VYTAUTO DIDIOJO UNIVERSITETAS

GAMTOS MOKSL FAKULTETAS

BIOLOGIJOS KATEDRA

Irma Prait

ELNINI GENETIN VAIROV BEI J PERNEAM ERKI USIKRTIMAS BORRELIA BURGDORFERI S.L. IR ANAPLASMA

PHAGOCYTOPHILUM

Magistro baigiamasis darbas

Molekulins biologijos ir biotechnologijos studij programa, 62401B107

Biologijos studij kryptis

Vadovas prof. Algimantas Paulauskas (paraas) (data) Apginta prof. habil. dr. Gintautas Kamuntaviius (paraas) (data)

KAUNAS, 2010

2

Darbas atliktas: 2008 2010 m. Vytauto Didiojo universitete, Biologijos katedroje, Kaune,

Lietuvoje ir 2009.07.01 2009.09.30 LLP Erasmus student praktikos metu, Telemark University

College, Department of Environmental and Health Studies, B i Telemark, Norvegijoje.

Recenzentas: dr. J.Radzijevskaja, fiziniai mokslai, biochemija.

Darbas ginamas: vieame magistr darb gynimo komisijos posdyje 2010 met birelio 3d.

Vytauto Didiojo universitete, Biologijos katedroje, 801 auditorijoje, 10 val. Adresas: Vileikos g. 8,

LT-44404 Kaunas, Lietuva.

Protokolo Nr.

Darbo vykdytojas: I.Prait

Mokslinis vadovas: prof. A.Paulauskas

Biologijos katedra, vedjas: prof. A.Paulauskas

3

TURINYS

SANTRAUKA .................................................................................................................................. 4

SUMMARY ...................................................................................................................................... 5

VADAS ............................................................................................................................................ 6

I. LITERATROS APVALGA ...................................................................................................... 8

1.1. Tauriojo elnio (Cervus elaphus) bendroji charakteristika ..................................................... 8

1.2. Stirnos (Capreolus capreolus) bendroji charakteristika ...................................................... 13

1.3. Iksodini erki (Ixodes ricinus) bendroji charakteristika .................................................... 19

1.3.1. Erki platinama Borrelia burgdorferi .......................................................................... 22

1.3.2. Erki platinama Anaplasma phagocytophilum ............................................................ 23

1.4. Elnini tyrimai ..................................................................................................................... 23

1.4.1 Elnini monitoringas Lietuvoje .................................................................................... 23

1.4.2. Elnini genetiniai tyrimai ............................................................................................. 25

1.4.3. Elnini usikrtimas Ixodes ricinus erkmis ir j perneamais patogenais ................. 30

II. MEDIAGA IR METODIKA .................................................................................................... 33

2.1. Tyrimo mediaga ................................................................................................................. 33

2.2. Elnini DNR iskyrimas, koncentracijos ir varumo nustatymas ........................................ 35

2.3. Erki ir j endoparazit DNR iskyrimas ............................................................................ 36

2.4. Elnini AAPD PGR eiga .................................................................................................. 36

2.5.Borrelia burgdorferi s.l. PGR ............................................................................................... 38

2.5.1. Borrelia burgdorferi s.l. genotipavimas ...................................................................... 39

2.6. Anaplasma phagocytophilum PGR ...................................................................................... 40

2.7. Elektroforez agarozs gelyje. Fragment vizualizavimas .................................................. 41

2.8. Matematinis APPD rezultat vertinimas ............................................................................ 42

III. REZULTATAI IR J APTARIMAS ........................................................................................ 43

3.1. Taurij elni ir stirn genetin vairov pagal AAPD analiz ........................................... 43

3.2. Erki usikrtimas Borrelia burgdorferi s.l ........................................................................ 55

3.2.1. Borrelia burgdorfferi s.l. genotip identifikacija ......................................................... 56

3.3. Erki usikrtimas Anaplasma phagocytophilum ................................................................ 57

IVADOS ........................................................................................................................................ 58

LITERATROS ALTINIAI ......................................................................................................... 59

PRIEDAI ......................................................................................................................................... 65

4

SANTRAUKA

Darbo autorius: Irma Prait

Pilnas darbo pavadinimas: Elnini genetin vairov bei j perneam erki usikrtimas

Borrelia burgdorferi s.l. ir Anaplasma phagocytophilum

Darbo vadovas: prof. Algimantas Paulauskas

Darbas ginamas: Vytauto Didiojo Universitete, Gamtos moksl fakultete, Kaunas, 2010,

birelio 3d.

Puslapi skaiius: 64

Lenteli skaiius: 13

Paveiksl skaiius: 40

Pried skaiius: 10

Elnini genetinei vairovei nustatyti buvo tiriami 27 taurij elni ir 36 stirn individai.

Taurij elni ir stirn pavyzdiai surinkti 2006-2009 metais Lietuvoje ir 2007 m. Norvegijoje.

Individai tirti naudojant AADP (atsitiktinai amplifikuotos DNR polimorfizmo) ir PGR (polimerazs

grandinin reakcija) metodik. Tyrimams naudoti kepen ir raumen pavyzdiai. Stirn ir taurij

elni individai buvo analizuojami naudojant deimt pradmen: ROTH-180-01, ROTH-180-02,

ROTH-180-03, ROTH-180-04, ROTH-180-05, ROTH-180-06, ROTH-180-07, ROTH-180-08,

ROTH-180-09, ROTH-180-10. Elektroforezs geli rezultatai parod, kad polimorfini lokus

skaiius yra 79, o fragment dydis - nuo 150 iki 3000 bazi por. Nustaius fragment dydius ir

skaiius, gauti duomenys buvo suvesti TREECON for Windows kompiuterin program, kuria

remiantis vertintas genetinis kintamumas. Genetinis kintamumas tarp tirt taurij elni individ

varijavo nuo 0,08 iki 0,80, tarp stirn nuo 0,04 iki 0,76. Buvo vertintas ir 75 Ixodes ricinus erki,

surinkt nuo elnini, usikrtimas Borrelia burgdorferi s.l. ir Anaplasma phacytophilum. 2,7% tirt

erki buvo infekuotos Borrelia burgdorferi s.l., o 1,3% erki Anaplasma phagocytophilum.

5

SUMMARY

Author of term paper: Irma Prait

Full title of term paper: Genetic diversity of deer and identification of Borrelia burgdorferi

s.l. and Anaplasma phagocytophilum in ticks collected from deer

Term paper adviser: prof. Algimantas Paulauskas

Presented at: Vytautas Magnus University, Faculty of Naturas Sciences, Kaunas, 2010,

June 3.

Number of pages: 64

Number of tables: 13

Number of pictures: 40

Number of appendixes: 10

The Red deer (Cervus elaphus) 27 individuals from Lithuania and Norway and the Roe

deer (Capreolus capreolus) 36 individuals from Lithuania were analyzed by RAPD (random

amplified polymorphic DNA) polymerase chain reaction (PCR). The liver and muscle tissues

samples were used for the investigations. Cervid individuals were analyzed using ten primers

(ROTH-180-01, ROTH-180-02, ROTH-180-03, ROTH-180-04, ROTH-180-05, ROTH-180-06,

ROTH-180-07, ROTH-180-08, ROTH-180-09, ROTH-180-10). Electrophoresis gels showed that

the number of polymorphic loci are 79 and fragments size are from 150 to 3000. TREECON for

Windows programm was used for the estimation of genetic variability. Genetic variability among

the Red deer separate individual varied from 0,08 to 0,80 and among the Roe deer varied from 0,04

to 0,76. A total 75 Ixodes ricinus ticks collected from cervids were examined for Borrelia

burdorferi s.l. and Anaplasma phagocytophilum. Borrelia burgdorferi s.l. were detected in 2 ticks

(2,7%) and Anaplasma phagocytophilum in 1 tick (1,3%).

6

vadas

Lietuvos kanopini vri fauna, susiformavusi po ledynmeio, iki i dien smarkiai

pakito. Tai vyko dl gamtos ir klimato slyg kitimo, vliau dl moni tiesiogins ir

netiesiogins veiklos. Itirpus paskutiniam ledynui, alto klimato slygomis, Lietuvos teritorijoje

gyveno tundros ir mikatundrs vrys avijauiai, iauriniai elniai, kurie vliau, klimatui atilus,

inyko arba pasitrauk toliau iaur. XVI-XVII a. Lietuvoje inyko stumbrai ir taurieji elniai

(vliau ie vrys ms krate vl buvo pradti auginti) (Baleiis ir kt., 1998).

iandien Lietuvoje gyvenantiems elniniams (stirnoms ir tauriesiems elniams) pavojus

inykti negresia, j populiacijos gausios ir paplitusios beveik visuose Lietuvos mikuose. i vri

populiacijos yra puikus modelis genetini padarini tyrimams. Lietuvos taurij elni gen fondas

paveiktas reintrodukcijos, perklimo, gyvn laikymo aptvaruose, fragmentacijos bei mediokls.

Stirn populiacijos gen fondas paveiktas fragmentacijos ir mediokls. Pastaraisiais deimtmeiais

Lietuvoje buvo tiriama kanopini biologija, morfologija bei ekologija ir j reikm ku