1

2

3

4

Longpass(LP) Shortpass(SP) Bandpass(BP)

460 500 540460 500 540 460 500 540

SP 500SP 500LP 500LP 500 BP 500/50BP 500/50

检测器组（激光器） PMT位置 带通 /长通透镜 适用染料

488nm蓝色激光

FL1 530/30 FITC

FL2 585/42 PE, PI

FL3 670 LPPerCP,

PerCP-Cy5.5, PE-Cy7

635nm红色激光 FL4 661/16 APC

空白对照（ unstained cell ） : 消除自发荧光的干扰 * * 自发荧光自发荧光：即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发：即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发

荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄

素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样

本死细胞比例越高自发荧光越强本死细胞比例越高自发荧光越强 单色荧光染色（ single color staining ）：特异荧光染色和非特异荧光染色 * 特异荧光：抗体 F(ab’)2 段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光； * 非特异荧光：即抗体 Fc 段与细胞表面的 Fc 受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光。 NRS block or FcγR inhibitor

同型对照（ Isotype Control ） – 与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 （即（即 FcFc 段相同， 段相同， F(ab’)2F(ab’)2 段不同）段不同）– 与染色的单克隆抗体与染色的单克隆抗体 ① ① 相同种属来源相同种属来源 ② ② 相同免疫球蛋白及亚型相同免疫球蛋白及亚型 ③ ③ 相同荧光素标记相同荧光素标记 ④ ④ 相同剂量和浓度相同剂量和浓度 ⑤ ⑤ 但由未免疫动物血清纯化而来但由未免疫动物血清纯化而来– 用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的 FcFc 受体而产生的背受体而产生的背

景染色景染色– 例如，例如，标记标记 FITCFITC 的单克隆抗体为小鼠的单克隆抗体为小鼠 IgG1IgG1 亚类抗体，标记亚类抗体，标记 PEPE

的单克隆抗体为小鼠的单克隆抗体为小鼠 IgG2aIgG2a 亚类抗体，同型对照应用相同浓度和亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化剂量的未免疫小鼠血清的纯化 IgG1IgG1 （（ γ1γ1 ）和）和 IgG2aIgG2a （ （ γ2γ2aa ），并分别标记），并分别标记 FITCFITC 和和 PEPE

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 1.16 7.21

9.5682.1

AP

C

FITC

荧光补偿（ compensation ）：是指在流式细胞多色分析中，纠正荧

光素发射光谱重叠（ spectral overlap ）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。

使用单种荧光素标记的单克隆抗体和 / 或其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行细胞染色

分析类型 管 功能 加入的抗体

双色分析

1 Isotype γ1-FITC γ2a-PE

2 Compensation1 A-FITC γ2a-PE

3 Compensation2 γ1-FITC B-PE

4 Sample1,2…… A-FITC B-PE

No.

Antibody Isotype

Mouse anti-human

未免疫Mouse

血清纯化而来1 A-FITC （ γ1） γ1-FITC

2 B-PE （ γ2a） γ2a-PE

BD FACS AriaII FACSDiva software

Setting High Medium Low

Frequency (kHZ) 87 60 30

Attenuation off on On

Gap 6 6 10-12

Drop1 4th drop 3rd drop 3rd drop

Purity Continuous

Pre sort gating and hierarchy

Spleen +LN

Pre-sorted CD4+

0 50K 100K 150K 200K 250K

0

102

103

104

105

87.9

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105

33.7

33.6

CD44

CD62L

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105

99

0

After-sorted memory T

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105

0

90.5

After-sorted naive TCD4+7AAD-

CD4

200 400 600 800 1000

GG00/G/G11

ss GG22/M/M

DNADNA 分析分析

DNA含量

细胞数量

2N2N 4N4N

PI staining

RFP+ T cells

RFP- T cells

0 102 103 104 105

<APC-A>:Il-2

0

20

40

60

80

100

% o

f M

ax

0 102 103 104 105

<APC-A>:Il-2

0

20

40

60

80

100

% o

f M

ax

Without stimulation PMA + Ionomycin

IL-2

0 102 103 104 105

<APC-A>:Il-4

0

20

40

60

80

100

% o

f M

ax

0 102 103 104 105

<APC-A>:Il-4

0

20

40

60

80

100

% o

f M

ax

IL-4

0 102 103 104 105

<APC-A>:IFN-r

0

20

40

60

80

100

% o

f M

ax

0 102 103 104 105

<APC-A>:IFN-r

0

20

40

60

80

100

% o

f M

ax

IFN-r