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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E
ENGENHARIA DE MATERIAIS
TESE DE DOUTORADO
Tratamento Térmico do Titânio e suas Consequências Sobre as Propriedades
Físico-químicas e de Biocompatibilidade
HAROLDO REIS ALVES DE MACÊDO
Orientador: Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior
Tese n° 99/PPGCEM
Natal, Fevereiro de 2012.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E
ENGENHARIA DE MATERIAIS
Haroldo Reis Alves de Macêdo
Tratamento Térmico do Titânio e suas Consequências Sobre as Propriedades
Físico-químicas e de Biocompatibilidade
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências e Engenharia de
Materiais do Centro de Ciências Exatas e da
Terra da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Doutor em
Ciências e Engenharia de Materiais.
Orientador: Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior.
Natal, Fevereiro de 2012.
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila
Mamede
Macêdo, Haroldo Reis Alves de.
Tratamento térmico do titânio e suas conseqüências sobre as
propriedades físico-químicas e de biocompatibilidade / Haroldo Reis
Alves de Macêdo. – Natal, RN, 2012.
107 f.; il.
Orientador: Clodomiro Alves Júnior.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Centro de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em
Ciência e Engenharia de Materiais.
1. Biologia celular – Tese. 2. Titânio – Tratamento térmico -Tese.
3. Resposta biológica – Tese. 4. Biocompatibilidade – Tese. I. Alves
Júnior, Clodomiro. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 576
Dedico este trabalho a minha família e à
minha esposa Marina pelo amor, compreensão,
carinho e incentivo nas dificuldades e a todos que
direta ou indiretamente contribuíram para sua
concretização.
Agradecimentos
A Deus pela sabedoria e saúde ....
A minha mãe Teresa Cristina e a meu pai Haroldo Macedo pelo incentivo
e apoio.
A minha esposa, Marina, pelo seu amor e por sempre ter me ajudado na
escrita dos trabalhos.
Ao professor Dr. Clodomiro Alves Júnior pela orientação deste trabalho,
pelo incentivo e pela amizade.
Ao professor Dr. Hugo Alexandre por ter cedido o laboratório, as células
utilizadas neste trabalho e principalmente pela orientação nos assuntos
relacionados à parte biológica, a seus alunos em especial a Raniere e a Moacir
pela colaboração na execução dos ensaios biológicos.
Ao professor Dr. Hamilton da UFC por ter cedido o laboratório de
microscopia para a realização da caracterização por EBSD e ao Flavio, técnico
deste laboratório que operou o equipamento na realização das análises.
Ao professor Dr. Jorge Lourenço do IFRN por ter cedido o forno para
realização dos tratamentos térmicos.
Ao professor Dr. Carlos Eduardo e ao HEMONORTE pela realização dos
ensaios com as integrinas.
Ao Erico, Artejose e Leopoldino, técnicos do NEPGN/UFRN que muito
contribuíram na realização das analises de DRX e MEV.
Ao professor Dr. Wanderson Santana pelos conhecimentos repassados
no que se refere às microestruturas decorrentes de tratamentos térmicos.
A todos os professores da Engenharia de Materiais pelo apoio e
competência em ministrar as disciplinas do curso.
Aos amigos Professores Dr. Ayrton de Sá Brandim, Dr. Marcio Cleto e
Dr. Luiz Fernando pela amizade, incentivo e apoio no meu aprimoramento
acadêmico.
A todos os integrantes do LABPLASMA pela convivência fraterna
durante os anos que estive no mesmo em especial aos que tive mais
proximidade: Marcio Willians, Narayanna, Duciane, Raquel, Jussier, Natalia,
etc.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
Resumo
Macêdo, H.R.A, Tratamento Térmico do Titânio e suas Consequências
Sobre as Propriedades Físico-químicas e de Biocompatibilidade. 2012.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2012.
O titânio e suas ligas são amplamente utilizados como biomaterial em
dispositivos biomédicos e devido a isso pesquisas têm sido desenvolvidas
visando aperfeiçoar e/ou compreender melhor a interação biomaterial/meio
biológico. O processo de fabricação desses dispositivos de titânio geralmente
envolve uma série de processos térmicos e mecânicos e que têm
consequências no produto final. Os tratamentos térmicos são usualmente
utilizados para obtenção de propriedades diferenciadas para cada aplicação.
Com o intuito de entender a influência desses tratamentos sobre a resposta
biológica da superfície, foram realizados, no presente trabalho, diferentes
tratamentos térmicos em titânio e analisadas suas influências na morfologia,
adesão e proliferação de células pré-osteoblástica (MC3T3-E1). Para tanto os
discos de titânio tratados termicamente foram caracterizados por microscopia
ótica, ângulo de contato, energia de superfície, rugosidade, microdureza
Vickers, difração de raios-X e microscopia eletrônica de varredura através das
técnicas de EBS, EDS e EBSD. Para análise da resposta biológica foram
realizados teste de proliferação por MTT, adesão por cristal violeta e expressão
da integrina β1 por citometria de fluxo. Foi verificado que na presença de uma
microestrutura muito ordenada, definida através de um ataque químico, as
células tendem a se alongar no mesmo sentido da orientação microestrutural
do material. Quando essa ordem não acontece, o fator mais importante a
influenciar na proliferação celular é a tensão residual, indicada pela dureza do
material. Deste modo os discos que apresentaram maior estado de tensão
residual apresentaram também maior proliferação celular.
Palavras-chaves: Titânio, Microestrutura, Resposta Biológica,
Biocompatibilidade.
Abstract
Macêdo, H.R.A, Heat treatment of titanium and their consequence in
physicochemical and biocompatibility properties. 2012. Thesis (Doctoral) –
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2012.
The titanium and titanium alloys are widely used as biomaterial in
biomedical device and so research have been developed aiming to improve
and/or better to understand interaction biomaterial/biological environment. The
process for manufacturing of this titanium implants usually involves a series of
thermal and mechanical processes which have consequence on the final
product. The heat treatments are usually used to obtain different properties for
each application. In order to understand the influence of these treatments on
the biological response of the surface, it was done, in this work, different heat
treatments in titanium and analyzed their influence on the morphology,
adhesion and proliferation of the pre-osteoblastic cells (MC3T3-E1). For such
heat-treated titanium disks were characterized by optical microscopy, contact
angle, surface energy, roughness, microhardness, X-ray diffraction and
scanning through the techniques (BSE, EDS and EBSD). For the analysis of
biological response were tested by MTT proliferation, adhesion by crystal violet
and β1 integrin expression by flow cytometry. It was found that the presence of
a microstructure very orderly, defined by a chemical attack, cells tend to stretch
in the same direction of orientation of the material microstructure. When this
order does not happen, the most important factor influencing cell proliferation is
the residual stress, indicated by the hardness of the material. This way the disks
with the highest level state of residual stress also showed increased cell
proliferation.
Keywords: Titanium, Microstructure, Biological Response, Biocompatibility.
Lista de Figuras
Figura 2.1 Transformação alotrópica do titânio ................................ 24
Figura 2.2 Diagramas de fases do titânio de acordo com seus
elementos de liga: (a) α-estabilizador, (b) β-
estabilizador do tipo eutetóide, (c) β-estabilizador do
tipo isomorfo e (d) neutro ................................................. 25
Figura 2.3 Diagrama de fases para as ligas de titânio mostrando as
transformações martensita em função da temperatura e
da concentração de elementos estabilizadores de fase
baseado nas linhas de transformação martensita ........... 27
Figura 2.4 Diagrama parcial de fases de sistemas constituídos pelo
titânio e por elemento β-estabilizadores ......................... 29
Figura 2.5 Diagrama esquemático da formação da estrutura de
Widmanstäntten na liga Ti-6Al-4V ................................... 31
Figura 2.6 Diagrama TTT pra uma liga de titânio α+β ...................... 34
Figura 2.7 Microestrutura por microscopia ótica do titânio
comercialmente puro grau 2 sem tratamento .................. 35
Figura 2.8 Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura
da liga Ti17 tratada isotermicamente a 750°C por (a)
360s e (b) 9400s. αGB – contorno de grão e αWGB –
contorno de grão Widmanstätten. A morfologia αWGB é
composta por colônias de placas α paralelas
frequentemente com a mesma orientação, que crescem
a partir de αGB ................................................................................................... 35
Figura 2.9 Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura
da liga Ti-6Al-2Sn-4Zr-6Mo. São mostrados grãos β
delimitados por contornos de grãos α ............................. 36
Figura 2.10 Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura
da liga Ti-6Al-4Va. São mostrados grãos α e β ............... 36
Figura 2.11 Micrografia do Ti-cp temperado em ar a partir de 900°C
por 2h, mostrando a formação de núcleo martensítico 37
recoberto por camadas de oxinitreto e de óxido de
titânio ...............................................................................
Figura 2.12 Difratograma padrões para o titânio comercialmente
puro: (a) fase α, (b) fase β ............................................... 38
Figura 2.13 Propriedades dos materiais que estão relacionadas à
biocompatibilidade ........................................................... 39
Figura 2.14 Representação da superfície do implante e sua
interação com as moléculas do fluido tecidual. (A)
Implante. (B) Moléculas de água. (C) Camada
glicoprotéica. (D) Célula .................................................. 40
Figura 2.15 – (1) Interação da superfície do material com a água. (2)
Comportamento das proteínas de acordo com o
conjunto superfície-água. (3) Células em crescimento na
superfície ativa e em desnaturação na superfície inativa 42
Figura 2.16 Representação das proteínas celulares envolvidas na
adesão do biomaterial ..................................................... 43
Figura 2.17 Morfologia celular em discos de titânio após 2 dias de
cultura. (a) superfície rugosa e (b) superfície polida ....... 44
Figura 3.1 Organograma da realização do trabalho ......................... 47
Figura 3.2 Fotografia do forno utilizado – Laboratório de
tratamentos térmicos do IFRN – Natal/RN ...................... 49
Figura 3.3 Esquema dos tratamentos térmicos realizados ............... 49
Figura 3.4 Ilustração dos locais marcados para as análises ............ 51
Figura 3.5 Região de análise de EBSD ............................................ 53
Figura 3.6 Micrografias das marcações de microdureza em: (a)
marcações na superfície que delimitam a área de
análises futuras, (b) marcação na camada externa e (c)
marcação no núcleo ........................................................ 54
Figura 3.7 Esquema do goniômetro para medição do ângulo de
contato ............................................................................. 55
Figura 3.8 Gota de 10 µL de água depositada sobre um disco de
titânio. Medição do ângulo de contato por meio do
surftens ............................................................................ 56
Figura 3.9 Fotografia ilustrativa da placa de 24 poços utilizada na
cultura de células.............................................................. 57
Figura 3.10 Ilustração do contorno das células utilizado para
aquisição dos dados das células sobre os discos,
utilizando o software Image Pro Plus .............................. 59
Figura 3.11 Espectrofotômetro específico para leitura de placas de
96 poços – laboratório de genética do CB/UFRN ............ 60
Figura 4.1 Micrografias do disco de titânio sem tratamento. (a)
micrografia ótica e (b) micrografia por MEV com
medição dos tamanhos dos grãos ................................... 64
Figura 4.2 Micrografia por microscopia ótica da amostra temperada
em água (1100°C). Constituída de uma estrutura de
lamelas macladas e em alguns pontos uma estrutura
em forma de placas ........... 65
Figura 4.3 Micrografia por microscopia ótica da microestrutura de
uma amostra temperada a 950°C, em água ................... 66
Figura 4.4 Micrografia por microscopia ótica das microestruturas
das amostras envelhecidas a 500°C por 4h ................... 67
Figura 4.5 Micrografia por microscopia ótica das microestruturas
das amostras envelhecidas a 700°C por 4h .................... 67
Figura 4.6 Microscopia ótica do corte transversal mostrando as
diferentes estruturas dos discos temperados .................. 68
Figura 4.7 Medição por MEV da espessura das camadas formadas
durante a têmpera ........................................................... 69
Figura 4.8 EDS da borda dos discos temperados a 1100°C ............ 70
Figura 4.9 Difratogramas para as diferentes camadas presente nos
discos. (a) núcleo martensítico (b) camada 1 – oxinitreto
de titânio e (c) camada 2 – dióxido de titânio .................. 71
Figura 4.10 Difratogramas do núcleo dos discos de titânio
temperados - varredura de 20° a 80° .............................. 73
Figura 4.11 Imagens de EBSD na interface do núcleo martensítico
com a camada 1 do disco temperado a 1100°C (a)
região de análise (b) mapa de cores das estruturas 74
cristalinas, apresentando somente estrutura hexagonal
compacta .........................................................................
Figura 4.12 Mapas de cores para estruturas cristalográficas. Em
todas as condições de tratamento apresentaram
somente estrutura hexagonal compacta .......................... 75
Figura 4.13 Microdureza Vickers – corte transversal .......................... 76
Figura 4.14 Microdureza Vickers – Superficial ................................... 77
Figura 4.15 Ângulo de contato na superfície dos discos de titânio
para água e para o meio de cultura celular (alfa-MEM) .. 78
Figura 4.16 Energia de superfície e suas componentes polar e
dispersiva para as diferentes condições de tratamento .. 79
Figura 4.17 Microscopia ótica das células aderida no titânio –
Orientação das células conforme a microestrutura ......... 81
Figura 4.18 Número de células aderidas para as diferentes
condições, contadas a partir de análise de imagens ....... 84
Figura 4.19 Porcentagem de área coberta por células ....................... 85
Figura 4.20 Morfologia celular. Células arredondadas (<1,5), células
parcialmente espraiadas (>1,5 e <2) e totalmente
espraiadas (>2) ................................................................ 86
Figura 4.21 Proliferação por MTT ....................................................... 87
Figura 4.22 Adesão celular para 1, 2 e 3 horas de cultura ................. 88
Figura 4.23 Histograma da expressão da integrina β1 para as
diferentes condições de tratamento do titânio ................. 89
Figura 4.24 Razão IMF das amostras tratadas pelo controle
negativo/isotípico ............................................................. 89
Figura 4.25 Relação ângulo de contato e proliferação celular ............ 90
Figura 4.26 Comparação do comportamento dos gráficos da
proliferação com as componentes da energia de
superfície 91
Figura 4.27 Comparação do comportamento dos gráficos da
proliferação com a fração de polaridade ......................... 92
Figura 4.28 Comparação do comportamento dos gráficos da
proliferação com os parâmetros de rugosidade .............. 93
Figura 4.29 Relação microdureza e proliferação celular .................... 94
Figura 4.30 Mapa de orientação cristalográfica, onde cada cor
representa uma orientação cristalográfica ....................... 95
Lista de Tabelas
Tabela 2.1 Composição química de Ti-cp (% em peso) segundo a
ASTM. O Ti-cp grau 2 está grifado para indicar o grau
de pureza do Ti que foi utilizado neste trabalho ........... 22
Tabela 2.2 Propriedades do titânio comercialmente puro............... 23
Tabela 3.1 Composição química do titânio utilizado segundo
fornecedor. Discos de Ti ASTM F67 GR1Φ
15x1,50mm ................................................................... 48
Tabela 3.2 Simbologia e descrição dos tratamentos dos
tratamentos térmicos realizados .................................. 50
Tabela 3.3 Energia de superfície dos líquidos usados ................... 56
Tabela 4.1 Relação das distancias interplanares e da largura a
meia altura dos principais picos comuns nos
difratogramas ............................................................... 73
Tabela 4.2 Fração de polaridade calculada a partir das
componentes polar e dispersiva da energia de
superfície dos discos de Ti ......................................... 80
Tabela 4.3 Parâmetros de rugosidade dos discos de Ti ................ 80
Tabela 4.4 Valores de Intensidade média de fluorescência para
todas as condições utilizadas neste trabalho. Para
todas as condições tratadas o IMF é maior que o não
tratado e que todos são maiores que o controle
negativo/isotípico .......................................................... 88
Lista de Abreviaturas e Símbolos
ASTM – American society for testing and materials
HC – Estrutura hexagonal
CCC – Estrutura cúbica de corpo centrado
α – Fase alfa primaria de estrutura hexagonal
α’ – Fase martensita de estrutura hexagonal
α’’ – Fase martensita de estrutura ortorrômbica
β – Fase beta de estrutura cúbica de corpo centrado
TTT – Diagrama tempo, temperatura e transformação
Ti-cp – Titânio comercialmente puro
MEV – Microscopia eletrônica de varredura
ES – Elétrons secundários
BSE – Elétrons retroespalhados
EDS – Difração de elétrons secundários
EBSD – Difração de elétrons retoespalhados
DRX – Difratômetro de raios-X
GIDRX – Difração de raios-X em incidência rasante
Ra – Rugosidade média aritmética
Rp – Altura máxima do pico
Rv – Profundidade máxima do vale
Rz – Rugosidade média entre os cinco maiores picos e os cinco maiores vales
Rt – Altura máxima do pico mais alto e o vale mais profundo
θ – Ângulo de contato
– Energia superficial
– Componente polar da energia de superfície
– Componente dispersiva da energia de superfície
FP – Fração de polaridade
ALFA-MEM – Meio de cultura celular
SFB – Soro fetal bovino
β1 – Integrina de ligação célula-substrato
IMF – Intensidade média de fluorescência
PDF – Power difraction file – padrão de cartas para análise de DRX
Sumário
1 – Introdução .................................................................................. 18
2 – Revisão Bibliográfica .................................................................. 22
2.1 – Titânio ................................................................................ 22
2.1.1 – Elementos estabilizadores de alfa e beta ............ 24
2.1.1.1 – Ligas α .................................................... 26
2.1.1.2 – Ligas quase α ......................................... 27
2.1.1.3 – Ligas α+β ............................................... 28
2.1.1.4 – Ligas quase β ......................................... 28
2.1.1.5 – Ligas β .................................................... 29
2.1.2 – Tratamento Térmico .............................................. 30
2.1.2.1 – Têmpera e Revenimento ........................ 31
2.1.2 – Transformação Martensita do Titânio ................... 32
2.1.3 – Microestruturas do Titânio ..................................... 33
2.2 – Interação do Titânio com o Meio Biológico – O Titânio
como Biomaterial .............................................................................. 38
3 – Metodologia ................................................................................ 47
3.1 – Material de partida ............................................................ 48
3.2 – Tratamentos térmicos dos discos de titânio ...................... 48
3.3 – Preparação metalográfica ................................................. 50
3.4 – Caracterizações das amostras .......................................... 51
3.4.1 – Microscopia Ótica e Análise de Imagens .............. 51
3.4.2 – Microscopia Eletrônica de Varredura .................... 51
3.4.3 – Difração de Raios-X .............................................. 53
3.4.4 – Microdureza Vickers .............................................. 53
3.4.5 – Rugosidade ........................................................... 54
3.4.6 – Molhabilidade ....................................................... 54
3.4.6.1 – Ângulo de Contato ................................. 55
3.4.6.2 – Energia de Superfície ............................. 56
3.5 – Ensaio em Cultura de Células ........................................... 57
3.5.1 – Proliferação por microscopia ótica e análise de
imagens 58
3.5.2 – Proliferação MTT ................................................... 59
3.5.3 – Adesão .................................................................. 60
3.5.4 – Avaliação da Expressão de integrinas ................. 61
3.6 – Análise Estatística ............................................................. 62
4 – Resultados e discussões ........................................................... 64
4.1 – Caracterizações do Titânio ............................................... 64
4.1.1 – Microestruturas ...................................................... 64
4.1.2 – Fases ..................................................................... 70
4.1.2.1 – Difração de Raios-X .............................. 70
4.1.2.2 – Difração de elétrons retroespalhados 73
4.1.3 – Microdureza Vickers .............................................. 75
4.1.4 – Ângulo de Contato ................................................ 78
4.1.5 – Energia de Superfície ........................................... 78
4.1.6 – Rugosidade ........................................................... 80
4.2 – Caracterização da Resposta Biológica ............................. 81
4.2.1 – Orientação Celular ................................................ 81
4.2.2 – Proliferação e Morfologia por Análises de
Imagens ............................................................................................ 83
4.2.3 – Análise de Proliferação Celular ........................... 86
4.2.4 – Avaliação da Adesão Celular ................................ 87
4.2.5 – Expressão de Integrinas ....................................... 88
4.3 – Correlação dos Resultados Biológicos com as
Propriedades Obtidas para o Titânio ............................................... 90
4.3.1 – Ângulo de Contato X Proliferação .................... 90
4.3.2 – Energia de Superfície X Proliferação ................ 91
4.3.3 - Rugosidade X Proliferação ................................ 92
4.3.4 – Microdureza Vickers X Proliferação ................. 93
4.3.5 – Orientação Cristalográfica X Proliferação ......... 94
5 – Conclusões e Sugestões ........................................................... 96
5.1 – Conclusões ....................................................................... 97
5.2 – Sugestão de Trabalhos Futuros ........................................ 98
Lista de Trabalhos Publicados ......................................................... 99
Referências ...................................................................................... 100
18
1 – Introdução
Com o advento de novos dispositivos para aplicações biomédicas, é
notória a utilização do titânio e suas ligas como biomaterial. Nesse sentido, o
conhecimento das suas características superficiais é de fundamental
importância, principalmente aquelas relacionadas com sua resposta quando
inseridas num meio biológico. Sabe-se que a fabricação de qualquer dispositivo
envolve uma série de processos térmicos, mecânicos e/ou químicos, que
podem influenciar a sua resposta quando inserido num meio biológico.
Algumas vezes esses processos são utilizados propositadamente para
modificar as propriedades físicas e/ou químicas da superfície. Outras vezes
eles são necessários durante a fundição, conformação, estampagem e
usinagem, entre outros. Nesse último caso o estado final da peça poderá
depender do processo de fabricação. Portanto, conhecer o quanto a resposta
biológica de uma superfície é sensível a essas variações de propriedades é de
fundamental importância para a confiabilidade do uso desses dispositivos. No
caso de implantes, por exemplo, há a necessidade de se definir uma superfície
compatível com uma boa resposta biológica, isto é imperativo na pesquisa
básica de implantes (Amarante e Lima, 2001). Qualquer implante, uma vez em
contato com o meio biológico, é caracterizado por mudanças dinâmicas em
suas propriedades superficiais envolvendo uma cascata de reações que ocorre
entre o meio biológico e o biomaterial formando um “filme de condicionamento”
que modula as respostas celulares (Puleo e Nanci, 1999).
Segundo Schneider (1994) e Macdolnad (2002) a molhabilidade e a
energia superficial exercem um importante papel na adsorção de proteínas,
aumentando a formação de adesões de osteoblastos na superfície do implante
(Schneider e Burridge, 1994; Macdonald et al., 2002). A rugosidade e a
molhabilidade interferem nos processos de adsorção de proteínas, com isso é
possível que células sejam fortemente influenciadas por ambos, se chegarem à
superfície do implante (Rupp et al., 2004). Macêdo (2011) por sua vez indica a
tensão residual como um forte influenciador da proliferação de células pré-
osteoblásticas.
Compreender como um processo de fabricação possa influenciar, bem
como quantificar o efeito de pequenas flutuações do processo sobre a resposta
19
biológica do dispositivo é o foco do presente trabalho. Na busca por superfícies
que supram a necessidade de obter uma resposta biológica mais rápida, várias
pesquisas têm sido desenvolvidas, modificando as propriedades de superfície
pelos mais variados processos (Silva et al., 2006) dentre os quais se destaca
os métodos mecânicos, químicos e físicos de tratamento de superfície, que
permitem obter os mais variados graus de texturas (Liu et al., 2004).
Os tratamentos utilizados neste trabalho foram do tipo térmico em forno
resistivo por ser um dos mais utilizados nas indústrias durante o processo de
fabricação dos implantes. Estes tratamentos também possibilitam diversas
combinações entre as propriedades mecânicas e de biocompatibilidade, uma
vez que geram modificações na estrutura interna dos materiais que, por
conseguinte modificam as propriedades se superfície afetando diretamente a
resposta biológica.
O presente trabalho teve como objetivo geral modificar a microestrutura
do titânio através de tratamentos térmicos e relacionar a influência dessa
microestrutura e das propriedades sobre a resposta biológica. Principalmente
no que se refere à proliferação de células pré-osteoblásticas, tendo para isso
os seguintes objetivos específicos:
Caracterizar as microestruturas e suas respectivas fases, obtidas por meio do
tratamento térmico comparativamente ao Ti na condição como recebido;
Determinar valores para as propriedades superficiais (rugosidade, ângulo de
contato, energia de superfície, dureza) que favoreçam a proliferação celular;
Avaliar a adesão, proliferação e morfologia as células sobre os discos de Ti;
Identificar qual a propriedade mais influencia na proliferação de células pré-
osteoblasticas.
Este estudo foi dividido em duas etapas a primeira dedicada à
caracterização do material antes e após os tratamentos térmicos utilizando
técnicas como: microscopia ótica, microscopia eletrônica, difração de raios-X,
ângulo de contato, energia de superfície e microdureza. Já a segunda etapa foi
dedicada à caracterização do comportamento das células quando cultivadas
sobre esses discos nas diferentes condições de tratamento. Estas foram
analisadas segundo os seguintes parâmetros: i) análise de imagens
(quantidade e morfologia celular, área ocupada por células, orientações
22
2 – Revisão Bibliográfica
2.1 – Titânio
O titânio é o quarto elemento metálico mais abundante no nosso planeta.
Pode ser encontrado em minérios ricos em óxidos de titânio, como o rutilo que
é rico em TiO2 ou como a ilmenita, rica em FeTiO3. Embora seja abundante na
natureza, relatos de sua extração e utilização são bastante recentes, tendo sido
obtido na forma metálica apenas em 1910 e somente na década de 1930 foi
obtido em volumes significativos com a concepção do processo Kroll e desde
então a produção, o emprego do titânio e de suas ligas vem crescendo nas
indústrias química, petroquímica, alimentícia, farmacêutica, aeronáutica,
espacial e médica (Lütjering e Willians, 2007).
O titânio é um metal de transição pertencente à família IVB da tabela
periódica, com número atômico 22, peso atômico 47,90 g/mol, raio atômico
0,1445 nm e densidade 4,45 g/cm3. Em termos de densidade, o titânio é 40%
mais leve que o aço e 60% mais pesado que o alumínio. O titânio possui
elevada resistência à corrosão que se deve à formação de um filme de óxido
protetor junto à sua superfície. Este filme, de óxido superficial, permite que o
titânio seja aplicado em condições adversas, como por exemplo, ambiente
salinos e meio biológico (Lütjering e Willians, 2007).
Em termos de classificação, a American Society for Testing and
Materials (ASTM) define que existem quatro classes principais de titânio
comercialmente puro (Ti-cp): ASTM Grau 1 a 4. Cada grau está associado a
um diferente teor de impurezas, sendo o grau 1 (um) o mais puro. Na tabela 2.1
são apresentadas as composições químicas do Ti-cp para os quatros graus de
pureza e na tabela 2.2 as respectivas propriedades (Donachie, 1988).
Tabela 2.1 – Composição química de Ti-cp (% em peso) segundo a ASTM. O Ti-cp grau 2 está grifado para indicar o grau de pureza do Ti que foi utilizado neste trabalho (Donachie, 1988).
Tipo de Ti
Fe C H N O Ti
Grau 1 Máx. 0,2 Máx. 0,1 Máx. 0,015 Máx. 0,03 Máx. 0,18 99,5 Grau 2 Máx. 0,3 Máx. 0,1 Máx. 0,015 Máx. 0,03 Máx. 0,25 99,2 Grau 3 Máx. 0,3 Máx. 0,1 Máx. 0,015 Máx. 0,03 Máx. 0,35 99,1 Grau 4 Máx. 0,5 Máx. 0,1 Máx. 0,015 Máx. 0,03 Máx. 0,4 99,0
23
Tabela 2.2 – Propriedades do titânio comercialmente puro (Mitsuo, 1998).
Tipo de Ti
Lim. Res.
(MPa)
Lim. Esc.
(MPa)
Along. (%)
Red. área (%)
Mód. Elast. (GPa)
Classe de
Liga
Grau 1 240 170 24 24 102,7 α Grau 2 345 275 20 20 102,7 α Grau 3 450 380 18 18 103,4 α Grau 4 550 485 15 15 104,1 α
Como o titânio é um elemento de transição que tem uma camada
incompleta em sua estrutura eletrônica no estado fundamental pode ocorrer a
formação de solução sólida com a grande maioria de elementos que possuem
raios atômicos com valores de até 15% de diferença. O processamento desse
metal é complexo, principalmente devido a sua susceptibilidade a elementos
intersticiais como oxigênio, nitrogênio, hidrogênio e carbono.
Quando puro, o titânio exibe duas formas alotrópicas. Até 882,5°C sua
estrutura cristalina é do tipo hexagonal compacta (HC), denominada de fase
α. Acima dessa temperatura, a estrutura cristalina é do tipo cúbica de corpo
centrado (CCC), definida como fase β. Tal arranjo cristalino é estável até a
fusão, em 1.672 °C conforme é mostrado na figura 2.1. Essa transformação de
fases pode ser eventualmente alterada a partir da adição de elementos de liga
ao titânio. Esses elementos podem estabilizar as fases: i) alfa, neste caso,
chamados de alfa-estabilizadores uma vez que aumentam a temperatura em
que é possível obter a fase alfa estável e/ou ii) beta, chamados de beta-
estabilizadores, estes elementos diminuem a temperatura em que é possível
obter a fase beta estável (Donachie, 1988; Lütjering e Willians, 2007).
24
Figura 2.1 – Transformação alotrópica do titânio (adaptado de Flower, 1990).
2.1.1 – Elementos alfa e beta-estabilizadores de fase do titânio
Os elementos classificados como α-estabilizadores envolvem metais
dos grupos IIIA e IVA (Al, Ga e Sn) e elementos intersticiais C, N e O. Por outro
lado, os metais de transição V, Ta, Nb, Mo, Mg, Cu, Cr, Fe e os metais nobres
são classificados como elementos β-estabilizadores. Dois tipos de elementos
β-estabilizadores são possíveis como resultados dos seus respectivos
diagramas de fase: os definidos como β-isomorfos e os β-eutetoides.
Existem ainda os elementos definidos como neutros, que não mudam a
temperatura de transformação alotrópica, como Zr. Os quatro tipos de
estabilizadores de fase do titânio têm seus respectivos diagramas de fase
esquematizados na figura 2.2 (Lütjering e Willians, 2007).
25
Figura 2.2 – Diagramas de fases do titânio de acordo com seus elementos de liga: (a) α-estabilizador, (b) β-estabilizador do tipo eutetóide, (c) β-estabilizador do tipo isomorfo e (d) neutro (Adaptado de Lütjering e Willians, 2007).
Embora o titânio puro seja largamente utilizado na indústria, em algumas
situações são necessárias combinações de propriedades às quais o titânio
puro não é aplicável. Para solucionar esse problema uma alternativa a ser
seguida é o uso de ligas de titânio.
As ligas de titânio são obtidas a partir da adição controlada de elementos
α e/ou β-estabilizadores ao titânio, com isso também é possível controlar a
estabilidade de fases, bem como as respectivas frações volumétricas de cada
fase à temperatura ambiente e consequentemente, suas propriedades
mecânicas. Assim obtém-se ligas versáteis, principalmente quanto ao
comportamento mecânico, uma vez que este depende fundamentalmente da
Al, O, N, C
Fe, Mn, Cr
Mo, V, Nb, Ta Zr (c)
(a) (b)
(d)
26
composição, da proporção entre as frações volumétricas das fases α e β e
finalmente, dos tratamentos térmicos e termomecânicos utilizados. De acordo
com as fases presentes à temperatura ambiente, as ligas de titânio podem ser
classificadas em cinco grupos, ligas alfa, ligas quase alfa, ligas alfa+beta, ligas
quase beta e ligas beta (Long e Rack, 1998).
2.1.1.1 – Ligas α
Ligas desse grupo exibem apenas fase α em temperatura ambiente.
Além do titânio comercialmente puro, nessa classe encontram-se ainda ligas
com elementos α estabilizadores, como os elementos mostrados na figura
2.2a. A presença de elementos estabilizadores da fase α, como soluto na
matriz de titânio eleva as linhas de transformação α/α+β e α+β/β, fazendo com
que, mesmo que uma liga α seja resfriada no campo α+β, a porção de fase
verificada esteja sempre à esquerda da linha Mi/Mf à temperatura ambiente,
sendo, então, termodinamicamente instável, transformando-se em α, conforme
a figura 2.3 (Donachie, 1988).
As ligas tipo α apresentam elevada resistência à fluência e por esta
razão, são adequadas ao uso em altas temperaturas. Como tais ligas não
exibem transição do tipo dúctil-frágil são indicadas para operar em ambientes
criogênicos. Além disso, essas ligas não exibem fases metaestáveis sujeitas à
transformação no resfriamento (Donachie, 1988).
27
Figura 2.3 – Diagrama de fases para as ligas de titânio mostrando as transformações martensíticas em função da temperatura e da concentração de elementos estabilizadores de fase baseado nas linhas de transformação martensítica (adaptado de Flower, 1990).
2.1.1.2 – Ligas quase α
As ligas quase α contêm elementos estabilizadores da fase α, além de
apresentar pequenos teores de elementos estabilizadores da fase β. A
presença de elementos estabilizadores da fase β na liga α, mesmo em
pequenas quantidades, faz com que o campo α+β aumente suficientemente
para permitir que uma pequena quantidade de fase β, em equilíbrio
metaestável, possa ficar retida em temperatura ambiente; permitindo assim, a
transformação martensítica da fase β em α’ (martensita de estrutura HC)
dentro de uma faixa muito limitada, obtida através das altas taxas de
resfriamento, a partir do campo α+β (Donachie, 1988).
28
2.1.1.3 – Ligas α+β
Tais ligas são formadas pelo titânio e por elementos β estabilizadores
em teor suficiente que permite a estabilização da fase β com fração
volumétrica entre 10 e 50% à temperatura ambiente. Dessa maneira, o efeito
dos elementos α e β estabilizadores resulta na formação de um campo de
coexistência das fases α e β que se estende até a temperatura ambiente
(Ahmed e Rack, 1998).
A combinação adequada de elementos de liga e de tratamentos térmicos
permite obter uma grande variedade de microestruturas, principalmente quando
as ligas α+β são comparadas às ligas α (Lütjering, 1998; Prasad e
Seshacharyulu, 1998). Em geral, a manutenção da fase β na estrutura conduz
à redução da resistência à fluência. Dessa forma, tais ligas não podem ser
aplicadas em temperaturas elevadas. A liga Ti-6Al-4V é o melhor exemplo de
ligas do tipo α+β (Qazi et al., 2003). Concebida inicialmente para ser
empregada na indústria aeronáutica, tornou-se o material de referência dentre
as ligas de titânio, sendo o material à base de titânio mais empregado na
fabricação de dispositivos para implante, sejam ortopédicos ou dentários. Com
o passar dos anos novas ligas α+β alternativas àquelas foram propostas,
sendo as principais representantes as ligas contendo Nb na composição, por
exemplo, Ti-6Al-7Nb (Long e Rack, 1998).
2.1.1.4 – Ligas quase β
São ligas com elementos estabilizadores da fase β em quantidade
suficiente para que as linhas de transformação martensítica passem abaixo da
temperatura ambiente e para que a linha β/α+β-transus fique bem abaixo da
temperatura de transformação alotrópica do titânio puro. Estas ligas podem
apresentar baixos teores de solutos estabilizadores da fase α, podendo assim
serem trabalhadas dentro do campo β à 800°C. A cinética da nucleação e
crescimento da fase estável α é bastante lenta, permitindo a manutenção da
fase β metaestável à temperatura ambiente, mesmo sem necessidade de
resfriamento rápido (Donachie, 1988).
29
2.1.1.5 – Ligas β
Ligas de titânio tipo β, são classificadas como metaestáveis ou estáveis,
apresentam elevada resistência mecânica, boa conformabilidade e são
endurecíveis através de tratamentos térmicos. Esta classe de ligas possibilita
combinar baixo módulo de elasticidade que é resultante da estabilização da
fase cúbica de corpo centrado, com elevada resistência mecânica. As ligas tipo
β são produzidas pela adição de elementos β estabilizadores em volume
suficiente que permite que a linha β-transus posicione-se bem abaixo da
temperatura de transformação alotrópica do titânio puro (Froes e Bomberger,
1985). No caso de ligas tipo β metaestáveis tem-se ligas com composição
dentro da faixa de β1 e β2 mostrada na figura 2.4 e que são obtidas através
do resfriamento rápido das mesmas.
Figura 2.4 – Diagrama parcial de fases de sistemas constituídos pelo titânio e por elemento β-estabilizadores (adaptado de Lütjering e Willians, 2007).
No caso de formação de estruturas contendo a fase β metaestável, é
possível a precipitação de outras fases como resultado de tratamentos térmicos
de envelhecimento. Ligas com teor de elementos β estabilizadores superior a
β2 são classificadas como estáveis e independem das condições de obtenção.
30
2.1.2 – Tratamentos Térmicos no Titânio
O titânio forma soluções sólidas intersticiais com elementos que
possuem raio atômico pequeno, pois possui como espaço intersticial
aproximadamente 26,5% do volume do reticulado cristalino para o α-Ti (HC) e
de 32% para o β-Ti (CCC). A estrutura α possui 4 posições intersticiais de raio
0,62 Å. Já a estrutura β possui 12 interstícios do tipo tetraédrico com raio 0,44
Å e 6 do tipo octaédrico (Bellinati, 1999).
A presença de elementos intersticiais tende a aumentar a dureza, a
resistência mecânica e diminuir a ductilidade do material. A maioria dos
produtos de titânio comercialmente puro contém traços alguns desses
elementos (Albrektsson, 1983).
Elementos estabilizadores de fase podem ser incorporados à estrutura
dos materiais formando soluções sólidas através de tratamentos térmicos. É na
manutenção de uma ou outra fase em equilíbrio termodinâmico que se baseia a
adição de elementos de liga e os tratamentos térmicos ou termomecânicos.
Durante o resfriamento a partir de temperaturas superiores a
temperatura β-transus (882°C) ocorre uma transformação alotrópica da
estrutura CCC para a estrutura HC no titânio comercialmente puro. A adição de
elementos de liga nesta temperatura modifica o equilíbrio entre os campos α e
β (Collings, 1984).
Os resfriamentos submetidos a altas taxas promovem a precipitação
mais fina da fase α’, resultando na estrutura Widmanstätten e, chegando estas
taxas de resfriamento a patamares mais elevados, a difusão atômica será
inibida gerando uma estrutura martensítica (Flower, 1990). A estrutura
Widmanstätten (α + β) é característica das ligas diluídas e se apresenta como
um emaranhado de agulhas paralelas em matriz de β (Brooks, 1982). A figura
2.5 mostra o diagrama esquemático da formação da estrutura de
Widmanstätten na liga Ti-6Al-4V.
31
Figura 2.5 – Diagrama esquemático da formação da estrutura de Widmanstäntten na liga Ti-6Al-4V (Brooks, 1982).
2.1.2.1 – Têmpera e Revenimento
A têmpera é o tratamento térmico que possui como objetivo aperfeiçoar
a relação entre microestrutura e as propriedades mecânicas. Basicamente, a
têmpera consiste em resfriar rapidamente o material, a partir da temperatura
elevadas a uma velocidade superior à velocidade crítica (Vc) para obter uma
estrutura denominada martensita. Essa velocidade (Vc) significa a menor taxa
de resfriamento que pode ser utilizada para que toda a estrutura obtida seja
martensítica (Moreira, 2008). A temperabilidade mede a habilidade de um
material sofrer um tratamento térmico que aumente a proporção de fase dura
(martensita). Normalmente, esse processo é complementado por outro
tratamento térmico, denominado revenimento.
32
Segundo Moreira e Lebrão (2008) são vários os meios utilizados para o
tratamento de têmpera de aços, dois destes meios frequentemente são
aplicados ao titânio, são eles: i) água –por meio de imersão, jatos, imersão ou
jatos com água aquecida, ou ainda, misturas de água com aditivos poliméricos
entre outros; ii) ar – este é um meio de tempera antigo, comum e barato. A
aplicação do ar como meio de têmpera é mais comum em metais não-ferrosos.
O revenimento tem como principal objetivo controlar a relação dureza e
tenacidade obtida após o processo de têmpera, reduzindo as tensões
produzidas durante esse processo e aumentando a ductilidade e a tenacidade.
O revenimento é realizado em temperaturas inferiores à de transformação
alotrópica com tempos de duração e velocidades de resfriamento controladas.
2.1.3 – Transformação Martensita do Titânio
Uma transformação martensítica, por definição, é uma transformação
que não envolve difusão de elementos de liga. A martensita é formada por
resfriamentos suficientemente rápidos (têmpera) para impedir a difusão e a
transformação em outras fases. Existem, basicamente, dois tipos de martensita
em ligas de titânio: martensita hexagonal (HC) e martensita ortorrômbica
(Lütjering e Willians, 2007).
Nas ligas de titânio contendo baixo teor de elementos β-estabilizadores,
a fase beta a altas temperaturas pode ser transformada em α’ (martensita de
estrutura HC) durante a têmpera acima da temperatura β-transus. Enquanto a
martensita ortorrômbica α’' pode ser formada durante a têmpera em ligas com
altas concentrações de elementos beta-estabilizadores. Esses diferentes tipos
de estruturas cristalinas da martensita do titânio estão relacionadas ao
deslocamento dos átomos por cisalhamento. Sendo que maiores taxas destes
deslocamentos favorecem à formação da martensita α’ (HC), enquanto que a
martensita α’’ (ortorrômbica) ocorrem quando estes deslocamentos são lentos
(Kim et al., 2007). A transformação martensítica em ligas de titânio tem
influência positivas sobre as propriedades de tensão e tenacidade à fratura das
ligas (Ouchi et al., 1999; Grosdidier e Philippe, 2000; Bhattacharjee et al., 2005)
33
tendo sido objeto de diversos estudos ( Margevicius e Cotton, 1998; Zhang et
al., 2005; Lin et al., 2011).
A transformação martensítica inicia com deslocamento do tipo
cisalhamento de átomos da fase β. A maior estabilidade da fase β se deve à
formação de ligações covalentes que são dificilmente quebradas e com isso
dificultam o cisalhamento dos átomos. A estabilidade desta fase afeta
significativamente a transformação martensita no titânio, assim como, a
formação e a quebra das ligações covalentes da estrutura unitária (Lin et al.,
2011).
Já que as ligações covalentes da α’’ são dificilmente formadas, o
cisalhamentos dos átomos pode ser limitado. Esta limitação pode favorecer à
formação desse tipo de martensita. Além disso, uma vez que as ligações
covalentes da martensita α’’ são formadas por têmpera ou por aplicações de
tensões, a dissolução destas ligações também é bastante difícil. Caso
contrário, onde ligações covalentes sejam facilmente formadas e/ou quebradas,
o cisalhamento dos átomos pode ser acelerado, resultando no aumento da
probabilidade de ocorrer a martensita α’ de estrutura HC (Lin et al., 2011).
2.1.4 – Microestruturas do Titânio
O titânio pode exibir uma grande variedade de estruturas dependendo
da composição química da liga, do processamento e do tratamento térmico
aplicado. Isto é possível porque o titânio e suas ligas exibem uma ampla faixa
de transformação de fases. Muitas dessas transformações se devem à
transformação alotrópica que ocorre de α para β outras, no entanto, se devem
à formação de fases de transição metaestáveis que se precipitam durante a
decomposição da fase β metaestável (Joshi, 2006).
O ponto chave da evolução microestrutural do titânio e de suas ligas é a
temperatura de transformação alotrópica. Ligas de titânio quando tratadas em
temperaturas acima da temperatura beta-transus apresentam-se como
monofásica β. Através do resfriamento a partir desta temperatura é possível
obter várias fases de equilíbrio e de não equilíbrio, dependendo da taxa de
resfriamento e da concentração de elemento de liga. Na figura 2.6 é
34
apresentado o diagrama TTT (tempo, temperatura e transformação) para uma
liga de titânio α+β (Joshi, 2006).
Figura 2.6 – Diagrama TTT pra uma liga de titânio α+β (Adaptado de Joshi, 2006).
A estrutura Widmanstätten pode mudar da forma de colônia de ripas
alinhadas para a forma basket-weave com o aumento da taxa de resfriamento
ou concentração de elementos de liga. Além disso, a estrutura lamelar se torna
mais fina quando a taxa de resfriamento é aumentada. Em resfriamentos mais
lentos a fase α esta presente nos contornos de grão β primário (Joshi, 2006).
Além dos produtos da transformação (α, α’, α’’), a microestrutura pode
reter pequenas quantidades de fase β, dependendo da composição da liga. A
quantidade de fase beta retida na microestrutura a partir do resfriamento no
campo β é maior para maiores concentrações de soluto na liga. A martensita α’
ou α’’ se decompõe sobre envelhecimentos subsequentes levando a um
aumento na resistência da liga (Joshi, 2006). A seguir nas figuras 2.7, 2.8, 2.9 e
2.10 são apresentadas diferentes microestruturas obtidas através do
processamento térmicos de ligas de titânio.
35
Figura 2.7 – Microestrutura por microscopia ótica do titânio comercialmente puro grau 2 sem tratamento (Pazos et al., 2010).
Figura 2.8 – Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura da liga Ti17 (Ti-5Al-4Cr-4Mo-2Sn-2Zr) tratada isotermicamente a 750°C por (a) 360s e (b) 9400s. αGB – contorno de grão e αWGB – contorno de grão Widmanstätten. A morfologia αWGB é composta por colônias de placas α paralelas frequentemente com a mesma orientação, que crescem a partir de αGB
(Teixeira et al., 2007).
36
Figura 2.9 – Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura da liga Ti-6Al-2Sn-4Zr-6Mo. São mostrados grãos β delimitados por contornos de grãos α (Bhattacharyya et al., 2003).
Figura 2.10 – Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura da liga Ti-6Al-4V. Observa-se grãos α e β (Lütjering e Willians, 2007).
As microestruturas mostradas nas figuras 2.7 a 2.10 são resultados de
tratamentos térmicos realizados em diferentes ligas de titânio. Nos quais é
possível observar grãos do tipo equiaxiais e grãos lamelares tanto de fase beta
quanto de fase alfa. Esta variação do tipo de fase para uma mesma estrutura
granular se deve à composição química da liga. Entretanto, não somente as
ligas podem ter sua microestrutura alterada. O titânio comercialmente puro
também pode apresentar microestruturas que variam tanto no tamanho quanto
no formato dos grãos.
Contorno de grão alfa
α
β
37
Borgioli e colaboradores (2001) trataram termicamente Ti-cp grau 2 em
forno utilizando o ar como atmosfera de tratamento (Borgioli et al., 2001).
Verificaram que para as amostras temperadas a partir da temperatura de
900°C forma-se duas camadas na superfície das amostras: uma fina camada
de óxido e uma camada um pouco mais espessa com pequenas quantidades
de oxinitreto de titânio. Estas camadas são mais espessas quanto maior for à
temperatura e/ou o tempo de tratamento. A parte central do material consiste
de uma estrutura acícular α, conforme é mostrado na figura 2.11.
Figura 2.11 – Micrografia do Ti-cp temperado em ar a partir de 900°C por 2h (Adaptado de Borgioli et al., 2001).
A seguir, na figura 2.12 são apresentados difratogramas padrões para
titânio comercialmente puro (Villars, 1997). Em (a) é apresentado o
difratograma para o titânio α, hexagonal; e em (b) o difratograma fase β,
cúbica.
Oxinitreto
Óxido
Núcleo
38
Figura 2.12 – Difratograma padrões para o titânio comercialmente puro: (a) fase α, (b) fase β (Pinto, 2005).
2.2 – Interação do Titânio com o Meio Biológico – O Titânio como
Biomaterial
O titânio e suas ligas são os biomateriais metálicos mais indicados para
aplicações biomédicas devido às combinações de propriedades, como:
biocompatibilidade, alta resistência à biocorrosão, relação tensão/deformação e
relação resistência/peso entre outros. Muitos trabalhos na literatura relatam o
comportamento do titânio quando aplicado em meio biológico (Macêdo, 2008;
Sá, 2009; Alves Jr, 2005).
O termo biomaterial foi definido na Conferência do Instituto Nacional de
Desenvolvimento de Consenso em Saúde em 1982 como: “Qualquer
(a)
(b)
Fase α
Fase β
39
substância (outra que não fármaco) ou combinação de substâncias, sintética ou
natural em origem, que possa ser usada por um período de tempo, completa ou
parcialmente como parte de um sistema que trate, aumente ou substitua
qualquer tecido, órgão ou função do corpo” (Vaz, 2007). Os biomateriais devem
ser isentos de produzir qualquer resposta biológica adversa local ou sistêmica,
ou seja: o material deve ser não-tóxico, não-carcinogênico, não-antigênico e
não-mutagênico. Sendo classificados como: bioinertes, bioativos e bioreativos.
Os bioinertes são menos susceptíveis a causar uma reação biológica adversa
devido a sua estabilidade química em comparação com outros materiais. Os
materiais bioativos têm como propriedade formar tecido sobre a sua superfície
e estabelecer uma interface capaz de suportar cargas funcionais. Os materiais
bioreativos ficam no limite entre os materiais bioinertes e os bioativos (Trota
Filho, 2007).
Quando o biomaterial entra em contato com o meio biológico ocorre uma
série de reações físicas, químicas e biológicas que dependem principalmente
das propriedades da superfície do biomaterial. Estas propriedades determinam
a biocompatibilidade de um material, a figura 2.13 relaciona algumas destas
propriedades (Spencer e Textor, 2007).
Figura 2.13 – Propriedades dos materiais que estão relacionadas à biocompatibilidade (Spencer e Textor, 2007).
Os pesquisadores estudam o comportamento dos biomateriais com
diferentes focos. Alguns destes grupos estudam células isoladas sobre a
40
superfície do material através de técnicas que quantificam a força de adesão
celular (Anselme, 2000a; Bao e Suresh, 2003). Outros grupos, no entanto,
focam seus trabalhos na interação do material com populações de células após
alguns minutos ou horas de contato material/células (Thoumine et al., 1996;
García et al., 1997; Rezania et al., 1997; Yamamoto et al., 1998; Myrdycz et al.,
2002; Anselme e Bigerelle, 2005). Outros ainda consideram todas as fases da
diferenciação, proliferação e adesão em curto prazo e longo prazo (Hunter et
al., 1995; Anselme et al., 2000b; Nishio et al., 2000; Mustafa et al., 2001; Suh et
al., 2003; Lee et al., 2004).
Estudos in vivo e in vitro realizados com implantes têm demonstrado que
as propriedades físicas e químicas dos biomateriais são capazes de regular a
resposta tecidual inicial. Portanto, a interação biomaterial-célula depende das
propriedades superficiais incluindo microestrutura, topografia, rugosidade e
molhabilidade (Walboomers e Al, 1999; Ponsonnet et al., 2003; Winkelmann et
al., 2003).
Sabe-se que quando um biomaterial entra em contato com o meio
biológico, as primeiras moléculas a alcançarem a sua superfície (escala de
tempo de nanosegundos) são as de água. Em seguida, uma série de diferentes
substâncias encontradas nos fluidos teciduais tais como: íons e proteínas,
assim como células do tipo condroblastos, fibroblastos e osteoblastos reagem
com a superfície conforme mostrado na figura 2.14 (Ellingsen, 1998).
Figura 2.14 – Representação da superfície do implante e sua interação com as moléculas do fluido tecidual. (A) Implante. (B) Moléculas de água. (C) Camada glicoprotéica. (D) Célula (Adaptado de Kasemo, 2002).
41
Tem-se, portanto inicialmente, a formação de uma camada de proteínas
sobre a superfície do biomaterial, nos primeiros instantes após o contato com o
meio biológico. Essa camada é fruto das reações iniciais entre os constituintes
teciduais e a superfície do implante e governará as futuras reações,
determinando o tipo de resposta celular (Ellingsen, 1998).
Quando as células chegam à superfície, elas “encontram” uma superfície
coberta de proteínas cuja camada tem propriedades que foram inicialmente
determinadas pelas camadas de água pré-formada. Assim, quando se fala de
interações superfície-célula, é em ultima análise a interação entre as células e
as proteínas ligadas à superfície (Kasemo, 2002).
As propriedades da superfície do biomaterial irão proporcionar uma
maior ou menor interação com a água e, por consequência, influenciarão as
proteínas e outras moléculas que chegarão logo em seguida. A figura 2.15
esquematiza a interação de biomoléculas com a superfície de diferentes
materiais, e suas influencias para a adsorção de proteínas e adesão celular
(Kasemo, 2002).
42
Figura 2.15 – (1) Interação da superfície do material com a água. (2) Comportamento das proteínas de acordo com o conjunto superfície-água. (3) Células em crescimento na superfície ativa e em desnaturação na superfície inativa (adaptado de Kasemo, 2002).
As características da superfície determinarão quais moléculas irão
adsorver, ao passo que a natureza e orientação dessas biomoléculas terão
consequências diretas no recrutamento, ancoragem, proliferação e
diferenciação das células (Vaz, 2007).
As ligações células-superfície são da ordem de 10 a 15 nm e recebem o
nome de sítios de adesão ou contatos focais. Os contatos focais formam-se
essencialmente em células com baixa mobilidade, devido ao fato destas células
apresentarem receptores de superfície que reconhecem proteínas da matriz se
associar a elas e, por conseguinte fixam as células. A arquitetura do
43
citoesqueleto celular é essencial na manutenção da forma e na adesão das
células (Anselme et al., 2000c).
A interação osteoblasto-biomaterial depende de aspectos fundamentais
do material, tais como topografia, química e energia de superfície. Estas
características do material determinam como as moléculas serão adsorvidas e,
mais particularmente, determinam a orientação das moléculas adsorvidas, bem
como o comportamento da célula durante o contato (Boyan et al., 1996).
Células quando em contato com uma superfície primeiramente se ligam
para em seguida aderir e espraiar. A primeira etapa, ou seja, a ligação depende
de proteínas de adesão, tais como: selectinas, imunoglobulinas, caderinas e
integrinas. A qualidade da adesão influenciará a morfologia e a capacidade da
célula proliferar e diferenciar (Anselme et al., 2000b).
As integrinas são receptores transmembranicos e agem como uma
interface entre o compartimento intra e extracelular. Deste modo auxiliam a
troca de informações entre o meio externo e interno atuando na indução da
adesão, propagação e migração celular e, por consequência, participam do
crescimento e diferenciação celular (figura 2.16).
Figura 2.16 – Representação das proteínas celulares envolvidas na adesão do biomaterial (Anselme, 2000a).
44
Osteoblastos humanos cultivados expressaram altos índices de
integrinas α1β1, α3β1, α5β1 e α7β5 e níveis muito menores de integrinas α2β1,
α4β1, α7β1 e α7β3 (Hughes et al., 1993). Ao que tudo indica a integrina β1 é
um receptor predominante envolvido na adesão de osteoblastos (Gronthos et
al., 1997).
Comparando diferentes tipos de células em materiais semelhantes
verificou-se que a resposta celular é diretamente relacionada à rugosidade
superficial (Chesmel et al., 1995; Healy et al., 1996; Thomas et al., 1997).
Observações por microscopia eletrônica de células ósseas em materiais com
várias rugosidades tem demonstrado que as células se espraiam e formam
uma camada celular contínua de melhor forma em superfícies rugosas que em
superfícies lisas (Kieswetter et al., 1996; Anselme et al., 2000c).
O fenômeno de orientação de células osteoblasticas tem sido descrito.
Em superfícies lisas as células orientam-se aleatoriamente enquanto que em
superfícies rugosas, com rugosidade Ra acima de 0,5 µm as células orientam-
se paralelamente à direção da rugosidade (Chesmel et al., 1995). Eisenbarth et
al (2002) e Huang et al (2004) mostraram que células osteoblásticas seguem a
orientação da rugosidade, conforme pode ser observado na figura 2.17
(Eisenbarth et al., 2002a; Huang et al., 2004).
Figura 2.17 – Morfologia celular em discos de titânio após 2 dias de cultura. (a) superfície rugosa e (b) superfície polida (Eisenbarth et al., 2002a).
Estas células alinhadas, mostrando orientação com as ranhuras, tem
melhor comportamento de adesão quando comparadas às células menos
orientadas e às células de forma arredondada (Eisenbarth et al., 2002a).
45
As células orientadas tiveram alta densidade de contatos focais onde
tinham contato com a borda das ranhuras da rugosidade, tendo mostrado
melhor organização do citoesqueleto. Estas mudanças, na orientação das
células podem levar a uma maior aderência em superfícies rugosas que em
superfícies polidas (Eisenbarth et al., 2002b).
A distribuição dos contatos focais indica o modo de adesão de
osteoblastos em diferentes rugosidades. Em superfícies lisas, os contatos
focais ficam uniformemente distribuídos em toda a superfície da membrana os
quais estão em contato com o substrato. Nas superfícies rugosas os contatos
focais restringem-se às extremidades das extensões das células, onde a
membrana celular está em contato com o substrato (Anselme, 2000a).
Para a adesão celular um outro parâmetro de grande importância são as
características de hidrofilicidade e hidrofobicidade (Kieswetter et al., 1996;
Rupp et al., 2006), uma vez que a energia de superfície pode influenciar a
adsorção de proteínas e a reorganização estrutural das proteínas no material
(Boyan et al., 1996). Segundo Altankov (1994) a adesão celular é melhor em
superfícies hidrofílicas (Altankov e Groth, 1994).
Ponsonnet et al (2003) mostraram que a componente polar da energia
de superfície, ou um baixo valor da fração de polaridade, foram os melhores
parâmetros para a proliferação de fibroblastos (Ponsonnet et al., 2003).
Mostraram ainda, que embora a energia de superfície tenha sido o fator
dominante, a rugosidade pode afetar de forma considerável a relação energia
de superfície e proliferação.
Assim pode-se constatar que os processos biológicos são fortemente
influenciados pelas propriedades do material. A fim de melhorar estas
interações muitas ligas de Ti foram desenvolvidas ao longo do tempo. Portanto
este trabalho foi realizado com a finalidade de melhorar a interação do Ti-cp
com células. A utilização deste tipo de Ti se deu com o intuito de diminuir os
riscos futuros provenientes de elementos ligantes.
47
3 – Metodologia
O presente trabalho foi dividido em duas partes. A primeira parte
consiste na preparação e caracterização de amostras de titânio com diferentes
tratamentos térmicos. A segunda parte consiste na realização de ensaios
biológicos para determinar a adesão e a proliferação de células pré-
osteoblásticas sobre as superfícies previamente preparadas. A seguir na figura
3.1 é apresentado o organograma da realização do trabalho.
Figura 3.1 – Organograma da realização do trabalho
Tratamentos Térmicos
Parte 1: Metalografia
Parte 1: Caracterizações
do Titânio
Parte 2: Cultura de
Células
Parte 2: Caracterizações
Biológica
• MO
• MEV (EBS, EDS, EBSD)
• DRX / GIDRX
• Ângulo de Contato
• Energia de Superfície
• Microdureza (HV)
• Rugosidade
• Análise de Imagens
• MTT
• Adesão
• Expressão da integrina β1
• Lixamento
• Polimento
• Ataque químico
48
3.1 – Material de partida
Neste trabalho foram utilizados discos de titânio comercialmente puro
(Ti-cp grau 2), com 15mm x 1,5mm (diâmetro x espessura) e composição
química de acordo com a tabela 3.1 fornecidos pela empresa Realum Ind.
Com. de Metais Puros e Ligas LTDA.
Tabela 3.1 – Composição química do titânio utilizado segundo o fornecedor. Discos de Ti ASTM F67 GR1Φ 15x1,50mm.
Elementos N C H Fe O Ti
% 0,011 0,011 0,004 0,04 0,085 Balanço
3.2 – Tratamentos térmicos dos discos de titânio
Os tratamentos térmicos foram realizados em forno resistivo (figura 3.2)
utilizando o ar ambiente como atmosfera estática de trabalho. Colocou-se 15
amostras por vez para a realização da têmpera em 1100°C, 1000°C e 950°C
respectivamente, mantendo-se essa temperatura por 1h (uma hora) e em
seguida resfriando-se em água (volume de 6L) à temperatura ambiente,
aproximadamente 25°C. Estas temperaturas foram utilizadas por estarem
acima da temperatura beta transus e por possibilitarem a obtenção de
diferentes microestruturas (Macêdo, 2008).
Das 15 amostras temperadas de cada condição anteriormente descrita,
5 permaneceram no estado temperado, 5 foram envelhecidas a 500°C e 5
foram envelhecidas a 700°C, todas por 4h. No caso do envelhecimento, o forno
permaneceu fechado até atingir a temperatura ambiente de aproximadamente
25°C, conforme o esquema apresentado na figura 3.3 e descrição dada na
tabela 3.2.
49
Figura 3.2 – Fotografia do forno utilizado para realização dos tratamentos térmicos – Laboratório de Tratamentos Térmicos do IFRN – Natal/RN
Figura 3.3 – Esquema dos tratamentos térmicos realizados
50
Tabela 3.2 – Simbologia e descrição dos tratamentos térmicos realizados.
Simbologia Tratamento
11 Têmpera 1100°C (1h)
11R5 Têmpera 1100°C (1h) + Envelhecimento 500°C (4h)
11R7 Têmpera 1100°C (1h) + Envelhecimento 700°C (4h)
10 Têmpera 1000°C (1h)
10R5 Têmpera 1000°C (1h) + Envelhecimento 500°C (4h)
10R7 Têmpera 1000°C (1h) + Envelhecimento 700°C (4h)
95 Têmpera 950°C (1h)
95R5 Têmpera 950°C (1h) + Envelhecimento 500°C (4h)
95R7 Têmpera 950°C (1h) + Envelhecimento 700°C (4h)
ST Sem Tratamento (comercial)
3.3 – Preparação metalográfica
Uma amostra tratada de cada condição foi cortada transversalmente
utilizando disco diamantado. Em seguida essa amostra, assim como todos os
demais, foram embutidas em resina de poliéster e preparadas
metalograficamente, passando pelas etapas de lixamento (lixas de
granulometria variando de 80 # a 2000 #) até remover toda a camada formada
durante a têmpera e polimento utilizando uma solução de 40% de sílica coloidal
(1 micra) com 60% de peróxido de hidrogênio (30%).
Terminada a etapa de polimento os discos foram atacados
quimicamente para revelação microestrutural, utilizando a solução Kroll (95mL
de H2O + 10mL de HF + 5mL de HNO3). Em seguida os discos foram limpos
em banho ultrassônico utilizando detergente enzimático, álcool e água
destilada, nesta ordem, sendo 10min de lavagem para cada líquido.
Devidamente limpas as amostras foram secas e acondicionadas em
embalagens apropriadas para uso posterior.
51
3.4 – Caracterizações das amostras
3.4.1 – Microscopia Ótica e Análise de Imagens da superfície
A técnica de microscopia ótica foi utilizada para análise da superfície e
do perfil dos discos, bem como para a observação e análise das células
aderidas à superfície dos discos. Para tanto foi utilizado um microscópio ótico
de luz refletida da marca Olympus modelo BX 60M com uma câmera digital
acoplada e conectada a um computador.
Para aquisição das fotomicrografias utilizou-se o software Image Pro
Plus versão 6.0. As fotomicrografias da superfície das amostras foram obtidas
em seis regiões do disco distribuídas conforme ilustra a figura 3.4. A
delimitação dessas regiões foi feita utilizando microdureza Vickers (HV), de
forma que a cada conjunto de 3 marcações de microdureza representa uma
região a ser analisada (quadrantes e centro).
Figura 3.4 – Ilustração dos locais marcados para as análises das células sobre os discos.
3.4.2 – Microscopia eletrônica de Varredura (BSE, EDS e EBSD)
Foram utilizados dois microscópios eletrônicos de varredura – MEV,
ambos de marca PHILLIPS e modelo XL30. O primeiro equipado com detetores
de elétrons secundários (SE) e de elétrons retro-espalhados (BSE),
52
pertencente ao Núcleo de Estudos de Petróleo e Gás Natural – NEPGN da
UFRN. Este equipamento foi utilizado no modo BSE para aquisição de imagens
da microestrutura da borda dos discos temperados.
O segundo MEV utilizado pertence ao LACAM/DEMM da UFC e possui
além dos detetores SE e BSE, os detetores de energia dispersiva de raios-x
(EDS) de marca EDAX e de difração de elétrons retro-espalhados (EBSD) de
marca HKL. Este ultimo detetor foi utilizado para análise das fases presentes
após os tratamentos térmicos. O software utilizado na aquisição foi o Flamenco
Channel 5, já o processamento dos resultados foi realizado com os softwares
Tango e o Mango.
Para utilização da técnica de EBSD o porta amostra foi rotacionado de
70°. Esta técnica consiste em analisar a difração de elétrons retro-espalhados.
Como resultado obtém-se: mapas de orientação cristalográfica, no qual cada
orientação tem uma cor associada, mapas de contornos de grãos e de fases,
figuras de polo e figuras de polo inversa. Neste trabalho somente foi utilizado
os mapas de orientação e o de fases.
Para análise de EBSD foi delimitado uma área de aproximadamente
50% do campo de visão referente a um aumento de 100x, representada pela
área colorida da Figura 3.5. Durante o processamento dos resultados foi
definido que estruturas cristalinas hexagonais (referentes às fases α e α’ do
titânio) fossem coloridas de vermelho, estruturas ortorrômbicas (referentes à
fase α’’) de amarelo e estruturas cúbicas de corpo centrado (referentes à fase
β do titânio) de azul, para identificação das fases presentes.
53
Figura 3.5 – Região de análise de EBSD. A imagem cinza refere-se a uma ampliação de 100x e a colorida refere-se somente a parte analisada por EBSD.
3.4.3 – Difração de Raios-X (DRX)
Utilizou-se um difratômetro de raios-X da SHIMADZU modelo XRD-6000
pertencente ao Núcleo de Estudos de Petróleo e Gás Natural – NEPGN da
UFRN. Foram utilizadas duas configurações de incidência do feixe. A primeira
configuração utilizada foi a Brag-Bretano, ou θ~2θ para varredura entre 20° e
80° numa velocidade de 2°/min e para varredura de 33° a 43° numa velocidade
de 0,25°/min. A segunda configuração foi a de incidência rasante (GIDRX) para
o ângulo de 6° e varredura entre 20° e 80° numa velocidade de 2°/min esta
configuração foi utilizada com a finalidade de obter informações mais
superficiais possível.
3.4.4 – Microdureza Vickers
O equipamento utilizado neste ensaio foi um microdurômetro digital HVS
1000 da PANAMBRA. Foram realizadas 18 identações (impressões de
microdureza) distribuídas por toda a superfície da amostra conforme a figura
3.4 A carga aplicada foi de 100g durante 15s. Essas impressões de
500µm
54
microdureza na superfície também foram utilizadas para localização das
regiões de análise celular (figura 3.6a).
Testes de microdureza foram ainda realizados na secção transversal da
amostra. As impressões neste caso foram realizadas de forma a se ter uma
média para comparação do valor da microdureza na microestrutura da camada
figura 3.6b e na microestrutura do núcleo figura 3.6c.
Figura 3.6 – Micrografias das marcações de microdureza: (a) marcações na superfície que delimitam a área de análises futuras, (b) marcação na camada externa e (c) marcação no núcleo.
3.4.5 – Rugosidade
Para análise da rugosidade foi utilizado um rugosímetro TIME modelo
TR300 do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Piauí – IFPI.
Foram analisados os parâmetros: rugosidade média aritmética (Ra), altura
máxima do pico (Rp), profundidade máxima do vale (Rv), rugosidade média
entre os cinco maiores picos e os cinco maiores vales (Rz), distancia vertical
máxima entre o pico mais alto e o vale mais profundo (Rt). Calculou-se a razão
Rp/Rz para saber se os picos na superfície eram pontiagudos ou
arredondados. Os valores apresentados nos resultados foram uma média de 5
(cinco) medições paralelas aproximadamente equidistantes de 2 mm.
3.4.6 – Molhabilidade
Para o estudo da molhabilidade, utilizou-se o método da gota séssil. Os
líquidos utilizados foram água, formamida, glicerol e meio de cultura ALFA-
MEM, o volume das gotas foi de 10 µL. O goniômetro utilizado nesta análise foi
(a) (b) (c)
100x 400x 400x 50µm 50µm 50µm
55
desenvolvido no Laboratório de Processamento de Materiais por Plasma -
LabPlasma/UFRN e o esquema do mesmo é apresentado na figura 3.7.
Figura 3.7 – Esquema do goniômetro utilizado para medição do ângulo de contato.
3.4.6.1 – Ângulo de Contato
Para determinar o ângulo de contato, colocou-se a amostra sobre a base
do goniômetro e em seguida gotejou-se água e meio de cultura, enriquecido
com soro fetal bovino, sobre a superfície dos discos. Este procedimento foi
acompanhado em tempo real e os resultados foram armazenados através do
software Pinnacle Studio QuickStart versão 8. Em seguida, ainda usando o
Pinnacle Studio, isolou-se uma imagem referente ao instante de 60 segundos.
De posse destas imagens passou-se então a utilizar outro software, o
Surftens (versão demo). Com auxílio deste programa foram feitas 5 (cinco)
marcações gerando-se um circulo e sua respectiva tangente, conforme é
mostrado na figura 3.8. Os valores de ângulo de contato que serão
apresentados neste trabalho representam uma média das medições de três
imagens sendo que foram feitas cinco medidas para cada imagem, ou seja,
uma média de 15 medições.
56
Figura 3.8 – Gota de 10 µL de água depositada sobre um disco de titânio. Medição do ângulo de contato por meio do Surftens.
3.4.6.2 – Energia de Superfície
A Energia de superfície foi calculada utilizando a equação de Fowkes
(Equação 1) (Rajendra e Narendra, 2003). Para tanto, foram utilizados os
valores dos ângulos de contato medidos anteriormente e os valores das
componentes polar e dispersiva de cada uma dos líquidos, estes dados são
apresentados na tabela 3.3.
[
] [
√ ] √
√
√
(1)
Tabela 3.3 – Energia superficial dos líquidos usados.
Líquidos ( ⁄ )
( ⁄ ) ( ⁄ )
Água 72,8 51,0 21,8 Formamida 58,2 18,7 39,5
Glicerol 63,4 26,2 37,2
θ
57
3.5 – Ensaios em Cultura de Células
Após o processamento metalográfico reservou-se três amostras de cada
condição de tratamento e três não tratadas para realização das análises
biológicas. Estas amostras foram então levadas ao Laboratório de
Biotecnologia e Polímeros Naturais – BIOPOL no Centro de Biociências da
UFRN, para esterilização por autoclavagem a 120°C por 30min e realização
dos ensaios biológicos.
Posteriormente, às etapas de limpeza, o experimento seguiu em
ambiente estéril numa câmara de fluxo laminar. Os discos foram colocados
numa placa de cultura de 24 poços, sendo um disco por poço. Em seguida
adicionou-se 1mL de meio de cultura celular (ALFA-MEM) suplementado com
10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico juntamente com células pré-
osteoblásticas de linhagem MC3T3-E1 ( células por poço), figura 3.9. As
placas permaneceram em condição de cultura celular em câmara de CO2 a
37°C.
Figura 3.9 – Fotografia ilustrativa da placa de 24 poços utilizada na cultura de células.
58
3.5.1 – Proliferação por microscopia ótica e análise de imagens
Para realização do teste de proliferação analisado por microscopia ótica
de luz refletida os discos com as células permaneceram em condição de
cultura conforme descrito anteriormente por 24h. Após este período o meio de
cultura foi retirado, sendo então adicionado paraformaldeido a 4% por 15min,
em seguida foi realizado três lavagens com PBS e só então as células foram
fixadas em metanol.
As análises óticas das células aderidas ao substrato foram realizadas a
partir de imagens adquiridas nas mesmas regiões marcadas previamente. O
software Image Pro Plus foi novamente utilizado, desta vez para quantificar as
células sobre cada disco, analisar suas morfologias e área ocupada pelas
células. Tais medidas foram realizadas para cada uma das imagens referentes
às 6 regiões marcadas e, como estão em triplicata, totalizam 18 imagens para
cada condição de tratamento.
A área total de cada imagem no aumento utilizado (500x) é de
146609,7µm2. Sabendo este valor e a área total ocupada por células em cada
imagens, fez-se o cálculo segundo a equação 2.
(2)
Assim, obteve-se valores em porcentagem da área ocupada por células
para cada condição de tratamento. Na figura 3.10 é apresentado um exemplo
do contorno das células, feito utilizando o software image pro plus, nesta figura
é apresentado uma das 18 imagens da condição 11.
59
Figura 3.10 – Ilustração do contorno das células utilizado para aquisição dos dados das células sobre os disco, utilizando o software Image Pro Plus.
A morfologia das células foi analisada através do recurso chamado
“Aspect” do Image Pro Plus, este recurso calcula a razão entre o raio maior e o
raio menor da elipse equivalente à área demarcada ao redor da célula, de
forma que quanto mais aproximado de 1 (um) for o resultado desta razão, mais
arredondada é a célula.
A fim de classificar as células morfologicamente, utilizou-se a
classificação de Zhu e colaboradores (2004), onde células foram classificadas
como não espraiadas (arredondadas), parcialmente espraiadas e
completamente espraiadas (Zhu et al., 2004). Para tanto foi calculado a razão
de aspecto das imagens do trabalho de Zhu (2004), obtendo-se valores entre
1,1 e 1,7. Com base nesses valores padronizou-se as seguintes faixas: entre 1
e 1,5 células arredondadas (não espraiadas), entre 1,5 e 2 células parcialmente
espraiadas e para valores acima de 2 células completamente espraiadas.
3.5.2 – Proliferação MTT
A proliferação foi avaliada por um período de 24h de contato entre
célula e os discos. Decorrido esse tempo o meio de cultura foi retirado e
60
adicionado MTT (brometo de 3 - [4,5 - dimetil - tiazol - 2 il] – 2,5 difenil
tetrazólio) sendo novamente levado à câmara de cultura por mais 4h.
Completado este tempo os cristais foram solubilizados em metanol (PA). Em
seguida todo o líquido foi trocado de placa, retirado da placa de 24 poços e
colocados numa placa de 96 poços. A proporção de troca foi a seguinte: cada
poço da placa de 24 preencheu 3 poços da placa de 96. Esta troca foi
necessária para leitura em espectrofotômetro específico para leitura de placas
de 96 poços (figura 3.11). A leitura foi realizada utilizando um comprimento de
onda de 570nm. Os valores foram analisados em porcentagem de absorbância
em relação ao controle (poço sem disco). Considerou-se a absorção do
controle como 100%, em seguida fez-se a razão entre a absorção da condição
tratada pelo controle.
Figura 3.11 – Espectrofotômetro específico para leitura de placas de 96 poços – laboratório de genética do CB/UFRN.
3.5.3 – Adesão
Os discos foram colocados numa placa de cultura de 24 poços, sendo
um disco por poço. Em seguida adicionou-se 1mL de meio de cultura celular
(ALFA-MEM) e células pré-osteoblásticas de linhagem MC3T3-E1 (
células por poço), figura 3.9. As placas permaneceram em condição de cultura
celular (5% de CO2 e 37°C) por 1 h, 2 h e 3 h.
61
Após os tempos de incubação o meio foi aspirado e os discos lavados 2
vezes com PBS. Em seguida, as células foram fixadas em metanol (PA) gelado
por 5 min. Depois lavou-se mais 2x (duas vezes) com PBS para posterior
coloração com Cristal Violeta 0,2% em Metanol 2%. Passado 10 min, com o
cristal violeta os discos foram lavados exaustivamente em PBS até que todo o
cristal violeta tivesse sido retirado. O corante do interior das células foi
removido com uma solução de etanol 50% e citrato de sódio 0,1 M.
Em seguida todo o líquido foi passado para uma placa de 96 poços para
leitura em espectrofotômetro específico para placas de 96 poços. A leitura foi
realizada utilizando um comprimento de onda de 550 nm. Os valores foram
analisados em porcentagem de absorbância em relação ao controle (poço sem
disco).
3.5.4 – Avaliação da Expressão de integrinas
Para avaliar a influência dos tratamentos térmicos do Ti sobre a
expressão quantitativa de integrinas de osteoblastos humanos da linhagem
Host, foram realizados experimentos, nos quais adicionou-se 5x103 destas
células sobre cada um dos discos de Ti (3 discos para cada condição
apresentada na tabela 3.2). Estas células foram cultivadas por 3 horas,
utilizando meio de cultura (ALFA-MEM) suplementado com 10% de soro fetal
bovino (SFB), 100 UI/ml de penicilina e 100 µg de estreptomicina.
Após o tempo estabelecido, as células foram lavadas em PBS e
tripsinizadas. As células foram incubadas por 1 hora a 4°C com 2 mg/ml de
cada anticorpo contra as integrinas β1 uma vez que estas são as mais
importantes na adesão diferenciação para osteoblastos e produção de matriz
óssea (Gali et al., 2011). Decorrido esse tempo, após três lavagens em PBS,
as amostras foram fixadas em parafolmaldeído 0,5% até análise no citômetro
de fluxo. Um total de 50.000 eventos foram adquiridos no citômetro de fluxo
(FACScan, BD Biosciences, San Jose, USA) do Hemonorte (Hemocentro do
RN).
Os resultados da expressão de integrinas nos osteoblastos cultivados
sobre o titânio foram expressos em intensidade média de fluorescência (IMF)
62
calculada através do software WinMDI versão 2.8. O IMF é a razão entre a
intensidade de fluorescência para cada condição de tratamento e o controle
isotípico (sem marcação específica). Este fator permite identificar diferenças de
intensidade de fluorescência, mesmo quando há uma baixa população de
células marcadas.
3.5.5 – Análise Estatística
Para análise estatística utilizou-se o teste da ANOVA que mede a
variabilidade entre os valores e em seguida fez-se o teste t-student para avaliar
o nível de significância estatística para p<0,05.
64
4 – Resultados e discussões
4.1 – Caracterizações do Titânio
4.1.1 – Microestruturas
Os discos de titânio sem tratamento (ST) apresentaram uma
microestrutura semelhante àquela apresentada na figura 2.7 para o titânio
comercialmente puro conforme é mostrado na figura 4.1a. Os grãos α da
estrutura do titânio antes do tratamento térmico apresentam tamanho variados
desde ~10 µm até ~40 µm, conforme pode ser observado nas medições da
micrografia de MEV apresentada na figura 4.1b.
Figura 4.1 – Micrografias do disco de titânio sem tratamento. (a) micrografia ótica e (b) micrografia por MEV com medição dos tamanhos dos grãos.
Analisando a micrografia da superfície (figura 4.1a) observou-se que
alguns grãos apresentaram no seu interior regiões escuras e em formato de
agulhas e grãos sem essas estruturas. A diferença entre estes dois tipos de
grãos pode ser atribuída à presença de impurezas do tipo hidrogênio, por
exemplo (Boyer, 1985) ou ainda devido à sílica coloidal utilizada no polimento.
Os tratamentos térmicos mais severos de têmpera (1100°C e 1000°C)
permitiram a obtenção de microestruturas bem definidas constituídas
basicamente de ripas ou lamelas de martensita maclada e em alguns pontos
isolados, uma estrutura em forma de placas, conforme pode ser visualizado na
figura 4.2.
(a)
(b)
50µm 50µm
65
Figura 4.2 – Micrografia por microscopia ótica da amostra temperada em água (1100°C). Constituída de uma estrutura de lamelas macladas e em alguns pontos uma estrutura em forma de placas. A micrografia da condição 1000° é semelhante a esta.
Já na têmpera a 950°C, não houve uma completa transformação da
estrutura α primária numa estrutura temperada, conforme ilustrado na figura
4.3, resultado numa estrutura denominada alfa deformada. A partir do campo
de fase α+β é possível obter estrutura martensita, através de altas taxas de
resfriamentos, em menor quantidade quando comparada às amostras
temperadas a partir do campo de fase β (Poondla et al., 2009). Este
comportamento pode ocorrer, pois esta temperatura é muito próxima à de
transformação alotrópica, o que leva à formação de uma estrutura denominada
alfa deformada.
placas
maclas
300µm
66
Figura 4.3 – Micrografia por microscopia ótica da microestrutura de uma amostra temperada a 950°C em água.
O tratamento de envelhecimento a 500°C por 4h possibilitou a
transformação das estruturas martensítica de lamelas grossas e bem definidas
em estruturas em que as lamelas foram mais finas e menos definidas (figura
4.4). Esta modificação foi menos intensa nas amostras temperadas em maiores
temperaturas, ou seja, a 1100°C e 1000°C. Observou-se ainda que 4h a 500°C
não foi suficiente para “dissolver” as lamelas formadas na têmpera a 1100°C.
Para envelhecimentos a 700°C por 4h foi possível verificar que houve
mudança na microestrutura (figura 4.5) comparativamente aos
envelhecimentos a 500oC. Neste caso, as lamelas foram totalmente desfeitas
durante o tratamento resultando em uma estrutura rica em agulhas escuras,
que podem ter surgido em decorrência da contaminação devido ao ar no
interior do forno.
300µm
67
Figura 4.4 – Micrografia por microscopia ótica das microestruturas das amostras envelhecidas a 500°C por 4h.
Figura 4.5 – Micrografia por microscopia ótica microestrutura das amostras envelhecidas à 700°C por 4h.
11R5
10R5
95R5
11R7
10R7
95R7
50µm
50µm
50µm
50µm 50µm
50µm
68
Os tratamentos de têmpera utilizados neste trabalho permitiram a
obtenção de microestruturas diferenciadas em tamanho e forma de grãos,
conforme pode ser visto na figura 4.6, onde é apresentada uma micrografia
ótica do corte transversal das amostras temperadas. Pode-se observar uma
evolução microestrutural semelhante ao mostrado nas figuras 4.2 e 4.3.
Figura 4.6 – Micrografia por microscopia ótica do corte transversal mostrando as diferentes estruturas dos discos temperados.
Uma camada espessa ao redor de todo o disco foi formada durante os
tratamentos térmicos. Esta camada apresentou-se mais espessa para maiores
temperaturas de têmpera. Observando com mais detalhe por microscopia
eletrônica de varredura, observa-se que essas camadas possuem espessuras
de 201 µm, 49,8 µm e 46 µm, para temperaturas de 1100, 1000 e 950oC,
respectivamente (figura 4.7). Observa-se ainda na micrografia de MEV a
presença de uma segunda camada ainda mais externa com espessuras de 10
µm, 4,24 µm e 1,21 µm para as respectivas temperaturas.
300um
11
10
95
300um 300um
69
Figura 4.7 – Medição em microscopia eletrônica da espessura das camadas formadas durante a têmpera.
Analisado por EDS (figura 4.8) a amostras temperadas a 1100oC,
observou-se uma camada mais externa (camada 2) que possui alta
concentração de oxigênio, sugerindo ser uma camada de óxido de titânio. A
camada intermediária (camada 1) que é a camada observada também por
microscopia ótica, embora apresente microestrutura bastante diferenciada do
núcleo, apresentam a mesma composição quando analisada por EDS. Portanto
se fez necessário outra técnica para melhor definição do que seria esta
camada.
4,24um
11
10
95
20
1u
m
10um
49
,8u
m
1,21um
70
Figura 4.8 – EDS da borda dos discos temperados a 1100°C.
4.1.2 – Fases
4.1.2.1 – Difração de Raios-X (DRX)
A técnica utilizada para identificar as camadas mostradas anteriormente
foi a Difração de Raios-X Rasante (GIDRX) nas duas camadas, sendo
analisadas separadamente. Inicialmente a camada 2 e em seguida, após
remoção da camada 2 por procedimento metalográfico, apenas a camada 1.
Os resultados confirmaram que a segunda camada é de fato óxido de titânio,
ou mais precisamente dióxido de titânio na forma de rutilo, segundo a carta 77-
0441 do Power Difraction File (PDF). Já a camada 1 apresentou fases de óxido
de titânio (carta89-3074) e de nitreto de titânio (cartas 87-0626 e 17-0386). Na
figura 4.9 são mostrados os difratogramas referentes a cada uma das
fases/camadas da condição 11.
Ca
ma
da
1
Núcle
o
71
20 30 40 50 60 70 80
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
' e
' e In
ten
sid
ad
e (
u.a
.)
'
20 30 40 50 60 70 80
0
500
1000
1500
2000
Inte
nsid
ad
e (
u.a
.)
Ti2
NT
iN.7
6T
iO0.4
8
TiO
0.4
8, T
i2N
TiN
.76
TiO
0.4
8
TiN
.76
TiN
.76
Ti2
N
20 30 40 50 60 70 80
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500T
iO2
TiO
2
Inte
nsid
ad
e (
u.a
.)
TiO
2
TiO
2
TiO
2
TiO
2
TiO
2
TiO
2T
iO2
TiO
2 TiO
2
TiO
2
Figura 4.9 – Difratogramas para as diferentes camadas presente nos discos. (a) núcleo martensítico (b) camada 1 – oxinitreto de titânio e (c) camada 2 – dióxido de titânio.
A literatura relata a possibilidade de formação destas duas fases durante
o tratamento em temperaturas elevadas e com altas taxas de resfriamentos
Nú
cleo
C
amad
a 1
C
amad
a 2 Rutilo
72
quando o ar é utilizado como atmosfera de trabalho. Borgioli e colaboradores
em 2001 obtiveram camadas muito semelhantes às obtidas neste trabalho. Os
autores concluíram que para tratamento em forno usando o ar como atmosfera
de trabalho se obtém uma camada de TiO2 mais externa e uma camada
intermediária à de TiO2 e ao núcleo formada por TiNxOy, ou seja de oxinitreto
de titânio (Borgioli et al., 2001).
A técnica de difração de raios-X foi ainda utilizada para análise das fases
do núcleo dos discos, para tanto ambas as camadas 1 e 2 foram removidas por
procedimentos metalográficos já descritos no tópico 3.3.
Analisando os difratogramas obtidos numa varredura de 20° a 80° na
configuração θ-2θ (figura 4.10) observou-se pequenos deslocamentos para a
esquerda em todos os picos do difratograma, mostrados na tabela 4.1. Uma
varredura mais lenta (0,25° por segundo) foi realizada apenas nas posições 2θ
em que se encontram os três picos principais do titânio. Observou-se, além do
deslocamento do pico principal (posição 2θ de ~40°) para a esquerda, que
caracteriza a formação da fase martensita. Estes deslocamentos se devem às
tensões residuais que surgiram após os tratamentos de têmpera, uma vez que
este tipo de tratamento promove um grande número de tensões provenientes
da falta de tempo para que haja uma reorganização atômica de acordo com os
diagramas de fases existentes.
A retenção da difusão dos átomos proporciona a formação de uma fase
metaestável que é a estrutura martensita. No caso deste trabalho, a martensita
obtida é a α’ por se tratar de um titânio comercialmente puro, ou seja, sem a
presença de elementos β estabilizadores e foi obtida apenas nas condições
mais severas de têmpera, ou seja, 11 e 10.
Acredita-se que as estruturas obtidas nestas duas condições de
tratamento são martensita com base na análise das microscopias óticas
(estruturas em forma de agulha) em conjunto com os difratogramas, onde foi
observado que para estas condições houve um alargamento dos picos devido à
presença das duas fases α e α’. A largura dos picos (FWHM) pode ser
verificada na tabela 4.1.
73
20 30 40 50 60 70 80
ST
Inte
nsid
ad
e (
u.a
.)
2
11
10
95
Figura 4.10 – Difratogramas do núcleo dos discos de titânio temperados - varredura de
20° a 80°.
Tabela 4.1 – Relação das distancias interplanares e da largura a meia altura dos principais picos comuns nos difratogramas.
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
D
~35° 2,546 2,546 2,558 2,547 2,555 2,556 2,553 2,554 2,557 2,557
~40° 2,231 2,240 2,247 2,237 2,247 2,247 2,244 2,245 2,245 2,245
~52,9 1,727 1,729 1,731 1,725 1,728 1,728 1,728 1,727 1,727 1,727
FWHM
~35° 0,285 0,185 0,163 0,182 0,143 0,107 0,146 0,127 0,111 0,151
~40° 0,281 0,153 0,153 0,166 0,155 0,138 0,149 0,140 0,130 0,142
~52,9 0,179 0,168 0,153 0,165 0,154 0,120 0,142 0,131 0,121 0,140
4.1.2.2 – Difração de Elétrons Retroespalhados (EBSD)
Na figura 4.11 apresenta-se as imagens obtidas durante o ensaio de
EBSD na interface do núcleo com a camada 1. Esta análise foi realizada
exatamente na interface das estruturas, a fim de saber qual a estrutura
cristalina destas fases. Observou-se que ambas apresentam somente estrutura
hexagonal compacta caracterizada pela cor vermelho (figura 4.11b). Entretanto,
74
como visto nos difratogramas anteriores, a estrutura lamelar refere-se à fase
martensita hexagonal ou α’ e a estrutura equiaxial refere-se à fase TiNxOy, ou
seja, oxinitreto de titânio. Quanto à camada de TiNxOy essas pode ter sido
formada por contaminação na rede cristalina durante o aquecimento no forno.
Já a camada de TiO2 foi mais provavelmente formada no momento do
resfriamento.
Figura 4.11 - Imagens de EBSD na interface do núcleo martesitico com a camada 1 do disco temperado a 1100°C (a) região de análise (b) mapa de cores das estruturas cristalinas, apresentando somente estrutura hexagonal compacta.
Essa técnica foi utilizada na análise do núcleo dos discos, afim de
identificar as fases presentes. A partir dos mapas de cores para estruturas
cristalográficas foi verificado que em todas as condições de tratamento,
somente a estrutura hexagonal compacta (representada pela cor vermelho)
estava presente, conforme pode ser verificado através da figura 4.12.
Entretanto ambas as fases α e α’ apresentam estrutura hexagonal
compacta. Para diferir estas fases utilizou-se os padrões de qualidade de
imagens a partir dos quais obteve-se um histograma que sempre
apresentavam dois picos. Um desses picos foi tomado como sendo referente à
fase α e o outro à fase α’ ou alfa deformada. Observou-se que as condições 11
e 10 apresentaram fase α’ em maior quantidade quando comparada à fase α,
já para as demais condições de tratamento o segundo pico foi atribuído à fase
alfa deformada essa observação foi confirmada analisando comparativamente
as imagens de microscopia ótica.
(a)
(b)
100µm
75
Figura 4.12 – Mapas de cores para estruturas cristalográficas obtidas por EBSD. Em todas as condições de tratamento apresentaram somente estrutura hexagonal compacta.
4.1.3 – Microdureza Vickers
Através dos testes de microdureza Vickers (HV) realizados nas
amostras, verificou-se que as camadas de oxinitreto de titânio formadas
durante o processo de têmpera têm aproximadamente o dobro da dureza do
núcleo do material, mesmo esse núcleo tendo estrutura martensita no caso das
condições 11 e 10, esses altos valores de dureza se devem à presença da fase
nitreto (figura 4.13). Valores de dureza semelhantes aos encontrados neste
trabalho para a camada de oxinitreto de titânio foram encontrados por Borgioli,
2001.
200µm 200µm 200µm
200µm 200µm 200µm
200µm 200µm 200µm
76
Figura 4.13 – Microdureza Vickers – corte transversal. Os oxinitretos apresentam-se mais duros que as estruturas martensítica e alfa deformada.
Em primeiro momento o ensaio de microdureza foi realizado para avaliar
o quanto as propriedades mecânicas mudaram, no entanto este teste mostrou
ter relações com a proliferação de células pré-osteobláticas, conforme já
observado por Macêdo, 2011.
Os valores de microdureza Vickers obtidos na superfície das amostras
indicam que os tratamentos térmicos aumentaram consideravelmente a dureza
do material. O titânio sem tratamento apresenta valores de dureza semelhantes
aos da literatura conforme é mostrado na figura 4.14 (Lütjering e Willians,
2007). Os valores encontrados para a fase martensita não são comparados
com a literatura, porque não foram encontrados trabalhos que tenham obtido
estruturas semelhantes para o mesmo tipo de titânio utilizado neste trabalho.
Entretanto, para outras ligas α valores na ordem de 436 +/- 45 HV foram
obtidos (Pinto, 2005).
Kao e colaboradores (2005) estudaram a variação da dureza para
diferentes tratamentos térmicos do Ti-cp. Encontraram que para altas
temperaturas e altas taxas de resfriamento a dureza do material aumenta
consideravelmente quando comparada ao material de partida, por exemplo,
encontraram para tratamento de 750° por 4 horas resfriado em forno, dureza na
ordem de 180 vickers e para tratamento a 1000° por 4 horas dureza na ordem
0
200
400
600
800
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7
Mic
rod
ure
za
(H
V)
camada 1 núcleo martensítico
77
de 250 Vickers (Kao et al., 2005). Esse valores são semelhantes aos valores
obtidos para as condições 95R7 e 10 respectivamente.
Rocha et al em 2006, realizaram tratamentos térmicos em Ti-cp,
encontrando valores de dureza Vickers para discos tratados a 955°C por 1 hora
e em seguida envelhecidos a 620° por 2 horas, na ordem de 259,9 +/- 23,3
vickers (Rocha et al., 2006). Levando em consideração os desvios padrões
esse valor é semelhante ao obtido para as condições 95 e 95R5.
Figura 4.14 – Microdureza Vickers – Superficial.
Os valores mais elevados de dureza foram obtidos para as condições de
têmpera a 1100°C seguido dos seus respectivos envelhecimentos. Da mesma
forma para amostras temperadas a 1000° e seus envelhecimentos e só então
dos discos tratados a 950° e seus envelhecimentos (Figura 4.14). Isso se deve
à quantidade de martensita formada nas têmperas (1100°C, 1000°C e 950°C).
Durante o resfriamento rápido a partir do campo de fase beta, formam-se
muitas lamelas que no geral são finas e alongadas. Entretanto, para
temperaturas mais elevadas ou para tempos mais prolongados, estas lamelas
tornam-se mais largas. Os contornos de grãos destas lamelas impedem a
migração de discordâncias e isso faz com que a dureza do material aumente
(Kao et al., 2005).
0
100
200
300
400
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
Mic
rod
ure
za
(H
V)
78
4.1.4 – Ângulo de Contato
Neste trabalho os ângulos de contato foram analisados utilizando água e
meio de cultura (ALFA-MEM). Observou-se que todos os valores de ângulo de
contato para a água são maiores que os encontrados para o meio de cultura
(figura 4.15). Isto indica que o titânio interage melhor com o meio de cultura do
que com a água, no entanto, todos os tratamentos apresentaram-se
moderadamente molháveis para ambos os líquidos. Esta boa interação com
esses dois líquidos indica que estas superfícies devem responder de forma
favorável à adesão e à proliferação de células.
Figura 4.15 – Ângulo de contato na superfície dos discos de titânio para água e para o meio de cultura celular (ALFA-MEM).
4.1.5 – Energia de Superfície
A energia de superfície é um indicador da química da superfície, em
termos das interações que podem ocorrer. Sabe-se que a energia de superfície
afeta fortemente as interações biológicas, tais como a adesão, proliferação e a
morfologia celular. Ponsonnet e colaboradores (2003) relacionam a
30
40
50
60
70
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
Ân
gu
lo d
e C
on
tato
(θ)
ÁGUA ALFA-MEM
79
componente polar da energia de superfície com o comportamento de células
fibroblásticas (Ponsonnet et al., 2003).
A energia de superfície foi determinada a partir dos resultados dos
ângulos de contato medidos através da técnica da gota séssil na superfície dos
discos após a remoção da camada de oxinitreto, ou seja, a análise foi realizada
no núcleo (estrutura martensita). Observa-se que para as condições de
têmpera a 1100°C seguida dos seus respectivos envelhecimentos à 500°C e a
700°C, a energia total se comporta de forma semelhante e isto se repetiu com
as componentes polar e dispersiva, salvo o fato de que a componente
dispersiva foi muito maior que a polar nas três condições conforme pode ser
observado na figura 4.16.
Para as condições de tratamento de 1000°C e seus respectivos
envelhecimentos a 500°C e 700°C, o valor da energia total foi semelhante,
entretanto, observou-se uma mudança da característica dispersiva apresentada
na condição 10 para uma característica polar apresentada nas condições 10R5
e 10R7. Já para os discos temperados a 950°C e seus envelhecimentos
apresentaram característica mais dispersiva, dada pelos altos valores desta
componente quando comparadas à componente polar. Este comportamento
das componentes é semelhante ao encontrado para a condição ST.
Figura 4.16 – Energia de superfície e suas componentes polar e dispersiva para as diferentes condições de tratamento.
0
10
20
30
40
50
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
(m
J/m
^2)
ENERGIA TOTAL POLAR DISPERSIVA
80
A energia de superfície é a soma das componentes polar e dispersiva da
energia de superfície. Sabe-se da literatura que a componente polar da energia
de superfície influencia a adesão de fibroblastos tendo sido mostrado que a
adesão deste tipo de célula é máxima quando a fração de polaridade,
( )⁄ é igual a 0,3 (Ponsonnet et al., 2003). Mesmo não tendo sido
utilizado este tipo de célula neste trabalho, fez-se o calculo da FP, a fim de
encontrar uma possível relação entre este fator e a adesão de osteoblastos. Os
valores obtidos estão na tabela 4.2.
Tabela 4.2 – Fração de polaridade calculada a partir das componentes polar e dispersiva da energia de superfície dos discos de Ti.
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
FP 0,22 0,27 0,29 0,47 0,78 0,44 0,31 0,44 0,33 0,37
4.1.6 – Rugosidade
Verificou-se que para todas as condições o parâmetro de rugosidade Ra
foi semelhante (tabela 4.3). Isso confirma a necessidade de utilização de mais
parâmetros de rugosidade quando o objetivo é investigar a relação das
propriedades do material com a resposta biológica. A tabela 4.3 mostra além
do parâmetro Ra os parâmetros Rp, Rz, Rv e Rt e a razão Rp/Rz que fornece
a forma do picos, se arredondado ou pontiagudo.
Tabela 4.3 – Parâmetros de rugosidade dos discos de Ti.
Ra(µm) Rp(µm) Rz(µm) Rv(µm) Rt(µm) Rp/Rz
11 11R5 11R7
10 10R5 10R7
95 95R5 95R7
ST
81
Observando-se a tabela 4.3 acima, pode-se concluir que para todas as
condições os picos apresentam-se arredondados. Exceto as condições 11,
11R7 e 10 que se encontram no limite entre a condição arredondado e
pontiagudo. Para os demais parâmetros verifica-se que os menores valores
foram obtidos para os discos sem tratamento. Todavia, é importante salientar
que outros parâmetros além da rugosidade devem ser levados em
consideração no estudo da interação do biomaterial com o meio biológico, uma
vez que o Ra é um parâmetro pobre para este tipo de estudo, pois como visto
para Ra semelhantes foi obtido diferentes graus de proliferação celular.
4.2 – Caracterização da Resposta Biológica
4.2.1 – Orientação Celular
Na figura 4.17 são apresentadas as morfologias celulares representativa
de cada condição de tratamento. Observa-se que nas amostras não tratadas as
células apresentaram-se com aspecto arredondado enquanto que nas
superfícies tratadas, que apresentam estrutura lamelar, as células apresentam-
se espraiadas, orientando-se geralmente conforme a orientação das lamelas.
Já nos discos em que as lamelas foram desfeitas as células apresentam
morfologia semelhante à dos discos não tratados.
Figura 4.17 – Microscopia ótica das células aderida no titânio – Orientação das células conforme a microestrutura.
50 um
11R5
50 um
11
82
Figura 4.17 – Continuação
11R7
10
10R5
10R7
95
95R5
ST
95R7
50 um 50 um
50 um 50 um
50 um 50 um
50 um 50 um
83
De acordo com Chesmel (1995), células ósseas alinham-se
aleatoriamente em superfícies lisas. Quando existe rugosidade orientada maior
que 500 nm, as células percebem essa topografia e orientam-se obedecendo a
orientação topográfica da superfície (Chesmel et al., 1995). A rugosidade
média obtida foi de 0,58 um, ou seja, acima do limite estabelecido e
semelhante para todas as condições. No entanto, somente em algumas
condições (11, 11R5, 10 e 10R5) a estrutura estava orientada e nestas, as
células obedeceram a orientação.
No caso deste trabalho as diferentes topografias testadas são
provenientes de tratamentos térmicos que modificaram a estrutura do material.
Observou-se que as células apresentam-se com orientação mais definidas para
estruturas de lamelas mais grossas. Esta orientação diminui à medida que as
lamelas ficam mais finas, até que a espessura das lamelas bem como a
distância entre elas sejam tais que as células não distingam a orientação da
estrutura e passam, portanto, a comporta-se da mesma forma que na estrutura
equiaxial dos discos não tratados.
4.2.2 – Proliferação e Morfologia por Análises de Imagens
A partir das imagens apresentadas na figura 4.17 e de outras 17
imagens de cada uma das condições de tratamento, calculou-se o número de
células aderidas à superfície dos discos. Os valores apresentados no gráfico da
figura 4.18 representam a soma das células para as 18 (dezoito) imagens
obtidas.
84
Figuras 4.18 – Número de células aderidas aos discos tratados sob diferentes condições, contadas a partir de análise de imagens.
Neste resultado nota-se que as células aderem-se preferencialmente
aos discos temperados, na ordem de suas temperaturas – 1100°C, 1000°C e
950°C, respectivamente. Observa-se também que os discos não tratados tem
um maior número de células que os discos envelhecidos. Realizando testes
estatísticos verificou-se que a diferença na quantidade de células para as
diferentes condições é estatisticamente significante para p<0.001.
Ainda, através das análises de imagens foi possível quantificar em
termos de porcentagem a área dos discos que está coberta por células.
Observou-se que para as condições 11 e 10 cerca de 45% da área estava
coberta por células, este percentual diminui aproximadamente 38% para as
condições de menor tensão residual, discos 95R5 e 95R7 conforme pode ser
observado na figura 4.19.
Embora o raciocínio lógico inicial seja que, para uma maior quantidade
de células maior deve ser a área ocupada. Esta relação não é tão simples de
se afirmar uma vez que para as condições em que as células estão orientadas,
estas são mais estreitas e compridas seguindo a orientação da estrutura e
tendo menor área que nas demais condições nas quais as células não
encontram obstáculos e crescem aleatoriamente ocupando grandes áreas.
300
350
400
450
500
550
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
N°
de c
élu
las a
deri
das
85
Presume-se assim que a área ocupada por células nos discos não tratados
seja maior.
Figura 4.19 – Área dos discos de ti coberta por células (Porcentagem).
A morfologia das células foram analisadas, tomando-se 3 (três) padrões
morfológicos que levam em consideração a elipse equivalente ao contorno da
célula, conforme a figura 4.20. Observou-se que a quantidade de células
arredondadas em todas as condições é inferior à quantidade de células
parcialmente espraiadas. Da mesma forma, estas têm menor quantidade que
as completamente espraiadas ao que indica que para todos os casos houve
uma boa adesão dessas células. Observou-se também que os maiores valores
para a razão de aspecto foram obtidos para as células que estavam orientadas
segundo a orientação das lamelas da microestrutura.
30%
35%
40%
45%
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
86
Figura 4.20 – Morfologia celular. Células arredondadas (<1,5), células parcialmente espraiadas (>1,5 e <2) e totalmente espraiadas (<2)
4.2.3 – Análise de Proliferação Celular (MTT)
A proliferação analisada pelo método MTT teve comportamento
semelhante ao encontrado através de análise de imagens, conforme a figura
4.21. Os discos temperados (11, 10 e 95) foram os que apresentaram maior
proliferação celular seguido dos envelhecimentos a 500°C e dos
envelhecimentos a 700°C. Esses últimos não tiveram diferença estatística
significante, exceto a condição 95R7, quando comparados com os discos não
tratados.
O maior destaque se deu para a condição 11 onde o número de células
quase que triplicou em comparação à placa controle. As demais condições
apresentaram em torno de 1 a 1,5 vezes mais células que o controle, exceto a
condição 95R7 que não chegou nem a dobrar o número de células,
comparando o mesmo parâmetro.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
Fre
qu
ên
cia
de
Cé
lula
s
<1,5 >1,5 e <2 >2
87
Figura 4.21 – Proliferação por MTT – dados plotados em relação à placa controle.
4.2.4 – Avaliação da Adesão Celular
Conforme o esperado para superfícies biocompatíveis, a taxa de adesão
celular aumenta para todas as condições de tratamento. As morfologias
específicas desenvolvidas para cada microestrutura afetaram diretamente a
adesão celular.
Na figura 4.22 são mostrados os resultados da adesão para 1, 2 e 3
horas de cultura. Nos discos 11, 11R5, 11R7, 10R5 e 95 os sítios de adesão
foram preenchidos nas primeiras 2 horas de contato/incubação, a partir desse
momento houve uma estabilização, não havendo, portanto mais adesão em 3h,
possivelmente devido ao fato de que todos os sítios de adesão já estarem
preenchidos.
Já para as condições 10, 10R7, 95R5 e 95R7 ao que tudo indica os
sítios não foram totalmente preenchidos e por isso é perceptível um aumento
gradual no número de células aderidas para os três tempos estudados.
No entanto para os discos ST percebe-se não houve adesão na
primeira hora estudada e que entre 1h e 2h as células aderiram à superfície
possivelmente preenchendo todos os sítios de adesão disponíveis, pois para
3h a adesão foi à mesma que para 2h.
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
% d
e A
bso
rção
88
Figura 4.22 – Adesão celular para 1, 2 e 3 horas de cultura.
4.2.5 – Expressão de Integrinas
Foi observado que todas as condições de tratamento apresentavam
maior expressão de integrinas β1 quando comparada ao disco não tratado,
conforme pode ser observado na tabela 4.4 de intensidade média de
fluorescência para todas as condições utilizadas neste trabalho. Este resultado
indica que as superfícies têm propriedades que podem levar à uma boa
adesão. Quando comparadas ao controle negativo/isotípico verifica-se que em
todas as condições houve um elevado número de ocorrências de integrinas β1,
confirmando que estas superfícies são adequadas para aplicações em cultura
de células, a figura 4.23 mostra os resultados plotados para os controles
negativo e positivo do disco da condição 11. Essa imagem é semelhante as
demais condições.
Tabela 4.4 – Valores de Intensidade média de fluorescência para todas as condições utilizadas neste trabalho. Para todas as condições tratadas o IMF é maior que o não tratado e que todos são maiores que o controle negativo/isotípico.
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST Controle isotípico
59,27 48,34 47,98 53,66 47,91 45,43 50,47 45,55 44,74 44,59 7,44
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
% d
e A
bso
rção
1h 2h 3h
89
Figura 4.23 – Histograma da expressão da integrina β1 para as diferentes condições de tratamento do titânio.
A razão entre os IMFs das condições de tratamento pelo controle
negativo indica o quanto uma condição foi melhor que a outra. A figura 4.24
apresenta os resultados desta razão.
Figura 4.24 – Razão IMF das amostras tratadas pelo controle negativo/isotípico.
4,5
5,5
6,5
7,5
8,5
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
IMF
Controle
negativo ou
isotípico
Controle
positivo
Disco de Ti
Condição 11
90
4.3 – Comparação dos resultados biológicos com as propriedades obtidas
para o titânio
4.3.1 Ângulo de Contato X Proliferação
Observa-se que para ângulos de contato semelhante a proliferação é
bem diferente e que essa proliferação é as vezes maior para os maiores
valores de ângulo de contato como pode ser observado para a condição 11,
por exemplo na figura 4.25. Todas as superfícies analisadas neste trabalho
apresentaram-se moderadamente molháveis, esta condição de molhabilidade
implica que todos os discos tratamento são passíveis de uma boa interação
com o meio biológico.
Figura 4.25 - Relação ângulo de contato e proliferação celular
Analisando o gráfico anterior, verificou-se que os discos temperados a
1100°C e 1000°C e seus respectivos envelhecimentos, não apresentaram uma
relação direta entre ângulo de contato e proliferação. Esta relação pode ser
observada quando se analisa o ângulo de contato do meio de cultura e a
proliferação para as condições 95, 95R5 e 95R7. Estas condições, no entanto,
apresentam uma topografia mais homogênea sem a estrutura lamelar.
0,5
1
1,5
2
35
45
55
65
75
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
Pro
life
raçã
o -
MT
T (%
)
Ân
gulo
deC
on
tato
(θ
)
água alfa mem MTT
91
4.3.2 – Energia de Superfície X Proliferação
Ponsonet et al (2003) associaram a alta adesão obtida com a baixa
energia superficial, na ordem de ⁄ . Todos os valores obtidos neste
trabalho são ainda menores não chegando a ⁄ . No entanto bastante
semelhantes enquanto que a proliferação foi diferente.
Na figura 4.26 são mostrados os resultados da proliferação e das
componentes de energia de superfície. Não foram observadas relações diretas
entre as componentes e a proliferação, exceto para a componente que
apresentou comportamento semelhante aos dos discos temperados a 1100°C e
seus respectivos envelhecimentos.
Figura 4.26 - Comparação do comportamento dos gráficos da proliferação com as componentes da energia de superfície.
Verificou-se que a fração de polaridade (FP) estabelecido por Ponsonet
(2003) para uma boa adesão de células fibroblasticas não pode ser aplicada à
células osteoblsticas. E que não foi possível estabelecer um valor para o FP
que indique uma boa adesão uma vez que para proliferações semelhantes,
condições 10R5 e 95, por exemplo, o valor de FP é muito diferente, conforme
pode ser observado na figura 4.27.
0
0,5
1
1,5
2
0
10
20
30
40
50
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
Ener
gia
de
Sup
erfí
cie
(mJ/
m2)
Pro
life
raçã
o -
MT
T (%
)
MTT gsp gsd gs
92
Figura 4.27 - Comparação do comportamento dos gráficos da proliferação com o fração de polaridade.
4.3.3 - Rugosidade X Proliferação
Muitos estudos relatam que o sucesso dos implantes depende, não
somente das propriedades físico-químicas, tais como a energia superficial, mas
também da rugosidade (Webb et al., 1998; Redey et al., 1999; Hallab et al.,
2001). Entretanto, na maioria dos casos relata-se somente o parâmetro Ra.
Neste trabalho observou-se que para um mesmo valor de Ra, foram obtidos
diferentes graus de proliferação celular e que esta proliferação não foi
influenciada diretamente pela rugosidade Ra, mesmo levando-se em conta
outros parâmetros de rugosidade, tais como os apresentados na tabela 4.3.
Outra relação comumente encontrada na literatura diz respeito à relação
entre molhabilidade, rugosidade e proliferação. A partir das observações
realizadas neste trabalho pode-se verificar que há uma relação mais intensa
que esta relacionada à topografia e à proliferação. Como visto no tópico
anterior para valores semelhantes de ângulo de contato houve uma
proliferação bastante diferenciada, por exemplo, 11 e 11R7.
Estas duas condições diferenciam-se principalmente pela topografia,
devido à microestrutura que apresentam e à tensão residual. Entretanto,
quando se leva em consideração as demais condições de tratamento que
0
0,5
1
1,5
2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
Fraç
ão d
e P
ola
rid
ade
Pro
lifer
ação
- M
TT
(%)
MTT FP
93
apresentam topografia/microestrutura semelhantes o parâmetro que as
diferencia é a tensão residual proveniente dos tratamentos térmicos realizados.
Analisando os demais parâmetros de rugosidade verificou-se que estes
também têm valores muito próximos e que não estão diretamente relacionados
à proliferação (figura 4.28). Entretanto, as maiores proliferações foram obtidas
para as condições em que os picos apresentam-se pontiagudos.
Figura 4.28 - Comparação do comportamento dos gráficos da proliferação com os parâmetros de rugosidade.
4.3.4 – Microdureza Vickers X Proliferação
A microdureza é um bom indicativo do estado de tensão residual do
material quando este material não é ligado. Maiores valores de microdureza
indicam um maior estado de tensão residual. Comparando esse resultado com
o da proliferação celular observa-se que as células preferem superfícies mais
tensas. Foi observado uma maior proliferação nos discos temperados quando
comparados aos discos envelhecidos. A curva do gráfico de microdureza é
bastante semelhante ao da proliferação (figura 4.29). Resultados semelhantes
já foram observados em estudos anteriores (Macêdo, 2011).
0
0,5
1
1,5
2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST
Pro
lifer
ação
- M
TT
(%)
Ru
gosi
dad
e (µ
m)
MTT Ra Rp Rv Rt Rz Rp/Rz
94
Figura 4.29 - Relação microdureza e proliferação celular.
4.3.5 – Orientações Cristalográficas X Proliferação
Foi observado que a maior proliferação celular se deu para a condição
11 e que a condição 95R7 foi a que apresentou menor proliferação celular.
Embora não sejam apresentadas quais as orientações cristalográficas estão
presentes em cada imagem, sabe-se que cada cor refere-se a uma destas
orientações. Comparando esses resultados com as orientações cristalográficas
apresentadas na figura 4.30 observou-se que não há uma correlação direta
entre a orientação cristalográfica e a proliferação celular, uma vez que para
número de células (proliferação) semelhantes são observadas colorações
(orientações cristalográficas) bem diferentes e que para cores iguais a
proliferação foi diferente.
Uma das ideias iniciais deste trabalho de que as orientações
cristalográficas teriam consequências superficiais e, portanto, afetariam a
adesão e consequentemente a proliferação de células foi contrariada. Pelo que
foi observado até então esta relação parece não existir e a resposta biológica
ao nível estudado foi mais influenciada pela tensão residual (indicada pela
microdureza) e pela topografia/microestrutura.
0
0,5
1
1,5
2
50
150
250
350
450
11 11R511R7 10 10R510R7 95 95R595R7 ST
Mic
rod
ure
za (
HV
)
Pro
life
raçã
o -
MT
T (%
)
MTT MicrodurezaHV
95
Figura 4.30 – Mapa de orientação cristalográfica, onde cada cor representa uma orientação cristalográfica.
200µm 200µm 200µm
200µm 200µm 200µm
200µm 200µm 200µm
97
5.1 – Conclusões
Foi possível obter martensita do tipo hexagonal em Ti-cp através de têmpera a
partir das têmperas 1100°C e 1000°C (campo de fase β) com resfriamento em
água;
Após a têmpera as únicas fases presentes são α’ no caso das condições 11 e
10 e alfa deformada para as demais condições;
O ângulo de contato foi influenciado pela topografia e não pela rugosidade Ra;
Não foi possível determinar um valor para Fração de Polaridade ideal para que
se tenha uma boa proliferação de células osteoblasticas sobre a superfície do
Ti tratado termicamente;
As células orientam-se conforme a topografia/orientação microestrutural
(orientação das lamelas). Neste caso, as células apresentam-se espraiadas, ou
seja, alongadas na direção da orientação das lamelas. E quando estas não são
definidas ou não existem, as células encontram-se arredondadas;
No geral existe mais células espraiadas que arredondadas. Essa diferença é
maior para os discos com estruturas lamelares;
Todas as condições apresentaram boa adesão celular e uma boa interação
com as integrinas β1;
Para o nível de análise utilizada neste trabalho, verificou-se que as orientações
cristalográficas não afetam a proliferação. Entretanto, a proliferação, assim
como a adesão, foram fortemente influenciadas pela topografia/microestrutura
e quando esta era muito semelhante acredita-se que o fator influenciador tenha
sido a tensão residual.
98
5.2 – Sugestão de Trabalhos Futuros
Realizar medidas quantitativas de tensão residual utilizando DRX.
Relacionar de forma direta a tensão residual com a proliferação celular.
Aumentar o tempo de proliferação.
Realizar os mesmos testes biológicos para outras ligas de titânio.
99
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H. R. A. Macêdo, M. O. Cardoso, D. O. Freitas, C. Alves Júnior. Estudo da
Molhabilidade do Titânio Tratado Termicamente. Revista Eletrônica de
Materiais e Processos, v.5, n.2 (2010) 61-67. ISSN 1809-8797
Completo em Congressos
J. O. Vitoriano, H. R. A. Macêdo, M. O. C. Macêdo, C. Alves Junior. Effect of
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MC3T3-E1. 21º Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica. p. 237-240
(2008) ISBN: 978-85-60064-13-7
H. R. A. Macêdo; M. O. C. Macêdo; M. W. D. Mendes; J. C. Sá; R. A. Brito; C.
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