SDO2-1

ผลของความซบซอนของแบบจาลองเยอหมเซลลตอการเขาสเซลลของอนภาคนาโนทอง

Effect of Membrane Complexity Model on Cellular Uptake of Gold Nanoparticles

ทศพล ลนน (Thodsaphon Lunnoo)* จรวฒน อศวขจรศกด (Jirawat Assawakhajornsak)**

นพมาศ โยลย (Noppamas Yolai)*** ดร.ธระพงษ พวงมะล (Dr.Theerapong Puangmali)****

บทคดยอ

งานวจยนมงเนนศกษาอนตรกรยาระหวางอนภาคนาโนทองและเยอหมเซลล โดยใชการจาลองแบบทาง

คอมพวเตอรแบบกลมอะตอม เพอศกษาผลการเขาสเซลลของอนภาคนาโนทองผานเยอหมเซลล 2 ชนด คอ เยอหม

เซลลอยางงาย และเยอหมเซลลพลาสมาทมความซบซอนใกลเคยงกบเยอหมเซลลของสงมชวตมากทสด จากผล

การศกษาพบวาขนาดของอนภาคนาโนทอง และความซบซอนของเมมเบรนมผลตอการเขาสเซลล ซงรปแบบการเขาส

เซลลของอนภาคนาโนทองสามารถแบงได 3 รปแบบ คอ 1) การเขาสเซลลแบบแพร 2) การเขาสเซลลแบบกงเอนโดไซ

โทซส และ 3) การเขาสเซลลแบบเอนโดไซโทซส สาหรบอนภาคทองทมขนาด 2 นาโนเมตร สามารถผานเขาสเซลลได

ดกวาอนภาคนาโนทองทมขนาดใหญ อนภาคนาโนทองทมขนาด 2-8 นาโนเมตรมรปแบบการเขาสเซลลเหมอนกนทง

2 แบบจาลองเซลลเมมเบรน แตสาหรบอนภาคทองขนาด 10 นาโนเมตรจะมการเขาสเซลลแตกตางกน โดยเขาสเซลล

แบบเอนโดไซโทซสสาหรบเมมเบรนอยางงาย และเขาสเซลลแบบแพรสาหรบพลาสมาเมมเบรน ดงนนความซบซอน

ของเยอหมเซลลมผลตอการอธบายรปแบบการเขาสเซลลของอนภาคนาโนทอง ซงความเขาใจอนตรกรยาระหวาง

อนภาคนาโนทองและเยอหมเซลลจะสามารถออกแบบอนภาคนาโนทองเพอประยกตใชในทางการแพทยระดบนาโน

ABSTRACT

In this work, we studied the interactions between gold nanoparticles (AuNPs) and cell membrane. To investigate

the effect of membrane complexity on the cellular uptake of AuNP, the internalization of AuNP in simple membrane

(DSPC/DSPG membrane) and idealized plasma membrane based on coarse-grained molecular simulation (CGMD) technique

was studied. Simulation results show that sizes of AuNP and the complexity of plasma membrane play significant roles in the

internalization of AuNP. The cellular uptake pathway of AuNP across cell membrane can be classified into three different

processes including (i) direct translocation, (ii) semi-endocytosis, and (iii) endocytosis. A 2-nm-in-diameter AuNP can be

translocated across cell membranes easier than larger particles. The translocation of AuNP (2-8nm) in both simple membrane

and plasma membrane had the same cellular uptake pathway. In contrast, the endocytosis pathway and the direct translocation

of a 10 nm AuNP were found in the simple membrane and the plasma membrane, respectively. Our study indicates that the

complexity of membrane model play an important role in the uptake pathway of AuNP. Understanding the interaction between

AuNPs and cell membrane provides the novel design of AuNP for applications nanomedicine.

คาสาคญ: กลไกการเขาสเซลล อนภาคนาโนทอง พลาสมาเมมเบรน

Keywords: Cellular uptake pathway, AuNP, Plasma membrane

* นกศกษา หลกสตรปรชญาดษฏบณฑต สาขาวชาฟสกส คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน

** นกศกษา หลกสตรปรชญาดษฏบณฑต สาขาวชาฟสกส คณะวทยาศาสตรธรรมชาตและคณตศาสตร คงสคอลเลจลอนดอน

*** นกศกษา หลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาฟสกส คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยมหดล

**** ผชวยศาสตราจารย ภาควชาฟสกส คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน

13

SDO2-2

บทนา

อนภาคนาโนทองถกนามาประยกตใชในทางการแพทยอยางแพรหลาย เชน การนาสงยา (drug delivery)

(Vigderman et al., 2013) การบาบดทางแสง (photothermal therapy) (Mayer et al., 2011) เปนตน เนองจากอนภาคนาโน

ทองมสมบตเฉพาะหลายประการ เชน สามารถเขากบเซลลของสงมชวตไดด และมสมบตทางแสงทสามารถตอบสนอง

ตอแสงทตกกระทบทเรยกวา Localized surface plasmon resonance (LSPR) (Wang et al., 2013) ซงมชวงการดดกลน

แสงชวงใกลอนฟราเรด (near-infrared) และสมบตทางแสงนขนอยกบรปทรงของอนภาคนาโนทอง เชน อนภาคนาโน

ทองแบบทรงกลมจะมชวงการดดกลนแสงในชวง 520 นาโนเมตร และอนภาคนาโนทองแบบแทง (nanorod) มชวงการ

ดดกลนแสงในยาน 800 นาโนเมตร ซงรปทรง และขนาดของอนภาคนาโนทองสงผลตอชวงการดดกลนแสงทแตกตาง

กน อยางไรกตามการนาอนภาคนาโนทองไปประยกตใชในดานการแพทยนนเกยวของกบกลไกการเขาสเซลล ซงเปน

ปจจยหลกในการพจารณาเพอเพมประสทธภาพในการนาอนภาคนาโนทองไปยงอวยวะเปาหมาย

เมออนภาคนาโนทองมาถงเซลลเปาหมาย อนภาคนาโนทองจะเขาสเซลลเปาหมายโดยขนอยกบลกษณะทาง

กายภาพ และการปรบปรงพนผวของอนภาคนาโนทอง โดยทขนาดของอนภาคเปนปจจยหลกทมผลตอการเขาสเซลล

เชน อนภาคทมขนาดเลกจะเขาสเซลลแบบแพร (direct translocation) และอนภาคมขนาดใหญจะเขาสเซลลแบบเอนโด

ไซโทซส (endocytosis) (Rossi et al., 2016; Huang et al., 2012; Deserno, 2014; Li, 2012; Ginzburg and Balijepalli, 2007;

Ding et al., 2012) Chithrani และคณะ (Chithrani et al., 2006) ไดศกษาผลของขนาดและรปทรงของอนภาคนาโนทอง

ผานเยอหมเซลลของสตวเลยงลกดวยนม พบวาอนภาคนาโนทองทรงกลมขนาด 50 นาโนเมตร สามารถผานเขาสเซลล

แบบเอนโดไซโทซสและเปนขนาดทใหประสทธภาพการเขาสเซลลทดสด (Chithrani et al., 2006; Perrault et al.,

2009) สาหรบการศกษาการจาลองแบบทางคอมพวเตอรเรมจากป 2010 Lin และคณะ (Lin et al., 2010) ไดศกษาการ

เขาสเซลลของอนภาคนาโนทองทมประจแตกตางกน (ประจบวก กลาง และประจบลบ) ผานเยอหมเซลลทมประจลบ

(DSPC/DPPG) พบวา อนภาคทมประจบวกจะมประสทธภาพการเขาสเซลลไดดทสด ในป 2012 Nangia และคณะ

(Nangiam et al., 2012) ไดรายงานความสามารถในการเคลอนทผานเยอหมเซลล (translocation rate) ชนด DSPC/DSPG

ของอนภาคนาโนทองทมรปทรงแตกตางกน ซงพบวาอนภาคทมรปทรงแบบแทงมอตราการผานเขาสเซลลไดดทสด

แมวาการศกษาการเขาสเซลลของอนภาคนาโนทองทขนาดแตกตางกนมการศกษาอยางแพรหลาย ยงมหลาย

ประเดนทยงไมมคาตอบ หรอมคาตอบแตยงไมชดเจน การจาลองทางคอมพวเตอรจงเปนอกแนวทางหนงในการศกษา

และแบบจาลองเมมเบรนทมการศกษามากอนหนานยงเปนแบบจาลองอยางงายซงประกอบดวยลพดนอยกวา 3 ชนด

เชน แบบจาลองของลพด 1 ชนด (Salassi et al., 2017; Simonelli et al., 2015; Quan et al., 2017; Potdar et al., 2015; Song

et al., 2012; Lin et al., 2010; Ge et al., 2014) 2 ชนด (Quan et al., 2017; Nangia et al., 2012; Angelikopoulos et al.,

2017; Heikkila et al., 2014; Lin et al., 2011) และ 3 ชนด (Gupta et al., 2017; Gupta et al., 2016) ซงในความเปนจรง

พลาสมาเมมเบรนประกอบดวยลพดมากกวา 1000 ชนด ซงการทจะอธบายผลของความซบซอนของเยอหมเซลลใน

แบบจาลองอยางงายนตอการเขาสเซลลของอนภาคนาโนนนจงยงไมเพยงพอ

จากรายงานขางตนพบวา การศกษาอนตรกรยาระหวางอนภาคนาโนทองและเยอหมเซลลสามารถนาไปสการ

ประยกตในดานการแพทย จงเปนทมาของงานวจยน โดยศกษาผลของขนาดอนภาคนาโนทองทแตกตางกนผานเยอหม

เซลลของสงมชวต ผานการจาลองแบบทางคอมพวเตอรแบบกลมอะตอม (coarse-grained molecular dynamic: CGMD)

และผลของความซบซอนของเซลลเมมเบรนตอการเขาสเซลลของอนภาคนาโนทอง ซงผลทไดจากการศกษาคาดวาจะ

สามารถนาไปสการออกแบบอนภาคนาโนทองเพอเพมประสทธภาพในดานการแพทยระดบนาโน (nanomedicine) ได

14

SDO2-3

วตถประสงคการวจย

1. เพอศกษาอนตรกรยาระหวางอนภาคนาโนทองกบเยอหมเซลล

2. เพอศกษาผลของขนาดอนภาคนาโนทองตอการเคลอนทผานเยอหมเซลล

3. เพอศกษาผลของความซบซอนของเซลลเมมเบรนตอการเคลอนทผานเยอหมเซลลของอนภาคนาโนทอง

วธการวจย

สนามแรง (Force field) ในงานวจยนไดปรบปรงสนามแรงจากแบบจาลองสนามแรงของ Martini (Marrink et al.,

2007) เพอใชในการอธบายอนตรกรยาระหวางอนภาคนาโนทองและเซลลเมมเบรน สาหรบในงานวจยนไดใช

แบบจาลองระดบกลมอะตอม (Coarse-grain model: CG) ในการอธบายอนตรกรยาระหวางอนภาคนาโนทองกบเซลล

เมมเบรน โดยการลดจานวนอะตอมจากระดบอะตอม (all atom) เปนระดบกลมอะตอม เชน 4 อะตอมทมสมบต

คลายกนลดลงเปน 1 บต สาหรบการลดจานวนอะตอมตามแบบจาลอง Martini แบงกลมระดบอะตอมออกเปน 4

ประเภท คอ มประจใชสญลกษณหลก Q มขวใชสญลกษณหลก P ไมมขวใชสญลกษณหลก N และกงมขวใชสญลกษณ

C สาหรบกลมอะตอมทมประจ Q และไมมขว N โดยแบงลกษณะการเกดพนธะเปน 4 ประเภท กลมอะตอมทไม

สามารถเกดพนธะไฮโดรเจนใชสญลกษณรอง 0 (Q0 หรอ N0) กลมอะตอมทประพฤตตวเปนผใหสาหรบการเกดพนธะ

ไฮโดรเจนใชสญลกษณรองเปน d กลมอะตอมทประพฤตตวเปนผรบสาหรบการเกดพนธะไฮโดรเจนใชสญลกษณรอง

เปน a และกลมอะตอมทประพฤตตวเปนผใหและผรบใชสญลกษณรองเปน da สาหรบมขว P และกงมขว C โดยแบง

ความแรงออกเปนระดบตวเลข 5 ระดบ เชน P1 อธบายอะตอมทมขวแบบแรงสด สวน P5 อธบายอะตอมทมขวออนสด

สาหรบการอธบายอนตรกรยาระหวางโมเลกล สามารถอธบายดวยฟงกชนศกยของเลนนารด-โจนส (Lennard-Jones

potential)

12 6 (12) (6)

LJ (12) (6)( ) 4 ij ij ij ijij ij

ij ij ij ij

C CU r

r r r rσ σ

ε = − = −

(1)

เมอ rij คอ ระยะระหวางโมเลกลลาดบท i และ j Cij(12) และ Cij

(6) คอ คาคงทซงขนกบชนดของอะตอมททาปฏกรยา และ

อนตรกรยาทางไฟฟา (electrostatic interaction) ดงสมการ (2)

el ( ) i jij

ij ij

q qU r f

rε= (2)

เมอ rij คอ ระยะระหวางโมเลกลลาดบท i และ j qi และ qj คอ คาประจของอนภาค i และ j ตามลาดบ และ f คอ คาคงท

ทางไฟฟา และ ε คอ คาสภาพยอมสมพทธ (relative permittivity) สวนการอธบายอนตรกรยาระหวางโมเลกลอธบาย

ดวยพลงงานศกยในการยดหดของพนธะ (bond stretching potential) ดงสมการ (3)

( )2

str ( )2

bij ij ij

ij

k r bU r

−= (3)

เมอ rij คอ ระยะระหวางโมเลกลลาดบท i และ j bij คอ ความยาวพนธะ ทตาแหนงสมดลของอะตอมท i และ j และ bijk

คอ คาคงทของแรงทอธบายความแรงของพนธะ และพลงงานศกยของการกางเขาออกของมม ดงสมการ (4)

( )20

angle ( )2

bijk ij ijk

ij

kU

θ θθ

−= (4)

15

SDO2-4

เมอ ijθ คอ คาคงทของมมทเกดขนกบลาดบอะตอมท i และ j ijkk คอ คาคงทของแรง และ ijkθ คอ คามมทตาแหนงสมดล

สาหรบอะตอม i j และ k ตามลาดบ สาหรบรายละเอยดตาง ๆ สามารถศกษาเพมเตมตามบทความของ Martini (Marrink

SJ et al., 2007) ซงแบบจาลองสนามพลงงานของ Martini สามารถอธบายอนตรกรยาและเพมเวลาในการคานวณไดเรว

ขนเปน 4 เทา ดงนนดวยเหตผลดงกลาวสนามแรงของ Martini จงเหมาะสมกบงานวจยน

แบบจาลองกลมอะตอมของอนภาคนาโนทอง (CG model of AuNP) สาหรบแบบจาลองของอนภาคนาโนทองจะ

สอดคลองกบสนามแรงของ Martini ซงโครงสรางของอนภาคนาโนทองจะเปนแบบ face center cubic (FCC) และม

ระยะหางระหวางอะตอมเปน 0.408 นาโนเมตร ซงสอดคลองกบคาคงทระยะหางแลตทซ (lattice constant) ของอนภาค

นาโนทอง สาหรบอนภาคนาโนทองทใชในการศกษามขนาด 6 ขนาดซงประกอบดวย 0.82, 2, 4, 6, 8 และ 10 นาโน

เมตร ซงสอดคลองกบจานวนอะตอม 19 249 1,958 6,699 15,707 และ 30,887 ตามลาดบ และคาคงทตาง ๆ ของ

สนามแรงของอนภาคนาโนทองสอดคลองกบงานวจยของ Lin และคณะ (Lin JQ et al., 2010) ซงไดมการปรบเทยบกบ

ผลการทดลอง และอนภาคนาโนทองใชเปนแบบอะตอม (1:1 mapping) และใชพารามเตอร C5 ซงมคา 3.5ε = กโลจล

ตอโมล และ 0.47σ = นาโนเมตร คาคงทเหลานถกนามาใชอธบายพฤตกรรมของออนภาคนาโนทอง

แบบจาลองเซลลเมมเบรน (Cell membrane models) สาหรบในงานวจยนเพอเปรยบเทยงผลของความซบซอน

ของเซลลเมมเบรนตอการเขาสเซลลของอนภาคนาโนทองไดศกษาเชงเปรยบเทยบในเยอหมเซลล 2 แบบ คอ

แบบจาลองเซลลเมมเบรนอยางงาย และแบบจาลองพลาสมาเมมเบรน ซงแบบจาลองเมมเบรนอยางงาย ใชแบบจาลอง

เซลลเมมเบรนทมประจสทธบนพนผวเปนลบในอตราสวน 3:1 ของ distearoyl phosphatidyl choline (DSPC) มประจ

เปนกลาง และ distearoyl phosphatidyl glycerol (DSPG) มประจเปนลบ และมความสมมาตรดงภาพท 1 (ก) สาหรบ

แบบจาลองของพลาสมาเมมเบรนประกอบไปดวยลพดจานวน 63 ชนด และคอเลสเตอรอลทความเขมขน 30 mol%

ซงเปรยบเทยบระหวางลพดชนบน (outer leaflet) และลพดชนลาง (inner leaflet) จะไมมความสมมาตร ดงแสดงในภาพ

ท 1 (ข) สาหรบลพดทมประจประกอบดวย phosphatidylinostitol (PI) PI-phosphate PI-bisphosphate PI-trisphosphate

(PIPs) และ phosphatidylserine (PS) ซงเปนสวนประกอบของเมมเบรนชนลาง สวนลพดชนด glycolipids (GM) เปน

สวนประกอบของเมมเบรนดานบน ลพดทมประเปนจกลาง (zwitterionic lipid) เ ชน sphingomyelin (SM)

phosphatidylethanolamine (PE) และ phosphatidylcholines (PC) ซงเปนสวนประกอบของพลาสมาเมมเบรนทงชนบน

และชนลาง และลพดทมประจเปนกลางซงเปนสวนประกอบทงพลาสมาเมมเบรนชนบนและชนลาง ซงประกอบดวย

ceramide (CER) diacylglycerol (DAG lysophosphatidylcholine (LPC) และพลาสมาเมมเบรนมประจสทธเปนลบ ซง

ภาพท 1 แบบจาลองเซลลเมมเบรนระหวาง (ก) แบบจาลองเมมเบรนอยางงาย (DSPC:DSPG) และ (ข) แบบจาลอง

พลาสมาเมมเบรน

16

SDO2-5

แบบจาลองพลาสมาเมมเบรนทใชในการศกษาในงานวจยนใชจากแบบจาลองของ Martini http://cgmartini.nl. ซง

รายละเอยดตาง ๆ ในการจาลองพลาสมาเมมเบรนสามารถอานไดท (Ingolfsson et al., 2014) และในงานวจยน

ประกอบดวยลพดทงหมด ~7000 ลพด น า ~700000 โมเลกล Na+ ~3000 และ Cl- ~2000 ไอออน ซงจานวนอะตอมท

ใชในการศกษาแตละขนาดมากกวา 712000 อนภาค และขนาดของกลองทใชศกษาคอ 40x40x50 nm3

รายละเอยดของการคานวณ (simulation details) อนภาคนาโนทองจะถกวางไวดานบนของเซลลเมมเบรนทระยะ

~10 นาโนเมตร ในการจาลองใชเทคนค NPT ensemble จาลองระบบทอณหภม 310 เคลวน โดยใชเทคนด Berendsen

barostat คาคงทไดอเลกทรก (dielectric constant) 15ε = อนตรกรยาทางไฟฟา (electrostatic interaction) คานวณ

โดยวธ Fast Particle Meah Ewald (PME) และอนตรกรยา van de Waals ใชการพจารณาอะตอมในรศม 1.2 และ 1.4 นา

โนเมตร ตามลาดบ สาหรบการศกษาเราใชเทคนค Steered MD โดยการผลกใหอนภาคนาโนทองเคลอนผานเซลลเมม

เบรน ในทศทาง z โดยใชแรงคงท 1000 กโลจลตอโมลตอนาโนเมตร และในงานวจยนศกษาพลวตเชงโมเลกลดวย

โปรแกรม GROMACS 5.0.7 (Van Der Spoel et al., 2005) และทาการวเคราะหผลทางรปภาพจาก Visual Molecular

Dynamics (VMD) (Humphrey et al., 1996)

การคานวณศกยของแรงเฉลย (Potential of mean force : PMF) ดวยเทคนค Umbrella sampling สาหรบ

การศกษาการเขาสเซลลของอนภาคนาโนทองโดยระยะทางอนภาคนาโนทองทเคลอนทผานเซลลเมมเบรนประมาณ 25

นาโนเมตร ในทศทาง z ซงอนภาคนาโนทองจะถกผลกใหเคลอนทดวยอตรา 0.0002 นาโนเมตรตอพโควนาท ดวยแรง

1000 กโลจลตอโมลตอตารางนาโนเมตรเพอใหอนภาคนาโนทองเคลอนทผานเยอหมเซลล (Gupta et al., 2017; Gupta

et al., 2016) สาหรบการคานวณพลงงานอสระ (PMF) จะเลอกตาแหนงของอนภาคทองหางจากเซลลเมมเบรนทละ 0.02

นาโนเมตรและนาตาแหนงมาคานวณพลงงานดวยเทคนค umbrella sampling โดยแตละตาแหนงคานวณ 1 นาโนวนาท

ในการคานวณใชอณหภม 310 เคลวน โดยใชเทคนค Nose-Hoover อนตรกรยาทางไฟฟาคานวณโดยวธ PME และ

อนตรกรยา van de Waals ใชการพจารณาอะตอมในรศม 0-1.2 นาโนเมตร และวเคราะหผลเพอใหไดกราฟ PMF โดยใช

เทคนค The weighted histogram analysis สาหรบการคานวณการเขาสเซลลโดยพจารณาทฤษฏทรานซซนเตท

(transition state theory) (Nangia et al., 2012; Mhashal et al., 2016) โดยจะมกาแพงพลงงานซงพจารณาจากตาแหนงท

มคาพลงงานตาสดและสงสดทไดจากกราฟ PMF ใชคานวณอตราการเขาสเซลล (the rate constants of internalization)

ดงแสดงในสมการท (5)

B

B

(z)expk T Gkh k T

∆= −

(5)

เมอ T คออณหภม Bk คาคงทโบลทซมนน (Boltzmann constant) h คาคงทของพลงค (Planck’s constant) (z)G∆

กาแพงพลงงานอสระ หลงจากนนกสามารถคานวณหาเวลา 12

t ของการเขาสเซลลไดดงสมการท (6)

12

0.693tk

= (6)

ผลการวจย

ผลของความซบซอนของเมมเบรนในการทาอนตรกรยาระหวางอนภาคนาโนทอง กบเซลลเมมเบรน ซงในงานวจยนได

ทาการศกษาการเขาสเซลลของอนภาคนาโนทองผานเยอหมเซลล 2 ชนด คอเซลลเมมเบรนอยางงาย โดย แบบจาลองลพดใน

อตราสวน 3:1 ของลพดชนด DSPC (ประจกลาง) และ DSPC (ประจลบ) กบพลาสมาเมมเบน ทมความซบซอน ใชลพด

ทงหมด 63 ชนดและมความไมสมมาตรระหวางลพดชนบนและชนลางของเซลลเมมเบรน

17

SDO2-6

สาหรบพลงงานอสระ (free energy) ของการเขาสเซลลของอนภาคนาโนทองผานเซลลเมมเบรนของแบบจาลองทง 2

ชนด ดงแสดงในภาพท 2 ซงแสดงพลงงานอสระของอนภาคนาโนทองและระยะหางระหวางจดกงกลางของอนภาคนาโน

ทองกบจดกงกลางของเซลลเมมเบรน สาหรบจดกงกลางของเซลลเมมเบรนท z = 0 พบวาอนภาคทองขณะทผานเซลลเมม

เบรนทง 2 แบบจาลองจะมพลงงานอสระแตกตางกนทง 0.82 และ 2 นาโนเมตร สาหรบทองทมขนาด 0.82 นาโนเมตรเมอ

เคลอนทผานเยอหมเซลลจะทาใหเมมเบรนเสยสภาพนอยหรอไมมความเสยหาย กราฟพลงงานอสระทเกดขนจะมความ

สมมาตรทงชวงกอนเขาสเซลลเมมเบรน (z>0) และชวงหลงออกจากเซลล (z<0) ดงแสดงในภาพท 2 (ก) และ (ค) และมความ

สมมาตรของกราฟพลงงานอสระไดชดเจนในแบบจาลองพลาสเมมเบรน (ภาพท 2 (ค)) ดงนนกราฟพลงงานอสระของ

อนภาคนาโนทอง ณ ตาแหนงทมพลงงานตาสดท z~2.0 (s1) และ -2.2 (s4) นาโนเมตรสาหรบเซลลเมมเบรนอยางงาย และ

z~2.2 (p1) และ -2.2 (p4) นาโนเมตร สาหรบพลาสมาเมมเบรน ซงอธบายไดวาอนภาคนาโนทองทมสมบตเปนกงชอบน ายง

มความชอบทจะอยบนพนผวของเซลลเมมเบรนและจะมพลงงานอสระสงเมออนภาคนาโนทองอยบรเวณกงกลางของเซลล

เมมเบรนเนองจากอนภาคนาโนทองเคลอนทจากบรเวณทชอบน ามายงบรเวณทไมชอบน า

อนภาคนาโนทองทมขนาด 2 นาโนเมตร ขณะทผานเซลลเมมเบรนทง 2 แบบจาลองจะมพลงงานอสระแตกตางกนอยาง

มนยสาคญ พจารณาแบบจาลองอยางงาย (DSPC/DSPG) อนภาคนาโนทองจะมกาแพงพลงงาน (free energy barrier) 3

ตาแหนงดวยกน คอ ท 2.46 7.06z = − − และ 8.88− นาโนเมตร ซงสอดคลองกบพลงงานท 43.74 4.70±

28.61 5.50± และ 25.42 7.03± กโลจลตอโมล ตามลาดบ สาหรบกราฟของพลงงานอสระจะมตาแหนงทมพลงงาน

อสระสงสด คอ S1 ท 3.60z = นาโนเมตร และกมพลงงานอสระตาทสด ณ ตาแหนงกอนทอนภาคนาโนทองจะเขาส

เซลลทเวลา

ภาพท 2 แสดงพลงงานอสระ (PMF) ของอนภาคนาโนทอง ขนาด 0.82 ((ก) และ (ค)) และ 2 ((ข) และ (ง)) นาโนเมตร

ผานแบบจาลองเยอหมเซลล 2 ชนด คอ (ก) และ (ข) เมมเบรนอยางงาย (DSPC/DSPG) และ (ค) และ (ง)

พลาสมาเมมเบรน และแสดงภาพทสอดคลองกบกราฟพลงงานทเวลาตาง ๆ

18

SDO2-7

23.85 นาโนวนาท ดงแสดงในภาพท 2 (ข) สวนตาแหนงทมพลงงานอสระสงทสด S2 ทเวลา 51.60 นาโนวนาทเปนตาแหนง

ทอนภาคนาโนจะหลดออกจากเซลล สาหรบแบบจาลองพลาสมาเมมเบรน รปรางของกราฟพลงงานอสระจะมความแตกตาง

จากแบบจาลองเมนเบรนอยางงาย ซงจากการสงเกตพบวามกาแพงพลงงานอสระเทากบ 260 6.04± กโลจลตอโมล ท

ตาแหนง 14.87z = นาโนเมตร กอนทอนภาคนาโนทองจะผานเซลลเมมเบรน จะมพลงงานอสระลดลงทตาแหนง P1 ซง

อนภาคนาโนทองเคลอนทมาจากบรเวณทเปนน ามาทพนผวของพลาสมาเมมเบรน และกจะมพลงงานสงขนเมออนภาคนา

โนทองแทรกเขาไปในพลาสมาเมมเบรน ซงผลทไดจะมลกษณะของกราฟพลงงานอสระคลายกบแบบจาลองเมมเบรนอยาง

งาย แตจะมพลงงานอสระสงกวาเมมเบรน อยางงายเนองจากพนผวของอนภาคนาโนทองมสมบตกงชอบน า จงทาให

ตาแหนงดงกลาวเปนจดตาสดของกราฟพลง งานอสระซงพบ 2 ตาแหนง ณ บรเวณพนผวของเซลลเมมเบรนทมสมบตชอบ

น าเหมอนกน ซงพบทเวลา 23.85 (S1) และ 52.30 (S3) นาโนเมตร ดงแสดงในภาพท 2 (ข) สวนจดททาใหคาพลงงานอสระ

สงสดคอตาแหนงทอยกงกลางของเซลลเมมเบรน ซงเปนบรเวณสวนหางของลพดทมสมบตไมชอบน าซงการทอนภาคนา

โนทองเคลอนทผานบรเวณทชอบน ามาบรเวณทไมชอบน าจงทาใหพลงงานอสระสง ในทางตรงกนขามกราฟพลงงาน

อสระของพลาสมาเมมเบรนจะมความแตกตางเพราะมสวนประกอบของคอเลสเตอรอลซงเปนสวนประกอบหลกของเยอหม

เซลล มผลทาใหรปแบบของกราฟพลงงานอสระแตกตางจากเมมเบรนอยางงาย ซงในแบบจาลองจะมการเพมคอเลสเตอรอล

เขาไปทงในสวนของชนบนและชนลาง ดงนนจงไมพบตาแหนงทมพลงงานอสระตา ณ บรเวณของสวนหางของลพดใน

พลาสมาเมมเบรน

ผลการคานวณอตราการเขาสเซลลและเวลาในการเขาสเซลลของอนภาคนาโนทองแสดงในตารางท 1 ซงถกคานวณ

ดวยสมการ (5) และ (6) จากผลการคานวณแสดงใหเหนถงผลของขนาดของอนภาคนาโนทองตอการเคลอนทเขาสเซลลและ

ผานแบบจาลองเยอหมเซลลแตกตางกน ซงผลการศกษาสอดคลองกบการทดลองการเขาสเซลลของอนภาคนาโนทองทม

ขนาดเลกกวา 10 นาโนเมตร (Nangia et al., 2012) จากตารางท 1 แสดงเวลาในการเขาสเซลลของ อนภาคนาโนทองขนาด

0.82 และ 2 นาโนเมตรเทากบ 111.0 10−× และ 64.1 10−× วนาท สาหรบเซลลเมมเบรนอยางงาย และเปรยบเทยบกบ

พลาสมาเมมเบรนเทากบ 102.3 10−× และ 323.0 10× วนาทตามลาดบ จากผลการศกษานแสดงใหเหนวาขนาดของอนภาค

นาโนทองและแบบจาลองของเซลลเมมเบรนมผลตอการเขาสเซลล

ตารางท 1 ตารางแสดงกาแพงพลงงานอสระ (kJ/mol) คาคงทการเขาสเซลล (s-1) และเวลาในการเขาสเซลลของอนภาคนา

โนทองขนาด 0.82 และ 2 นาโนเมตร ผานแบบจาลองเยอหมเซลลอยางงายและพลาสมาเมมเบรน

อนภาคนาโนทอง กาแพงพลงงานอสระ (Barrier)

(kJ/mol)

อตราการเขาสเซลล (k)

(s-1)

เวลาในการเขาสเซลล (t1/2)

(s)

เมมเบรนอยางงาย

0.82 nm

2 nm

11.24 3.33±

43.47 4.70±

106.9 10× 51.7 10×

111.0 10−× 64.1 10−×

พลาสมาเมมเบรน

0.82 nm

2 nm

19.06 4.81±

260.85 6.04±

93.0 10×

332.3 10−×

102.3 10−×

323.0 10×

19

SDO2-8

จากการศกษาของ Ingolfsson และคณะ (Ingolfsson et al., 2017) ไดรายงานวาถาความซบซอนและตาแหนงของพลาสมา

เมมเบรนมการเปลยนแปลงจะสงผลโดยรวมตอสมบตของพลาสมาเมมเบรน เชน การเคลอนไหว (dynamics) และความเปน

ระเบยบของเซลลเมมเบรน การเปลยนแปลงสมบตของเมมเบรนเนองจากความเขมขนของคอเลสเตอรอลทเพมขนสงผล

โดยตรงตอการเรยงตวของเมมเบรน (the sol-called condensing effect) และการเรยงตวของสายไฮโครคารบอน (the so-called

ordering effect) (Rog et al., 2009; Rog et al., 2003; Berkowitz et al., 2009; Pendit et al., 2009) นอกจากนคอเลสเตอรอลยง

สงผลถงความหนาของเมมเบรน (thickness) และความแขงแรงของเมมเบรน ซงปองกนการเกดชองวางระหวางเมมเบรน และ

การเปลยนรปรางของเมมเบรน (membrane deformations) ดงนนจงสรปวาพลงงานอสระทสงขนในแบบจาลองพลาสมาเมม

เบรนเปนผลมาจากคอเลสเตอรอล และสงผลใหความสามารถในการเขาสเซลลลดลง จากกราฟพลงงานอสระสามารถสรป

การเขาสเซลลของอนภาคนาโนทองได 2 ขนตอน ในชวงแรกอนภาคนาโนทองจะทาอนตรกรยากบพนผวของเซลลเมม

เบรน ในขณะทพลงงานอสระ ณ ตาแหนงนจะสงผลใหมคาตา (S1 และ P1 สาหรบแบบจาลองเมมเบรนอยางงายและ

พลาสมาเมมเบรน ตามลาดบ) และขนทสอง กราฟพลงงานอสระจะแสดงมคาสงสดเมออนภาคนาโนทองกาลงหลดออกจาก

เมมเบรน (S2 และ P3 ในภาพท 2 (ข) และ (ง))

ภาพท 3 รปแบบการเขาสเซลลของอนภาคนาโนทองทขนาด 2 – 10 นาโนเมตร ผานเยอหมเซลลอยางงาย

(DSPC/DSPG) ทเวลาตางๆ (ก) 2 นาโนเมตร (ข) 4 นาโนเมตร (ค) 6 นาโนเมตรเมตร (ง) 8 นาโนเมตร และ

(จ) 10 นาโนเมตร

20

SDO2-9

ภาพท 4 รปแบบการเขาสเซลลของอนภาคนาโนทองทขนาด 2 – 10 นาโนเมตร ผานเยอหมเซลลพลาสมาเมมเบรนท

เวลาตางๆ (ก) 2 นาโนเมตร (ข) 4 นาโนเมตร (ค) 6 นาโนเมตรเมตร (ง) 8 นาโนเมตร และ (จ) 10 นาโนเมตร

นอกจากความแตกตางของพลงงานอสระ ความซบซอนของเมมเบรนสงผลตอรปแบบการเขาสเซลล (uptake pathways)

ของอนภาคนาโนทอง การเขาสเซลลของอนภาคนาโนทองสามารถเกดขนผาน 2 กระบวนการ คอ กระบวนการเขาสเซลล

แบบแพร (direct translocation) และเอนโดไซโทซส (endocytosis) โดยกระบวนการเอนโดไซโทซส เมมเบรนจะมการเปลยน

รปโดยการงอกยนออกมา หรอโคงเพอพยายามหอหมอนภาคนาโนทอง สาหรบอนภาคนาโนทองทมขนาดเลก (2-8 นาโน

เมตร) จะมการเขาสเซลลแบบแพรหรอแบบแทรก ดงแสดงในภาพท 3 และ 4 ซงแสดงรปแบบการเขาสเซลลของอนภาคนา

โนทองทมขนาดแตกตางกนทงแบบจาลองเมมเบรนอยางงายและพลาสมาเมมเบรน สาหรบอนภาคทมขนาด 2 นาโนเมตร

จะสามารถเขาสเซลลไดเรวและงาย กวาอนภาคนาโนทองทมขนาดใหญ โดยทจะเรมทาอนตรกรยากบเซลลเมมเบรนทเวลา

12 และ 20 นาโนวนาท และกจะสรางร เพอแทรกผานเซลลเมมเบรน โดยใชเวลา 22 และ 42 นาโนวนาท สาหรบ เมมเบรนอ

ยางงายและพลาสมาเมมเบรน ตามลาดบ เมออนภาคมขนาดทใหญขน 4-8 นาโนเมตร จากการสงเกต สามารถสรปไดวาจะ

ผานเขาสเซลลเมมเบรนแบบกงเอนโดไซโทซส (semi-endocytosis)

กระบวนการเขาสเซลลของอนภาคทมขนาด 10 นาโนเมตร โดยอนภาคนาโนจะถกวางอยเหนอเมมเบรน จากนน

อนภาคนาโนจะเรมทาปฏกรยากบเซลลเมมเบรน ทาใหเซลลเมมเบรนเรมเปลยนรปรางยนออกเพอปรบตวในการเขาสเซลล

สาหรบเมมเบรนอยางงายเมออนภาคนาโนทองพยายามเขาสเซลลทาใหเมมเบรนโคงงอ จนกระทงเวลา 118 นาโนวนาท

21

SDO2-10

เซลลเมมเบรนจะมลกษณะคลายคอขวดทมขนาดเลกดงแสดงในภาพท 3 (จ) หลงจากนนเมมเบรนกจะขาดทเวลา 122 นาโน

วนาท ทาใหเกดเปนถง (vesicle) หอหมอนภาคนาโนทอง หรอ เอนโดโซม (endosome) เรยกกระบวนการนวา เอนโดไซโท

ซส และสาหรบพลาสมาเมมเบรนรปแบบการเขาสเซลลจะแตกตางจากเมมเบรนอยางงาย จากภาพท 4 (จ) แสดงใหเหนวา

อนภาคนาโนทองจะมการทาลายเซลลเมมเบรน ทาใหฉกขาดซงผลทาใหเกดชองวางระหวางพลาสมาเมมเบรน ทเวลา 30 นา

โนวนาท และอนภาคนาโนกผานเขาสเซลลโดยกระบวนการแทรกผานเซลลเมมเบรน ซงกระบวนการเขาสเซลลแบบเอนโด

ไซโทซสไมสามารถเกดขนกบพลาสมาเมมเบรน ซงโมเลกลของคอเลสเตอรอลมบทบาทสาคญตอความแขงแรงของเมม

เบรนและควบคมกลไกการเขาสเซลล (Sun et al., 2014; Bennett et al., 2009) ดงนนความแขงของพลาสมาเมมเบรน จงมคา

มากกวาเมมเบรนอยางงาย ซงสดทายเราสามารถสรปไดวาความซบซอนของเมมเบรนมผลโดยตรงตอรปแบบการเขาสเซลล

ของอนภาคนาโนทอง

อภปรายและสรปผลการวจย

การศกษาอนตรกรยาของอนภาคนาโนทองและเซลลเมมเบรนโดยใชเทคนคแบบกลมอะตอม (coarse-grained

molecular dynamic simulation) เพอศกษาผลของขนาดอนภาคนาโนทอง (2-10 นาโนเมตร) ตอการเขาสเซลล และ

แบบจาลองของเมมเบรนทมความซบซอนแตกตางกน ซงเราสามารถจาแนกรปแบบการเขาสเซลลเปน 3 แบบ ดงน 1)

การเขาสเซลลแบบแพรหรอแทรก (direct translocation) 2) กงเอนโดไซโทซส (semi-endocytosis) และ 3) เอนโดไซโท

ซส (endocytosis) สาหรบอนภาคทมขนาด 10 นาโนเมตร รปแบบการเขาสเซลลจะแตกตางกน โดยท เมมเบรนอยาง

งายเขาสเซลลแบบเอนโดไซโทซส และพลาสมาเมมเบรนเขาสเซลลแบบกงเอนโดไซโทซส ดงนนขนาดของอนภาคนา

โนทองและความซบซอนของเซลลเมมเบรนทใชศกษามบทบาทสาคญตอการควบคมกลไกการเขาสเซลล สาหรบ

การศกษานแสดงใหเหนถงความสมพนธระหวางการศกษาเชงคอมพวเตอรทสามารถออกแบบ หรออธบายกลไกการ

เขาสเซลลสาหรบการนาไปประยกตใชในดานชวการแพทยได

กตตกรรมประกาศ

ผวจยขอขอบคณทนวจยสาหรบคณาจารยบณฑตศกษา มหาวทยาลยขอนแกนทมอบทนการศกษา ขอขอบคณ

ศนยคอมพวเตอรสาหรบวจย มหาวทยาลยขอนแกน สาขาวชาฟสกส คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน ท

สนบสนนในการใชทรพยากรคอมพวเตอรเพอการวจยในครงน ขอขอบคณ ผชวยศาสตราจารย ดร.ธระพงษ พวงมะล

อาจารยทปรกษาโครงงานวจยเปนอยางสงทใหคาปรกษาและขอเสนอแนะตาง ๆ ในการทาวจย

เอกสารอางอง

Angelikopoulos P, Sarkisov L, Cournia Z, Gkeka P. Self-Assembly of anionic, ligand-coated nanoparticles in lipid

membranes. Nanoscale 2017; 9(3): 1040-1048.

Bennett WFD, MacCallum JL, Tieleman DP. Thermodynamic analysis of the effect of cholesterol on

dipalmitoylphosphatidylcholine lipid membranes. J. Am. Chem. Soc 2009; 131(5): 1972-1978.

Berkowitz ML. Detailed molecular dynamics simulations of model biological membranes containing cholesterol.

Biochim. Biophys. Acta 2009; 1788(1): 86-96.

Chithrani BD, Ghazani AA, Chan WCW. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake

into mammalian cells. Nano Letters 2006; 6(4): 662-668.

22

SDO2-11

Deserno M. Elastic deformation of a fluid membrane upon colloid binding. Phys. Rev. E 2004; 69(3):

031903-031903-14.

Ding HM, Tian WD, Ma YQ. Designing nanoparticle translocation through membranes by computer simulations.

ACS Nano 2012; 6(2): 1230-1238.

Ge Z, Li Q, Wang Y. Free energy calculation of nanodiamond-membrane association the effect of shape and surface

functionalization. J. Chem. Theory Comput 2014; 10(7): 2751-2758.

Ginzburg VV, Balijepalli S. Modeling the thermodynamics of their of nanoparticles with cell membranes. Nano Lett

2007; 7(12): 3716-3722.

Gupta R. Rai, B. Effect of size and surface charge of gold nanoparticles on their skin permeability: a molecular

dynamics study. Sci. Rep 2017; 7: 45292.

Gupta R, Rai B. Penetration of gold nanoparticles through human skin: unraveling its mechanisms at the molecular

scale. J. Phys. Chem. B 2016; 120(29): 7133-7142.

Heikkila E, Martinez-Seara H, Gurtovenko AA, Javanainen M, Hkkinen H, Vattulainen I, Akola J. Cationic Au

nanoparticle binding with plasma membrane-like lipid bilayers: potential mechanism for spontaneous

permeation to cells revealed by atomistic simulations. J. Phys. Chem. C 2014; 118(20): 11131-11141.

Huang K, Ma H, Liu J, Huo S, Kumar A, Wei T, Zhang X, Jin S, Gan Y, Wang PC, He S, Zhang X, Liang XJ. Size

dependent localization and penetration of ultrasmall gold nanoparticles in cancer cells, multicellular

spheroids, and tumors in vivo. ACS Nano 2012; 6(5): 4483-4493.

Humphrey W, Dalke A, Schulten K. VMD: Visual molecular dynamics. J. Mol. Graphics 1996; 14: 33-38.

Ingolfsson HI, Carpenter TS, Bhatia H, Bremer PT, Marrink SJ, Lightstone FC. Computational lipidomics of the

neuronal plasma membrane. Biophys. J 2017;113(10): 2271-2280.

Ingolfsson HI, Melo MN, van Derden FJ, Arnrez C, Lopez CA, Wassenaar TA, Periole X, de Vries AH, Tieleman

DP, Marrink SJ. Lipid organization of the plasma membrane. J. Am. Chem.Soc 2014; 136: 14554-14559.

Li X. Size and shape effects on receptor mediated endocytosis of nanoparticles. J. Appl. Phys. 2012; 111(2): 024702.

Lin JQ, Zhang HW, Chen Z, Zheng YG. Penetration of lipid membranes by gold nanoparticles: insights into cellular

uptake, cytotoxicity, and their relationship. ACS Nano 2010; 4(9): 5421-5429.

Lin JQ, Zheng YG, Zhang HW, Chen Z. A Simulation study on nanoscale holes generated by gold nanoparticles on

negative lipid bilayers. Langmuir 2011; 27(13): 8323-8332.

Marrink SJ, Risselada HJ, Yefimove S, Tieleman DP, de Vries AH. The MARTINI force field: coarse grained model

for biomolecular simulation. J.Phys.Chems B 2007; 111(27):7812-7824.

Mayer KM, Hafner JH. Localized surface plasmon resonance sensors. Chem. Rev 2011; 111(6): 3828-3857.

Mhashal AR, Roy S. Free energy bare and capped gold nanoparticles permeating through a lipid bilayer. Chem. Phys.

Chem 2016; 17(21): 3504-3514.

Nangia S, Sureshkumar R. Effects of nanoparticle charge and shape anisotropy on translocation through cell

membranes. Langmuir 2012; 28(51): 17666-17671.

23

SDO2-12

Pandit SA, Scott HL. Multiscale simulations of heterogeneous model membranes. Biochim. Biophys. Acta 2009;

1788(1); 136-148.

Perrault SD, Walkey C, Jennings T, Fischer HC, Chan WCW. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles

through design. Nano Letters;2009: 9(5), 1909-1915.

Potdar D, Sammalkorpi M. Asymmetric heat transfer from nanoparticles in lipid bilayers. Chem. Phys. 2015; 463:

22-29.

Quan X, Peng C, Zhao D, Li L, Fan J, Zhou J. Molecular understanding of the penetration of functionalized gold

nanoparticles into asymmetric membranes. Langmuir 2017; 33(1): 361-371.

Rog T, Pasenkiewicz-Gierula M, Vattulainen I, Karttunen M. Ordering effects of cholesterol and its analogues.

Biochim. Giophys. Acta 2009; 1788(1): 97-121.

Rog T, Pasenkiewicz-Gierula M. Effects of epicholesterol on the phosphatidylcholine bilayer: a molecular simulation

study. Biophys. J 2003; 84(3): 1818-1826.

Rossi G, Monticelli L. Gold nanoparticles in model biological membranes: a computational perspective. Biochim.

Biophys. Acta 2016; 1858(1): 2380-2389.

Salassi S, Simonelli F, Bochicchio D, Ferrando R, Rossi G. Au nanoparticles in lipid bilayers: a comparison between

atomistic and coarse-grained models. J. Phys. Chem. C 2017; 121(20): 10927-10935.

Simonelli F, Bochicchio D, Ferrando R, Rossi G. Monolayer-protected anionic Au nanoparticles walk into lipid

membranes step by step. J. Phys. Chem. Lett 2015; 6(16): 3175-3179.

Song B, Yuan H, Pham SV, Jameson CJ, Murad S. Nanoparticle permeation induces water penetration, ion

transport, and lipid flip-flop. Langmuir 2012; 28(49): 16989-17000.

Sun D, Lin X, Gu N. Cholesterol affects C60 translocation across lipid bilayers. Soft Matter 2014; 10(13):

2160-2168.

Van Der Spoel D, Lindahl E, Hess B, Groenhof G, Mark AE, Berendsen HJC. GROMACS: fast, flexible, and free.

J. Comput. Chem. 2005; 26(16): 1701-1718.

Vigderman L, Zubarev ER. Therapeutic platforms based on gold nanoparticles and their covalent conjugates with

drug molecules. Adv. Drug Delivery Rev. 2013; 65(5): 663-676.

Wang Y, Black KCL, Luehmann H, Li W, Zhang Y, Cai X, Wan D, Liu SY, Li M, Kim P, Li ZY, Wang LV, Liu Y,

Xia Y. Comparison study of gold nanohexapods, nanorods, and nanocages for photothermal cancer

treatment. ACS Nano 2013; 7(3): 2068-2077.

24