ACEA NovoCyte流式细胞仪应用资料B 图2. ACEA NovoCyteTM流式细胞仪上检测NK-92细胞系对Raji细胞的自然杀伤作用。取对数生长期Raji细胞（ATCC® CCL-86™），5nM

No

voC

yte

检测

免疫

细胞

对肿

瘤细

胞的

杀伤

效应

ACEA NovoCyte 流式细胞仪应用资料 —NovoCyte 检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效应

肿瘤免疫治疗是应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞

的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机

体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿

主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长 [1]，

从而达到治疗疾病的目的。免疫治疗是目前肿瘤领域的

研发热点，因其在某些肿瘤疾病上卓越的疗效和创新性，

被《科学》杂志评为 2013 年最重要的科学突破 [2]。临床

上将免疫治疗与手术、放疗、化疗和靶向治疗有机地结

合起来，是今后肿瘤治疗发展的趋势。

细胞治疗是免疫治疗方法中的一种，主要基于免疫细胞

的细胞杀伤作用。具有细胞杀伤作用的免疫细胞，包括

CTL（Cytotoxic T Lymphocyte）细胞、NK（Natural

Killer）细胞、LAK（Lymphokine Activated Killer）细

胞、NKT（Natural Killer T）细胞等。细胞杀伤作用分

以下三种：① NK 细胞介导的细胞杀伤作用：NK 细胞对

靶细胞的直接杀伤，不需要抗原致敏，无特异性 ; ②抗体

依赖性细胞介导的细胞杀伤作用（ADCC）：效应细胞表

面具有 IgG 的 Fc 受体，当靶细胞表面结合有特异性抗体

时，其 Fc 段能与效应细胞表面的 Fc 受体结合，从而触

发对靶细胞的杀伤或破坏 ; ③ CTL 介导的细胞杀伤作用：

细胞毒性 T 淋巴细胞（CD8+T）通过释放穿孔素、颗粒

酶等对靶细胞的直接杀伤作用。

检测细胞杀伤作用的方法主要有 51Cr- 释放法（51Cr-

release assay）、酶联免疫斑点法（ELISpot assay）和

流式细胞术。51Cr- 释放法是一种比较经典的方法，常作

为细胞杀伤作用检测的金标准，但是不能在单细胞水平

上检测，敏感度低，某些肿瘤细胞很难标记，标记后细

胞自发释放率较高和辐射危害，给试验者带来诸多不便；

酶联免疫斑点法检测的是经抗原活化后细胞分泌的细胞

因子，虽具有较高敏感性、单细胞水平检测等优点，但

存在仅检测胞外分泌的细胞因子和单参数分析的局限性

[3]。流式细胞术避免了放射性试剂的应用 , 具有简单、

方便、高敏感性、单细胞水平分析和多参数选择的特点，

通常用 CFSE、DiOC18、CTO 等细胞示踪染料标记效应

细胞或靶细胞、选择性地结合效应细胞和 / 或靶细胞膜

表面特异性标记，利用 PI 或 7-AAD 染料区分靶细胞的

死活 [3,4]，在单细胞水平上检测细胞杀伤作用。本文使

用 ACEA NovoCyteTM 系列流式细胞仪，选用 CFSE/7-

AAD 法，检测 NK 细胞及双特异性单链抗体 BiTE（Bi-

specific T-cell Engagers）介导的 T 细胞杀伤作用。

■ 概述

■ NK 细胞介导的细胞杀伤作用自然杀伤细胞是机体重要的免疫细胞，它不依赖抗体和补体，即能直接识别和杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞，具体的识别

机理目前还不清楚 [5]。NK 细胞在某些情况下也参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，因此，NK 细胞活性可作为判断

机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一。体外检测 NK 细胞活性是诊断 NK 细胞功能及其与某些疾病关系的一个重要手段，

开发它的抗癌功能也是近年来癌症研究的重点之一。本文在 ACEA NovoCyteTM 流式细胞仪上检测人外周血 PBMC 中 NK

细胞对淋巴瘤细胞 Daudi 的杀伤作用，同时检测了 Daudi 细胞上 CD19 的表型变化。如图 1A 所示，在未加入效应细胞

的条件下，Daudi 细胞的自发死亡细胞比例为 17.89%，加入效应细胞后，当效应细胞（Effector cells, E）：靶细胞 (Target

cells, T)=0.25 时，Daudi 细胞死亡比例增至 23.17%。同时，随着效应细胞：靶细胞的比例不断增高，Daudi 细胞死亡

比例持续增高，当效应细胞：靶细胞 =10 时，Daudi 细胞死亡比例达到 66.35%，表明 NK 细胞作为效应细胞发挥了显著

的细胞杀伤效应。对 CD19 抗原的检测显示死亡细胞 CD19 的荧光强度有一定程度的下降。如图 1B 所示，以 %lysis 计

算细胞杀伤比例，%lysis 随 E/T 比例增高显著增高。

全国服务热线：400 600 1063


A

B

图 1. ACEA NovoCyteTM 流式细胞仪上检测外周血 PBMC 中 NK 细胞对 Daudi 细胞的自然杀伤作用。取对数生长期Daudi 细胞 (ATCC® CCL-213 ™ )，5nM CFSE（Molecular Probes，C34554）标记后，调整细胞浓度至 1×106/ml，10 万 / 孔（100ul/ 孔）铺于 48 孔板；计数外周血单个核细胞 (PBMC)，然后按不同 E:T 比例（100ul/ 孔）加入 PBMC（100ul/ 孔），混匀后，置 37℃ CO2 培养箱中继续培养，24h 后收集细胞，加入 APC 标记的 anti-CD19 抗体（ACEA，8920003），冰上孵育 30min，PBS 洗一遍，加入 20ug/ml 7-AAD（Biolegend，420404），冰上孵育 20min，上机测试。图 1A. 流式检测结果图。图 1B.NK 细胞对靶细胞 Daudi 的杀伤效果分析，%lysis 计算公式：

■ NK-92 细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用NK-92 细胞是 Klingemann HG 实验室于 1992 年从一名恶性非霍奇金淋巴瘤患者外周血分离并成功建系的大颗粒淋巴细

胞。NK-92 细胞与 NK 细胞一样，识别靶细胞无 MHC 限制性，可以在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞，对其进行基因

工程改造，可提高其杀伤活性、特异性和敏感性 [6]，更因为 NK-92 细胞的抗肿瘤活性高、体外扩增快、有治疗效益和副

作用小，已开展了相关临床研究 [7-9]。本文在 ACEA NovoCyteTM 流式细胞仪上检测 NK-92 细胞对淋巴瘤细胞 Raji 的

杀伤作用。如图2A所示，在未加入效应细胞的条件下，Raji细胞的自发死亡比例为9.19%，加入效应细胞后，当E:T比为0.04


时，Raji 细胞死亡比例增至 9.94%，随着 E:T 比加大，Raji 细胞死亡比例持续上升，当 E:T 比为 10 时，Raji 细胞死亡高

达 82.35%，表明 NK-92 细胞作为效应细胞发挥了显著的细胞杀伤效应。如图 2B 所示，以 %lysis 计算细胞杀伤比例，%lysis

随 E/T 比例增高显著增高。

A


B

图 2. ACEA NovoCyteTM 流式细胞仪上检测 NK-92 细胞系对 Raji 细胞的自然杀伤作用。取对数生长期 Raji 细胞（ATCC® CCL-86 ™），5nM CFSE 标记后，调整细胞浓度至 1×106/ml，10 万 / 孔（100ul/

孔）铺于 48 孔板；计数 NK-92 细胞（ATCC® CCL-2407 ™），然后按不同 E:T 比例（100ul/ 孔）与 Raji 细胞混合后，置 37℃ CO2 培养箱中继续培养，4h 后收集细胞，加入 20ug/ml 7-AAD，冰上

孵育 10min，上机测试。图 2A. 流式检测结果图。图 2B.NK-92 细胞对靶细胞 Raji 的杀伤效果分析（（n=3，means ± SEM）。

■ CD3/CD19 BiTE 介导的 CTL 对肿瘤细胞的杀伤作用细胞毒性 T 细胞（CTL）是肿瘤免疫的主要途径，通过释放毒性物质或促发靶细胞上的死亡受体而直接溶解靶细胞，或通

过分泌 IFN-γ 间接杀伤肿瘤细胞，在机体发挥免疫监视作用。双特异性单链抗体（BiTE）含有两个抗原的结合位点，一个

位点对 T 细胞表面抗原 CD3 特异，另一个位点对靶细胞特异，它可以将 T 细胞和靶细胞短暂连接，从而活化 T 细胞，释

放颗粒酶、穿孔素等活性物质，溶解杀伤靶细胞 [10]。本文在 ACEA NovoCyteTM 流式细胞仪上检测 CD3/CD19 BiTE

介导下 CTL 细胞对淋巴瘤细胞 Daudi 的杀伤作用。如图 3A 所示，在 CD3/CD19 BiTE（1ug/ml）存在的实验条件下，

未加入效应 T 细胞时，Daudi 细胞的自发死亡比例为 20.21%，当加入 T 细胞后，在 E:T 比为 0.63 时，Daudi 细胞死亡

比例增至 27.39%，随着 E:T 比加大，Daudi 细胞死亡比例持续上升，当 E:T 比为 10 时，Daudi 细胞死亡达到 74.23%;

而在对照抗体 anti-CD19 存在的条件下，未加入效应细胞或加入不同比例的效应细胞，Daudi 细胞死亡比例始终保持稳定，

和自发死亡比例一致。这一结果表明 CD3/CD19 BiTE 有效地介导了 T 细胞发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。如图 3B 所示，

以 %lysis 计算细胞杀伤比例，在 CD3/CD19 BiTE 作用下，%lysis 随 E/T 比例增高显著增高；而在 anti-CD19 作用下，%lysis

始终保持稳定。


A


B

图 3. ACEA NovoCyteTM 流式细胞仪上检测在 CD3/CD19 BiTE 作用下 T 细胞对 Daudi 细胞的细胞杀伤作用。取对数生长期 Daudi 细胞，5nM CFSE 标记后，调整细胞浓度至 1×106/ml，10 万 / 孔（100ul/

孔）铺于 48 孔板，同时，使用 T 细胞富集试剂盒（EasySepTM human T cell enrichment kit，STEMCELL，19051）磁珠分离富集 T 细胞并计数，然后按不同 E:T 比例（100ul/ 孔）与 Daudi 细胞混

合，随后，加入 1ug/ml CD3/CD19 bispecific T cell engager (BiTE) （scFv（CD19×CD3e），G&P Bioscience,FCL1770），1ug/ml anti-CD19 为对照，混匀，置 37℃ CO2 培养箱中继续培养，

72h 后收集细胞，加入 20ug/ml 7-AAD，冰上孵育 10min，上机测试。图 3A. 流式检测结果图。图 3B. T 细胞对靶细胞 Daudi 的杀伤效果分析（（n=3，means ± SEM）。

参考文献

1、周光炎主编 . 免疫学原理 . 上海 . 上海科学技术出版社 . 2014 年第 3 版

2、Breakthrough of the year 2013. Notable developments. Science. 2013; 342 (6165):1435-41

3、 Zaritskaya L, Shurin MR, et al. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 2010; 9(6): 601–616

4、 GG Kim, VS Donnenberg, et al. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: Comparisons to a 4h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 2007; 325(1-2): 51–66

5、Janeway's. Immunobiology. Garland Science. 8th edition (2012)

6、罗渊，段连宁 .NK-92 细胞的研究和应用进展 . 中国免疫学杂志 , 2010(01)：85-91

7、 Klingemann H, Boissel L, et al. Natural Killer Cells for Immunotherapy- Advantages of the NK-92 Cell Line over Blood NK Cells. Front Immunol.2016; 14;7:91

8、 Arai S, Meagher R, et al. Infusion of the allogeneic cell line NK-92 in patients with advanced renal cell cancer or melanoma: a phase I trial. Cytotherapy. 2008; 10:625–32

9、 Tonn T, Schwabe D, et al. Treatment of patients with advanced cancer with the natural killer cell line NK-92. Cytotherapy.2013; 15:1563–70

10、Baeuerle PA, Reinhardt C. Bispecific T-Cell Engaging Antibodies for Cancer Therapy. Cancer Res. 2009; 69(12):4941-4944

地址：浙江省杭州市西湖区西园五路2号5幢电话：+86 571-28908600传真：+86 571-28901358www.aceabio.com.cn艾森官网二维码

仅供研究，不用于临床诊断


Documents

ACEA NovoCyte流式细胞仪应用资料B 图2. ACEA NovoCyteTM流式细胞仪上检测NK-92细胞系对Raji细胞的自然杀伤作用。取对数生长期Raji细胞（ATCC® CCL-86™），5nM