Unidad 2

REPLICACION DE ADN

Duplicación o Replicación del DNA

Debido a la temporalidad de los seres vivos, para que una

especie no se extinga ha de haber al menos un momento en el que la información biológica (características morfológicas y

fisiológicas) se replique y a partir de esas copias aparezcan

los descendientes.

La duplicación es la

capacidad que tiene el ADN

de hacer copias o réplicas

de su molécula. Este

proceso es fundamental

para la transferencia de la

información genética de

generación en generación.

Características de la replicación• Es semiconservativa - al final cada molécula de ADN

nueva presenta una cadena original y una cadena nueva.

• La replicación siempre se realiza adicionando

nucleótidos en dirección 5' → 3'

• Es semidiscontinua - en una de las cadenas se sintetizan filamentos bastante grandes y de forma continua, mientras que en la otra (cadena retardada) la síntesis es discontinua, ya que se van sintetizando fragmentos pequeños que se disponen de manera separada.

•  Es bidireccional - a partir de un punto dado, la duplicación progresa en dos direcciones.

• El proceso de duplicación del DNA es controlado enzimáticamente, asegurando así una alta fidelidad en la información que contiene la copia.

1. Replicación semiconservativaEl modelo semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953) proponía que el ADN de doble hélice separa sus dos cadenas y cada una sirve de molde para sintetizar una nueva siguiendo las reglas de complementariedad de las bases nitrogenadas. Dicho modelo fue demostrado por Meselson y Stahl en 1957, el nombre de semiconservativo, es debido a que las dos dobles hélices recién sintetizadas poseen una cadena vieja (una mitad vieja) y otra nueva (mitad nueva)

replicación

2. Adición de nucleótidos en dirección 5' → 3'

Unión a través del grupo fosfato del

nucleótido nuevo con el grupo hidroxilo (OH) libre del nucleótido

anterior

La enzima que cataliza la adición de los nucleótidos se denomina Polimerasa de ADN

Inicio de la replicación

• El sitio de inicio de la replicación (origen de replicación o replicón) consiste en secuencias específicas de nucleótidos reconocidas por proteínas específicas (polimerasas, helicasas, primasas).

• En el origen de replicación las cadenas que conforman la doble hélice son separadas y da inicio la replicación en ambas cadenas.

• A medida que la replicación continúa la horquilla de replicación se mueve a través del ADN.

Debido al antiparalelismo del ADN y a que las ADN polimerasas solamente sintetizan en la dirección 5'- 3', la síntesis de una de las cadenas se puede realizar de forma continua, mientras que la otra se sintetiza de manera discontinua (cadena retardada), a base de fragmentos cortos (fragmentos de Okazaki) .

3. Replicación semidiscontinua y asimétrica

cadena líder cadena

líder

cadena retardada

4. Replicación bidireccional A partir de un punto de origen progresa en dos direcciones opuestas, existiendo dos puntos de crecimiento u horquillas de replicación. Si se observan simultáneamente las dos horquillas de replicación, a un lado del origen la hélice de nueva síntesis se polimeriza de forma continua, mientras que al otro lado del origen se polimeriza de forma discontinua.

Cadena líder

Cadenaretardada

Las ADN polimerasas solamente sintetizan ADN en la dirección 5' – 3’.

Para que puedan iniciar la síntesis de ADN necesitan un extremo 3' OH al que ir añadiendo nucleótidos, y ese extremo lo suministra un ARN de tamaño pequeño que se denomina ARN cebador o "primer".

La síntesis de ADN comienza, por tanto, sintetizando un corto segmento de ARN denominado primer, el cual es sintetizado por una enzima denominada Primasa.

ADN

ADN primer ARN

3´ 5´

5´3´ - OH

cadena vieja

cadena nueva

La Primasa es una ARN polimerasa que utiliza como molde ADN.

Primasa actúa:

• 1 vez sobre la cadena líder (1 primer)

• Múltiples veces sobre la cadena retardada:

1 vez/fragmento Okazaki generado

Primer de RNA: 23-30 nucleótidos (E. coli)

10 nucleótidos (eucariotas)

Tasa error DnaG: 1/104nucleótidos

Los errores de ARN no son heredados porque el primer siempre es sustituido por ADN

Todos los fragmentos de Okazaki comienzan por un primer. Posteriormente, la ADN polimerasa III lleva a cabo la síntesis del fragmento de ADN correspondiente hasta llegar al siguiente primer.

En ese momento, la ADN polimerasa I sustituye a la polimerasa III. La ADN polimerasa I se encarga de retirar el ARN (primer) mediante su actividad exonucleotídica 5'- 3' OH y al mismo tiempo rellena el hueco sintetizando ADN.

Por último, los dos fragmentos de Okazaki tienen que unirse, por lo que es necesario enlazar el extremo 3'OH de un fragmento con el 5'P del siguiente fragmento. Dicha labor de sellado y unión de los sucesivos fragmentos la realiza la Ligasa.

Mecanismo de acción de las ligasas

unen fragmentos de ADN adyacentes a través de enlaces fosfodiester

Resumen de la síntesis de cadena retardada

Síntesis de primer RNA (primasa)

Extensión para formar fragmentos de Okazaki (Polimerasa III)

Síntesis de un nuevo fragmento de Okasaki

Remplazo del oligo de RNA por DNA (Polimerasa I)

Unión de los fragmentos (ligasa)

Otras proteínas involucradas en replicación

HelicasasEnzimas dependientes de ATP encargadas de separar la doble cadena, desempeñan un papel fundamental para que se puedan sintetizar los primers en la cadena retardada.

Proteínas de unión a ADN de cadena sencilla (SSB, single strand binding)

Previenen la formación de estructura secundaria y

apareamientos internos en la cadena sencilla (paterna), evita

el reensamblaje del dúplex mientras ocurre la síntesis de la

cadena hija. Además protege a la cadena sencilla del ataque

de nucleases. La unión de esta proteína favorece la unión de

las siguientes.

Problemas topológicos en la replicación

La separación de la doble hélice produce

superenrollamientos (enrollamientos del eje de la

doble hélice)

La “relajación” del superenrollamiento requiere roturas de la doble hélice

Topoisomerasas:Clase I y II

Topo I:Cortan 1 cadena DNATopo II:Cortan las 2 cadenas DNA

Topoisomerasa

Enlace covalente:5’P(DNA)-Tyr

Corte en una cadena, formar el

enlace ADN- fosfotirosina

topo1

ADN

Liberar tensión y

resellar las cadenas

Horquilla de replicación: Actividades participantes (Resumen)

(Eliminación primer,Síntesis relleno)

(Síntesis del RNA primer)

(Mantenimiento de lascadenas separadas)

Desenrollamiento doble hélice(topoisomerasa)

Separación de las cadenas (helicasas)

Previenen la formación de estructura secundaria (prot. de unión a cadena sencilla)

Primosoma - unión de helicasa y primasa en cadena retrasada

cadena líder

cadena retardada

Primasa

Polimerasa III

Polimerasa I

Ligasa

MODELOS DE REPLICACIÓN CONSERVATIVO Y DISPERSIVO

Modelo Conservativo: cuando el ADN doble hélice se replica se producen dos dobles hélices, una de ellas tiene las dos hebras viejas (está intacta, se conserva) y la otra doble hélice posee ambas hebras de nueva síntesis.

Modelo Dispersivo: Cuando el ADN doble hélice se replica se originan dos dobles hélices, cada una de ellas con hebras que poseen tramos viejos y tramos de nueva síntesis en diferentes proporciones.

semiconservativo

conservativo dispersivo

Tarea:

Recapitulando…..• La replicación es la capacidad que tiene el ADN de

hacer copias de su molécula.

• Es un proceso de alta fidelidad (casi no se cometen errores).

menos de 1 error/109 nucleótidos

• El replicón es la unidad del ADN en la cual ocurren actos individuales de replicación. El replicón contiene un origen donde comienza la replicación y un final donde ésta se detiene, además contiene todos los elementos de control necesarios. para la

• La replicación es semiconservativa, semidiscontinua, bidireccional y siempre ocurre en dirección 5‘→ 3‘.

• Durante el proceso de replicación intervienen diversas enzimas: Topoisomerasas, Helicasas, Prot. de unión a cadena sencilla, Primasas, Polimerasas de ADN y Ligasas.

cadena retardada Cadena líder

Polimerasas en E. coliDNA POLIMERASA I1. Actividad polimerasa (síntesis en dirección 5’3’)

2. Actividad correctora (revisora) por su función de exonucleasa (remoción de nucleótidos erróneos).

3. Actividad reparadora, retira los primers de ARN (función de exonucleasa) y rellena el hueco con su actividad de polimerasa.

 DNA POLIMERASA IIActividad correctora , el papel que juega en la replicación del ADN es desconocido.

DNA POLIMERASA IIIEs la enzima que realiza la mayoría de la replicación del ADN, el corazón catalítico del enzima lo constituyen las subunidades a (encargada de la polimerización), e (realiza la función correctora de pruebas) y q (ensamblaje de las subunidades?).

  ADN Pol I ADN Pol II ADN Pol III

Estructura PM (dalton)

Constitución

Nº Polimerasas/célula

  109.000

Monómero

400

  90.000

Monómero

Desconocido

  900.000

Multímero

asimétrico

10-20

Actividad/Función

Polimerasa 5'-3' /Elongación

Exonucleasa

3'-5'/Correctora

Exonucleasa

5'-3'/Reparación

SI

SI

SI

 SI

SI

NO

 SI

SI

NO

Las principales características de las ADN Polimerasas de E. coli, se pueden resumir en la siguiente tabla:

El proceso de síntesis de ADN tiene que producir dos moléculas

exactamente iguales, cualquier error que se cometa se

convertirá en una mutación. Las ADN polimerasas deben ser

bastante fieles copiando el ADN. Para ello poseen una función

correctora de pruebas que retira el último nucleótido introducido

de forma incorrecta. Esta función se realiza debido a la actividad

de exonucleasa 3´– 5´.

Función correctora (actividad exonucleasa 3´- 5´)

G

T

cadena templad

o

errorapareamient

o

Sitio actividad exonucleasa

3´ -- 5´

Polimerasa ADN (I, II y III)

Actividad polimerasaFunción elongación

Actividad exonucleasa (3´)

Función correctora

Posee muchas cadenas o subunidades polipeptídicas. Es un dímero asimétrico, una mitad del dímero se encarga de sintetizar la cadena retardada y la otra mitad sintetiza la cadena líder. El corazón catalítico lo conforman las subunidades a(alfa), e (épsilon) y q (teta). La subunidad t (tao) interviene en la unión del dímero. El complejo g- d (gama-delta) produce la unión al ADN molde. La subunidad b (beta) sujeta la enzima al ADN.

ADN Polimerasa III (E. coli)

La tendencia de la enzima a permanecer unida al molde en lugar de disociarse y reasociarse se le conoce como procesividad. Se puede definir como el numero de nucleótidos incorporados por evento de unión entre la enzima y el DNA. Se considera que la estructura tipo rosca que forma la subunidad b de la polimerasa III desempeña un papel clave en la procesividad de la enzima.

Como regla general el incremento en la procesividad disminuye la probabilidad de reducir errores.

Replicación en E. coli (I)Enzimas que participan en la iniciación: • Dna B (helicasa – separa las dos cadenas)• SSB (Prot de unión a cadena sencilla –

evita la formación de estructura secundaria y reensamblaje del duplex)

• Dna G (primasa – síntesis de primer ARN)• Topo I, III y girasa (topoisomerasas -

libera estrés torcional generado por el desenrrollamiento de la cadena de ADN)

• Otras enzimas Dna A - reconoce el origen de replicación y contribuye a separar las cadenas. Dna C - actúa conjuntamente con la DNA B

Enzimas que participan en el alargamiento: DNA polimerasa I y IIILigasa – unión de los fragmentos de Okazaki

Enzimas que participan en la terminación: • TUS - frena a la horquilla de replicación

mediante una actividad contrahelicasa

Una vez que ha comenzado la replicación, las dos horquillas de replicación avanzan en sentidos opuestos y con una misma velocidad, hasta encontrarse en un punto diametralmente opuesto a origen (OriC ) donde se desensambla el complejo de replicación.

Existen además sitios específicos de terminación (sitios Ter) que son reconocidas por la proteína Tus (Terminus Utilization Substance). La unión de la proteína Tus a la secuencia frena a la horquilla de replicación correspondiente mediante una actividad contrahelicasa, (inhibe a la DnaB).

Terminación de la replicación

Replicación en E. coli (II)

El origen de replicación en E. coli (Ori C) tiene 245 pb

de longitud, 3 secuencias (13pb) y 4 secuencias (9pb) casi idénticas repetidas en

tandem

Replicación en eucariotas

• Velocidad de alargamiento: La velocidad de polimerización en eucariotas es mucho menor que en procariotas

E. coli = 500 nt/s levaduras = 60 nt/s; Drosophila = 40 nt/s y ratón = 30 nt/s

• Origen de replicación: En eucariotas existen múltiples replicones (múltiples orígenes de replicación)

levadura = 500, Drosophila = 3500, ratón = 25000 y plantas = 35000

• En eucariotas la división celular tiene lugar una vez que el ADN se ha replicado, dicha replicación tiene lugar durante la fase S del ciclo celular (8 h aproximadamente)

• En eucariotas los fragmentos de Okazaki son más cortos Procariotas =1000 a 2000 nucleótidosEucariotas = 100 a 200 nucleótidos

• El control es más complejo

origen origen

horquilla de replicación

burbuja de replicación

replicón replicón

burbuja de replicación

Ori C

Número de orígenes de replicaciónEscherichia coli 1 origen de replicación

Saccharomyces cerevisiae 300 orígenes de replicación

Células humanas 20 000 orígenes de replicación

Función E. coli SV40Helicasa DnaB Antígeno T (Tag)

Evitar formación de estructura secundaria

SSB Factor de replicación A (RFA)

Primasa DnaG Primasa

Incrementar procesividad Subunidad b de la polimerasa DNA III

PCNA

Elongación Polimerasa DNA III Pol a (cadena retrasada)Pol d (cadena líder)

Polimerasas en eucariotesPara la replicación de ADN en células eucariotas se utilizan dos polimerasas diferentes, una para sintetizar la hélice conductora y otra para producir la hélice retardada. La ADN polimerasa a sintetiza la cadena retardada mientras que la ADN polimerasa d sintetiza la cadena líder, ambas enzimas tienen función correctora (exonuleasas 3´– 5´).

ENZIMA FUNCIÓN

Pol a(alfa)

Síntesis cadena retardada. Asociada a la primasa (síntesis del cebador)

Pol d(delta)

Síntesis de la cadena líder

Pol e(epsilon)

Síntesis cadena líder en algunas especies

Pol b(beta)

Polimeriza huecos pequeños (20 nucleótidos) , acción reparadora

Pol g(gamma)

Síntesis ADN mitocondrial

Control de la Replicación durante el ciclo celularEl control de la replicación está íntimamente ligado al ciclo celular, cada célula hija ha de tener la misma cantidad de DNA que la madre.

Debe haber un acoplamiento entre replicación y división celular de manera que solo puede iniciarse una ronda de replicación por división celular.

Deben existir controles para que:• Solo ocurra replicación en la fase S.• Determinar cuantos orígenes estén activados a la misma vez.• Los orígenes de replicación que se están activando lo hagan siguiendo un patrón determinado para cada tipo de célula (primero se activan unos, luego otros).

Primero se replica la cromatina activa (menos condensada ) y al final la heterocromatina o forma inactiva (fuertemente empaquetada )

1. En la fase G1 se comprueba que las condiciones ambientales son favorables y le permiten continuar a fase S.

2. En G2 es donde se comprueba que la célula esta bien, que el DNA se ha replicado completa y correctamente y la célula entra en mitosis. La célula no se divide hasta que se asegura que la descendencia va a estar en condiciones adecuadas.

Las cinasas dependientes de ciclina (CDKs) y las ciclinas son proteínas que controlan puntos clave de regulación en la fase G1 y en las fase G2 (el comienzo de la fase M o de la fase S).

La ciclinas se unen a las CDKs para activarlas. En su forma activa éstas disparan determinados mecanismos que están relacionados con el comienzo de la fase S o M. Los niveles de ciclinas, varían a lo largo del ciclo celular.

Ciclinas G1 (fase G1) ---- max (punto Start) da inicio de la fase SCiclinas G1 (fase s) y Ciclinas mitóticas ---- max da inicio de la fase M

Los cromosomas eucarióticos son moléculas de DNA lineales, con extremos especializados llamados telómeros (estructuras que confieren estabilidad al cromosoma).

Todas las polimerasas conocidas extienden la cadena de ADN en dirección 5’- 3’ y para iniciar la síntesis se requiere un primer.

La síntesis de la cadena líder se completa hasta el final, PERO, la cadena discontinua (retardada) se iría acortando en cada ronda de replicación debido la discontinuidad de su síntesis.

ADN

primer ARN

5´ 3´

3´5´ - OH

cadena vieja

cadena nueva

ADN

ADN

primer ARN

5´ 3´

3´5´ - OH

cadena vieja

cadena nueva

ADN

La enzima que evita este

acortamiento en las cromátidas

hijas en cada ciclo celular es

llamada telomerasa.

La telomerasa es un complejo de

ribonucleoproteina

(RNA+proteínas) que sintetiza

un fragmento de DNA a partir de

un RNA molde. Añaden en los

extremos 3´segmentos lineales

de ADN. No necesitan molde ya

que intrínsecamente poseen un

pequeño segmento de ARN.

GGGGTT GGGGTT GGGGTT GGGGTT

CCCCAA CCCCAA5´ …_3´ …_ 5´

3´

AACCCCAAC 5´3´

telomerasa

ARN molde

primasa

+

Este ARN de la enzima se posiciona sobre el ADN y a partir del extremo 3‘OH comienza la síntesis de secuencias en tandem TTGGGG. Una vez añadido algunos nucleótidos la enzima se transloca (actuando así como molde movible) para comenzar otra vez y así se van sintetizando las secuencias repetidas del telómero. Esto mecanismo permite el alargamiento del extremo protuberante 3’ OH.

Replicación de

• Plásmidos

• Virus (cadena doble, sencilla, lineales o

circulares)

• ADN mitocondrial

1. Algunas ADN polimerasas añaden la primera base (nucleótido) a un OH de proteínas específicas que se unen a los extremos de los cromosomas lineales.

2. Estas proteínas tienen como función el reconocimiento de los extremos cromosómicos.

3. Estas proteínas no son eliminadas y están covalentemente unidas en sus extremos 5’.

Elementos genéticos lineales

ADN lineal

círculo rodante

estructura q (teta) como en E. coli

circularización por extremos cohesivos

Circularización de los elementos lineales

Modelo replicativo tipo teta

Replicación bidireccional a

partir de un origen, da lugar

a intermediarios replicativos

que asemejan a la letra

griega q.

enzima de ruptura

ruptura

ruptura

punto de crecimiento

cadena desplazada

punto de crecimiento

una vuelta completa

(una revolución)

origen

Modelo replicativo del círculo rodante

ADN circular de cadena sencilla(Fago fX174)

ADN circular de cadena doble(Fago lamda)

forma replicativa

(doble cadena))

Procariotas Eucariotas

Modelo Escherichia coli Saccharomyces cerevisiaeSV40 (virus del simio)

Secuencias de reconocimiento

secuencias consenso de 9 y 13 pb (9-mers y 13-

mers)

secuencias consenso de 11 pb (levadura)

Velocidad de elongación (replicación)

Rápida 1000nt/s

Lenta 50nt/s

Origen de replicación Único (OriC) Múltiples (en levadura ARS, autonomously replicating

sequences)

Proteínas de inicio (reconocimiento al origen)

DnaA No identificadas

Primosoma Primasa + Helicasa (DnaB+DnaG)

Primasa + Polimerasa a (alfa)

Polimerasa (elongación)

Polimerasa III Polimerasa a (alfa) – cadena retrasada

Polimerasa d (delta) – cadena líder

Fragmentos de Okazaki

1000-2000 nucleótidos 100-200 nucleótidos

Primers de ARN 25 bases 10 bases

Control Menor Mayor – asociado a ciclo celular, dependiente de ciclinas y

cinasas

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La técnica de Reacción en Cadena de la

Polimerasa o PCR ( de sus siglas en inglés

Polymerase Chain Reaction) es una técnica

para la síntesis "in vitro" de secuencias

específicas de ADN.

Kary Mullis en 1983 presentó la PCR

Premio Nobel de Química (1993)

La técnica se basa en la replicación del ADN realizada por la ADN polimerasa. Esta enzima realiza la síntesis de una cadena complementaria de ADN (5´- 3´) usando un molde (cadena sencilla), a partir de una región de doble cadena. Para sintetizar la región dada se usan unos primers (iniciadores) que son complementarios a cada uno de los extremos 3´del fragmento de ADN que se desea amplificar.

Región de doble cadena de interés

molde de cadena sencilla (templado)

Primer 1

Primer 2

síntesis del fragmento por la

polimerasa

La reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas:

1. Desnaturalización del ADN doble cadena – separación de las dos cadenas por incubación a 93-97ºC. La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.

2. Hibridación de los primers (iniciadores) a cada una de las cadenas - los primers se unen a las zonas 3´ complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. La hibridación ocurre a una temperatura entre los 45-60º C (temperatura que favorece el apareamiento por complementariedad entre los primers y la cadena molde)

3. Extensión (elongación)- se produce la síntesis de una cadena sencilla en la dirección 5´- 3´ mediante la ADN polimerasa (produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad).

*El tamaño del fragmento a amplificar rige el tiempo necesario para la extensión.

Es importante no realizar un número alto de ciclos para evitar errores de replicación y productos no específicos. Procurar utilizar el menor número de ciclos posibles.

1 ciclo 94°C, 30 s – desnaturalización

45-60 °C, 30 s – alineamiento

72°C, 1 min –extensión (1000pb)*

A partir del ciclo 3 la

acumulación del ADN

ocurrirá en forma

exponencial

Después de 25 ciclos

(30 millones de veces)

Elementos que componen la reacción

Elementos esenciales:

DNA polimerasa termoestable

Un par de oligonucleótidos (primers)

dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

Cationes bivalentes: La concentración de Mg (MgCl2) resulta fundamental para la polimerasa. Además bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la reacción

Buffer (Tris-HCl pH 8.0)

Cationes monovalentes: concentraciones del ión K+ favorece la desnaturalización de secuencias cortasconcentraciones de K+ ayudan a la desnaturalización de secuencias largas

DNA molde (0.01 – 0.1mg)

Propiedades y aplicaciones de las polimerasas termoestables

Enzima Organismo Comentarios

Taq Thermus aquaticus PCR rutinario

Tfl Thermus flavus Procesividad media

Pwo Pyrococcus woesei Genera productos con extremos romos

Pfu Pyrococcus furiosus Alta fidelidad y procesividad

Pfx Thermococcus sp. Alta fidelidad y procesividad media

Pfx platinum

Thermococcus sp. Alta fidelidad y especificidad, procesividad media

Consideraciones para el diseño de oligonucleótidos (primers):

contenido G+C 40% - 60%

longitud 18-25 nucleótidos

evitar secuencias invertidas repetidas

evitar complementariedad entre los oligonucleótidos

Tm de los oligos no debe diferir más de 5°C

procurar extremo 3’OH sea G o C