Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Qu ... · de replicarse, pero si de unirse al colorante de fuscina). 7.2.2. TIPOS D E TINCIONES PARA MICOBACTERIAS. Básicamente

Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Químicas

Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 85

Fig. 7.1.1.Robert Koch.

7. DIAGNOSTICO

7.1. PRUEBA DE LA TUBERCULINA.

En 1980 Robert Koch anuncio la cura contra la tuberculosis, mediante un líquido

parduzco transparente obtenido de los cultivos de Mycobacterium tuberculosis. Según Koch,

la administración diaria de tuberculina, daba como resultado la cura de la tuberculosis. Un año

después la tuberculina fue rechazada como la cura para la consunción. Sin embargo Robert

Koch no se imagino, que su descubrimiento no era la cura a la tuberculosis, si no una de las

primeras pruebas diagnosticas para la tuberculosis.

Con el paso del tiempo, se emplearon diversas pruebas cutáneas basadas en la tuberculina de

Koch: prueba cutánea Von Pirquet), Prueba percutanea (Moro), Prueba conjuntival

(Calmette), Prueba intradérmica (Mantoux).

A principios de 1930 la prueba intradérmica de la tuberculina empezó a ser ampliamente

utilizada como prueba de diagnostico.



Fig. 7.1.2. Caja con jeringas del derivado proteico de la tuberculina (PPD)

Tuberculina Vieja (OT) . La tuberculina vieja es la tuberculina descubierta por Robert

Koch, y el método original empleado por Koch para su preparación, consiste en desarrollar a

los bacilos tuberculosos en un medio de caldo de carne glicerado, y a continuación matar a los

microorganismos con calor en un gabinete de flujo de vapor a 100 grados centígrados. El

medio de cultivo restante se concentra a la décima parte de su volumen original en baño

maría. Actualmente este tipo de tuberculina es empleada en el área de veterinaria.

Der ivado Proteico Pur ificado de la Tuberculina (PPD).

En 1932, Seibert y Munday aislaron la proteína de peso molecular bajo mediante

precipitación de filtrados de cultivo de bacilos tuberculosos con ácido tricloroacetico (TCA).

La observación principal de este producto en pruebas intradérmicas en cobayos y humanos

fue que a dosis bajas, la proteína purificada era bastante específico para la tuberculosis.

Posteriormente se logro la obtención de un producto más purificado mediante precipitación

con sulfato de amonio (AS), tratándose del derivado proteico purificado tal y como lo

conocemos hoy en día



Fig. 7.1.3. Obsérvese los efectos producidos por antígenos de tuberculina.

7.1.1 PRINCIPIO INMUNOLÓGICO.

Como hemos revisado, la entrada o contacto con una micobacteria en el organismo de

una persona ocasiona una respuesta inmunológica de tipo retardado en su cuerpo, al mismo

tiempo que los linfocitos T son sensibilizados.

Con tal antecedente, cuando se le aplica la inyección de tuberculina en la piel de una persona,

esta estimula a los linfocitos T cercanos al sitio de la lesión, activando así la reacción de

hipersensibilidad retardada (esta reacción inmunológica es llamada retardada ya que requiere

de 24 a 48 horas para manifestarse).

En el sitio de la inyección el antígeno es infiltrado por basofilos, monocitos y neutrófilos

ocasionando una respuesta inflamatoria, vaso dilatación y edema. Proliferan linfocitos T

específicos para el antígeno y descargan linfocinas, que median la acumulación de otras

células en ese lugar.

La célula que presenta el antígeno en la sensibilización por contacto se le llama célula de

Langerhans, (una célula dendrítica presentadora de antígeno que porta antígenos MHC clase

II).

Individuos sensibilizados con antígenos de tuberculina manifiestan una reacción de

hipersensibilidad retardada, observándose visualmente a 24 horas después de haberse aplicado

la inyección intradérmica, y alcanza su máximo a 48 horas después.



Fig. 7.1.4. Paso 1 de la inyección intercutánea de Mantoux en la superficie anterior del brazo.

7.1.2. TIPOS DE TUBERCULINAS.

Básicamente se manejan 2 tipos de tuberculinas para aplicación intradérmica:

A) Tuberculina vieja (OT). Se trata de la tuberculina descubierta por Koch.

B) Der ivado proteico pur ificado de la tuberculina (PPD). Es la tuberculina más

ampliamente utilizada hoy en día, y su contenido es una proteína purificada a partir del bacilo

tuberculoso utilizada como antígeno.

7.1.3. APLICACIÓN DE LA PRUEBA DE LA TUBERCULINA PPD VÍA

INTRADÉRMICA (PRUEBA DE MANTOUX).

La prueba de la tuberculina mide la hipersensibilidad retardada a la tubérculo proteína (PPD).

• La prueba cutánea de Mantoux consiste en inyección intercutánea de tuberculina en la

superficie anterior del antebrazo.



Fig. 7.1.5. Paso 2 de la inyección intercutánea de mantoux en la superficie anterior del brazo.

Fig. 7.1.6. Paso 3, medición de la roncha resaltada en el brazo.

• Se emplea una jeringa de tuberculina con aguja calibre 26 o 27, se introduce 0.1 mL

de antígeno justamente por debajo de la capa superior de la piel.

• Si la prueba fue aplicada de manera correcta, se producirá una elevación pálida

definida de la piel (roncha) de 6 a 10 mm de diámetro en un tiempo estimado de 48 a

72 horas.

• El PPD se estandariza desde el punto de vista biológico contra un preparado

internacional de referencia , y su actividad se expresa en unidades de tuberculina (UT)

• La dosis recomendada de PPD para la prueba cutánea es de 5 UT.

• Cuando se sospecha de un grado elevado de hipersensibilidad en una persona o bien

de una tuberculosis ocular, se emplea al principio 1 UT (primera potencia) o menos,



Fig. 7.1.7. Medición en milímetros.

para evitar el riesgo de reacción excesiva a nivel local o en el sitio de la lesión

micobacteriana (se aplican menos de 5 UT de PPD).

7.1.4. LECTURA DE LA PRUEBA

• Los resultados de la prueba se leen a 48 a 72 horas después de la inyección

intradérmica.

• Las lecturas son efectuadas bajo una buena fuente de luz y deberá ponerse en flexión

ligera el antebrazo del paciente a nivel del codo.

• Los bordes de induración se identifican mediante deslizamiento del codo índice

ligeramente a través de la zona de reacción.

• Una vez que están marcados los bordes, con una regla flexible se mide la induración

en sentido transverso a nivel de su diámetro más amplio.

• Los resultados de las pruebas cutáneas de la tuberculina deben anotarse en milímetros

de induración; los términos "positiva" o "negativa" no brindan información sobre el

tamaño de la reacción, y vuelven un problema las decisiones subsecuentes

relacionadas con el tratamiento preventivo.



Fig. 7.1.8. Interpretación de la prueba, resultado positivo con una induración de 1 centímetro de diámetro.

7.1.4.1. INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA.

Prueba negativa si la induración y eritema miden menos de 5 mm de diámetro.

Prueba positiva si la induración y eritema mide más de 5 mm de diámetro.

7.1.4.2. REACCIONES FALSAS POSITIVAS A LA PRUEBA DE LA TUBERCULINA.

• En ocasiones las lecturas de la prueba de tuberculina, dan como resultado una lectura

falsa positiva, esto ocurre frecuentemente en pacientes con infecciones con

micobacterias no tuberculosas (MOTT) y en pacientes que por lo general son niño,

que ya se han vacunado con el bacilo de CalmetteGuerin (BCG).



7.1.4.3. REACCIONES FALSAS NEGATIVAS A LA PRUEBA DE LA TUBERCULINA.

Tabla. 7.1. Causas potenciales de reacciones negativas falsas a la prueba cutánea de tuberculina.

Factores relacionas con la per sona sometida a la prueba Infecciones: Virales (HIV, Sarampión, parotiditis, varicela). Bacterianas (fiebre tifoidea, brucelosis, lepra, tos ferina). Micoticas (Blastomicosis sudamericana). Vacunaciones con virus vivos (sarampión, parotiditis, polio). Trastornos metabólicos (insuficiencia renal crónica). Factores nutricionales (deficiencia grave de proteínas). Enfermedades que afectan a los órganos linfoides (enfermedad e Hodkin, linfoma, leucemia linfocitica crónica). Fármacos (corticosteroides). Edad (neonatos, ancianos). Infecciones recientes con M. tuberculosis. Estrés (Intervenciones quirúrgicas, quemaduras, reacciones de injerto contra huésped).

Factores relacionados con la tuberculina empleada. Almacenamiento inapropiado (exposición a la luz y al calor). Diluciones inapropiadas. Desnaturalización química. Contaminación.

Factores relacionados con el método de administración Inyección de muy poco antígeno. Administración retrasada después de cargar la jeringa. Inyección demasiado profunda.

Factores relacionados con la lectura de la prueba y el r egistro de los resultados. Lector inexperto. Desviación consciente o inconsciente.

Error de lectura.



ANERGIA: La anergia (ausencia de algún tipo de respuesta inmunológica, en este caso a la

hipersensibilidad retardada) hacia la tuberculina es observada muy comúnmente en pacientes

con VIH activa, e incluso en pacientes cero positivos (pacientes con VIH, que aún no

manifiestan síntomas). Es por esto que la tuberculina no es una prueba cien por ciento fiel

hacia el diagnostico de la tuberculosis.

Como conclusión se puede decir que la prueba del PPD, no es confiable, debido a la

diversidad de reacciones falsas negativas o positivas por los factores revisados. Esta prueba es

útil en el diagnostico como un apoyo a los resultados de la baciloscopia y otras pruebas

diagnosticas.

7.2. BACILOSCOPÍA.

7.2.1. FUNDAMENTO.

Como se ha revisado con anterioridad, las micobacterias poseen la característica de

poseer un alto porcentaje de lípidos en su pared celular. Estos lípidos tienen la capacidad de

ligarse o unirse al colorante de fuscina (también a la auramina fenólica, para el caso de la

tinción de fluorocromo auramina), de tal manera que estas no son decoloradas por el alcohol

ácido (ácido resistencia). Esta propiedad permite la coloración de la bacteria y su observación

en el microscopio.



Al unirse la micobacteria al colorante de fuscina, este se colorea de color rojo brillante, y al

agregarse el colorante de contraste (colorante de azul de metileno), las micobacterias (color

rojo) quedan distinguibles de todo lo demás (color azul) véase mas adelante en este capitulo.

7.1.2.1.1. POR QUE LA BACILOSCOPIA ES UNA PRUEBA DIAGNÓSTICA

ESTANDAR PARA TODOS LOS LABORATORIOS CLÍNICOS?

• La observación de bacterias ácido resistentes en una muestra de esputo, junto con

antecedentes clínicos del paciente: perdida de peso, y evidencia de un infiltrado

pulmonar en radiografía de tórax, es la clara evidencia de una tuberculosis activa.

• La baciloscopia para muestra de esputo es muy útil para el seguimiento o monitoreo

de la respuesta del organismo del paciente hacia determinado tratamiento. Una vez que

se comienza un tratamiento con drogas antituberculosas, el cultivo de la micobacteria

puede volverse negativo antes que la tinción (esto sugiere que la bacteria no es capas

de replicarse, pero si de unirse al colorante de fuscina).

7.2.2. TIPOS DE TINCIONES PARA MICOBACTERIAS.

Básicamente hasta hoy en día existen tres procedimiento distintos para la coloración

de bacterias ácido resistentes:

A) Tinción de ZiehlNeelsen

B) Tinción de Kinyoun en frío

C) Tinción con fluorocromo auramina.



7.2.1. Microscopía observada, habiendo utilizado la técnica de Ziehlneelsen para su preparación.

7.2.2.1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS

La tinción de ZiehlNeelsen y Kinyoun, utilizan prácticamente los mismos reactivos y

colorantes (Carbol fuscina, alcohol ácido), así como el mismo colorante de contraste (azul de

metileno). La diferencia esta, en la preparación de estos reactivos y en el procedimiento

empleado de cada técnica. Para la tinción de Ziehl Neelsen se tiene que calentar la

preparación o portaobjeto, mientras que en la de Kinyoun (coloración en frío) no se tiene que

calentar la preparación.

El por que se debe de calentar la preparación en el método de Ziehl Neelsen, es debido a que

las micobacterias poseen una gran capa de lípidos o capa cérea, aunque sabemos que la

fuscina se liga a estos lípidos, el calentamiento logra ablandar esta capa, dejando entrar a la

carbolfuscina fácilmente.

La técnica de Kinyoun se utiliza un agente tenso activo (alta concentración de fenol en la

carbol fuscina) que aumenta la permeabilidad del colorante a través de la capa cérea. Esta alta

concentración de fenol permite disolver el material lipídico de la pared celular de la

micobacteria, lo cual ocasiona la penetración de la carbolfuscina sin la necesidad de calor.



7.2.2.Microscopía observada, habiendo utilizado la técnica en frío de Kinyoun para su preparación.

7.2.3. Microscopía observada, habiendo utilizado la técnica en frío de fluorocromoauramina para su preparación.

La coloración con fluorocromo auramina, en ves de utilizar la fuscina, utiliza auramina

fenólica, la cual al igual que la fuscina, tiene la capacidad de unirse a los lípidos de la pared

de la micobacteria. Las bacterias ácido resistentes teñidas con fluorocromos, son coloreadas

de color amarillo brillante (si se utiliza auramina) o naranjarojo (utilizando rodamina). La

coloración de contraste utilizada en esta tinción es el permanganato de potasio, el cual

produce un fondo negro de contraste.

La tinción de fluorocromo auramina posee ventajas respecto a las demás técnicas para

la coloración de micobacter ias.

Las bacterias teñidas con fluorocromos son amarillo brillante (auramina) o naranja

rojo (rodamina) contra un fondo oscuro, esto permite que la preparación pueda ser leída con

un objetivo de 25 x aumentando el campo de visión. El intenso contraste entre las

micobacterias coloreadas de forma brillante contratando con el fondo oscuro, reducen el

tiempo de observación y ofrece una clara ventaja a la hora de dar lectura ala preparación.



La pequeña desventaja de este procedimiento, es que se requiere de una fuente de luz intensa

(lámpara de 1.200 W o una luz fuerte con filtro para isotiocianato de fluoresceína (ITCF),

ósea de in microscopio de fluorescencia.

** NOTA. El hecho de que, para la observación de la preparación mediante la técnica de

fluorocromoauramina se necesite de una luz fuerte con filtro para isotiocianato de

fluoresceína (ITCF), NO !!! Quiere decir que se trate de una reacción antígenoanticuerpo,

sino de una unión fisicoquímica del colorante con la pared celular rica en lípidos de la

micobacteria.

Tabla 7.2. Procedimiento de la coloración para BAAR . Procedimiento Ziehl

Neelsen Procedimiento Kinyoun en

fr ío Procedimiento Fluorocromo

auramina

carbolfuscina: disolver 3 g de fuscina en 10 mL de etanol al 90 95 %. Agregar 90 mL de una solución acuosa de fenol al 5 %

Carbolfuscina: disolver 4 g de fuscina básica en 20 mL de etanol al 9095 % y luego agregar 100 mL de una solución acuosa de fenol al 9 % (9 g de fenol disueltos en 100 mL de agua destilada).

Auramina fenólica: disolver 0,1 g de auramina O en 10 mL de etanol 9095 5 y luego agregarla a una solución de 3 g de fenol en 87 mL de agua destilada. Almacenar el colorante en una gaveta marrón.

Alcoholácido: agregar 3 mL de HCl concentrado lentamente a 97 mL d etanol 9095 % en este orden: la solución puede calentarse!!

Alcoholácido: agregar 3 mL de HCl concentrado lentamente a 97 mL d etanol 9095 % en este orden: la solución puede calentarse!!

Alcoholácido: agregar 0,5 mL de HCl concentrado a 100 mL de alcohol al 70 %

Colorante de contraste azul de metileno: disolver 0,3 g de cloruro de azul de metileno en 100 mL de agua destilada.

Colorante de contraste azul de metileno: disolver 0,3 g de cloruro de azul de metileno en 100 mL de agua destilada.

Permanganato de potasio: disolver 0,5 g de permanganato de potasio en 100 mL de alcohol al 70 %

Procedimiento:

1. cubrir un frotis secado y fijado con calor con un pequeño rectángulo

Procedimiento:

1. cubrir un frotis secado y fijado con calor con un pequeño rectángulo (2x3cm)

Procedimiento:

1. Cubrir un frotis fijado con calor y secado con calor con carbol auramina y permitir



(2x3cm) en papel filtro.

2. Aplicar 57 gotas de colorante carbolfuscina para humedecer con cuidado el papel filtro.

3. Calentar el portaobjeto cubierto con el colorante hasta la emisión de vapores, sin permitir que se seque. El calentamiento se puede realizar con un mechero a gas.

4. Eliminar el papel con pinzas, lavar el portaobjetos con agua y escurrir.

5. Decolorar con alcohol ácido hasta que no aparezca más colorante en el lavado (2 min.).

6. Teñir con el azul de metileno de contraste (1 a 2 minutos).

7. Enjuagar, escurrir y secar al aire. (1 a 2 minutos).

8. Examinar con un objetivo de aceite de inmersión x 100.Las micobacterias se colorean rojo y el fondo de azul pálido.

en papel filtro.

2. Aplicar 57 gotas de colorante carbolfuscina para humedecer con cuidado el papel filtro. Dejar descansar durante (5 minutos) agregar mas colorante si el papel se seca *NOTA* !!! NO VAPORIZAR!!!

3. Eliminar el papel con pinzas, lavar el portaobjetos con agua y escurrir.

4. Decolorar con alcoholácido hasta que no aparezca más colorante en el lavado (2 min.).

5. Teñir con el azul de metileno de contraste (1 a 2 minutos).

6. Enjuagar, escurrir y secar al aire. (1 a 2 minutos).

7. Examinar con un objetivo de aceite de inmersión x 100.Las micobacterias se colorean rojo y el fondo de azul pálido

colorear durante (15 minutos).*NOTA* !!! NO CALENTAR NI CUBRIR CON PAPEL FILTRO!!! .

2. Enjuagar con agua y escurrir.

3. Decolorar con alcohol ácido (2 minutos).

4. Enjuagar con agua y escurrir.

5. Cubrir el frotis con abundante cantidad de permanganato de potasio durante (2 minutos, no mas de 4 min.).

6. Enjuagar con agua de la canilla y escurrir.

7. Examinar con objetivo x 25 utilizando lámpara de vapor de mercurio y un filtro BG12 o una luz fuerte. Las micobacterias se colorean color naranja amarillento contra fondo oscuro.



7.2.3. PROCEDIMIENTO DE LA BACILOSCOPÍA SEGÚN EL I.N.D.R.E

(INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICA).

7.2.3.1. ÁREA DE TRABAJO.

La mesa de trabajo tendrá que ser de por lo menos 1 x 0.50 m, recubierta de material

que pueda desinfectarse fácilmente (acero inoxidable), junto a esta área deberá existir una

tarja para la coloración o tinción de preparaciones, además deberá existir otra mesa de iguales

dimensiones para la observación baciloscopica.

7.2.3.2. EQUIPO Y MATERIAL.

El material requerido para el procedimiento es el siguiente:

• Microscopio binocular con oculares 10x, 40 x y lente de 100 .

• Tarja para tinciones.

• Mechero de gas o de alcohol.

• Autoclave u olla express

• Cristalería de laboratorio para la preparación de soluciones (matraces, probetas,

pipetas etc...).

• Pizetas.

• Embudos.

• Lápiz de punta de diamante o de tungsteno.

• Frascos para soluciones colorantes y reactivos preparados.

• Gasa o papel para cubrir el área de trabajo.



• Envases para muestras.

• Aplicadores de madera.

• Portaobjetos.

• Varillas de vidrio para soporte de la tinción (puente).

• Hisopos de algodón.

• Frasco con fenol al 5 % para desechar los aplicadores usados.

• Recipientes para eliminación de material contaminado.

• Gradillas para láminas.

• Aceite de inmersión.

• Papel de seda.

• Papel filtro.

7.2.3.3. PREPARACIÓN DEL EXTENDIDO.

1. Preparar la lista de trabajo con los nombres de los pacientes a quienes se le van a procesar

sus muestra.

2. Cubrir el área de la mesa donde se van a preparar los frotis con papel absorbente

impregnado con fenol al 5%.

3. Conforme el orden de la lista colocar las muestras a procesar sobre la mesa de trabajo en

línea horizontal.



4. Etiquetar perfectamente el envase de la muestra y el porta objetos donde se realizara la

tinción, es punto clave que el numero de identificación del paciente coincida en la hoja de

trabajo, recipiente de la muestra y porta objetos.

5. La rotulación del portaobjetos deberá realizarse con lápiz de diamante o de tungsteno. El

portaobjetos es etiquetado en la parte del extremo izquierdo con el número de identificación

correspondiente y nombre del paciente.

6. Evitar confusiones también es punto clave, para esto; el laboratorista puede colocar frente a

el, la muestra y el portaobjetos a procesar, tanto el recipiente de la muestra como el

portaobjetos deberán coincidir en su numero de identificación. Es preferible realizar la tinción

una a una.

7. El extendido debe realizarse con un palillo de madera (el asa de nicromio, no es

recomendable para la tinción de Ziehlneelsen u otra para micobacterias, ya que esta puede ser

peligrosa para el trabajador al liberarse partículas infecciosas y aerosoles si esta interactúa con

el mechero). Para el caso de baciloscopia de esputo, es recomendable la toma de 3 muestras o

más para el extendido.

8. En el porta objetos se realiza un frotis o extendido de tamaño de 2 cm de largo por 1 cm de

ancho. El frotis se realiza haciendo movimientos circulares para la obtención de una película

uniforme. En este paso debe de cuidarse que el frotis no sea demasiado grueso ni tampoco

demasiado delgado, para evitar dificultades mas adelante para la lectura de la prueba.

9. El palillo o aplicador de madera tendrá que desecharse en un recipiente que contenga fenol

al 5%, para cada muestra se deberá usar un aplicador de madera distinto, aun y se trate de la

muestra del mismo paciente.



7.2.4. Fijación del frotis

7.2.5. Limpieza con fenol al 5 %

10. El frotis se deja secar a temperatura ambiente. La laminilla no deberá calentarse mientras

el frotis este húmedo, ya que de lo contrario, se producen aerosoles infecciosos peligrosos

para el laboratorista.

11. Una vez secado el frotis a temperatura ambiente, se fija el frotis pasándolo sobre la flama

del mechero 2 o 3 veces. Debe evitarse el sobrecalentamiento de la laminilla, ya que esta

puede romperse o alterar la estructura de la bacteria.

12. Una vez terminada la tinción, se procede con la desinfección del área de trabajo con fenol

al 5% y se esteriliza el recipiente con los aplicadores de madera y el papel utilizado como

cubremesas.



7.2.6. Colocación del frotis a teñir.

13. Los recipientes de las muestras no son desechados hasta que no se reporten los resultados

de su baciloscopia, cuando esto se cumpla, estos se esterilizan y se desechan.

7.2.3.4. TINCIÓN DEL EXTENDIDO (ZIEHLNEELSEN).

En México el I.N.D.R.E. (Instituto de diagnóstico y referencia epidemiológica) utiliza

el método de ZiehlNeelsen como método base para la coloración de micobacterias. Ellos

recomiendan teñir como máximo 12 preparaciones simultaneas para lograr una coloración

uniforme..

1. Colocar el frotis sobre las varillas del puente, con el extendido y numeración hacia arriba,

de modo que el laboratorista pueda visualizarlo. Si existen más preparaciones a teñir, estas

deben estar separadas por lo menos 5 mm separadas una de la otra evitando la contaminación

por arrastre de soluciones.

2. Como control de calidad. Diariamente se incluyen preparaciones control, tanto negativas

como positivas, estas deberán ser leídas al microcopio antes de revisarse las demás muestras

problema.



7.2.7. Se cubre el frotis con colorante de fuscina.

7.2.8. Decoloración de la preparación con alcohol ácido

3. Se cubre completamente la preparación con el colorante de Carbol fuscina.

4. Se calienta la preparación usando un hisopo de algodón impregnado con alcohol hasta la

producción de vapores visibles. El punto clave en este paso, es evitar que el colorantes hierva

o este se seque sobre la laminilla, de lo contrario, se formaran diversos cristales que

confundirán al laboratorista cuando este frente al microscopio revisando la preparación,

ocasionando falsos positivos como resultado final de la prueba.

5. Después de la emisión de vapores, el portaobjetos es lavado con agua destilada y se deja

escurrir colocando el portaobjetos en forma inclinada.

6. Se decolora la preparación con alcohol ácido hasta la desaparición del colorante visible ( 2

minutos aproximadamente).



7.2.9. Coloración de contraste: azul de metileno.

7.2.10. Escurrimiento de la preparación.

7. Se cubre completamente la preparación con el colorante de contraste: azul de metileno y se

esperan no mas de 1 minuto.

8. Se enjuaga la preparación con agua destilada y se escurre.

9. Con un algodón impregnado con alcohol ácido, se limpia la parte inferior (cara opuesta de

la preparación), para la eliminación de restos de colorante que pudieran interferir con la

lectura.

10. Se deja secar la preparación a temperatura ambiente.



7.2.11. Ejemplo, del método empleado para la lectura de bacilos en campos ópticos en un microscopio.

7.2.3.5. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA. (LECTURA DE LA PRUEBA).

Este es el último paso de la baciloscopía antes de registrar los resultados. La lectura es

realiza en un microscopio óptico a con objetivo de 100 x.

1. Se colocan unas gotas de aceite de inmersión sobre el extremo más cercano a la

identificación del extendido.

2. Se enfoca el microscopio acercando el objetivo de inmersión (100 x) hasta tocar la

superficie de la gota de aceite, se observa en el ocular y se ajusta con el tornillo micrométrico.

3. Cada campo microscópico se divide mentalmente en cuatro cuadrantes. La lectura se inicia

en el cuadrante de la parte superior derecha y se continúa con los otros cuadrantes en sentido

de las manecillas del reloj. Debe observarse en superficie y en profundidad, utilizando

constantemente el tornillo micrométrico.



7.2.12. Observación microscópica de los bacilos acidoalcohol resistentes teñidos con tinción de Ziehlneelsen.

7.2.13. Ejemplo a seguir, durante una lectura baciloscopica.

4. La observación de los bacilos ácido alcohol resistentes al microscopio aparecen como

bastoncillos delgados, ligeramente curvos, teñidos de rojo y generalmente con gránulos más

coloreados en su interior, aislados en parejas o en grupos sobre el azul de la tinción de

contraste.

5. Tendiendo en cuenta como se observan los bacilos ácido alcohol resistentes en la

coloración de Ziehlneelsen, se procede a la identificación de estos al microscopio. Una vez

identificado el bacilo en el campo observado, la observación microscópica debe seguir un

procedimiento para la lectura de los demás campos, la preparación se lee de izquierda a

derecha del extendido realizando lecturas de 100 campos como mínimo.



Se considera como campo microscópico útil en aquellos que además de la observación de

bacilos ácido alcohol resistentes, son observados elementos celulares de origen bronquial

como: leucocitos, células ciliadas, broncolitos. Los campos en los que no son observados tales

elementos bronquiales, no son considerados para la contabilización de la prueba.

6. Cuando el promedio de los bacilos observados es elevado, para su contabilización final es

aconsejable utilizar un cuadriculado con 100 cuadros y apuntar en cada cuadrante el número

de bacilos por campo observado.

7. Como regla general la observación microscópica del extendido es de 100 campos. Sin

embargo el número de campos varía si en su observación aparecen bacilos ácido alcohol

resistentes

a) Si no se observan BAAR o están presentes menos de 1 bacilo por campo en

promedio, solo se examinarán 100 campos microscópicos útiles.

b) Si son observados de 1 a 10 bacilos en promedio por campo, solo se observan 50

campos microscópicos útiles.

c) Si son encontrados más de 10 bacilos en promedio por campo, solo se observan 20

campos microscópicos útiles.

8. Una vez terminada la lectura, el aceite de inmersión es limpiado del objetivo utilizando una

gasa o papel suave.

9. El frotis observado es sumergido en xilol, se deja escurrir y este es archivado.



7.2.3.5. INFORME DE RESULTADOS (INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA).

Los resultados de la observación microscópica, son reportados por número de cruces.

Este dato puede indicarle al médico el tamaño de la lesión, la capacidad infectiva del paciente;

además proporciona una importante información epidemiológica y la evolución del

tratamiento.

Tabla 7.3. Informe de resultados baciloscópicos. Resultado. Característica

Negativo No se observan bacilos ácidoalcohol resistente (BAAR) en 100 campos microscópicos observados.

De 1 a 9 BAAR Reportar el número de bacilos en 100 campos.

Positivo (+) Menos de un bacilo por campo en promedio (de 10 a 99 bacilos), en 100 campos observados.

Positivo (++) De uno a diez bacilos por campo en promedio en 50 campos observados. Positivo (+++) Más de 10 bacilos por campo en 20 campos microscópicos observados. * BAAR = Bacilos ácido resistentes

Para baciloscopía en esputo, si el paciente es diagnosticado como positivo, este deberá

iniciar algún tratamiento y ser controlado mediante exámenes baciloscopicos mensuales. Este

deberá presentar negativa la prueba durante el segundo y tercer mes de tratamiento. Si la

baciloscopia continua siendo positiva después del tercer mes, es recomendable realizar un

cultivo microbiológico para confirmar el fracaso al tratamiento.



En la siguiente tabla, se descr ibe el método utilizado por la CDC (Centers of Diseases Control) para el informe de la cantidad de bacilos acidorresistentes.

Tabla 7.4. Método para el informe de la cantidad de bacilos acidorresistentes observados en frotis teñidos. Fuente bibliográfica: Diagnóstico microbiológico, Elmer W. Koneman, Ed.

panamericana. Cantidad de bacilos observados Método de Informe del CDC

0 Negativo. ( ) 1 2 / 300 campos observados Cantidad observada. (+ o ) 1 9 / 100 campos observados Numero promedio / 100 campos. (1 + ) 1 9 / 10 campos observados Numero promedio / 10 campos (2 + ) 1 9 / campos observados Número promedio / campo (3 + ) Más de 9 / campo observado Más de 9 /campo (4 + )

7.2.3.6. REGISTRO DE RESULTADOS.

El laboratorio deberá llevar un control o registro interno de los resultados de las

baciloscopías revisadas. Este registro puede llevarse acabo en una libreta destinada a llevar

dicho control.

La libreta o bitácora deberá incluir:

* Número de paciente.

* Domicilio.

* Sexo.



* Edad.

* Nombre del centro de salud.

* Señalar si la baciloscopía se realizó a partir de una preparación o de una muestra.

* Señalar la calidad y condiciones de la muestra.

* Resultado de la baciloscopia

* Observaciones.

* Resultados Positivos deberán ser registrados con tinta roja.

7.2.3.7. CONSERVACIÓN Y ELIMINACIÓN DE LAS PREPARACIONES.

1. Al término de la lectura de la baciloscopía, el portaobjetos deberá ser lavado suavemente

con xilol, se deja secar y se almacena.

2. No deberá desecharse ninguna laminilla, ya sea positiva o negativo, las laminilla deberán

almacenarse durante un año en una caja que impida la exposición de la luz y el polvo.

3. Luego de cumplirse el año, las preparaciones o portaobjetos deberán ser colocados en un

envase para vidrio (contenedor para materiales punzo cortantes), para su posterior

esterilización y desecho.



7.2.3.8. CAUSAS DE ERROR EN LA BACILOSCOPÍA.

1. Causas relacionadas con la muestra.

a). Mala calidad de la muestra o volumen insuficiente.

b). Rotulación inadecuada en la muestra.

2. Causas relacionadas con la preparación del frotis.

a). No tomar la porción adecuada de la muestra para su tinción.

b). La preparación de demasiados frotis simultáneos.

c). Muestras contaminadas por el uso inadecuado de los aplicadores de madera.

d). Un área de trabajo insuficiente.

c) Mezclar laminillas.

3. Causa r elacionadas con la tinción.

a). Uso de laminillas rayadas.

b). Calentamiento excesivo de la carbol fuscina durante su preparación (el secado y la

ebullición forman cristales en el frotis).

c). Inadecuada decoloración de la preparación, el lavado insuficiente puede ocasionar

la confusión de micobacterias con otros bacilos no ácido resistentes



4. Causas relacionadas durante la lectura de la prueba.

a). Lectura de un número de campos menor de lo indicado.

b). Falta de habilidad para distinguir a los bacilo de los artefactos de la tinción.

c). No verificar el número de identificación del paciente con la del porta objetos.

d). Rotulado del portaobjetos ilegible.

e). Presencia de micobacterias en el aceite de inmersión, la punta del gotero del aceite

de inmersión no debe topar con la preparación.

f). Registro equivocado del resultado observado.

Antes de proseguir con el desarrollo de los siguientes temas, debo aclarar que solo

laboratorios con un nivel II de servicios o superior pueden realizar cultivos microbiológicos,

identificación de género y especie y pruebas de susceptibilidad. Aquellos laboratorios que

posean un nivel I de servicio, solo se ocupan de recoger la muestra, realizar la baciloscopia y

en todo caso subrogarla a un laboratorio de referencia que posea un nivel II o superior de

servicio.

Para el diagnostico de tuberculosis, los laboratorios se han clasificado de acuerdo a los

servicios que estos pueden brindar. En la siguiente tabla se describen dichos niveles de

servicios.



Tabla.7.5. Niveles en los laborator ios para el procesamiento de muestras.

NIVELES PROCESOS

NIVEL 1

1. Recolección de muestras clínicas adecuadas, incluidos esputos inducidos por aerosol.

2. Transporte de muestras a laboratorios de un nivel superior para posterior aislamiento e identificación.

3. Pueden prepararse y examinarse frotis para el diagnóstico presuntivo o como una forma de seguimiento de la evolución de pacientes ya diagnosticados en tratamiento quimioterapéutico.

NIVEL 2

1. Pueden realizarse todas las funciones de los laboratorios de "nivel I" y procesarse muestras según sea necesario para cultivos en medios sólidos y líquidos

2. Pueden llevar acabo la identificación de Mycobacterium tuberculosis.

3. Pueden realizarse estudios de susceptibilidad a las drogas contra M. tuberculosis con drogas antituberculosas de primera línea.

4. Pueden conservar los cultivos de micobacterias durante un tiempo razonable.

NIVEL 3

1. Pueden realizarse todas las funciones de los laboratorios de "nivel I" y "nivel II", y también pueden identificar todas las especies de Mycobacterium a partir de muestras clínicas.

2. Pueden realizar estudios de susceptibilidad a drogas contra micobacterias.

3. Pueden conservar cultivos de micobacterias durante un tiempo razonable.

4. Pueden realizar trabajos de investigación y proporcionar capacitaciones.



7.3. CULTIVO MICROBIOLÓGICO.

El primer medio de cultivo para micobacterias fue el preparado con huevos enteros y

mezcla de féculas de papas, glicerol y sales, solidificado por calentamiento a 85 º C a 95 º C

durante 30 a 45 minutos. El proceso de solidificación por calor del medio que contiene

proteínas es conocido como "CONDENSACIÓN". Un medio de cultivo condensado es más

susceptible a la licuefacción proveniente de los efectos de las enzimas proteolíticas

producidas por bacterias contaminantes que en un medio solidificado por el agregado de agar

7.3.1. MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS.

Existen diversos medios de cultivo, para el desarrollo de las micobacterias, de la

variedad de cultivos existentes, los podemos dividir en dos: MEDIOS DE BASE SÓLIDA

(Medios selectivos y no selectivos). Y MEDIOS LÍQUIDOS o CALDOS.

Fig. 7.3.1. Medio de cultivo para micobacterias en frasco.



7.3.1.1.1. MEDIOS DE CULTIVO NO SELECTIVOS.

Para antes del siglo XIX, aún no existían medios de cultivo para aislamiento de

micobacterias. Fue hasta finales del siglo XIX mediante experimentación, se encontró que en

un medio de cultivo con huevos enteros y mezcla de féculas de papas, glicerol y sales,

solidificado por calentamiento a 85 º C A 95 º C durante 30 a 45 minutos daba como resultado

un medio de cultivo efectivo para las micobacterias. Poco después a este medio se le

agregaron colorantes de anilina como el verde de malaquita y cristal violeta, se observo que

estos colorantes servían como agentes inhibidores de bacterias contaminantes. Actualmente

los fabricantes de medios de cultivo tienen bien establecidas las concentraciones de estos

colorantes como el verde de malaquita (más utilizado), ya que un exceso de estos puede

inhibir el crecimiento de las micobacterias.

En la tabla 7.6. Se describen los medios de cultivo sobre base de huevo para la recuperación

de micobacterias.

Tabla. 7.6. Medios no selectivos para el aislamiento de micobacterias. Medio Componente Agente inhibidor

LowensteinJensen Huevos enteros coagulados, sales definidas, glicerol, fécula de papa

Verde de malaquita, 0,035 g/100 mL

Petragnani Huevos enteros coagulados, yemas de huevo, leche entera, papa, fécula de papa, glicerol


Medio de la American Thoracic Society

Yemas de huevo frescos coagulados, fécula de papa, glicerol


Middlebrook 7H10 Sales definidas, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, glicerol, dextrosa.


Middlebrook 7H11 Sales definidas, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, glicerol, 0,1 % de hidrolizado de caseína




7.3.2. Medio de LowensteinJensen en pico de flauta.

1. El medio de LowensteinJensen, es el más utilizado en los laboratorios clínicos, este es

menos inhibitorio a bacterias contaminantes que el medio de petragnani. Sin embargo a pesar

de que este medio de cultivo es el más antiguo y reconocido, hoy en día se esta dejando de

utilizar, ya que en comparación con el medio de cultivo Middlebrook el medio de

LowensteinJensen es mas más lento para el crecimiento de micobacterias. Sin embargo el

medio de LowensteinJensen posee gran ventaja, ya que los estudios cromogénicos y pruebas

bioquímicas son más exactas cuando son realizados a partir de subcultivos provenientes del

medio de LowensteinJensen.

2. El medio de Petragnani posee gran cantidad de agente inhibidor (0,052 g/100 mL), es muy

utilizado en cultivos a partir de muestras muy contaminadas.

3. El medio de la Amer ican Thoracic Society (ATS), posee tan solo 0,02 g/100 mL de verde

de malaquita, por lo que no es recomendable para muestras de esputo, este medio es muy

utilizado para muestras de LCR, líquido pleural y biopsias de tejidos (muestras regularmente

estériles).



7.3.3. Crecimiento de M. tuberculosis en medio sólido Middlebrook 7H11.

4. El medio de cultivo Middlebrook7H10 y Middlebrook 7H11, a diferencia del de

LowensteinJensen (tubo en pico de flauta), están preparados en placas transparentes,

permitiendo la observación precoz de micro colonias de micobacterias (microbiólogos con

experiencia pueden observar características morfológicas bien definidas a partir de las

microcolonias) en un tiempo de 10 a 12 días de incubación en lugar de los 18 a 24 días en

promedio requeridos por otros medios. La rapidez de estos medios de cultivo, es la adición de

biotina y catalasa. Además estos medios de cultivo son los mayormente utilizados para las

pruebas de susceptibilidad. La diferencia entre el medio Middlebrook 7H10 y 7H11, es la

adición 0,1 % dehidrolisado de caseína en el Middlebrook 7H11, un aditivo que mejora la

velocidad y el rendimiento de las micobacterias resistentes a Isoniazida (INH). las desventajas

de estos medios, es la poca inhibición hacia la flora contaminante, ya que poseen

concentraciones muy bajas de verde de malaquita, además estos medios de cultivo, a

diferencia del LowensteinJensen (el cual requiere la incubación al 5 o 10% de oxígeno), los

medios de Middlebrook requieren de una incubación en condición absoluta de anaerobiosis.

requieren de una incubación en condición absoluta de anaerobiosis.



7.3.1.1.2. MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS.

Este tipo de medios de cultivo van acompañados de diversos agentes antibacterianos y

antifungicos, los cuales evitan el crecimiento de bacterias contaminantes. Estos medios de

cultivo dan como resultado un aumento enorme en la recuperación de micobacterias. Sin

embargo, para quienes preparan medios de cultivo selectivos para el aislamiento de

micobacterias, debe utilizarse con precaución la inclusión de agentes inhibidores, ya que

estoas pueden ocasionar inhibición de las propias micobacterias.

A continuación, en la siguiente tabla se describen algunos de los medios de cultivo selectivos

más utilizados en el mercado.

Tabla 7.7. Medios Selectivos para el aislamiento de micobacterias. Medio Componentes Agente inhibidor

Modificación de Gruft del Lowenstein jensen

Huevos enteros coagulados, sales definidas, glicerol, fécula de papa, RNA5mg/100 mL

Verde de malaquita, 0,025 g/100 mL, penicilina, 50 U/mL, Ácido nalidíxico, 35 ug/mL

LowensteinJensen Huevos enteros coagulados, sales definidas, glicerol, fécula de papa

Verde de malaquita, 0,025 g/100 mL Cicloheximida, 400 ug/mL, Lincomicina, 2u /mL, Ácido nalidíxico, 35 ug/mL

Middlebrook 7H10

Sales definidas, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, glicerol, glucosa.

Verde de malaquita, 0,0025 g/100 mL, Cicloheximida, 360 ug/mL, Lincomicina, 2u/mL, Ácido nalidíxico, 20 ug/mL.

Selectivo 7H11 (Medio de Mitchison)

Sales definidas, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, glicerol, glucosa, hidrolizado de caseína.

Carbenicilina, 50 u/mL, Anfotericina B 10 u/mL , Polimixina B 200 U/mL, Lactato de trimetoprima, 20 ug/mL



7.3.1.2. PROCEDIMIENTO PARA LA SIEMBRA.

Dependiendo si la muestra requiere ser procesada previamente por medio de una

descontaminación y desinfección, en general el procedimiento es el siguiente:

1.La muestra es transferida a un tubo cónico de 50 ml.

2.Si la muestra requiere descontaminación previa al cultivo, el tubo cónico con la muestra es

agitada en el agitador vortéx durante 15 a 20 segundos,

3. La muestra es tratada con igual cantidad del agente descontaminante a utilizar.

generalmente se deja actuar el descontaminante (puede ser NacetilLcisteína + NaOH)

durante 15 minutos.

4. Se agrega el buffer de fosfatos. (generalmente hasta la marca de 45 ml del tubo cónico).

5. Antes de centrifugar las muestras en el gabinete de bioseguridad, se limpian las superficies

del recipiente con fenol al 5%.

6. La muestra es centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos, utilizando una centrífuga con

refrigeración abordo.

7. Se decanta el sobrenadante en un recipiente a prueba de salpicaduras, se limpian las

superficies del recipiente con fenol al 5%.



8. Si el cultivo sólido, es en tubo y en pico de flauta como el de Lowenstein Jensen, el medio

se inocula utilizando una pipeta estéril (se cubre toda la superficie del pico de flauta). se

etiquetan los datos completos del paciente, y se incuba a 37 grados centígrados durante 9

semanas. Durante estas 9 semanas el medio de cultivo se monitorea cada semana.

NOTA **. Es importante realizar la siembra o inoculación en dos tubos de LowensteinJensen

en presencia de 5 o 10% de oxígeno.

10. Si es utilizado un medio de cultivo en placa como el Middlebrook, el procedimiento de la

inoculación es realizada de igual manera que para cualquier cultivo en placa, utilizando un asa

microbiológica.

11. Obviamente el último paso, es la desinfección del área de trabajo y del gabinete de

bioseguridad tipo II, utilizando fenol al 5%.

7.3.2. IDENTIFICACIÓN / PRUEBAS BIOQUÍMICAS.

La identificación de Mycobacterium tuberculosis mediante pruebas bioquímicas es

hasta ahora la prueba diagnostica más confiable y utilizada, sin embargo, la desventaja de las

pruebas bioquímicas es el tiempo que tarda en obtener los resultados finales. Esta situación ha

dado lugar al perfeccionamiento de técnicas moleculares o cromatográficas.



7.3.4. Prueba de niacina. Mycobacterium tuberculosis (+).

7.3.2.1. ACUMULACIÓN DE NIACINA.

PRINCIPIO.

Todas las micobacterias no tienen la capacidad de acumular la niacna, sin embargo M.

tuberculosis, M. simiae y ocasionalmente cepas de M. africanum, M. bovis, M. marinum y M.

chelonae si tienen las enzimas para convertir la niacina a ribonucleótido de niacina.

PROCEDIMIENTO.

Como es mostrado en la fotografía, los tubos de ensaye contienen una tira de papel filtro

impregnado con bromuro de cianógeno. Se extraen las colonias provenientes del medio

sólido, mezcladas con un poco de solución salina, se colocan en el fondo del tubo de vidrio.

LECTURA DE LA PRUEBA.

La aparición de un color amarillo en el medio incubado con la tira de niacina abordo, indica la

acumulación de niacina, dando positiva la prueba.

Actualmente se han desarrollado tiras de papel de filtro impregnadas con niacina, eliminando

la necesidad de la utilización de bromuro de cianógeno (sustancia altamente tóxica). Para



7.3.5. Reducción de nitratos a nitritos. Mycobacterium tuberculosis (+).

evitar un falso negativo, es vital el aislamiento de suficientes colonias de Mycobacterium

tuberculosis en el medio de cultivo.

7.3.2.2. REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS.

PRINCIPIO.

Mycobacterium tuberculosis es un gran productor de nitrorreductasa, enzima que cataliza la

conversión de nitratos a nitritos.


Como es mostrado en la imagen, la coloración rosarojo en el agregado de ácido sulfanílico y

Nnaftiletilendiamina a un extracto de colonias aisladas de un medio de cultivo, indica la

existencia de nitritos y por tanto afirmando la positividad de la prueba.

Además de Mycobacterium tuberculosis, esta prueba de reducción de nitratos a nitritos es

utilizada para la identificación de M. kansasii y M. szulgai.



7.3.6. Hidrólisis del Tween 80. Mycobacterium tuberculosis (variablemente positivo)

7.3.2.3. HIDRÓLISIS DEL TWEEN 80.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA.

Tween 80 es el nombre comercial del detergente (derivado polietilenado del monooleato de

sorbitano) que se utiliza para la identificación de micobacterias que son capaces de producir

una enzima lipasa que cliva o hidroliza el Tween 80 en ácido oleico y sorbitol polioxietilado.

Para Mycobacterium kansasii el Tween 80 es una característica positiva para su

identificación.


El desarrollo de color rojo es el resultado positivo, ya que indica la capacidad de la bacteria

para hidrolizar el Tween 80.

El cambio de color amarillo a rojo en esta prueba, no es debido a un cambio en el pH, sino al

resultado del cambio en la densidad óptica a medida que se va produciendo ácido oleico y

sorbitol polioxietilado, como productos de degradación del Tween 80.



7.3.7. Prueba de catalasa Mycobacterium tuberculosis ()

7.3.2.4. PRUEBA DE LA CATALASA A 68 GRADOS CENTÍGRADOS.

PRINCIPIO.

La mayoría de las micobacrterias son capaces de producir la enzima catalasa, sin embargo no

todas las especies son capaces de producirla en condiciones de temperatura elevada a 68

grados centígrados durante 20 minutos (catalasa termoestable). Normalmente esta prueba

bioquímica es negativa para las micobacterias tuberculosas, con excepción de las cepas de

Mycobacterium tuberculosis resistentes a la isoniazida, por lo que esta prueba es de gran

ayuda en tales casos.


La lectura de la prueba es realizada en tubos de LowensteinJensen ubicados en posición

vertical y no en pico de flauta, esto para que la superficie plana del medio sea inoculada e

incubada durante 14 días antes de agregarle el peroxido de hidrógeno. Si en el tubo se levanta

una columna de efervescente o de burbujas de unos 4 mm de diámetro, la prueba es

considerada como positiva.



7.3.8. Prueba de catalasa en medio de Middlebrook 7H11. Mycobacterium tuberculosis ()

Si se quiere evitar el tiempo de 14 días de incubación a 68 grados centígrados para revisar la

prueba de la catalasa después del cultivo primario, se puede utilizar un medio de Middlebrook

7H10 o 7H11 (como cultivo primario), agregando unas gotas de peróxido en la superficie de

las colonias y observar rápidamente el resultado de la prueba.

7.3.2.5. PRUEBA DE LA ENZIMA ARILSULFATASA.

PRINCIPIO.

Normalmente ciertas especies pertenecientes a las micobacterias de crecimiento rápido, son

positivas a esta prueba. La aril sulfatas es una enzima que cliva fenolftaleína libre a partir de

la sal tripótasica del disulfito de fenolftaleína.



7.3.9. Prueba de la enzima arilsulfatasa. Mycobacterium tuberculosis ()

PROCEDIMIENTO Y LECTURA DE LA PRUEBA.

La prueba es realizada, agregando bisulfato de fenolftaleína tripotásica a un tubo que contiene

sustrato de fenolftaleína en agar ácido oleico (Wayne).

En 3 o 14 días de incubación, la lectura de la prueba puede realizarse al observar una

coloración rojo a rosa después de la adición de carbonato de sodio, lo cual indica que la

prueba es positiva.

La prueba es negativa cuando no hay cambio de color después de la adición de carbonato de

sodio.

7.3.2.6. PRUEBA DE LA UREASA.

PRINCIPIO.

Esta prueba trata de verificar si la micobacteria es capas o no de producir la enzima ureasa.

Esta enzima hidroliza la urea, y por consiguiente se forma amoníaco y dióxido de carbono. El

amoniaco reacciona en solución, formando carbonato de amonio, ocasionando así una

alcalinización del medio como resultado del aumento del pH de la solución. (es la causa del

vire de la solución).



7.3.10. Prueba de la ureasa. Mycobacterium tuberculosis (+)

PROCEDIMIENTO.

Esta prueba puede ser realizada, inoculando al microorganismo en agua destilada, la cual

contenga un concentrado sobre la base de urea, o bien se pueden utilizar discos de papel

impregnados con urea y estos se agregan al agua destilada.


Si ocurre un cambio de color a rosa en la solución, la prueba es ureasa (+), si no ocurre

cambio de color, la prueba es ureasa ().

7.3.2.7. PIRAZINAMIDASA.

PRINCIPIO.

La pirazinamidasa es una enzima producida por ciertas micobacterias, la cual deamina la

pirazinamida para formar ácido pirazinoico, tal compuesto produce una banda o anillo en el

medio.



7.3.11. Prueba de la pirazinamida. Mycobacterium tuberculosis (+)

LECTURA.

Utilizando un caldo con base de Dubos, previamente sembrados con un subcultivo de la

muestra problema, este se coloca a incubar durante 4 días aproximadamente. Después de la

incubación, al agregar sulfato de amonio ferroso, en el medio sobresale un anillo de color

rojorosado es la indicación de que la micobacteria es capas de desaminar la pirazinamida.

7.3.2.8. INCORPORACIÓN DE HIERRO.

Algunas micobacterias como M. fortuitum, tienen la capacidad de incorporar sales de

hierro solubles desde el medio de cultivo, al agregarle una solución acuosa al 20 % de citrato

de amonio férrico, se produce un aspecto marrón en la colonia, lo cual indica que la prueba es

positiva.



7.3.12. Prueba de crecimiento en T2H. Mycobacterium tuberculosis (+).

7.3.2.9. INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO POR LA HIDRAZIDA DEL ÁCIDO

TIOFENO2CARBOCÍLICO (T2H).

La hidrázida del ácido tiofeno2carboxílico (T2H) inhibe selectivamente el desarrollo

de Mycobacterium bovis, mientras que otras micobacterias pueden crecer en un medio que

contenga este compuesto.

Si se siembran tres cepas de micobacterias en un medio de cultivo Middlebrook 7H11 de

cuatro cuadrantes, y además se siembra Mycobacterium bovis en el cuarto cuadrante, se tiene

como resultado la inhibición del crecimiento de Mycobacterium bovis, y el crecimiento de las

demás micobacterias. Esta prueba es fundamental para la diferenciación de Mycobacterium

bovis (con crecimiento) de Mycobacterium tuberculosis (sin crecimiento).



7.3.2.10. CRECIMIENTO EN CLORURO DE SODIO AL 5% .

Ciertas micobacterias tienen la capacidad de crecer en un medio de cultivo de base de

huevo con NaCl al 5%, cuando se incuban a 28 grados centígrados. Estas micobacterias son:

M. flavescens, M. triviale y las micobacterias de crecimiento rápido (excepto M. chelonei).

Las demás no pueden resistir a una gran concentración de sales.

La prueba se realiza en un medio de LowensteinJensen en pico de flauta, el cual contiene

NaCl al 5%, esta prueba no se realiza en un medio de cultivo en placa como el Middlebrook.

7.3.2.11. CRECIMIENTO EN AGAR MACCONKEY

Algunas micobacterias son capaces de crecer en este medio de cultivo (se debe

eliminar el cristal violeta), Mycobacterium fortuitum y Mycobacterium chelonei son capaces

de crecer en este medio.



TABLA 7.8. Características bioquímicas diferenciales para el diagnóstico de Micobacterias

PATÓGENAS.

(+) Positivo, () Negativo, V Variable, Espacios blancos Pocos datos

TABLA 7.7. Características bioquímicas diferenciales para el diagnóstico de Micobacterias PATÓGENAS.

MICROORGANISMO

Temper atura de

aislamiento y tiempo pa ra

el crecimiento óptimos en medio de

cult ivo sólido Middlebrook

Pigmenta ción /luz

P igmentación / oscuridad

Pr ueba de la niacina

Reducción de nitra to

Hidr ólisis del

Tween 8010 días

Catalasa

pH 7.0 Aa 68ºC

Ar ilsulfatasa 3 día s Ur easa Pir azina midasa Incor por ación

de hier ro

Crecimiento sobre la hidr az ida de l ácido t iofeno2 car boxílico (T2H)

Cr ecimiento e n 5% de NaCl

Crecimiento e n Aga r

MacConkey

M. tuberculosis 37 ºC 12 a 25 días Gamuza Gamuza (+) (+) V (—) (—) (+) (+) (—) (+) (—) (—)

M. africanum 37 ºC 31 a 42 días Gamuza Gamuza V V (—) (—) (—) V (—) (—) (+) (—) (—)

M. bovis 37 ºC 24 a 40 días Gamuza Gamuza V (—) (—) (—) (—) (+) (—) (—) (—) (—) (—)

M. ulcerans 32 ºC 28 a 60 días Gamuza Gamuza (—) (—) (—) (+) (—) V (—) (—) (+) (—) (—)

M. kansasii 37 ºC 10 a 20 días Amarillo Gamuza (—) (+) (+) (+) (—) (+) (+) (—) (+) (—) (—)

M. marinum 30 º C 5 a 14 días Amarillo Gamuza V (—) (+) (—) V (+) (+) (—) (+) (—) (—)

M. simiae 37 ºC 7 a 14 días Amarillo Gamuza (+) (—) +/ (+) (—) (+) (—) (—) (+) (—)

M. asiaticum 37 ºC 10 a 21 días Amarillo Gamuza (—) (—) (+) (+) (—) (—) (—) (—) (+) (—)

M. szulgai 37 ºC 12 a 25 días

Amarillo a naranja

Amarillo a 37 ºC

Gamuza a 25 ºC

(—) (+) V (+) (—) (+) (—) (—) (+) (—) (—)

M. scrofulaceum 37 ºC 10 días Amarillo Amarillo (—) (—) (—) (+) (—) (+) V (—) (+) (—) (—)

M. gordonae 37 ºC 10 días Amarillo a naranja Amarillo (—) (—) (+) (+) (—) (—) V (—) (+) (—) (—)

M. thermoresistible 45 ºC 7 días Amarillo Amarillo (—) (+) (+) (+) (—) (+) (—) (+) (—)

M. flavescens 37 ºC 7 a 10 días Amarillo Amarillo (—) (+) (+) (+) (—) (+) (+) (—) (+) V (—)

M. xenopi 42 ºC 14 a 28 días Amarillo Amarillo (—) (—) (—) (+) (+) (—) (+) (—) (+) (—) (—)

Complejo M. avium 37 ºC 10 a 21 días

Gamuza a amarillo pálido

Gamuza a amarillo pálido

(—) (—) (—) (—) (—) (—) (+) (—) (+) (—) V

M. haemophilum 30 ºC 14 a 21 días Gris Gris (—) (—) (—) (—) (—) (—) (+) (—) (+) (—)

M. malmoense 37 ºC 21 a 28 días Gamuza Gamuza (—) (—) (+) V (—) V V (—) (+) (—)

M. shimoidei 37 ºC 14 a 28 días Gamuza Gamuza (—) (—) (+) (—) (—) (—) (+) (—) (+) (—) (—)

M. genavense 37 ºC 14 a 28 días Gamuza Gamuza (—) (—) (+) (+) (—) (+) (+) (—) (+) (—) (—)

M. celatum 37 ºC 14 a 28 días Gamuza Gamuza (—) (—) (—) (+) (+) (—) (+) (—) (+) (—) (—)

M. gastri 37 ºC 10 a 21 días Gamuza Gamuza (—) (—) (+) (—) (—) (+) (—) (—) (+) (—) (—)

Complejo M. terrae 37 ºC 10 a 21 días Gamuza Gamuza (—) V (+) (+) (+) (—) V (—) (+) (—) V

M. triviale 37 ºC 10 a 21 días Gamuza Gamuza (—) (+) (+) (+) V (—) V (—) (+) (+)

M. fortuitum 37 ºC 3 a 5 días Gamuza Gamuza (—) (+) V (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

M. chelonae spp chelonei

28 ºC 3 a 5 días Gamuza Gamuza V (—) V (+) (+) (+) (+) (—) (+) (—) (—)

M. chelonae spp abscessus

35 ºC 3 a 5 días Gamuza Gamuza (—) (—) V (+) (+) (+) (+) (—) (+) (+) (+)

M. smegmatis 37 ºC 3 a 5 días

Gamuza a amarillo

Gamuza a amarillo (—) (+) (+) (+) (—) (+) (+) (—)



7.4. MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS * CALDOS Y SISTEMAS DE DETECCIÓN

AUTOMATIZADOS.

Se ha demostrado que las personas que utilizan botellas de caldo de cultivos líquidos

BACTEC 12B® han experimentado un índice mayor de recuperación de M. tuberculosis y

otras especies de Mycobacterium de 1 a 2 semanas antes que quienes utilizan sólo medios de

cultivo sólidos. Por esto, el empleo de medios de cultivo líquidos para la recuperación

temprana de micobacterias es muy recomendado en la actualidad.

Hasta hoy en día se disponen de tres sistemas automatizados para la detección de

micobacterias:

• El sistema radiométrico BACTEC aceptado y probado por el tiempo,

• El recientemente introducido sistema no radiométrico MB/BacT (Organon Teknika

Durham, NC)

• El sistema ESP Myco (Difco Laboratories, Detroit, Michigan).

Dos alternativas posibles para los laborator ios sin sistemas automatizados son:

• El método manual SeptiChek System (BBL)

• El sistema MGIT (Becton Dickinson, Cockeysville, MD).



7.4.1. SISTEMAS DE DETECCIÓN AUTOMATIZADOS

7.4.1.1. SISTEMA RADIOMETRICO BACTEC AFB

CONSTRUCCIÓN.

Los componentes del instrumento automatizado BACTEC 460 (Becton Dickinson

Diagnostic Instruments, Sparks, MD) incluyen un contador de centelleo, un conjunto de

agujas de aspiración y un riel móvil en el que pueden colocarse hasta 60 botellas de cultivos.

El riel es alineado de modo que cada botella de cultivo pasa por turno bajo el conjunto de

agujas de aspiración a una velocidad de aproximadamente una cada 80 segundos. El

instrumento está equipado con una campana que proporciona aire filtrado por filtros HEPA

bajo presión negativa en el área de prueba y una fuente de luz UV como características de

seguridad adicionales. La aguja es esterilizada por calor electrotécnico durante el intervalo

previo a que se tome la muestra de la próxima botella.

Fig. 7.4.1. Sistema radiométrico BACTAEC AFB



El principio de operación del BACTEC AFB incluye la aspiración de la columna de gas

existente por encima del medio de cultivo de un frasco ampolla sembrado, y la detección

cuantitativa de la radiactividad en el aspirado (C14), la que a su vez refleja el grado de

desarrollo en el frasco ampolla. Los conteos radiactivos del gas se comparan con un valor

basal predeterminado, y de esta forma puede establecerse un índice de desarrollo

BOTELLAS.

Cuando la botella problema está justo debajo del conjunto de agujas, la aguja es

introducida a través del tapón de goma en el espacio de la cabeza. Se aspira una muestra

del gas de la cabeza y se libera a la cámara del contador de centelleo. El gas de la cabeza es

reemplazado con un bolo fresco de CO2 al 10% inmediatamente después de que la muestra es

aspirada.

La botella del caldo de cultivo BACTEC 12B es la clave para la operación. Consiste en un

frasco ampolla de vidrio de 20 mL con un cuello corto, la boca del cual se sella con un fino

tapón de goma. Contiene 4 mL de medio de cultivo líquido que consiste en una base de caldo

de Middlebrook 7H9, BSA, hidrolizado de caseína, catalasa y estearato de polixileno como

enriquecedores del crecimiento, pequeñas cantidades de una mezcla antimicrobiana de

polimixina B, anfotericina B, ácido nalidíxico, trimetoprima y azlocilina para evitar el

crecimiento de contaminantes y ácido palmítico marcado con 14C como detector del

crecimiento.

7.4.2. Botella para cultivo de micobacterias y detección en el sistema radiométrico BACTEC



El frasco ampolla se inocula con 0,5 mL de la muestra procesada y se coloca en una estufa a

35°C. Si hay micobacterias en el inóculo, se libera 14CO2 en el espacio de la cabeza y la

cantidad de éste refleja directo la cantidad de crecimiento en el frasco

ampolla. Se utiliza un sistema detector de radiactividad muy sensible debido a que el

metabolismo muy lento de las micobacterias produce sólo cantidades mínimas de CO2.

LECTURA DE LA PRUEBA

Cuando ha pasado un período designado de tiempo de incubación, los frascos ampolla se

colocan sobre el riel del instrumento BACTEC 460 preparado para las lecturas. La cantidad

de radiactividad se mide en el gas aspirado de la cabeza, el cual es traducido a un valor

numérico denominado índice de crecimiento (IC). Un IC mayor de 10 se considera positivo;

no obstante, deben realizarse coloraciones para acidorresistentes de una pequeña alícuota del

caldo, ya que otras bacterias pueden vencer la inhibición antibiótica.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS.

Con el empleo del sistema BACTEC en comparación con los medios sólidos convencionales,

se ha comunicado tanto un aumento de la cantidad de cultivos positivos provenientes de

muestras clínicas como una disminución del tiempo de detección, El tiempo de detección para

M. tuberculosis promedia los 9 a 14 días; puede ser de menos de 7 días para algunas cepas de

micobacterias diferentes de M. tuberculosis.

Las desventajas del sistema incluyen el costo de los instrumentos, la imposibilidad de

observar la morfología de las colonias y detectar cultivos mixtos, el sobrecrecimiento por

contaminantes, la necesidad de desechar materiales radiactivos y el uso de muchas agujas.



Las muestras procesadas con otros reactivos distintos del NALCNaOH (como el cloruro de

benzalconio o el Zephiranfosfato trisódico) no se pueden emplear con el sistema BACTEC

debido a que las cantidades residuales en el caldo inhibe potencialmente el desarrollo de las

micobacterias.

Una ventaja adicional del sistema BACTEC es la capacidad de realizar estudios rápidos de

susceptibilidad a las drogas antimicobacterianas. El instrumento BACTEC, también se puede

utilizar para diferenciar M. tuberculosis y M. bovis de las micobacterias no tuberculosas

mediante el empleo de frascos ampolla de cultivos de sangre con pnitroacetilamino

hidroxipropiofenona , (NAP). M. tuberculosis y M. bovis no pueden desarrollarse en medios

de cultivo con NAP y, por lo tanto, no pueden producir un IC positivo después de varios días

de incubación.

7.4.1.2. SISTEMA DE DETECCIÓN DE MICOBACTERIAS MB/BACT

CONSTRUCCIÓN

Las micobacterias son bacterias aeróbicas, por lo tanto estas consumen oxígeno (O2) y

generan bióxido de carbono (CO2) como parte de su metabolismo. El sistema automatizado

MB/BACT, posee una lámpara luz, el equipo hace reflejar el haz de luz visible hacia el sensor

del fondo de la botella Bactec . El fondo de la botella cambia de color conforme el grado de

bióxido de carbono (CO2) producido.

7.4.3. Construcción de la lámpara de luz, del equipo MB/BACT



Finalmente el software del equipo registra el cambio de color determinando el grado de

positividad de la muestra.

BOTELLAS

El MB/BacT es un sistema automatizado para detectar micobacterias. Las botellas para

procesamiento MB/BacT contienen 10 mL de caldo de Middlebrook 7H9 enriquecido

en una atmósfera de bióxido de carbono (CO2), nitrógeno y oxígeno bajo vacío. Por esta

razón, esta botella proporciona las condiciones nutritivas y ambientales adecuadas para

recuperar las especies de Mycobacterium encontradas con más frecuencia en las muestras

clínicas de sangre.

7.4.5. Sistema MB/BACT 950, muy utilizado para el procesamiento de hemocultivos.

7.4.4. Fondo de botella, comparación de resultados: positivo y negativo.



Se agrega medio mililitro del suplemento antibiótico reconstituido para micobacterias que

contiene anfotericina B, azlocilina, ácido nalidíxico, polimixina B, trimetoprima y factores de

crecimiento patentados a cada botella justo antes de usarlas para aumentar el desarrollo de

especies de Mycobacterium y reducir el de las bacterias contaminantes que puedan sobrevivir

al procedimiento de descontaminación y concentración, El fondo de cada botella de caldo está

cubierto con un sensor permeable al gas que cambia de verde oscuro a amarillo brillante

cuando se produce bióxido de carbono (CO2) en el caldo por el metabolismo de las

micobacterias.

Las botellas se colocan paradas dentro de los orificios individuales en la cámara incubadora, y

se utiliza luz reflejada para monitorear continuamente la producción de CO2 generada por las

bacterias.

Conforme la micobacteria crece en el medio, esta consume oxígeno, y el compuesto

fluorescente embebido en el fondo del tubo al no estar unido con el oxígeno es capaz de emitir

luz fluorescente.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS

7.4.6. Botellas de cultivo líquido, para uso en el sistema MB/BACT 950, obsérvese la fluorescencia en el fondo de las botellas.



A pesar de que los ensayos de campo multicéntricos patrocinados por los fabricantes indican

que el sistema radiométrico BACTEC tiene ventaja sobre el sistema MB/BacT. Este último

recupera un porcentaje más alto de micobacterías con menos tiempo en comparación con los

métodos convencionales y la detección colorimétrica del crecimiento micobacteriano elimina

la necesidad del manejo y descarte de reactivos con radioisótopos, esta es una ventaja clara.

7.4.1.3. SISTEMA ESP MYCO

CONSTRUCCIÓN

Cada botella de cultivo, cuando se coloca en una gaveta especial en el módulo de la

estufa, es unida a un sensor, que consiste en una caja plástica, una aguja suspendida y una

membrana hidrofóbica. Así, cada botella es continuamente monitoreada para evaluar

cualquier cambio en la presión de gas debido a la actividad metabólica de los

microorganismos en la botella de cultivo. Los cambios de presión significativos pueden ser

indicados tempranamente a partir del consumo de oxígeno; o, más tarde, con la producción de

gases del metabolismo de los microorganismos.

Fig. 7.4.7. Sistema ESP MYCO, Un sistema moderno, el cual se auto revisa diariamente y lleva un control automático del índice de crecimiento.



BOTELLAS

Cada botella contiene medio modificado de Middlebrook 7H9, Casitone, glicerol y esponjas

de celulosa. Las esponjas proporcionan una plataforma de crecimiento para las micobacterias,

ya que simulan los alvéolos de los pulmones. Inmediatamente antes de la inoculación de la

muestra, cada botella es suplementada con una mezcla antibiótica (PVNA) que contiene

polimixina B, vancomicina, ácido nalidíxico y anfotericina B.


Este sistema esta basado en la señal temprana durante la fase del consumo de oxígeno en el

ciclo de crecimiento, ya que las botellas están unidas a un sensor durante su incubación y son

monitoreadas continuamente.

El método de detección no radiométrico utilizado también excluye la necesidad de manipular

y descartar materiales radiactivos.

7.4.1.4. SISTEMA MGIT 960

CONSTRUCCIÓN

El Bactec MGIT960 es un sistema automatizado no radiométrico de alto rendimiento

para al detección de micobacterias, diferenciación y pruebas de susceptibilidad. Este sistema

utiliza tubos MGIT para hacer crecer a la micobacteria, así como probar su susceptibilidad a

diversos compuestos antituberculosos.



Un compuesto fluorescente es embebido en siliconas en el fondo del tubo. Este compuesto es

sensible al oxígeno disuelto en el medio (no emite fluorescencia en contacto con un alto grado

de oxígeno).

Conforme la micobacteria crece en el medio, esta consume oxígeno, y el compuesto

fluorescente embebido en el fondo del tubo al no estar unido con el oxígeno es capaz de emitir

luz fluorescente.

La lectura de estos tubos, se pueden realizar ya sea utilizando el equipo automatizado: MGIT

960, o bien realizando la lectura manual de los tubos frente a una luz UV. Más adelante se

explica esta forma de lectura manual

Fig. 7.4.8. Fundamento químico de los tubos MGIT.



La micobacterias que identifica el equipo son:

• M. tuberculosis

• M. aviumintracellulare

• M. kansasii

• M. xenopi

• M. simiae

• M. flavescens

• M. chelonae

• M. fortuitum

• M. gordonae

Fig. 7.4.9. Sistema automatizado MGIT 960, posee una amplia base de datos, para la detección definitiva de diversas micobacterias patógenas.



BOTELLAS

El sistema Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) (BBL, Becton Dickinson,

Microbiology Systems, Hunt Valley, MD) consiste en un tubo de vidrio con fondo redondo de

16 x 100 mm que contiene 4 mL de base de caldo Middlebrook 7H11 modificado, al cual se le

ha agrega 0,5 mL de OADC como enriquecimiento (ácido oleico, albúmina bovina, dextrosa y

catalasa) y 0,1 mL de la mezcla antibiótica PANTA (polimixina B, anfotericina B, ácido

nalidíxico, trimetoprima, azlocilina).

La mezcla antibiótica inhibe el desarrollo de bacterias contaminantes; el suplemento OADC

proporciona ácido oleico, un importante estimulante metabólico para las micobacterias;

albúmina, para unirse a los ácidos grasos libres tóxicos; dextrosa, como fuente de energía; y

catalasa, para destruir los peróxidos tóxicos que pueden estar presentes en el medio. Un

compuesto fluorescente es embebido en siliconas en el fondo del tubo. Este compuesto es

sensible al oxígeno disuelto en el medio; es decir, la presencia de oxígeno en el medio no

inoculado sirve para extinguir la emisión de luz fluorescente.

.

Fig. 7.4.10. Tubo indicador MGIT, si el sistema automatizado falla, con una simple lámpara de luz ultravioleta, visualmente se puede revisar la identificación.



LECTURA

Para realizar la prueba, los 0,1 mL de PANTA y los 0,5 mL de la mezcla OADC se

agregan asépticamente al tubo, y se reconstituye el medio liofilizado. Esto es seguido por 0,5

mL de muestra o un concentrado de ella; si se agrega más de 0,5 mL de muestra puede afectar

adversamente el rendimiento del tubo. Se coloca la tapa, se mezclan los ingredientes por

inversión del tubo varias veces y se coloca el tubo en la estufa del equipo MGIT 960 a 37°C

Como el crecimiento bacteriano activo consume el oxígeno disuelto, la fluorescencia es

desenmascarada y es detectada automáticamente por el equipo MGIT 960. Además estos

tubos pueden leerse manualmente mediante el uso de una lámpara de luz ultravioleta (véase

más adelante).

7.4.2. SISTEMAS DE DETECCIÓN MANUALES (SEMIAUTOMATIZADOS).

7.4.2.1. SISTEMA SEPTICHEK AFB

CONSTRUCCIÓN

Este sistema consiste en una botella tapada que contiene 20 mL de caldo Middlebrook 7H9

modificado bajo bióxido de carbono (CO2) al 20%. Un segundo componente es un tubo

plástico, tapado en un extremo con una tapa a rosca removible, dentro del cual está incluida

una paleta de dos caras, en cuyas dos superficies está embebido el medio sólido.



Una superficie de la paleta está cubierta con agar Middlebrook 7H11 no selectivo; el lado

opuesto está dividido en dos secciones, una contiene medio LJ modificado y la otra agar

chocolate para detectar el crecimiento de bacterias contaminantes.

LECTURA

El sistema se procesa mediante extracción de la tapa de la botella que contiene el medio de

cultivo, al cual se le agrega 1 mL de un suplemento reconstituido, también provisto por el

fabricante, compuesto de glucosa, glicerina, ácido oleico, piridoxina, HCl, catalasa, albúmina,

azlocilina, ácido nalidíxico, trimetoprima, polimixina B Y.Afifotericina B. El caldo

suplementado se inocula luego con 0,5 mL de una muestra tratada con NALCNaOH. Se

retira la tapa a rosca de la parte superior de la paleta y se asegura el conjunto a la botella de

caldo de cultivo.

Fig.7.4.11. Sistema no automatizado SEPTICHEK, estos sistemas poseen la gran ventaja de poseer 2 medios bifásicos: sólidolíquido, que permite la recuperación de M. tuberculosis más rápidamente, que cuando se utilizan medios de cultivo sólidos.



Los medios de cultivo sólidos sobre la paleta son inoculados invirtiendo el conjunto, para

permitir que la mezcla del caldo de cultivo bañe toda la superficie del agar. El sistema es

colocado luego en una estufa a 35°C en posición vertical. Las superficies del agar y los

medios de cultivo se examinan cada tres días para ver la aparición del desarrollo, después de

lo cual, si es negativo, el conjunto se invierte de nuevo para reinocular el medio con agar.

Si se observa crecimiento, deben realizarse frotis para acidorresistentes a partir de las colonias

aisladas que desarrollan sobre la superficie del agar y pueden realizarse subcultivos del caldo

a los medios selectivos apropiados o pueden prepararse para el

análisis de sondas de DNA.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS.

Mejor índice de recuperación que los medios sólidos, atribuido a la naturaleza bifásica

del sistema y la ventaja se obtenía por la repetida exposición temprana del medio con agar a

los microorganismos que proliferaron en la fase líquida.

Comparado con el LJ y el Middlebrook 7H11, el promedio de días para la recuperación de

micobacterias es menor para el sistema SeptiChek AFB; 3 días menos para la detección de

M. tuberculosis y 9 días menos para el M. aviumintracellulare.



7.4.2.2. TUBO INDICADOR DE CRECIMIENTO DE MICOBACTERIAS (MGIT).

BOTELLAS

Los tubos MGIT son iguales a los utilizados en el sistema MGIT 960, para aquellos usuarios

que no dispongan del equipo automatizado, solo tienen que comprar los tubos MGIT, realizar

el procedimiento descrito anteriormente, y leer la fluorescencia del tubo visualmente mediante

el uso de una lámpara ultravioleta.

LECTURA

Los tubos se leen por medio, de una lámpara de Wood, colocando el tubo con la mezcla que

se va a probar entre un control positivo (solución de sulfito de sodio) y uno negativo (tubo

MGIT sin inocular).

* NOTA. No leer en la oscuridad.

Fig. 7.4.12. Tubo indicador MGIT



Colocar los tubos en forma vertical directamente en la lámpara de Wood o un

transiluminador.

* Si observa una fluorescencia naranja o resplandor naranja, la prueba es positiva.

* Si no se observa la fluorescencia naranja, la prueba es negativa.

Se deben utilizar anteojos protectores de luz UV para observar el color naranja brillante en el

fondo de los tubos positivos, con una reflexión naranja observada también en el menisco.

Los tubos positivos se tiñen para acidorresistentes. Los tubos negativos se colocan

nuevamente en la estufa y se observan a intervalos regulares hasta las 6 semanas.

7.4.2.2.1. LECTOR BACTEC MICROMGIT ™

El lector MGIT ™, es utilizado en laboratorios de pequeño volumen o laboratorios con

poco espacio de trabajo para cultivo de micobacterias.

Este lector MicroMGIT ayuda de una manera sencilla a interpretar el nivel de fluorescencia

en el tubo MGIT, eliminando así la subjetividad de la lectura visual.

.



El lector es fácil de usar, es operado con una batería intercambiable, no requiere energía

eléctrica, utiliza un botón sencillo de operación y uso de iconos en pantalla.

Solamente se coloca el tubo en la parte superior del lector, y la lectura es automática

eliminando así la subjetividad visual


Todas las reacciones positivas deben ser confirmadas por una coloración para

acidorresistentes debido a que en ocasiones pueden desarrollar otras bacterias que consumen

oxígeno a pesar de la mezcla antibiótica PANTA. Una desventaja importante es el alto costo

de cada tubo (unos 8 dólares por unidad); sin embargo, esto es compensado en algún grado,

ya que la fluorescencia se observa visualmente y no requiere equipos elaborados o costosos.

Fig. 7.4.13. Lector manual de tubos MGIT



Tabla 7.9. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE SISTEMAS AUTOMATIZADOS Y SEMI AUTOMATIZADOS PARA LA DETECCIÓN DE Mycobacterium tuberculosis.

SISTEMA LECTURA VENTAJAS DESVENTAJAS

BACTEC AFB

AUTOMATIZADA

Detección radiométrica mediante radioisótopos (Detección de CO2 marcado con el isótopo radioactivo C14 )

Aislamiento en 9 a 14 días.

Es el equipo más específico para la detección de micobacterias, ya que utiliza C14 como un marcador de crecimiento.

En comparación con los medios de cultivo sólidos y sistemas convencionales, el BACTEC AFB es más rápido y tiene mayor capacidad de aislamiento

Las pruebas de susceptibilidad para este sistema son altamente confiables y se logran resultados al mismo tiempo del aislamiento o más tardar en 18 días

Costo excesivamente elevado del sistema.

Necesidad de desechar residuos radioactivos

Solo muestras descontaminadas con NALC NaOH podrán ser procesadas en este sistema.

Solo laboratorios con un nivel de bioseguridad III podrá tener este sistema (debido a la utilización de residuos radioactivos).

Requiere un alto nivel de consumibles

MB /BACT

AUTOMATIZADA

Detección calorimétrica (Detección de cambio de color mediante un haz de luz visible)

Aislamiento en 14 días o más

No tiene la necesidad de utilizar reactivos radioactivos, y por lo tanto no necesita de un control de bioseguridad para este tipo de residuos

En comparación con los medios de cultivo sólidos y sistemas convencionales, el MB/BACT es más rápido y confiable

Las pruebas de susceptibilidad son rápidas

Se requieren consumibles:

PANTA Y OADC Costo elevado del sistema



ESP/MYCO

AUTOMATIZADA

Detección de cambios de presión dentro de la botella y la producción de gases (O2, CO2, NH2, H2) por parte de la micobacteria.

Aislamiento hasta en 7 días (es el más rápido) debido al constante monitoreo de las botellas durante su incubación

No tiene la necesidad de utilizar reactivos radioactivos, y por lo tanto no necesita de un control de bioseguridad para este tipo de residuos.

Una gran ventaja de este equipo es el constante monitoreo por agitación automática de las botellas

En comparación con los medios de cultivo sólidos y sistemas convencionales, el sistema ESP / MYCO es más rápido y confiable

Cuenta con botellas para uso pediátrico, las cuales requieren poco volumen de hasta 0.1 mL de muestra.

Costo elevado del sistema

Requiere un alto nivel de consumibles

MGIT 960

AUTOMATIZADA

Compuestos fluorescentes embebidos en el tubo; estos indican el consumo de oxígeno de la bacteria que es detectado mediante una lámpara de luz ultravioleta y traducida la señal por el equipo automatizado..

Aislamiento en 14 días o más


En comparación con los medios de cultivo sólidos y sistemas convencionales, el MGIT es más rápido y confiable

Las pruebas de susceptibilidad son

Costo elevado del sistema.

Se requieren consumibles: PANTA Y OADC



rápidas, de hasta 7 días.

SEPTICHEK AFB

SEMIAUTOMATIZADA / MANUAL

Detección de colonias aisladas en el medió sólido, su crecimiento es favorecido por la fase líquida de la botella

Aislamiento hasta en 16 y 18 días de incubación.

Es más rápido y confiable que cualquier medio sólido existente, gracias a su naturalidad bifásica de la botella

Costo relativamente accesible


Si hay crecimiento la identificación del género y especie se realiza mediante 2 pasos: Tinción de acidorresistente y subcultivo en medios sólidos selectivos para posterior identificación mediante pruebas bioquímicas y especialmente sondas de DNA (Biología molecular).

Las pruebas de susceptibilidad se realizan por separado por otros métodos.

TUBO INDICADOR MGIT Y LECTOR MICRO MGIT™

SEMIAUTOMATIZADA / MANUAL

Compuestos fluorescentes embebidos en el tubo; estos indican el consumo de oxígeno de la bacteria. La fluorescencia es detectada visualmente utilizando una lámpara de luz ultravioleta.

Aislamiento hasta en 14 días de incubación.

Ahorra espacio

Costo accesible

Es más rápido y confiable que cualquier medio sólido existente.


La Identificación solo puede ser a nivel de genero

Las pruebas de susceptibilidad se realizan en tubos separados. (Se tiene que comprar 1 tubo para cada uno de los antituberculosos manejados).

Se requieren consumibles: PANTA Y OADC



7.5. APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR.

Las aplicaciones de la biología molecular en nuestro país están limitadas a laboratorios

muy especializados o laboratorios de investigación. Por su costo estas pruebas diagnosticas no

están disponibles en la mayoría de los laboratorios clínicos de rutina y a menudo son

subrogadas a otros laboratorios. Esta es la desventaja principal de estas pruebas, que a pesar

de ser el futuro de la microbiología diagnostica, aun no se han logrado estandarizar y facilitar

para uso de rutina.

7.5.1. DETECCIÓN DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE LA

AMPLIFICACIÓN DE SU DNA (PCR).

La amplificación del material genético de M. tuberculosis mediante una reacción enzimática

da lugar a millones de copias del DNA blanco. Teóricamente este hecho convierte a la PCR

en la técnica de diagnóstico más rápida y especifica de todas las técnicas de diagnóstico

actualmente utilizadas, ya que, en teoría esta puede ser utilizada sin la necesidad de aislar

previamente a la micobacteria en un medio de cultivo.

En 1983 a 1985, Kary Mullis desarrolló una nueva técnica que hizo posible la síntesis de

grandes cantidades de un fragmento de DNA sin clonarlo.



El primer paso consiste en sintetizar fragmentos con secuencias idénticas a las que flanquean

la secuencia blanco. Esto se consigue por medio de una maquina sintetizadora de DNA

.Estos oligonucleótidos sintéticos suelen tener unos 20 nucleótidos de longitud y actúan como

iniciadores de la síntesis de DNA

La mezcla de reacción contiene el DNA blanco (material genético de la micobacteria en este

caso), un gran exceso de los iniciadores deseados, una DNA polimerasa termoestable y cuatro

desoxirribonucleósidos trifosfato.

El ciclo en sí de la P C R tiene lugar en 3 fases:

Fase 1: El DNA blanco que contiene la secuencia que va a amplificarse se desnaturaliza por

calentamiento, separando sus cadenas complementarias.

Fig. 7.5.1. Fase 1, desnaturalización del material genético por calentamiento.



Fase 2: La temperatura desciende de forma que los iniciadores pueden formar puentes de

hidrógeno con el DNA blanco, uniéndose a ambos lados de la secuencia previamente

separada. Como existe un exceso de iniciadores, las cadenas de DNA blanco normalmente se

asociarán o unirán al iniciador en vez de volverse a unir entre sí.

Fase 3: Se añaden nucleósidos trifosfato y la DNA polimerasa. La DNA polimerasa extiende

a los iniciadores y sintetiza copias de la secuencia del DNA blanco.

Fig. 7.5.2. Fase 2, Al bajar la temperatura, los iniciadores vuelven a formar puentes de hidrógeno y se unen a la secuencia del DNA blanco.

Fig. 7.5.3. Fase 3, Se añade la DNA polimeraza y los nucleósidos trifosfato.



Al final de cada ciclo, las secuencias del DNA blanco de ambas cadenas han sido copiadas.

Cuando se repite el ciclo, las cuatro cadenas producidas en el primer ciclo se copian para

producir 8 fragmentos nuevos, el tercer ciclo generará 16 productos. En teoría 20 ciclos

producirián 1 millón de copias de la secuencia blanco.

La desventaja de esta maravillosa técnica es el difícil manejo durante su procedimiento y que

esta debe de estar sujeta a estrictos controles de calidad, sin mencionar su precio. Actualmente

en laboratorios especializados o de referencia, primeramente se obtiene el aislamiento por

cultivo, luego utilizan la amplificación del material genético de las colonias aisladas mediante

un termociclador, y finalmente identifican el agente mediante la hibridación con sondas de

DNA marcadas (véase más adelante). En países ya desarrollados, la PCR ha sustituido a la

identificación de micobacterias por medio del uso de pruebas bioquímicas.

Fig 7.5.5. Termociclador de PCR moderno para la amplificación del DNA .

Fig. 7.5.4. Finalmente, se completa el ciclo, y de una cadena de DNA se forman 4.



Existen también diversas variantes de la PCR, cono la PCR inversa, PCR anidada, PCR

múltiple; todas ellas desarrolladas con fines diagnósticos, que sin duda fijan el futuro próximo

de la microbiología clínica.

7.5.2. USO DE SONDAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS PARA LA CONFIRMACIÓN DE

CULTIVOS POSITIVOS DE Mycobacterium tuberculosis.

Una sonda es una secuencia de cadena simple de ácido nucleico que puede hibridar

específicamente con su cadena complementaria mediante el apareamiento de bases. Una

sonda puede ser tanto de DNA o RNA. El principio de esta tecnología, es la desnaturalización

del DNA blanco, y la posterior hibridación con una sonda de DNA o RNA marcada con un

compuesto radioactivo.

Actualmente en el mercado, existen diferentes reactivos de sondas de DNA da cadena simple

marcadas con I 125 (radioisótopo radioactivo de yodo 125) complementarias del rRNA de

diversas especies de micobacterias, entre ellas: M. tuberculosis.

PRINCIPIO

El rRNA liberado de la bacteria que se va a probar (M. tuberculosis por ejemplo) a través de

la acción de un agente lítico, calor y sonicación, se hibridiza con la sonda de DNA de cadena

simple marcada con I 125 para formar un complejo DNARNA estable.



Después de la separación del complejo marcado del DNA, se cuentan los complejos DNA

RNA radiactivos. Los resultados de la prueba se calculan como porcentaje de hibridación de

la sonda inicial.

Los altos niveles de exactitud, especificidad y sensibilidad de estas sondas para la

confirmación de especies clínicas de Mycobacterium han sido certificadas en varios estudios

científicos alrededor del mundo. También existen sondas de ácidos nucleicos no isotópicas

para la identificación de varias especies de micobacterias. Estas sondas, son sondas de DNA

Fig. 7.5.6. Esquematización del procedimiento empleado para la identificación de M. tuberculosis por medio del uso de sondas de DNA marcadas con radioisótopos fluorescentes.



de cadena simple, marcadas con éster de acridina complementarias al rRNA del

microorganismo blanco.

Para poder realizar la prueba de identificación mediante sondas de DNA, es necesario tener el

cultivo o aislamiento primario de M. tuberculosis (y de preferencia amplificar su material

genético mediante PCR). Como hemos revisado anteriormente existen medios para el

aislamiento primario: medios líquidos y medios sólidos, el uso de cualquiera de estos medios

de cultivo son necesarios para el posterior diagnostico mediante sondas de DNA.

La ventaja de utilizar medios líquidos como aislamiento es su rapidez, ya que el aislamiento

primario en medios sólidos es de 4 semanas y de 3 semanas utilizando Middlebrook 7H11.

Los medios líquidos tardan hasta 7 días después de la inoculación en indicar una

fluorescencia, radiactividad, presión o actividad metabólica, estableciendo la positividad de la

prueba. El sistema SEPTICHEK ofrece una clara ventaja, ya que es un medio de cultivo

bifásico (medio líquido + medio sólido al mismo tiempo).



7.6. OTRAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS.

7.6.1. CROMATOGRAFÍA GASLÍQUIDO Y CROMATOGRAFÍA DE ALTA

RESOLUCIÓN.

La cromatografía se basa en que los compuestos poseen diferentes solubilidades

cuando son expuestos a distintos materiales o fases no miscibles. El principio de la

cromatografía es lograr un equilibrio de absorción entre dos fases, una móvil y la otra

estacionaria. Las fases móvil y estacionaria existen virtualmente en todos los tipos de

cromatografía.

En la cromatografía Gas líquida, un gas inerte que actúa como transportador (nirógeno, helio,

argón) es la fase móvil y en ella se inyecta la muestra para el análisis. La fase estacionaria

consiste en una matriz sólida (sílica o celita) cubierta por un líquido inerte y fácilmente

volatilizable. Estos materiales cubren la superficie interna de un tubo capilar (columna)

enrollado de vidrio que está encerrada en la unidad de calentamiento.

La muestra en análisis es volatilizada por calor en la zona de inyección de la columna, donde

se mezcla inmediatamente con el flujo del gas transportador. Los compuestos presentes en la

muestra se distribuyen entre la fase inerte y móvil de la columna en función de sus afinidades

relativas por la fase cubierta de la columna.

Los compuestos con baja afinidad son los que pasan más rápido a través de la columna y se

detectan primero; aquellos con mayor afinidad se mueven a través de la columna más

lentamente y emergen últimos.



El tiempo que transcurre entre la inyección de un material dado en la columna y su aparición

en el sistema de detección se denomina "tiempo de retención". Este tiempo de retención, en

condiciones definidas de temperatura, tipo de gas transportador y empaquetamiento de la

columna, es constante; por lo tanto, compuestos desconocidos pueden ser identificados por

comparación con muestras conocidas, preparadas de un modo similar y corridas a través de la

misma columna.

La composición de los ácidos micólicos y constituyentes de los ácidos grasos de la pared

celular de las micobacterias, son componentes que pueden ser determinados por técnicas

cromatográficas como: cromatografía gaslíquido (GLC), cromatografía líquida de alta

presión (HPLC).

El ácido tuberculoestéarico (TBE) es un compuesto de ácidos grasos largos de cadena larga de

la pared celular de M. tuberculosis, que puede descubrirse desde concentraciones en

femtomoles con cromatografía de gaslíquido.

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) puede analizar ácidos grasos de cadena

larga, varios componentes de la membrana celular de diferentes bacterias. Los

microorganismos crecidos en condiciones estandarizadas son cosechados y saponificados con

hidróxido para liberar los ácidos grasos de cadena larga de las células intactas. Estos ácidos

grasos son metilados para volverlos volátiles, extraídos con un solvente orgánico (hexano:

metil tertbutil éter) e inyectados en una columna que contiene una fase líquida de fénil métil

silicona entrecruzada adsorbida sobre silicua fundida y con hidrógeno como gas

transportador. La detección de los derivados metilesterificados de los ácidos grasos se realiza

con ionizador de llama. El detector emplea una mezcla de oxígeno ardiente e hidrógeno para

encender a los compuestos orgánicos; las partículas ionizadas de la muestra pasan luego entre



los alambres con carga opuesta, que genera una fluctuación en la corriente que es medida y

trasladada a un registro permanente.

De tal manera que el HPLC es capaz de detectar cantidades infinitesimales de determinadas

sustancias químicas en líquidos orgánicos (en este caso los ácidos micólicos de M.

tuberculosis), y aumenta la señal de determinada sustancia hasta un millón de veces, para que

estas puedan ser interpretadas por un software específico, mostrando en pantalla una señal en

forma de gráfica, en la que cada pico demuestra la concentración del analito o compuesto que

se busca en una muestra clínica determinada.

Fig. 7.5.7. Equipo automatizado de cromatografía de alta resolución (HPLC).



En la siguiente imagen se muestra un cromatograma, el cual muestra la identificación de picos

(señal), que separan o identifican varios componentes de benceno en una muestra problema

(mezcla).

El uso práctico de HPLC para el diagnostico de tuberculosis, tan solo consta en

descontaminación previo a la muestra (en caso de que se requiera como las muestras de

esputo) antes de someterla al aparato. En caso de muestras como líquido cefalorraquídeo, no

tendría caso un pretratamiento de la muestra. Este sistema ha sido empleado con gran éxito

en países ya desarrollados para la detección de tuberculosis meníngea en niños. Entonces el

cromatograma de ácidos micólicos sería específico para ciertas especies de micobacterias,

como habíamos mencionado anteriormente, para Mycobacterium tuberculosis la señal leída

seria el pico perteneciente al ácido tuberculoesteárico cuya concentración aseguraría su

presencia en la muestra analizada.

Fig. 7.5.8. Ejemplo de lectura de un cromatográma detectado en un equipo de HPLC.



7.3.5.2. ANTICUERPOS ANTI Mycobacter ium tuberculosis.

En la sección de patogenía e inmunidad, revisamos como el organismo humano se

defiende ante una infección por M. tuberculosis. A grandes rasgos, se entiende claramente la

forma en que nuestro sistema inmunitario se defiende, esta es mediante una respuesta de

hipersensibilidad retarda por parte de los macrófagos, junto con las diversas linfocinas y

citocinas secretadas por los linfocitos que ocasionan una zona de necrosis en el tejido o zona

de lesión provocando la detención de la tuberculosis mediante la posterior calcificación de la

zona lesionada (lo anterior descrito se aplica solo en caso de que el cuerpo del paciente fuera

inmune a la micobacteria). Se puede destacar, que en la tuberculosis, la respuesta

inmunológica humoral o respuesta específica mediada por anticuerpos de memoria no es útil

para aniquilar al bacilo tuberculoso.

Entonces de que ayudan los anticuerpos en esta enfermedad ?

A pesar de que los anticuerpos en la tuberculosis no tienen una función defensora, estos son

secretados de forma sistemática, y nos sirven para determinar un posible diagnostico de la

enfermedad. La técnica más confiable en la medición de anticuerpos es la técnica EIA

(Enzimoinmunoensayo) y ELISA (Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima).



Aunque en la práctica diaria estas técnicas son altamente específicas para la detección de

anticuerpos o antígenos de muchas enfermedades, en el diagnóstico de la tuberculosis solo se

obtiene una sensibilidad de 80 %. Esto se debe a que las paredes celulares de las

micobacterias son similares entre si y con otros hongos (comparten epitopes o determinantes

antigénicos) y no se puede proporcionar un diagnóstico 100 % especifico y sensible, como lo

es cuando ELISA es aplicado en el diagnóstico de otras enfermedades. Otra gran desventaja

de las pruebas diagnósticas por serología son; la imposibilidad de detectar anticuerpos anti

M.tuberculosis en una etapas tempranas de la tuberculosis.

Sin embargo, la medición serológica de anticuerpos IgG e IgM en suero, tiene una clara

ventaja sobre las demás técnicas cuando esta es acompañada del diagnóstico radiológico y

baciloscopico del paciente.

Cuando esta técnica se logre perfeccionar al grado de que no existan reacciones cruzadas, será

sin duda la mejor técnica diagnostica. Ya que es una técnica muy rápida, es automatizable, se

necesitan unos pocos mililitros de sangre, está al alcance de la mayoría de los laboratorios del

país y si se utilizan anticuerpos monoclonales para su empleo podría llegar a ser tan específica

como las técnicas de PCR.

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Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Qu ... · de replicarse, pero si de unirse al colorante de fuscina). 7.2.2. TIPOS D E TINCIONES PARA MICOBACTERIAS. Básicamente