Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran...

Mikroskopije

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Sestava aparature za slikanje

Interakcija med snovjo in valovanjem (delci)

OPAZOVANA SNOV / PRIPRAVA VZORCA

IZVORvalovanja (delcev)

„OPTIKA“

DETEKTOR

Primerjaj med metodami!!

• občutljivost

• razmerje signal/šum

• dinamični razpon

• prostorska ločljivost

• časovna ločljivost

• osnovni princip nastanka slike

• pogoji priprave opazovanega sistema

• komponente aparatur oz. opreme

Kontrast –zaznavanje robov/mej!!!

Mikroskopija

• Pred očesom potrebujemo vmesnik, ki poveča sliko ! Slednja pomeni povečane razdalje med deli slike oz. povečanimi koti !

• Še vedno gledamo krajevno odvisno absorbcijo svetlobe !

• V vsaki točki slike zbiramo svetlobo – iz vseh optičnih ravnin in

– različnih valovnih dolžin !

• Kontrast pomeni razliko v inteziteti v dveh točkah slike !

okular kot povečevalno steklo

Povečava mikroskopa

Primeri slik optične mikroskopije

majhni organizmi,organi(6x, ~ 100 m)

1 mm = 1000 m

posamezne celice(1000x, ~ 1 m)

tkiva(600x, ~ 10 m)

Poljubno velika povečava nam ne da poljubno velike ločljivosti!!

GEOMETRIJSKA OPTIKA VALOVNA OPTIKA

Povečava vs. ločljivost

točkast izvorsvetlobe

Airyjev disk

Uklon na eni reži in interferenčni vzorec

dva točkasta izvora (S1, S2)

S1 max. S2 (1.) min.

y … lateralna ločljivost

Rayleighjev kriterij

Meja ločljivosti pri optičnem mikroskopu

kot zajema (kotna apertura)

y ≈ 0.61 / sin

y bo manjši za nižje in večje

y = 0.61 / (n sin) == 0.61 / NA

NA ... numerična apertura

imerzijska mikroskopija /n

(n ... lomni količnik)

y ≈ 200 nm ≈ /2

= 450 nmn = 1.5 = 70°

Kako lahko povečamo ločljivost

z ≈ 2 y

3D Airyjev vzorec 2D Airyjev vzorec

Lateralna vs. aksialna ločljivost

Različni načini izvedbe presevne optične mikroskopije

Metode za neobarvane vzorce!!

Svetlobna mikroskopija eritrocitov

Mikroskopija s svetlim poljem

Mikroskopija s temnim poljem

Fluorescenčna mikroskopija

• Ne gledamo absorpcije vse svetlobe, temveč le tisto, ki se absorbira na fluorescenčnih označevalcih, ki svetlobo absorbirajo ter jo nato emitirajo pri višji valovni dolžini (nižji energiji) !

svetlo polje fluorescenca

Fluorescenčna mikroskopija celic; sestavljena slika iz slik citoskeleta, jedra in membran

10 µm

0 s 5 s 10 s 15 s

dinamika membranskih domen na orjaških lipidnih vesiklih

Časovna ločljivost

Konfokalna mikroskopija

• Dodatna drobna zaslonka zbira svetlobo le iz izbrane optične ravnine !

• V vsaki točki slike zbiramo svetlobo

– iz ene same izbrane optične ravnine in

– različnih valovnih dolžin !

• Kontrast pomeni razliko v intezitetiv dveh točkah slike v eni optični ravnini !

fluorescenca konfokalna fluor.

Spektroskopija

• Ne zanima nas, od kje prihaja svetloba, temveč kakšna je !

• Gledamo spekter ! Iz celotne slike zbiramo svetlobo in jo analiziramo pri različnih valovnih dolžinah !

• Kontrast pomeni razliko spektralne gostote pri dveh podobnih valovnih dolžinah !

Konfokalna mikrospektroskopija

• Na detektorju zmoremo ločiti svetlobo različnih valovnih dolžin !

• Gledamo krajevno odvisno absorbcijo spektra svetlobe ! Ne zanima nas le intenziteta spektra, temveč posamezni deli spektra oz. spektralna gostota, ki se s krajem spreminja !

• Kontrast pomeni katerikoli razliko v spektru v dveh točkah slike !

konfokalno mikrospektroskopija

500 550 600

Fluorescen

ce intensity (a.u.)

Wavelength (nm)

Membrane probe

Nanoparticles

IR in ramanska mikrospektroskopija

• Na detektorju zmoremo ločiti svetlobo različnih valovnih dolžin v IR področju!

• Gledamo krajevno odvisno absorbcijo IR ali Ramanskega spektra! Zanimajo nas posamezni deli spektra, npr. slika v izbranem vibracijskem načinu določene kemijske skupine !

• Kontrast pomeni katerikoli razliko v spektru v dveh točkah slike !

y = 0.61 / (n sin) == 0.61 / NA

NA ... numerična apertura

IR vs. Raman

KONCEPT vibracijske MIKROSPEKTROSKOPIJE!!!V vsaki točki slike zajamemo celoten vibracijski spekter.To pomeni, da lahko kontrastiramo sliko preko lokalizacije različnih molekulskih skupin (kemično mapiranje). Intenziteta barve lahko pomeni lokalno koncentracijo neke snovi.

Pri SPEKTROSKOPIJI posnamemo povprečen vibracijski spekter vzorca.NI KRAJEVNE INFORMACIJE o razporeditvi komponent v vzorcu!!!

Sklopitev FTIR spektrometra in mikroskopa

Shema FTIR mikroskopa

vrstični mikroskop(zajem slike točko po točko)

mikroskop s FPA detektorjem(zajem celotne slike hkrati)

Možnosti za zajem slike

monokromatski izvorSTABILNOST!!!prostor za vzorce

posebni optični filtri!!!notch – (anti)Stokesedge - Stokes

spektrometer zdetektorjem

Shema Ramanskega mikroskopa

odvisnost od disperzijskih lastnosti uklonske mrežice

odvisnost od goriščne razdalje zrcal v spektrometru

Spektralna ločljivost - Raman

Stimulated Raman Scattering Microscopy –Mikroskopija s stimuliranim ramanskim sipanjem

Ko svetlobo zamenjajo hitri delci

Zelo hitri delci se namreč obnašajo kot svetloba !

Presevna elektronska mikroskopija (TEM)

• Gledamo krajevno odvisno (ne)sipanje hitrih elektronov !

• V vsaki točki slike zbiramo elektrone, ki se niso sipali na vzorcu, ki mora biti v vakuumu in na prevodnem nosilcu (da se vzorec ne nabija) !

• Kontrast pomeni razliko v sipanju elektronov v dveh točkah slike, ki je odvisna od mase sipalcev (jeder) !

lečaelektromagnetna

leča (tuljava,

kondenzator)

fosforna plošča

TEM Golgijevega aparata rastlinskih celic

Vrstična elektronska mikroskopija (SEM)

• Gledamo krajevno odvisno emisijo sekundarno vzbujenih elektronov zaradi trkov z elektroni zelo ozkega snopa!

• Kontrast pomeni razliko v intenziteti sekundarnih elektronov v dveh točkah slike, ki je odvisna od mase sipalcev in njihove elektronske strukture!

elektromagnetna leča kot objektiv

elektromagnetna leča kot deflektor

SEM izvornih celic

Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran...

Documents

Zoran Jaglicic - TELEFONI

Zoran Geller - Operativni sitemi

Zoran Miloševič, Zavarovalnica Triglav, d.d.sors.ba/UserFiles/file/SorS/2019/02. Zoran Milošević.pdf · Višelicadigitalizacije u osiguranju Zoran Miloševič, Zavarovalnica Triglav,

Zoran Kravar - Antimodernizam

Zoran Misic

- Zlatna Grana - Zoran Zelic

ZORAN ZEC - ivantic

104680855 Planiranje Na Nastavata Po Programiranje Slavica Karbeva OOU Petre Pop Arsov Bogomila 2011 12 God

Zoran Jakšić: Kraljevi

Zoran Boban OMD2

CV Zoran Turkalj

Zoran Pavlović – Ždralovi

Zoran Modli- Kola Letenja

Zoran Veršić

Planiranje Na Nastavata Po Programiranje ,Slavica Karbeva , OOU Petre Pop Arsov, Bogomila, 2011.12 God

Zoran Sretenović - Sreta · 2020. 5. 2. · Zoran Sretenović - Sreta Zoran Sretenović i Žarko Paspalj Zoran Sretenovic je rodjen 5. Avgusta 1964. Godine u Beogradu. 1979. na poziv

Zoran Simjanovic II Deo

Zoran D.lukovic-Verske Sekte

Značenje direktne mikroskopije u mikrobiološkoj

Tamara Vonta - Zoran Janković