PROTEOMIKOS ĮVADAS

Prof. Vida MildažienėVDU GMF Aplinkos tyrimų centras

KMU Kardiologijos instituto Ląstelių kultūrų lab.

1994 m. Markas Vilkinsas (Marc Wilkins) pasiūlė terminą:

Proteoma – tam tikro organizmo (ląstelės) sintetinamų baltymųvisuma tam tikru laiko momentu.

Proteomika – visų genomo koduojamų baltymų struktūros ir funkcijos nustatymas

Tai viso organizmo baltymų rinkinio analizė. Jos metu nustatoma baltymų ekspresija – jos kitimas organizmui vystantis ir sąveikaujant su aplinka. Proteomika tiria savitus ląstelės arba organizmo genųraiškos kitimus baltymų lygmenyje.

Atliekama ne tik baltymų kokybinė ir kiekybinė analizė. Nustatoma ir jų vieta ląstelėje, modifikacijos, sąveikos bei funkcijos

PROTEUSProteus – senovės graikų dievas, žinojęs apie praeitį, dabartį ir ateitį, tačiau vengdavęs apie tai kalbėti.Pagautas jis lengvai ištrūkdavo, nes galėjo įgauti bet kokį pavidalą. Tokštamą atsakymą gaudavo tik sugebantys jį išlaikyti.

Dėl gebėjimo virsti kuo tik norėjo, Proteus tapo pirmapradės medžiagos, iš kurios mes visi sudaryti, simboliu

Proteomika yra genomikos dalis

Laimėjimai nustatant žemesniųjų organizmų ir žmogaus genomą: 1970- bakteriofago, 1981 –

mtDNR, 1995 - nustatyta visas bakterijos Haemophilus influenzae (1.8 mln bp) genomas;1998 - 100Mb Caenorhabditis elegansgenomo seka; 1999 – visa žmogaus 22 chromosomos nukleotidųseka;2000 – beveik visas žmogaus genomas;Tobulėja technologijos –D. melanogaster genomas sekvenuotas per 6 savaites

2001 m. vasario mėn paskelbta Pogenominė Era –Bang! Ir mokslas pereina į naują etapą, kurio tikslas yra išaiškinti visas genomo funkcijas

Time: “Dicovering the holy grail of biology”

Richard Dawkins:“The biological equivalent to the 1969 Apollo Space Mission”

Michael Dexter, Director of the Wellcome Trust:“Medical landmark that will eclipse other great scientific discoveries of the past”Sanger Centre, Cambridge:

“Discovering the code of codes, the book of life and of humankind”.

DNR sekos nustatymas nereiškia ,kad išaiškintas jos veikimasFAKTAI:

Mažiau kaip 1,2 % genomo koduoja baltymus;

Tik pusės nustatytų genų funkcija yra žinoma; apie 40% nustatytų genomo sekų koduoja nežinomos funkcijos ar ne visai nustatytos funkcijos baltymus

<30% žmogaus genomo transkribuojama, t.y., nuskaitomos tarpgeninės sritys (miRNR);

97-98% žmogaus genomo transkriptų sudaro baltymų nekoduojanti RNR (ncRNA)

Individualių žmonių DNR skiriasi tik 0.2%, arba 1 iš500 bazių;

98% žmogaus DNR sutampa su šimpanzės DNR.

‘Gyvenimo knyga' parašyta mums dar neįskaitoma kalba, tarsi senoviniais hieroglifais

Dogma apie genų skaičiaus atitikimąorganizmo sudėtingumo laipsniui - paneigta

Viroidai – 0-1 genaiRNR virusai – 1-25 genai;T4 virusas – 200 genų;Mycoplasma genitalium – 350 genų;E. Coli bakterija – 4000 genų;Mielės – 6000 genų;Vaisinė muselė – 13000 genų;Nematoda – 18000 genų;Bitės – 15000 genųArabidopsis – 26000 genų;Žmogus – 26000 genų;Pelė – 25000 genų;Ryžiai – 45000 genų

Aukštesniųjų eukariotų baltymus koduojančių genų skaičius (20,000 -30,000) panašus įC.elegans and D.melanogaster (apie 20,000).Tam tikrų augalų ir tam tikrų vienaląsčių protistų genomas didesnis už žmogaus.

Pogenominės eros iššūkiai

Žinių apie visus organizmo genus nekanka suprasti kas lemia fenotipą...

Nustatyti raidžių tvarką: tik pradžios pabaiga.Genomika yra >>> nei genomo sekos išaiškinimas; genomo realizavimui suprasti būtina proteomika

iRNR “profilis” tiesiogiai nesutampa su baltymų “profiliu”

Esamos tyrimų technologijos ir DNR savybės (pvz., stabilumas) lėme tai, kad DNR buvo “žemiau kabantis vaisius”

Molekulinės biologijos tyrimai visada buvo daugiau orientuoti į genus, tik vėliau buvo domimasi jų koduojamais baltymais.

DNR yra stabili molekulė, sudaryta iš 4 nukleotidų. Erdvinė molekulės konformacija (dviguba spiralė) ir funkcijos pobūdis nepriklauso nuo nukleotidų sekos. Istoriškai baltymų tyrimai apsiribojo vienos rūšies baltymo analize (baltymų chemija) ir savybių tyrimu. Padėtis pasikeitė, pradėjus taikyti daug efektyvesnius DNR ir baltymųvisuminio tyrimo metodus. 2002 m. chemijos mokslų Nobelio premija skirta J.B. Fenn (JAV) ir K. Tanaka (Japonija) už biologinių molekulių MS analizės metodo patobulinimus, įgalinančius atlikti baltymų tyrimus Didžiajai daugumai ląstelės vyksmų tiesiogiai svarbūs ne genai, o jų koduojami baltymai. Siekiant suprasti ląstelės vyksmus, būtina gauti informaciją apie joje esančių baltymų visumą: baltymųstruktūrą, funkcijas ir jų sąveiką.

Genomas realizuojamas per proteomą:

centrinė molekulinės biologijos dogma

Baltymai – gyvos ląstelės struktūra ir funkcija

Organizmas turi vieną genomą, tačiau daug proteomų

Organizmo baltymų skaičius gali būti keliomis eilėmis didesnis negu genų. Tai paaiškinama alternatyviu sukirpimu ir posttransliacinėmis modifikacijomis, kurių žinoma virš 200 atmainų.Baltymai sudaryti iš >20 monomerų. Kiekvieno baltymo erdvinė struktūra (biologinės funkcijos pobūdis) yra unikali. Jie nestabilūs.Proteoma labai dinamiška. Ji sąveikauja genomu ir kinta priklausomai nuo organizmo vystymosi, aplinkos poveikio ir ligų. Kiekvienas kūno organas turi kitą proteomą.Vienas baltymas - daug funkcijų (“moonlightning”): skirtingos funkcijos dalijasi vienu genu. Būdingi struktūros motyvai ir domenai sudaro baltymų grupavimo įšeimas pagrindą.

Organizmo sudėtingumą lemia ne genomo DNR kiekis ir ne jo koduojamų baltymų kiekis –jį lemia nepaprastas baltymų pasaulio sudėtingumas.

Alternatyvus sukirpimasmikro-RNR

Daugybinės sąveikosDaugiafunkciai

baltymai

RNRi

konformacinė baltymų įvairovė

Daugybinis savitumas

Veikia multimeriniaikompleksai

Proteomikos tikslas yra išaiškinti baltymų visumos veikimo principus: baltymųraišką (kiek kokių baltymų yra tam tikroje ląstelėje), jų funkcijos valdymo principus, sąveiką, nutaikymą, veikimo vietas, įtaką medžiagų apykaitai ir struktūrai, fenotipui; proteomos pokyčių prasmę

Dvi proteomikos strategijos: I. Visuminis baltymų raiškos apibūdinimas - - 2DE/MSII. Visuminis baltymų funkcijų apibūdinimas Proteomics represents an exploration of the great unknown

Proteomikos tyrimProteomikos tyrimųų tipaitipaiStruktūrinė Proteomika - 2D ir 3D baltymų struktūra

rentgeno spindulių kristalografijaNMR spektroskopija

Raiškos proteomika - visuminės baltymų raiškos nustatymas, įvertintant jos pakitimus vystymosi, aplinkos poveikio ir susirgimų metu – svarbu diagnostikai, prognostikai ir vaistams kurti.

Baltymų sekos nustatymas ir identifikavimasBaltymų kiekio įvertinimas

Elektroforezė, IEF, RP-HPLC, baltymų gardelėsMasių spektrometrija

Funkcinė proteomika arba Cell mapping Baltymų modifikacijos, vieta ląstelėje, sąveikos, etc.

Masių spektrometrija,elektroforezė, mielių dihibridinėsistema, baltymų (ligandų) gardelės, mutagenezė, In silico (bioinformatika)

Struktūrinė proteomika

Nustatytų erdvinių baltymų struktūrų skaičius baltymų duomenų bazėse

RaiRaišškos proteomika kos proteomika

iRNR lygis nėra lygus ekspresuojamo baltymo lygiuiNeatspindi funkcionalaus baltymo prigimties

Genomo seka iRNR Baltymas Funkcionalus

baltymas

Transkripcijos valdymas

Transliacijos valdymas

Potransliacinis valdymas

Funkcinė proteomikaStruktūrinė proteomikaRaiškos proteomika

Proteomikos tyrimProteomikos tyrimųų technologijostechnologijos

Lyginami du mėginiai –kontrolinis ir tiriamasis

Bioinformatikos poreikis

Top-Downproteomika: iš viršaus žemyn

Bottom-upIš apačios į viršų proteomika

Ląstelių lizėTūkstančiųpeptidų mišinystripsinas

2-D LC-MS/MS

RPLC-MS/MS LC-IMS-

MS/MS

LC

m/z

SCX steps LC

m/z

drift

Duomenų bazių paieška - MS/MS rezultatų lyginimas su peptidų sekomis

Baltymų gausa ląstelėse labai nevienoda

Negausių baltymų kiekybinio nustatymo problema

Baltymų funkcijos – apie 40% nustatytų genomo sekųkoduoja nežinomos funkcijos ar nevisai nustatytos funkcijos

baltymus...

Cheminė funkcija (fermentams);Biocheminė funkcija (substratas-produktas; ligandas-signalas);Ląstelinė funkcija (kokiuose keliuose veikia, kuriose ląstelės erdvės skyriuose, su kuo sąveikauja baltymas kaip sąveikų tinklo dalis);Fenotipinė funkcija (kokius požymius lemia).

Daugiadarbiai baltymai - “moonlighting proteins

Vienas baltymas >> >viena funkcija

Citochromas c

– mitochondrijųkvėpavimo grandinėselektronų nešiklis;

– apoptozės signalo tarpininkas

Kaip aiškinti vieno geno mutacijos lemiamų ligų mechanizmus? Kurios išdaugiadarbio baltymo funkcijųsvarbios kuriems požymiams?Kam baltymai tokie dideli?

7 iš 10 glikolizės fermentų –daugiadarbiai

Ceruloplazminas:Plazmos feroksidazė (geležies homeostazė);Askorbato oksidazė;Vario pernaša ir saugojimas;Organinių substratų skaidymas;Antioksidacinė apsauga;Prooksidacinis aktyvumas;NO oksidacija (nitrozotiolu apykaita).

Gliceraldehido-3-fosfatodehidrogenazė:Rūgštinė fosfatazėEsterazėADP-ribozilinimasMikrovamzdelius jungiantis baltymasBaltymų kinazėUracil-DNR glikozilazėt-RNR-jungiantis baltymasAmiloidinį baltymą Amy c-jungiantis baltymas

Akies lęšiuko kristalinai:α – šaperonasδ – arginino-sukcinato liazėε – laktato dehidrogenazėβ – aldehido dehidrogenazėλ – hidroksiacil KoA dehidrogenazėµ – ornitino ciklodeaminazėρ – NADPH-chinono reduktazėτ – enolazėσ – GSH-S-transferazė

Baltymų disulfidizomerazė:Prolil hidroksilazės subvienetasTiroksiną jungiantis baltymasPeptidus jungiantis baltymasOligosachariltransferazės subvienetasTriglicerolius pernešančio baltymo subvienetasTioredoksino aktyvumas

Paneigta dogma vienas genas-vienas baltymas-viena funkcija

Current Opinion in Structural Biology 2004, 14:663-668

Fosfogliukozės izomerazė:Ląstelės viduje: katalizuoja 2a glikolizės reakcijąLąstelės išorėje: 1.neuroleukinas (brandina B ląsteles, gemalo nugaros neuronų išlikimo veiksnys; 2. autokrininis judėjimo veiksnys; 3. Brandina žmogaus mielomos leukemijos ląsteles.

Karbinolamino dehidrogenazė:kepenų fenilalanino apykaitos fermentasRegul

PutA:Fermentas prolinodehidrogenazė, esant daug Pro; DNR jungiantis baltymas, esant mažai Pro

Neurofilinas:Ląstelės paviršiaus receptoriusEndotelio ląstelėse jungia kraujagysliųaugimo veiksnį ir signalus naujoms kraujo ląstelėmsNervų aksonuose yra semaforino III ligandas, padeda nukreipti aksomus

“Moonlighting”: skirtingoms funkcijoms panaudojamos kitos molekulės dalys;“Promiscuity”: tuo pačiu AC atliekamos skirtingos funkcijos (> nefiziologinis)

Konformacinė baltymų įvairovė: nepriklausomai nuo ligando jungimo, galima daugiau kaip viena baltymo konformacija

Kraštutinė konformacijų įvairovė būdinga betvarkiams baltymams IUPs - Intrinsically Unstructured Proteins

IUP įgauna įvairias konformacijas, priklausomai nuo baltymų, su kuriais sąveikauja;IUP susilanksto jungimosi su partneriais metu (apjungtas jungimasis ir lankstymasis).

Nors IUP nėra didelis, jungimosi paviršius didelis, nes IUP jungiasi ištemptos formos.Žinoma >100 IUPsų – jie svarbūs genų raiškai, signalo perdavimui ir šaperonų veiklai. Tarp jų nėra fermentų.

~10% baltymų yra visiški IUPsai.

~40% eukariotų baltymų turi bent vieną ilgą (>50 am.r.) bestruktūręsritį.

http://iupred.enzim.hu/

Kaip tas pats IUPsas gali turėti priešingą poveikį partnerio aktyvumui?geltona spalva – nesujungtas partneris, žalia – aktyvintas partneris, raudona – nuslopintas partneris.(a) – IUPs gali jungtis, būdamas dviejų skirtingų konformacijų;(b) - IUPs veikia kaip šaperonas, sukelia parterio konformacijos

pusiausvyros (akt/inakt) pasikeitimą;(c) IUPs jungia du partnerius tos pačios srities alternatyviomis

konformacijos formomis

Eukariotai turi daugiau betvarkių baltymų

Betvarkių baltymų molekulėse Mažiau hidrofobinių, daugiau krūvį turinčių aminorūgščių

Baltymų posttransliacinės modifikacijos

PTM nustatymo problemosMažas santykinis modifikuotų baltymų kiekis, lyginant su nemodifikuotais;Būtina išskirti visus modifikaciją turinčius peptidus, nes galimos ne vienos vietos modifikacijos;PTM yra laikinos ir grįžtamos, todėl būtina inaktyvinti jas šalinančius fermentus; PTM nėra stabilios, jų gali nelikti tyrimo metu.

Baltymų sąveikos: egzistuoja skirtingos to paties baltymo būsenos

Baltymų vietos ląstelėje nustatymas

Organelių proteomikaMembranųproteomika

Fluorescuojančiųžymių vaizdinimas

Skirtingų mielių baltymų, sulietų su GFP, vietos ląstelėje vaizdinimas Cooper, Haussman “The Cell”2007Taip nustatyta >4000 mieliųbaltymų (75 proc.) vieta

Baltymų sąveika

E. ColiAr čia gali būti laisvų molekulių?

Bakterijos citoplazma tankiai pripakuota baltymų, ribosomų. iRNR, DNR;molekulės nėra tolygiai pasiskirsčiusios;medžiagų koncentracija artima baltyminio kristalo koncentracijai.

Drosophila melanogaster2346 baltymųsąveikos tinklas

Proteomikos šakosBaltymų skirstymas. Baltymų kokybinis nustatymas.Baltymų kiekybinis nustatymas.Baltymų sekos nustatymas. Susijęs su bioinformatika, funkcijos prognozavimu, evoliucinių ryšių įvertinimu.Baltymų erdvinės struktūros nustatymas (struktūrinė proteomika).Baltymų funkcijų tyrimas:Interaktomika (baltymų sąveikos nustatymas ir prognozavimas).Baltymų modifikacijos tyrimai (fosfoproteomika ir glikoproteomika). Ląstelės proteomika – baltymų vietos ląstelėje nustatymas. Eksperimentinė bioinformatika (Mathias Mann) – eksperimentinių ir bioinformatikos metodų derinys.

~omikos ir jų santykis

LEGOMIKA

Alosteriniai fermentai