

+

_O

Ph Ph

Ph

Ph

PhN

.

.h

Reichardt’s dye

„charge transfer” festék

C. REICHARDT, Chem. Rev. 94, 2319-2358 (1994)

6

A Reichardt-festék abszorpciós színképe 90 %-os (m/m) glicerin-víz elegyben (GW), ionos folyadékban (IL), acetonitrilben (ACN) és diklórmetánban (DCM).

K.A. Fletcher, Green Chem. 3, 210-215 (2001)

7

S0

= 810 nm

Ph-O-Ph

= 453 nm

H2O

S1

Oldószer polaritás

8

skála

Az oldószer polaritását jellemzi.

NTE

TMSEvízE

TMSEoldószerEE

TT

TTNT

9

Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől

Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől

Etanolban + 78 C max = 568 nm

- 78 C max = 513 nm

Piezokromizmus: A szín függ a nyomástól

Etanolban 1 bar max = 547 nm

10 kbar max = 520 nm

10

A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben

1. Nem kell átlátszó minta

2. Nagyobb érzékenység

3. Háromszoros szelektivitás

- gerjesztési hullámhossz szerint

- emissziós hullámhossz szerint

- lecsengési idő szerint

Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál

11

Fluoreszcens festékpróbák

J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic, London, 1999

Vázlat

12

Műszerekstacionárius spektrofluoriméteridőkorrelált egyfoton-számlálás

Statikus kioltás dinamikus kioltás oldószer polaritás / hőmérséklet / viszkozitás hatása

Lippert-egyenlet vibrációs relaxáció oldószer relaxáció kettős fluoreszcencia feherjék fluoreszcenciája / triptofán FRETrotációs diffúzió (orientációs relaxáció)

13

Spektrofluoriméterek

-stacionárius- időfelbontásos (F mérése, időkorrelált egyfoton-számlálás)

14

Stacionárius

15

Időkorrelált

egyfoton-számlálás

16

Fluoreszcencia lecsengési görbe

17

Statikus kioltás

18

Oxazin1 + receptor

19

20

21

QKI

I

QKF

F

QQF

F

QF

FFK

QFFF

QF

QFK

QFQF

F

F

1

1

1

0

0

00

0

22

Dinamikus kioltás

23

Lakowicz, p. 461

24

Lakowicz, p. 461

25

M + h

M + h

M +

M + Q

M*

26

A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka

Kioltó nélkül

MkMkdt

Mdnrf

Kioltóval

QMkMkMkdt

Mdqnrf

nrf

f

nrf

f0 kk

k

MkMk

MkΦ

Qkkk

k

QMkMkMk

MkΦ

qnrf

f

qnrf

f

27

Qkk

k1

kk

Qkkk

Φ

Φ

nrf

q

nrf

qnrf0

Qkk

k1

I

I

nrf

q

F

F0

Stern-Volmer egyenlet

28

Oldószer polaritása és hőmérséklete

29

S0

S1

Oldószer polaritás

30

Polaritás hatása: Lippert-egyenlet

+

_

- - - -

+ + + +2a

G v. E

31

Lippert-egyenlet

VR2

GE2

2

3FA E1n2

1n

12

1

a

2hh

+

_

- - - -

+ + + +2a

G v. E

32

Naftilamin-származékok Stokes eltolódása

Lakowicz, p. 191

33

S0

S1

vibrációs relaxáció

10-12 s

oldószer relaxáció

oldószer relaxáció

10-10 s

abszorpció10-15 s

emisszió10-9 s

Hőmérséklet hatása: folyamatok Jablonski-diagramon

34

Patman

CCH3(CH2)14

O

CH3

CH2 CH2N(CH3)3+

A Prodan lipofilizált + ionos változata

35

400 500

IF

[nm]Lakowicz, p. 199

-Oldószer relaxáció sebessége kisebb, ha csökken a hőm.- a sáv -30C-on a legszélesebb: kettős fluoreszc.

36

Kettős fluoreszcencia

DMANCN fl. Színképe etilénglikolban

Lakowicz, p. 201

37

CH2 CH

NH2

COOH

*

*

COOH

NH2

CHCH2HO

*

COOH

NH2

CHCH2

NH

Fluoreszkáló aminosavak

fenil-alanin

tirozin

triptofán

38

Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma

(víz, pH 7)

Lakowicz, p. 446

39

Lakowicz p. 453

A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára

1) Apoazurin Pfl

2) T1 ribonuklease

3) staphillococcus nuclease

4) glucagon

40

Rezonancia energia-átadás

(Förster resonance energy transfer = FRET)

Távolságmérés fluoreszcenciával!

Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UV-fénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el

FRET: 2-10 nm-es távolságok érzékelhetők

41

Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával.

42

Ha D és A távolsága kicsi, FRET,

D-t gerjesztve az A fluoreszkál

A hatás 1/r6-nal arányos

43

Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata

C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003)

44

Akceptor

Donor: EtBr

(etidium bromid)

N

C2H5

NH2H2N

+

Br-

45

EtBr abszorpció

BODIPY fluoreszcencia

46

Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni

47

Festékmolekula orientációs relaxációja

dehdor τττ

+

_

- - - -

+ + + +2a

G v. E

48

Hidrodinamikai súrlódás járuléka

0M

hd τkT

ηVfCτ

Stokes-Einstein-Debye egyenlet

49

Dielektromos súrlódás járuléka

D23

2

de τ12ε

1ε

kTaτ

50

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán

Habuchi et al., (Sapporo), Anal. Chem. 73, 366-372 (2001)

Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer

Keresztkötések gyakorisága () 8 % divinilbenzol

Ioncserélő csoport: Na-szulfonát

51

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán

A

[cm-1]

F

[cm-1]

A- F

[cm-1]

S1

[ps]

or

[ps]víz 15 699 14 970 729 380 110gyanta 15 211 14 925 286 2340 >10 000