Zastosowania wielowymiarowego NMR

Zastosowania wielowymiarowego NMR

• chemia: 2D NMR rutynowe pomiary : COSY, NOESY, ROESY, HSQC, HMBC, itd.

• biomolekuły 2D, 3D, 4D dobrze zdefiniowane wąskie zakresy spektralne

• widma wielowymiarowe (2D, 3D) są też coraz bardziej popularne w badaniach fazy stałej

• MRI – te same metody (2D, 3D), ale próbkowanie

przestrzeni odwrotnej gradientami B0

Co dają widma wielowymiarowe?

• poprawa separacji sygnałów

• poprawa czułości przy pośredniej detekcji jąder o niskim g

• identyfikacja jąder wzajemnie oddziałujących – problem podstawowy: przypisanie sygnałów

odpowiednim atomom

• pośredni pomiar widm wielokwantowych

• obrazowanie (MRI) – przestrzenne zróżnicowanie częstości rezonansowych

jednowymiarowe widmo NMR białka

widmo dwuwymiarowe

i trójwymiarowe

HNCACB

Problemy rosną z liczbą wymiarów czyli :

• ograniczenia związane z próbką (nieistotne w większości przypadków)

- stężenie, g, B0, T, własności relaksacyjne

• i próbkowaniem (metodologiczne) - liczba punktów (ewolucji w wymiarach pośrednich) szybko rośnie z liczbą

wymiarów

- rozdzielczość jest proporcjonalna do maksymalnego czasu ewolucji (teoremat Nyquista)

N – wymiarowy eksperyment :

Dla ni punktów w wymiarze i : n1 n2 .... nN-1 2N-1 pomiarów 1D

t N exc mix i

t i

N–1

(w przypadku MRI zmiana amplitudy PFG zamiast czasu)

W praktyce 2D:

• liczba pomiarów 1D

n2D= (t1max sw1 + 1) 2

przykład (500 MHz) t1max=0.05 s, sw1=3.5 kHz (1H 7ppm) lub 20 kHz (13C 160 ppm)

rozdzielczość 20 Hz

n2D= 352 (1H) lub 2002 (13C)

czas pomiaru (2 akumulacje po 2 s):

24’ (1H) lub 2 h 13’ (13C)

i 3D

• liczba pomiarów 1D

n2D= (t1max sw1 + 1) (t2max sw2 + 1) 4

przykład (500 MHz) t1max=t2max=0.05 s, sw1=3.5 kHz (1H) sw2= 20 kHz (13C)

rozdzielczość 20 20 Hz

n3D= 2818816

czas pomiaru (2 akumulacje po 2 s): ~4 miesiące

wpływ indukcji B0

• wraz z wielkością B0 rośnie czułość:

S/N~B01.5

• ale zakresy spektralne także rosną z proporcjonalnie do B0

• przykład: 500 MHz 700 MHz

aby uzyskać tę samą rozdzielczość w :

widmach 2D czas pomiaru wzrośnie o 40% (7/5)

widmach 3D dwukrotnie (7/5)2

wpływ indukcji B0


S/N~B01.5




widmach 2D czas pomiaru wzrośnie o 40% (7/5)

widmach 3D dwukrotnie (7/5)2

wpływ indukcji B0


S/N~B01.5




widmach 2D - czas pomiaru wzrośnie o 40% (7/5)

widmach 3D – czas pomiaru wzrośnie dwukrotnie (7/5)2

Jak obejść problem próbkowania?

• Widma projekcyjne ND 2D (próbkowanie radialne) zawodzi przy dużej liczbie sygnałów

Koźmiński & Zhukov, Kim & Szyperski

• Rekonstrukcja z projekcji (też próbkowanie radialne) Kupče & Freeman

• Kodowanie przestrzenne – pomiary jednoprzebiegowe (EPI) Frydman et al.

• Spektroskopia kowariancyjna (naprawdę korelacyjna) Brüschweiler

• Metody niefourierowskie (MEM, MDD)

Billeter, Orekhov, Hoch

• Wielowymiarowa transformata Fouriera (dowolne próbkowanie) nasza grupa

czyli metody spektroskopii projekcyjnej

oraz:

Jak obejść problem próbkowania?

• Widma projekcyjne ND 2D (próbkowanie radialne) zawodzi przy dużej liczbie sygnałów

Koźmiński & Zhukov, Kim & Szyperski

• Rekonstrukcja z projekcji (też próbkowanie radialne) Kupče & Freeman

• Kodowanie przestrzenne – pomiary jednoprzebiegowe (EPI) Frydman et al.

• Spektroskopia kowariancyjna (naprawdę korelacyjna) Brüschweiler

• Metody niefourierowskie (MEM, MDD)

Billeter, Orekhov, Hoch

• Wielowymiarowa transformata Fouriera (dowolne próbkowanie) nasza grupa

czyli metody spektroskopii projekcyjnej

oraz:

spektroskopia projekcyjna: Próbkowanie radialne t1 i t2 w widmie trójwymiarowym

• Pomiar punktów wzdłuż promienia r pod kątem j

t2=r cos(j), t1=r sin(j) • Po jednowymiarowej transformacie Fouriera

względem r uzyskuje się widmo z kombinacją liniową częstości :

wr= cos(j) w2 + sin(j) w1 Niezbędne wyznaczenie znaków częstości • Analiza bezpośrednia – obliczanie częstości „Reduced Dimesionality”

• Widmo próbkowane wzdłuż promienia jest rzutem widma trójwymiarowego na płaszczyznę nachyloną pod kątem j rekonstrukcja z projekcji

t1

t2

r

j

Widma o zredukowanej wymiarowości – czyli rekonstrukcja z pojedynczej projekcji

• Dla każdego sygnału trzeba rozwiązać układ równań liniowych, tj. trzeba zbadać różne kombinacje znaków częstości:

w= cos(j) w2 sin(j) w1 + …

– dwa wymiary dwie niewiadome / dwa równania – trzy wymiary trzy niewiadome / cztery równania – …

• Zawodzi gdy liczba sygnałów jest zbyt duża np. dla wielowymiarowych eksperymentów NOE dla biomolekuł potrzebna jest metoda pozwalająca odtworzyć widmo o wysokiej wymiarowości

Prosty przykład

4D → 2D HACANH

j1= x/y, j2= x/y, (G1,y)/(-G1,-y)

Koźmiński & Zhukov, J. Biomol. NMR, 26, 157 (2003)

HACANH

+++

+–+

+– –

++–

[H i)( , H (i-1) C (i), C (i-1) N(i)] ( ) H (i) ( )t tN 21a aa a

Rekonstrukcja z projekcji

• częstości w widmach 2D z próbkowaniem czasu wzdłuż r pod kątem j :

w2 cos(j) + w1 sin(j) Efekt: projekcja widma 3D na płaszczyznę

nachyloną pod kątem j. konieczne jest wyznaczenie znaków

wszystkich częstości oryginalny pomysł - obrazowanie: Lauterbur, Nature, 242, 190 (1973) (obecnie w MRI stosuje się kodowanie

takie jak w przypadku spektroskopowym)

t1

t2

r

j

Rekonstrukcja z projekcji Kupče & Freeman, J. Biomol. NMR, 27, 383 (2003)

F3 (1H)

F1 (13C)

F2 (15N)

• jeśli częstości F3 nie są

zdegenerowane wystarczą

dwie płaszczyzny :

F1F3 i F2F3


F3 (1H)

F1 (13C)

F2 (15N)

F1F3 t2 =0 j= 0o



dwie płaszczyzny :

F1F3 i F2F3


F3 (1H)

F1 (13C)

F2 (15N)

F1F3 t2 =0 j= 0o

F2F3 t1 =0 j= 90o



dwie płaszczyzny :

F1F3 i F2F3

• w praktyce potrzeba wiele

• otrzymuje się prawdziwe

widmo trójwymiarowe

kolejne projekcje pomagają usunąć

niejednoznaczności

F3 (1H)

F1 (13C)

F2 (15N)

j

Kupče & Freeman, J. Biomol. NMR, 27, 383 (2003)

13C,15N-ubikwityna

F3 (1H) =8.77 ppm

F3 (1H) =7.28 ppm

F3 (1H) =8.31 ppm

dwie płaszczyzny

trzy płaszczyzny

rekonstrukcja konwencjonalne

rekonstrukcja

• zaleta : „prawdziwe” widma wielowymiarowe

• wady:

– artefakty, które mogą tworzyć fałszywe sygnały

– zafałszowane kształty sygnałów

– zafałszowane stosunki intensywności

• wiele różnych podejść (deterministycznych i statystycznych) do rekonstrukcji widm

• jak dotąd żadna nie jest całkowicie wolna od wad i ogólna

Transformacja Fouriera

- najlepsza estymata sygnałów okresowych

))(exp(),,(),,( 332211

1 2 3

321321 tttitttsSt t t

wwwwww =

),,(),,(),,(),,( 321

1

3212

2

3211

3

321 wwwwww StSttSttts FTFTFT

punkty przestrzeni czasu w rzędach i kolumnach

algorytm FFT

Podejście konwencjonalne sekwencyjna jednowymiarowa FT:

Splot sygnału NMR z funkcją próbkowania i ograniczeniem czasu ewolucji – wybór pomiędzy aliasingiem i poszerzeniem

t

poszerzenie Ograniczenie czasu pomiaru

t1

identyczne kopie widma

aliasing próbkowanie

Problem:

• teoremat Nyquista:

Δt<1/sw

• rozdzielczość:

Δn1/at

• dla danego czasu pomiaru konieczny kompromis między zakresami częstości a rozdzielczością

• czas pomiaru rośnie w postępie geometrycznym z liczbą wymiarów

Aliasing

przez równoodległe punkty

można przeprowadzić więcej

niż jedną sinusoidę

but only one fits to randomly

distributed points

Aliasing




ale tylko jedna pasuje gdy

punkty rozłożone są losowo

Aliasing




ale tylko jedna pasuje gdy

punkty rozłożone są losowo

Wciąż obserwuje się aliasing powodowany zaokrąglaniem losowych współrzędnych

czasu i/lub wielkością kroku zegara spektrometru.

Jest to jednak nie znaczące –

n.p. 12.5 ns cykl zegara daje MHz okno spektralne wolne od aliasingu.

FT i aliasing próbkowanie próbkowanie

konwencjonalne losowe

64 punkty

128 punktów

256 punktów

512 punktów

tmax=1s

1024 punkty

FT i aliasing próbkowanie próbkowanie

konwencjonalne losowe

64 punkty

128 punktów

256 punktów

512 punktów

tmax=1s

1024 punkty

próbkowanie losowe 2D - symulacja

• próbkowanie losowe brak aliasingu! • można osiągnąć większe czasu ewolucji (i

poprawić rozdzielczość) bez przedłużania eksperymentu!

jak to osiągnąć:

• wielowymiarowa transformacja Fouriera w jednym kroku:

• przemienna algebra Clifforda: etc.

),(),( 2121 wwStts FT

),()exp(),()exp(),( 21

0 0

2222111121

max1

1

max2

2

ttwtittstiSt

t

t

t

= =

= wwww

)exp()exp(),( 22211121 tititts =

12

3

2

2

2

1 === iii

31221 iiiii ==

400 MHz 3D HNCA ubikwityny 512 punktów Kazimierczuk, Zawadzka, Koźmiński, Zhukov J Biomol NMR, 36, 157 (2006)

konwencjonalne losowe w3(1H) = 8.10

ppm

w3(1H) = 8.74 ppm

Rezultat:

brak aliasingu

szerokość linii zdeterminowana relaksacją poprzeczną

brak dodatkowych parametrów

artefakty – o amplitudzie proporcjonalnej do pierwiastka kwadratowego z liczby punktów

Artefakty są zdeterminowane częstością piku i rozkładem próbek można je obliczyć i usunąć

schematy próbkowania

• widmo 3D HNCACB dla różnych rozkładów

• stosunek amplitudy sygnałów do artefaktów (S/A) nie zależy od gęstości próbkowania i wymiarowości eksperymentu

• S/A jest proporcjonalny do pierwiastka kwadratowego z liczby punktów

• można mierzyć widma o dowolnie wysokiej wymiarowości z rozdzielczością ograniczoną jedynie procesami relaksacyjnymi

Poziom artefaktów nie zależy od gęstości próbkowania K. Kazimierczuk, A. Zawadzka, W. Koźmiński, J. Magn. Reson. 197, 219-228 (2009)

symulacje 1D - 250 punktów

różny czas pomiaru – stały poziom artefaktów

tmax=4s, Q=3.12 tmax=8s, Q=1.56 tmax=16s, Q=0.78

tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 month, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 year, Q=3.97 x 10-7




















tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 miesiąc, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 year, Q=3.97 x 10-7





tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 miesiąc, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 rok, Q=3.97 x 10-7

Q=0.013

Q=0.54

Q=59.52 Q=33.3

Q=0.97

poziom artefaktów nie zależy od wymiarowości

Iteracyjne czyszczenie widm J. Stanek, W. Koźmiński, J. Biomol. NMR. submitted

700 MHz 3D 13C-edited

NOESY-HSQC .

1.5 mM ubiquitin on 700

MHz

w3 (1H) = –0.185 ppm

Poisson disc sampling .

cutoff level of 0.35%

(relative to diagonal peak

amplitude)

2000 data points

t1,max = 30 ms,

t2,max = 12.5 ms

θ = 0.048

Widmo

konwencjon

alne

MEM

MDD

MFT +

iterative

cleaning

transformacja oszczędnościowa SMFT

• wysoka wymiarowość i rozdzielczość

– problem wielkości plików

• 3D – dziesiątki GB - możliwe

• 4D – do TB, łatwe w przyszłości

• 5D, 6D – PB (peta bajty) lub więcej

• rozwiązanie: widma NMR są raczej puste, obliczajmy tylko te miejsca w których są sygnały!





• 4D – do TB, łatwe w przyszłości







• 4D – do TB - łatwe w przyszłości

















Sparse MFT

C H

R

C

O

N

H

H

C H

C

R

N

O

C H C H

R R

C C

O O

N

H

H H

C H

C

R

N N

O

A B C D E

w 1

w2

A

B

C

D

E

w3

Sparse MFT

C H

R

C

O

N

H

H

C H

C

R

N

O

C H C H

R R

C C

O O

N

H

H H

C H

C

R

N N

O

A B C D E

w 1

w2

A

B

C

D

E

w3

Sparse MFT

C H

R

C

O

N

H

H

C H

C

R

N

O

C H C H

R R

C C

O O

N

H

H H

C H

C

R

N N

O

A B C D E

w 1

w2

A

B

C

D

E

w3

Sparse MFT

C H

R

C

O

N

H

H

C H

C

R

N

O

C H C H

R R

C C

O O

N

H

H H

C H

C

R

N N

O

A B C D E

w 1

w2

A

B

C

D

E

w3

Sparse MFT

C H

R

C

O

N

H

H

C H

C

R

N

O

C H C H

R R

C C

O O

N

H

H H

C H

C

R

N N

O

A B C D E

w 1

w2

A

B

C

D

E

w3

Sparse MFT

C H

R

C

O

N

H

H

C H

C

R

N

O

C H C H

R R

C C

O O

N

H

H H

C H

C

R

N N

O

A B C D E

w 1

w2

A

B

C

D

E

w3

G21C-E22N-H

E22C-A23N-H

A23-L24N-H

L24C-A25N-H

A25C-V26N-H V26C-Q27N-H

Q27-E28N-H

E28C-R29N-H

R29C-L30N-H

L30-K31N-H

4D HNCACO CsPIN protein (92 aa)

• przekroje CA-CO dla par N-HN

• 1800 t1/t2/t3 punktów

• 0.65% eksperymentu konwencjonalnego

(ok. 4 miesięcy) • 20 godzin pomiaru

N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

G21C-E22N-H

E22C-A23N-H

A23-L24N-H

L24C-A25N-H


Q27-E28N-H

E28C-R29N-H

R29C-L30N-H

L30-K31N-H






N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

G21C-E22N-H

E22C-A23N-H

A23-L24N-H

L24C-A25N-H


Q27-E28N-H

E28C-R29N-H

R29C-L30N-H

L30-K31N-H






N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

G21C-E22N-H

E22C-A23N-H

A23-L24N-H

L24C-A25N-H


Q27-E28N-H

E28C-R29N-H

R29C-L30N-H

L30-K31N-H






N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

G21C-E22N-H

E22C-A23N-H

A23-L24N-H

L24C-A25N-H


Q27-E28N-H

E28C-R29N-H

R29C-L30N-H

L30-K31N-H






N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

G21C-E22N-H

E22C-A23N-H

A23-L24N-H

L24C-A25N-H


Q27-E28N-H

E28C-R29N-H

R29C-L30N-H

L30-K31N-H






N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

G21C-E22N-H

E22C-A23N-H

A23-L24N-H

L24C-A25N-H


Q27-E28N-H

E28C-R29N-H

R29C-L30N-H

L30-K31N-H






N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

G21C-E22N-H

E22C-A23N-H

A23-L24N-H

L24C-A25N-H


Q27-E28N-H

E28C-R29N-H

R29C-L30N-H

L30-K31N-H






N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

G21C-E22N-H

E22C-A23N-H

A23-L24N-H

L24C-A25N-H


Q27-E28N-H

E28C-R29N-H

R29C-L30N-H

L30-K31N-H






N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

G21C-E22N-H

E22C-A23N-H

A23-L24N-H

L24C-A25N-H


Q27-E28N-H

E28C-R29N-H

R29C-L30N-H

L30-K31N-H






N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

D180-V181

G182-V183

V183-D184

V181-G182

D184-N185

4D HNCACO 0.5 mM Maltose Binding Protein

(MBP) (370 residues)

700 MHz RT HCN probe

• przekroje CA-CO dla

par N-HN • 6700 t1/t2/t3 punktów

• 5.5 % eksperymentu konwencjonalnego


N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

D180-V181

G182-V183

V183-D184

V181-G182

D184-N185

4D HNCACO 0.5 mM Maltose Binding Protein

(MBP) (370 residues)

700 MHz RT HCN probe



• 5.5 % eksperymentu konwencjonalnego


N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

4D HN(CA)NH CsPIN protein (92 aa)

• przekroje N-HN • każda para N-HN

skorelowana jest z jednostką poprzednią i następną




E22N-H A23N-H L24N-H A25N-H V26N-H

Q27N-H E28N-H R29N-H L30N-H K31N-H

N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

N

H

4D HN(CA)NH CsPIN protein (92 aa)

E22N-H A23N-H L24N-H A25N-H V26N-H

Q27N-H E28N-H R29N-H L30N-H K31N-H

• przekroje N-HN • każda para N-HN

skorelowana jest z jednostką poprzednią i następną




N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

N

H

5D

• HCCCONH-TOCSY ubikwityna

• przekroje H-C dla każdej trójki: Ni+1-HNi+1-COi)

• 2000 t1/t2/t3/t4 punktów

• 0.005% czasu konwencjonalnego

(ok. 140 lat) • 61 godzin pomiaru

N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

H

C H

H

L24 K41

G54 V77

6D

• HCCCACONH-TOCSY CsPIN (92 residues) • przekroje H-C (dla: Ni+1-HNi+1-COi-CAi) • 1650 t1/t2/t3/t4/t5 punktów

• 0.0066 % eksperymentu konwencjonalnego (ok. 197 lat) • 114 godzin pomiaru

N

Ca

Cb

H

O

C

Ca

Cb

N

H

C

O

H

C H

H

pomiar sprzężeń

• HNCO {Ca}

• 6 sprzężeń dla jednego sygnału w układzie E.COSY

• 4900 punktów t1/t2

• 2.6% gęstości konwencjonalej

• 31 godzin pomiaru

• zamiast 50 dni

conventional random

Kazimierczuk K, Zawadzka A, Koźmiński W, Zhukov I

J. Am. Chem. Soc. 130 (2008) 5404-5405

Documents

Zastosowania wielowymiarowego NMR