流式细胞仪流式细胞仪FLOW CYTOMETER

原理及应用

EPICS XL 流式细胞分析仪

流式细胞术

流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、

分子免疫学和单克隆抗体技术、激光技术、电子计

算机技术等学科高度发展、综合的结晶。

FCM应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进

入了细胞和分子水平的研究,

流式细胞仪与显微镜

FLOW MICROSCOPE

光源 激光 自然光、灯光、氙(汞)灯

对象 细胞、生物粒子 细胞、生物粒子

承载工具 载(盖)玻片鞘液及流动室

检测信号 光学信号 形态及染色

放大方式 PMT，放大电路 目镜X物镜 光学放大放大方式 PMT，放大电路 目镜X物镜, 光学放大

统计 人工，200计算机，>5000

结果 简单，单参数多参数，综合分析

基本原理基本原

流路

流动室

鞘液SHEATH

样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml样本流 单细胞悬液 个/

光路

光源光源

滤片

光电倍增管PMT HV

电路

放大电路HV及GAIN 增益

/ 转换A/D转换

统计：计算机

流 路流 路

单细胞悬液

大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中

这一过程,成为流体动力学聚焦

FLOW CELL

Injector Tip

Sh thSheathfluid

FluorescenceFluorescencesignals

Focused laserbeam

光 路

光源

检测信号散射光信号

FS 前向角散射光FS: 前向角散射光SS: 侧向角散射光(90度散射光)

荧光信号荧光染料荧光染料光学滤片

光 路光 路

光源

与通过的细胞聚焦在同一点上

激光

空冷空冷

488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green,空冷/水冷冷 水冷Enterprise II水冷

Innova300系列 Innova70系列

检测信号

散射光信号—前向散射光(FS)散射光信号—前向散射光(FS)

FS F d (A l Li ht) S ttFS----Forward (Angel Light) Scatter在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器

FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及optical homogeneity 有关

FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性如:大小如:大小

前向散射光

Laser

FALS Sensor

前向散射光

散射光信号 – 侧向散射光散射光信号 – 侧向散射光

SS-Side (Angel Light) Scatter与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器

SS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及optical homogeneity 有关

SS用于检测细胞内部结构如:胞浆内颗粒多少, 核质比如:胞浆内颗粒多少, 核质比

侧向散射光

Laser

FALS Sensor

90LS Sensor

侧向散射光

Light Scatter Gating

Side Scatter Projection

1000 Neutrophils

on

d S

catte

r

800

1002001000

ter P

roje

ctioScale

Forw

ard

400

600

20304050

100

Monocytes

rwar

d S

catt

0 200 400 600 800 1000

0 2

0081520

Lymphocytes For

90 Degree Scatter0 200 400 600 800 1000

光路-荧光信号光路-荧光信号

每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.

利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些( )光学信号

荧光染料的特性

•激发波长(EXCITING)激发波长(EXCITING)

•发射波长(EMISSION)( )

常用荧光染料的特性

荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色

FITC 488 525 免疫荧光 绿色

PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色( ) 88 575 免疫荧光 橙色

ECD 488 620 免疫荧光 橙红

免疫荧光 红PeCy5 488 675 免疫荧光 红

PI 488 620 DNA染色 橙红

PECy7 488 755 免疫荧光 深红

P CP 488 670PerCP 488 670

APC 633 670

常用荧光染料(488nm 633nm激发)常用荧光染料(488nm,633nm激发)

Fluorescein Isothiocyanate (FITC)Phycoerythrin (PE)Allophycocyanin (APC)Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP)Peridinin Chlorophyll Protein (PerCP)Tandem Dyes

PE-Texas Red (ECD)PE Texas Red (ECD)PE-Cy5 (PC5)PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures)PE Cy5.5 (PC5.5) (futures)PE-Cy7 (PC7) (futures)

4 Color Single Laser (488nm)g ( )FITC/PE/ECD/PC5

Future Possibilities: 5 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7

荧光染料比较(平均荧光强度)Q Prep / ImmunoPrep 试剂系统Q-Prep / ImmunoPrep 试剂系统

CD8-FITCCD8-FITC CD8-PECD8-PE CD8-ECDCD8-ECD

CD8 PC5CD8 PC5 CD8 P CPCD8 P CP CD8 APCCD8 APCCD8-PC5CD8-PC5 CD8-PerCPCD8-PerCP CD8-APCCD8-APC

PerCP < APC < FITC < ECD < PC5 < PE

FALS Sensor

eqFr

e

Fluorescence

Fluorescence detectorFluorescence detector( FL1,FL2,FL3,FL4)

光路 - 滤片特性光路 - 滤片特性

长通滤片 – 允许长于设定波长的光通过

短通滤片 – 允许短于设定波长的光通过

带通滤片 – 允许一定带宽的波长通过带通滤片 允许 定带宽的波长通过

光路 - 滤片特性光路 - 滤片特性

当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光,

这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter)

滤片滤片

带通滤片 BAND PASS (BP)带 滤片 ( )只允许某些波长的光通过

630 nm BandPass Filter

Transmitted LightWhite Light Source

二向色性滤片 DICHROIC FILTER定波长 上 过 该波长 折射

620 -640 nm Light

一定波长以上通过，该波长以下折射

Di h i Fil /Mi 45 dDichroic Filter/Mirror at 45 deg

Transmitted Light

Light Source

Reflected light

Unique 4-Color Single Laser Design

675BP FL4 (PC5)

525BP FL1 (FITC)

575BP FL2 (RD1)

620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5)

Air-cooled Argon Ion Laser Side ScatterDetector

525BP FL1 (FITC)

550DL600DL

645DL

Beam Shaping Lenses 488DL488BK

High SensitivityQuartz Flow Cell

Forward ScatterDetector

PC7

750BP FL4 (PC7)

525BP FL1 (FITC)

575BP FL2 (RD1)

675BP(PC5) 750BP FL4 (PC7)

Air-cooled Argon Ion Laser Side ScatterDetector

525BP FL1 (FITC)

550DL600DL

700DL

Beam Shaping Lenses 488DL488BK

High SensitivityQuartz Flow Cell

Forward ScatterDetector

Optics - DetectorsOptics - DetectorsPhotomultiplier tube (PMT)

将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号

不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程

Single Parameter Histogram: Count vs MFI

ImmunophenotypingImmunophenotyping

g g

110

150

y g

Count

30

70

Log FITC

1000 100 10 1.1

30

Single Parameter Histogram

Dual Parameter Histograms

1 2

e (C

D4)

100 45% 2%

ores

cenc

10

g P

E F

luo

1

3 426%27%

1 1 10 100 1000

Log

.1

3 426%27%

Log FITC Fluorescence (CD8).1 1 10 100 1000

Dual Parameter Histograms

Dual Parameter Histograms

3-D Histograms

3-D Histograms

3-D Histograms

Cytomics FC500

EPICS XL/XL-MCL,Sample Prep System

EPICS ALTRA

CD分子(Cluster of differentiation)-------人类白细胞分化抗原人类白细胞分化抗原

20年前由于杂交瘤技术的出现 开创了制备单克隆抗20年前由于杂交瘤技术的出现,开创了制备单克隆抗体的新纪元。从此单克隆抗体（单抗）广泛应用在医学、免疫学和血液学基础和临床研究获得了巨大成就。其中最具代表性的就是利用单抗 究人类血细胞表面抗原 由 发起表性的就是利用单抗研究人类血细胞表面抗原。由WHO发起，人类白细胞分化抗原国际研究小组组织鉴定和统一命名，将识别相同抗原的单抗归于一组，以Cluster of识别相同抗原的单抗归于 组，以Cluster of Differentiation member system, 简称CD表示。

自1982年始至2000年，共召开了七届国际人类白细胞分化抗原会议 共命名 种 单抗 同 中有几种胞分化抗原会议，共命名 247种CD单抗。同一CD中有几种、十几种、甚至几十种单抗，克隆不同，生产实验室不同，虽然同一CD单抗识别同一抗原分子，但这些单抗与抗原不同位然同 CD单抗识别同 抗原分子，但这些单抗与抗原不同位点反应，因此用同一CD系列中多个单抗测定时，结果会有差异

CD抗原及其相关细胞群

细胞群 CD抗原T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38B细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75

髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63

激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97粘附分子 CD11 CD18 CD29 CD44 CD49 f粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f内皮细胞 CD105 CD106 CD109

细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126

流式细胞术的临床应用流式细胞术的临床应用流式细胞术的临床应用流式细胞术的临床应用

临床免疫学临床免疫学

临床血液学临床血液学临床血液学临床血液学

临床肿瘤学临床肿瘤学

细胞凋亡细胞凋亡

血栓与止血血栓与止血血栓与止血血栓与止血

骨髓和器官移骨髓和器官移

植植

基础医学研究基础医学研究基础医学研究基础医学研究

((一一) ) FCMFCM在临床免疫学中的应用在临床免疫学中的应用

1.1.评价机体的免疫功能评价机体的免疫功能(1) (1) 淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群

●● TT细胞：细胞： CD3CD3++●● TT细胞：细胞： CD3CD3CD4CD4++ (Th/Ti)(Th/Ti)CD8CD8+ + (Ts/Tc)(Ts/Tc)

●● BB细胞：细胞： CD19CD19++

●● NKNK细胞：细胞：CD3CD3-- CD16CD16+ + CD56CD56++

(2) (2) 淋巴细胞亚群细分淋巴细胞亚群细分●● TT细胞细胞:: TsTs：：CD8CD8++ CD28CD28--●● TT细胞细胞: : TsTs：：CD8CD8 CD28CD28

TcTc：：CD8CD8+ + CD28CD28++

ThTh：：CD4CD4+ + CD29CD29++

TiTi：：CD4CD4+ + CD45RACD45RA++TiTi：：CD4CD4 CD45RACD45RA●● BB细胞：细胞：B1B1：：CD5CD5+ + CD19CD19--

B2B2：：CD5 CD5 ++ CD19CD19++

根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同

将CD4+、CD8+分为将CD4+、CD8+分为

CD4+:

T h1:CD4+IFNr+

Th2: CD4+IL4+Th2: CD4 IL4

Th0:CD4+IFNr+IL4+

CD8+:

Tc1:CD8+IFNr+Tc1:CD8+IFNr+

Tc2:CD8+IL4+

Tc0:CD8+IFNr+IL4+

辅助性T细胞亚群的生物学功能及临床意义辅助性T细胞亚群的生物学功能及临床意义

Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。

Th2细胞 ：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。

Th1/Th2细胞平衡偏移多见于：感染症、自身免疫病、过敏症、排斥反应、免疫缺陷、肿瘤恶化等。检测Th1/Th2细胞平衡主要是分斥反应、免疫缺陷、肿瘤恶化等。检测Th1/Th2细胞平衡主要是分析疾病发生发展的状况，为临床调整Th1/Th2细胞平衡偏提供正确的治疗依据。

(3) (3) 活化淋巴细胞亚群活化淋巴细胞亚群( )( )●● 活化总活化总TT细胞：细胞： CD3CD3+ + /HLA/HLA——DRDR++

●● 静止总静止总TT细胞：细胞： CD3CD3+ + /HLA/HLA——DRDR--●● 静止总静止总TT细胞：细胞： CD3CD3 /HLA/HLA——DRDR●● 活化活化CD4+CD4+细胞：细胞：CD4CD4+ + /HLA/HLA——DRDR++

活化活化 细胞细胞●● 活化活化CD8+CD8+细胞：细胞：CD8CD8+ + /HLA/HLA——DRDR++

●● 活化诱导分子：活化诱导分子： CD69CD69●● 白细胞介素白细胞介素22低亲和力受体：低亲和力受体： CD25CD25

CD25CD25+ + /CD3/CD3++：：活化活化TT细胞细胞CD25CD25 /CD3/CD3 ：：活化活化TT细胞细胞CD25CD25-- /CD3/CD3++：：静止静止TT细胞细胞

(4) (4) ⅠⅠ型变态反应介导分子型变态反应介导分子低亲 力 体低亲 力 体●● CD23CD23：： IgEIgE低亲和力受体低亲和力受体

●● 膜结合：膜结合：IgEIgE膜结合膜结合 gg

(5) HLA(5) HLA类抗原类抗原

HLAHLA B7 / BB7 / B 2727●● HLAHLA--B7 / BB7 / B--2727

●● HLAHLA--DRDR

●● HLAHLA--DPDP

HLAHLA DQDQ●● HLAHLA--DQDQ

●● HLAHLA--ABCABC

(6) (6) 细胞因子受体细胞因子受体

ILIL 2 R t (CD25)2 R t (CD25)●● ILIL--2 Receptor (CD25)2 Receptor (CD25)

●● ILIL--12 Receptor12 Receptor

●● EGFEGF--ReceptorReceptor

●● TNFTNF--ReceptorReceptor

●● TGFTGFββ--ReceptorReceptor●● InsulinInsulin--ReceptorReceptorpp

(7) T(7) T细胞受体库细胞受体库

●● TGRTGR γ/δγ/δ●● TGR TGR γ/δγ/δ●● TGR TGR αα//ββ●● TCRTCR νβνβ变异体变异体●● TCR TCR νβνβ变异体变异体

(8) (8) 机体免疫功能监测的应用机体免疫功能监测的应用

●● 自身免疫性疾病自身免疫性疾病HLA-B27:强直性脊柱炎相

关标志

●●变态反应性疾病变态反应性疾病CD23: 与变态反应严重程度

呈正相关呈正相关

●●免疫缺陷性疾病免疫缺陷性疾病

●● 感染性疾病感染性疾病((病毒 细菌 寄生虫感染病毒 细菌 寄生虫感染))●● 感染性疾病感染性疾病((病毒、细菌、寄生虫感染病毒、细菌、寄生虫感染))

●● 免疫治疗监测免疫治疗监测

肿瘤免疫监测肿瘤免疫监测●● 肿瘤免疫监测肿瘤免疫监测

●● 移植免疫监测移植免疫监测

临床应用临床应用

免疫调节：细胞因子/受体的相互作用

共受体 配体的相互作用共受体/配体的相互作用

发病机理：HIV、癌症、自身免疫性疾病

药物/疫苗效果的评价

免疫状态评价：感染（病毒、寄生虫、细菌等）免疫状态评价：感染（病毒、寄生虫、细菌等）

移植、化疗等

如 二个HIV病人 CD4 15/ l如：二个HIV病人 CD4

器官移植后免疫监测

提示排异------- CD3+/CD25+基线5-10%以上

提示肾穿------- CD3+/CD25+持续增加

预测感染------- CD4/CD8比值下降预测感染------- CD4/CD8比值下降

指导免疫抑制剂应用-- CD4/CD8

甲亢病细胞免疫功能检测：

CD4、CD4/CD29、CD4/CR45RA、CD8/CD28、CD19/CD5

肿瘤患者细胞免疫功能检测：

CD3/HLA DR CD4/HL ADR CD8/HLA DRCD3/HLA-DR、CD4/HL-ADR、CD8/HLA-DR、CD3/CD16+56、CD3/CD25、CD19

肝炎患者协同刺激分子B7肝炎患者协同刺激分子B7

（B7-1/CD80、B7-2/CD86）及其受体CD28（B7-1/CD80、B7-2/CD86）及其受体CD28的研究

细胞免疫功能与感染性疾病

细胞免疫功能的抗感染作用细胞免疫功能的抗感染作用正常人的免疫功能

细胞免疫的抗感染作用

细胞免疫功能的测定T细胞亚群T细胞功能

细胞免疫功能测定的临床意义

细胞免疫功能的抗感染作用

感染的发生有两个基本要素：病原体和机体的免疫功能体的免疫功能

免疫功能对疾病转归的影响：对免疫功能正常的人不起致病作用的病原体 在免疫功能低正常的人不起致病作用的病原体，在免疫功能低下的人身上可发生致命性的感染；免疫功能正常的人发生某种感染后可很快恢复 而在免疫功能的人发生某种感染后可很快恢复，而在免疫功能紊乱的人则成为慢性状态。对同样的病原体所导致的感染，给予同样的抗感染治疗，转归完全不致的感染，给予同样的抗感染治疗，转归完全不

一样。

结论：感染性疾病的发展和转归与机体的免疫结论：感染性疾病的发展和转归与机体的免疫系统的强弱密切相关。既往的医学研究偏重于对感染性疾病病原体的治疗。免疫系统与各种感染感染性疾病病原体的治疗。免疫系统与各种感染关系和免疫治疗已成为研究的世界热点之一。

细胞免疫功能的抗感染作用

为什么？？？为什么？？？HIV感染：有些人很快进入艾滋病期，而少数

HIV感染者则长期处于稳定状态HIV感染者则长期处于稳定状态；乙肝病毒感染：有人为乙肝病毒携带者, 也有

人成为慢性乙肝病人人成为慢性乙肝病人。

HPV感染：多数人表现为无症状的HPV潜伏感染者 少数人表现为复发性HPV感染者，少数人表现为复发性HPV。

细胞免疫功能的抗感染作用—不重视机体免疫功能的后果

化疗药物的滥用

耐药菌的产生耐药菌的产生

二重感染的发生

进 步损害免疫功能进一步损害免疫功能

机体的免疫系统机体 免疫系

非特异免疫非特异免疫皮肤粘膜，吞噬细胞，正常菌群

特异性免疫细胞免疫 CD4+ T 细胞 CD8+ T 细胞细胞免疫：CD4+ T 细胞，CD8+ T 细胞体液免疫：B细胞

机体的免疫系统机体 免疫系

T4细胞

非特异性免疫 特异性免疫非特异性免疫 特异性免疫

NK细胞，吞噬细胞 B细胞 T8细胞

细胞免疫功能与感染性疾病—细胞免疫功能与感染性疾病免疫功能测定方法

体内：PPD试验？PPD试验？

体外：体液免疫 细胞数量 免疫球蛋白定量体液免疫：B细胞数量，免疫球蛋白定量细胞免疫：T细胞及其亚群的数量和功能（

流式细胞仪 ELISA ELISPOT）流式细胞仪，ELISA，ELISPOT）

细胞免疫功能测定方法—T细胞亚群的测定

辅助细 细 毒细T辅助细胞和T细胞毒细胞：CD4+，CD8+记忆T细胞和纯真T细胞：CD45RA+，CD45RO+辅刺激信号阳性T细胞：CD28+激活T细胞：CD38+，HLADr+激活 细胞凋亡T细胞：CD95+其它：CD25，CD57。其它：CD25，CD57。

Naive T4细胞和记忆T4细胞纯真T4 记忆T4

体外增殖反应体外增殖反应 特异性刺激 （—） （+ + +） 非特异性刺激 （+ + +） （+ + +）分泌细胞介素 IL2 （+ + +） （+ + ）

IL4 （ ） （+ + +） IL4 （—） （+ + +） IFN-r （—） （+ + +）细胞表型

（+ + +） （ ） CD45RA+ （+ + +） （—） CD45RO+ （—） （+ + +） CD62L+ （+ + +） （+/—） CD29+ （+ +） （+ + +）生命周期 3.5年 6个月体内免疫功能 新的病原 已感染或免疫过体内免疫功能 新的病原 已感染或免疫过

国人 HIV/AIDS 和正常人 T 细胞亚群测定 HIV/AIDS（N=59） 正常人(N=51) （平均值±标准差） （平均值±标准差）

百分比 绝对值

(细胞/mm3)

百分比 绝对值

(细胞/mm3)

淋巴细胞B 淋巴细胞

自然杀伤细胞

27.0±9.3

11.8±8.9

10.5±7.9

4±12 1

1345±536

162±137

107±86

1040±49

33.1±4.4

11.8±2.5

17.5±7.7

68 6± 8

2230±500

256±60

388±289

1 12±3 2T 淋巴细胞

CD3+CD4+

CD3+CD8+

/

75.4±12.1

10.7±8.6

59.8±12.7

68 5±18 3

1040±495

175±105

806±358

103±84

68.6±7.8

37.6±8.2

25.5±7.3

57 6±42 5

1512±372

775±297

570±177

485±222CD4+45RA-/CD4+

CD4+45RA+/CD4+

CD4+CD28+/CD4+

CD4+CD25+/CD4+

68.5±18.3

31.6±10.3

54.8±14.2

4 5±4 1

103±84

82±128

97±126

5±6

57.6±42.5

42.5±11.5

95±4.2

4 9±2 4

485±222

353±145

793±291

45±45CD4+CD25+/CD4+

CD4+DR+/CD4+

CD8+CD28+/CD8+

CD8+DR+/CD8+

4.5±4.1

35.2±11.7

24.2±18.4

34 1±10 8

5±6

36±30

205±158

284±192

4.9±2.4

11.1±5.4

43.1±9.2

16 3±9 5

45±45

83±44

550±45

106±101CD8+DR+/CD8+

CD8+CD38+/CD8

CD4+CD95+/CD4+

CD8+CD95+/CD8+

34.1±10.8

80.6±7.1

44.7±18.4

24 6±18 2

284±192

643±292

68±60

176±126

16.3±9.5

42.4±11.0

46.9±19.0

27 7±16 0

106±101

228±124

289±237

376±236CD8+CD95+/CD8+ 24.6±18.2 176±126 27.7±16.0 376±236

细胞免疫功能测定方法免疫 定—T细胞功能的测定

T细胞增殖功能同位素H3掺入试验BrdU

T细胞毒试验（CTL）细胞毒试验（ ）同位素Cr51四联体

细胞介素测定ELISAELISA流式细胞仪

ELISPOTELISPOT

细胞免疫功能与感染性疾病—细胞免疫功能测定的临床意义

HIV感染和艾滋病其它各种感染性疾病其它各种感染性疾病

--病毒感染：HBV，HCV，EBV，CMV结核病 真菌感染--结核病，真菌感染。

肿瘤和化疗病人的免疫功能监测

器官移植病人的免疫监测器官移植病人的免疫监测

自身免疫病和过敏性疾病

T细胞免疫功能低下与感染年龄 诊断 T4 T8 CD4+CD28+ CD8+CD28+ CD8+CD38+ CD8+DR+

cell/mm3 % cell/mm3 % % % % %

F28 隐脑 179 58 86 28 53 48 99 32F28 隐脑 179 58 86 28 53 48 99 32

M25 病毒脑炎 348 53 121 18 25 23 85 41

F55 FUO TB？ 270 10 610 22 54 5 95 27F55 FUO， TB？ 270 10 610 22 54 5 95 27

M63 MDS？TB？ 166 33 60 12 10 16

F38 肺霉菌球 810 45 342 19 97 61 40 19F38 肺霉菌球 810 45 342 19 97 61 40 19

F27 播散性霉菌病 1021 43 638 27 50 45 65 45

M64 FUO，恶组？ 348 33 484 46 95 17 94 50，恶组

F36 CMV感染（治疗前） 623 16 3061 77 11 3 96

M39 PBSCT后，CMV感染 295 13 1339 59 62 30 83 39M39 PBSCT后，CMV感染 295 13 1339 59 62 30 83 39

M28 PBSCT后，CMV感染 579 33 493 28 53 23 65 34

M42 PBSCT后 175 16 706 64 95 30 86 64后 175 16 706 64 95 30 86 64

M38 PBSCT后 585 24 672 27 94 45 88 68

HJX抗CMV治疗前后淋巴细胞亚群变化抗 治疗前后淋 细胞 群变化

8月3日 8月21日 9月26日8月3日 8月21日 9月26日

% (细胞 /mm3) % (细胞 /mm3) % (细胞 /mm3) % (细胞 /mm3)

血淋巴细胞 血淋巴细胞 66 3970 29 1901 37 2000 32±8 2043±364

B淋巴细胞 3 115 5 93 4 88 15±2 313±66

自然杀伤细胞 自然杀伤细胞 3 119 4 78 11 226 12±4 243±95

T淋巴细胞 94 3732 89 1699 82 1638 75±5 1539±300

辅助细胞 T辅助细胞 16 623 40 758 37 742 45±7 902±185

T抑制/细胞毒细胞 77 3061 47 892 42 830 31±6 649±202

CD4+CD28+/CD4+ 11 71 96 731 92 678 96±4 870±153

CD8+CD28+/CD8+ 3 101 46 410 58 498 55±9 390±62

CD8+CD38+/CD8 96 2929 82 686 72 594 41±18 264±121

HJX免疫改变结果分析

抗CMV治疗前T8淋巴细胞显著增加

抗CMV治疗后T8淋巴细胞稍增加T8淋巴细胞显著增加

异常的T细胞免疫激活T细胞附刺激信号表达

T8淋巴细胞稍增加异常的T细胞免疫激活较前显著好转细胞附刺激信号表

减少

细胞免疫功能低下；符合病毒感染后的免

T细胞附刺激信号表达恢复正常

低下的免疫功能明显符合病毒感染后的免疫改变。

低下的免疫功能明显好转；病毒感染后恢复期的免疫改变。复期的免疫改变。

((二二) ) FCMFCM在临床血液学中的应用在临床血液学中的应用

1.1.白血病的白血病的MICMIC分型分型

●● MorphologyMorphology●● MorphologyMorphology

●● ImmunologyImmunology

●● CytogeneticsCytogenetics●● CytogeneticsCytogenetics

白血病分型是选择化疗方案和判断预白血病分型是选择化疗方案和判断预

后的重要依据 白血病免疫分型是后的重要依据 白血病免疫分型是MICMIC分型分型后的重要依据。白血病免疫分型是后的重要依据。白血病免疫分型是MICMIC分型分型

的重要组成部分，也是对的重要组成部分，也是对FABFAB分型的补充，分型的补充，

对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断

及对白血病发病机制的研究都具有重要作用及对白血病发病机制的研究都具有重要作用及对白血病发病机制的研究都具有重要作用及对白血病发病机制的研究都具有重要作用

。。

白血病免疫分型诊断标准白血病免疫分型诊断标准白血病免疫分型诊断标准白血病免疫分型诊断标准((EGIL) EGIL) 标准标准

BB淋巴系白血病淋巴系白血病

ProPro--BB--ALL (BALL (BⅠⅠ型型))：：

CD19CD19++，，或或//和和CD22CD22++，，或或//和和CD79aCD79a++C 9C 9 ，，或或//和和CC ，，或或//和和C 79aC 79a

Common ALL (BCommon ALL (BⅡⅡ型型))：：

CD19CD19++，，或或//和和CD22CD22++，，或或//和和CD79aCD79a++，，CD10CD10++CD19CD19 ，，或或//和和CD22CD22 ，，或或//和和CD79aCD79a ，，CD10CD10

PrePre--BB--ALL (BALL (BⅢⅢ型型))：：

CD19CD19++，，或或//和和CD22CD22++，，或或//和和CD79aCD79a++，，Cy Ig MCy Ig M++CD19CD19 ，，或或//和和CD22CD22 ，，或或//和和CD79aCD79a ，，Cy Ig MCy Ig M

成熟成熟--BB--ALL (BALL (BⅣⅣ型型))：：

CD19CD19++ 或或//和和CD22CD22++ 或或//和和CD79aCD79a++ Kappa/LambdaKappa/Lambda++CD19CD19 ，，或或//和和CD22CD22 ，，或或//和和CD79aCD79a ，，Kappa/LambdaKappa/Lambda

急性髓性白血病急性髓性白血病((AML)AML)急性髓性白 病急性髓性白 病(( ))

亚型 常 表 达 抗 原亚型 常 表 达 抗 原

M0 CD11b CD13或CD33 MPO

M1 CD13 CD15 CD33 CD34 HLA-DR CD56 CD19

M2 CD11b CD13 CD15 CD33 CD34

M3 CD11b CD13 CD15 CD33 CD34M4 CD4 CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 CD34M4 CD4 CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 CD34M5 CD4 CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 CD34

M6 血型糖蛋白A CD13 CD33 CD34M7 CD41 CD61 CD13 CD33 CD34 因子Ⅷ相关抗原

AMLAML中，中，M0 M6 M7M0 M6 M7可以通过免疫分型确诊可以通过免疫分型确诊

AML与ALL免疫表型AML与ALL免疫表型

CD19 CD7 CD33 CD13 HLA-DR TdTCD19 CD7 CD33 CD13 HLA-DR TdT

B ALL + + +/B-ALL + - - - + +/-

T-ALL - + - - -/+ +

AML - -/+ + + +/- -

T-ALL表型特征

CD7 CD5 CD2 CD3 CD4 CD8 CD1a

I + 90% 75% - - - -

II + + + 25% 90% 90% +

III + + + + +/- +/- -

非T-ALL亚型

HLA-DR CD19 CD10 CD20 Cyu smIg Ig重排II + - - - - - -II + + - - - - +III + + + +III + + + - - - + IV + + + + - - +V + + + + + +V + + + + + - + VI + + - + - - +

AML免疫表型

M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7HLA-DR + + - + + +/- +/-CD34 + +/- - +/- +/- - +/-CD33 + + + + + +/- +/-CD13 +/- + + + + + +/-CD11b / /CD11b - + +/- + + - / CD15 - + +/- + + +/- / CD14 +/ + +CD14 - +/- - + + - -GPA - - - - - + -GP +GP - - - - - - +

免疫分型的价值免疫分型的价值

●● 能正确区别能正确区别AMLAML和和ALLALL，，并能进一步区别并能进一步区别能 确区别能 确区别 和和 并能进 步区别并能进 步区别

ALLALL中的中的TT系和系和BB系及亚型。系及亚型。

●● 能正确鉴别能正确鉴别AMLAML中的中的M0M0、、M6M6、、M7M7

●● 诊断双系或双表型白血病诊断双系或双表型白血病●● 诊断双系或双表型白血病诊断双系或双表型白血病

●● 发现仅表达个别次要非本系列相关抗原发现仅表达个别次要非本系列相关抗原

的白血病的白血病

●● 诊断少见疑难白血病诊断少见疑难白血病((如毛细胞性白血病如毛细胞性白血病))●● 诊断少见疑难白血病诊断少见疑难白血病((如毛细胞性白血病如毛细胞性白血病))

2.2.白血病的耐药基因白血病的耐药基因((MDR)MDR)检测检测白 病的耐药基因白 病的耐药基因(( ))检测检测

●● MDRMDR表达产物表达产物——PP糖蛋白糖蛋白((PP--gp)gp)

●● PP--gpgp的作用机理的作用机理

●● PP--gpgp在白血病检测中的临床意义在白血病检测中的临床意义

成人急性白血病P-gp表达的临床意义

P PP-gp+ P-gp-

缓解率（CR） 20.5% 78.5%

AML 6个月复发率 66.7 % 8.7%151

平均无病生存期 5M 13M

缓解率（CR） 66.7% 80.0%

ALL 6个月复发率 50 0 % 9 5%ALL 6个月复发率 50.0 % 9.5%

47 平均无病生存期 4M 13M

李建勇 Clin J Oncol 1998,4:302

成人ALL多药耐药P-gp与形成学分型的关系

分型 例数 P-gp+ P-gp- P-pg阳性率

L1 25 3 22 12%

L2 40 10 30 25%L3 3 1 2 33.3%

P>0.05 华东：中华血液学杂志，1998，19：371P>0.05 华东：中华血液学杂志，1998，19：371

P-gp表达与ALL免疫分型的关系P gp表达与ALL免疫分型的关系

免疫分型 例数 P 阳性例数 阳性率(%)免疫分型 例数 P-gp阳性例数 阳性率(%)

B 38 8 21.1

T 10 1 10.0

T/B 4 2 50.0

难分类 4 2 50.0

My- 40 4 10.0

My+ 16 9 56.3

My+ALL 的P-gp阳性率明显增高

AML中免疫表型与P- gp表达的关系中免疫表 与 gp表达的关系

成人：

P 的表达与CD7 CD14 CD42b CD61 CD34 等高P-gp的表达与CD7、CD14、CD42b、CD61、 CD34 等高度相关。

老年人 P 的表达与CD14 CD42b CD61有相关性老年人： P-gp的表达与CD14、CD42b、CD61有相关性

P-gp的表达与CD34高度相关。

3.3.白血病的其它检查白血病的其它检查

(1)(1) 细胞凋亡的检查细胞凋亡的检查(1) (1) 细胞凋亡的检查细胞凋亡的检查

●● FasFas及及FasLFasL

●● Apo 2Apo 2··77●● bclbcl--22

●● P53P53

●● Annexin ⅤAnnexin Ⅴ●● Annexin ⅤAnnexin Ⅴ

●● Caspase(Caspase(半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶))

( )( ) 细胞细胞 分析分析(2) (2) 细胞细胞DNADNA分析分析

(3) (3) 白血病残留病灶检查白血病残留病灶检查((MRD)MRD)

4 血液病的其他应用4.血液病的其他应用

AA，PNH鉴别诊断自身抗体检测

PAIgG, PAIgM, PAIgARBC抗体粒细胞抗体

PNH红细胞表面CD59表达

((三三) ) FCMFCM在临床肿瘤学中的应用在临床肿瘤学中的应用

●● 肿瘤患者的免疫功能检查肿瘤患者的免疫功能检查●● 肿瘤患者的免疫功能检查肿瘤患者的免疫功能检查

●● 肿瘤早期诊断肿瘤早期诊断//鉴别诊断鉴别诊断

●● 肿瘤的复发转移，预后评估肿瘤的复发转移，预后评估

●● 肿瘤患者的治疗监测肿瘤患者的治疗监测●● 肿瘤患者的治疗监测肿瘤患者的治疗监测

血液标本的检查血液标本的检查血液标本的检查血液标本的检查

●● 肿瘤患者的免疫功能检查肿瘤患者的免疫功能检查

●● 肿瘤患者的粘附分子检查肿瘤患者的粘附分子检查

ICAMICAM 1 CD541 CD54ICAMICAM--1 CD541 CD54

ICAMICAM--2 CD1022 CD102

ICAMICAM--3 CD1063 CD106

CD62CD62 CD63CD63 CD42a/bCD42a/b CD41/61CD41/61CD62CD62、、CD63CD63、、CD42a/bCD42a/b、、CD41/61CD41/61、、

TSPTSP

肿瘤实体瘤标本的肿瘤实体瘤标本的FCMFCM检查检查肿瘤实体瘤标本的肿瘤实体瘤标本的FCMFCM检查检查

耐药基因检查耐药基因检查耐药基因检查耐药基因检查

癌基因与抗癌基因在肿瘤细胞中的表达及与预后的关系粘附分子检查粘附分子检查细胞凋亡检查细胞凋亡检查细胞凋亡检查细胞凋亡检查

细胞细胞DNADNA及细胞周期分析及细胞周期分析(癌前病变,恶性肿瘤预后评价)

细胞增殖能力研究

肿瘤细胞耐药性筛选肿瘤细胞耐药性筛选

肿瘤相关抗原，特异标志物肿瘤相关抗原，特异标志物

激素受体激素受体激素受体激素受体

与癌细胞生物行为有关的因子，如与癌细胞生物行为有关的因子，如CD44CD44

细胞细胞DNADNA分析原理分析原理

利用特殊的利用特殊的荧荧光染料光染料((PIPI、、EBEB、、AOAO等等) ) 与细胞内与细胞内DNADNA碱基结合，被碱基结合，被荧荧光光等等)) 与细胞内与细胞内 碱基结合 被碱基结合 被荧荧光光染料染色的细胞在激光照射下发射染料染色的细胞在激光照射下发射出出荧荧光，荧光强度与光，荧光强度与DNADNA含量成正比。含量成正比。荧荧光 荧光 度与光 荧光 度与 含 成含 成流式细胞仪通过测定细胞的荧光强流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的度推算出细胞的DNADNA含量含量

细胞周期与细胞周期与DNADNA的倍体关系的倍体关系细胞 期与细胞 期与 的倍体关系的倍体关系

细胞周期： DNA 倍体 G0 期 DNA 合成静止期 2NG0 期：DNA 合成静止期 2NG1 期：DNA 合成前期 2N S 期： DNA 合成期 2N-4N G2 期：DNA 合成后期 4N M 期： 细胞分裂期 4N

Normal Cell Cycle

GG22MM GG00

DNA A l iDNA A l iGG22GG11 GG00GG11

DNA AnalysisDNA Analysis

ssGG00GG11

Coount

ss GG22MMt

0 200 400 600 800 1000

DNA content22NN 44NN

DNADNA倍体性倍体性PloidyPloidy 细胞内染色体细胞内染色体DNADNA含量含量DNADNA倍体性倍体性PloidyPloidy：：细胞内染色体细胞内染色体DNADNA含量含量二倍体二倍体DiploidDiploid：：正常体细胞内染色体正常体细胞内染色体DNADNA含量含量

指数指数 测定标本的测定标本的 期细胞期细胞DNADNA指数（指数（DIDI）：）：测定标本的测定标本的G0/G1G0/G1期细胞期细胞DNADNA含量与同种系正常细胞的含量与同种系正常细胞的G0/G1G0/G1期细胞期细胞DNADNA含量的含量的比值 表示细胞倍体性比值 表示细胞倍体性比值，表示细胞倍体性比值，表示细胞倍体性

SS期含量期含量SPFSPF：：SS期细胞占总周期细胞的比例期细胞占总周期细胞的比例增殖指数增殖指数PIPI：：增殖细胞占总周期细胞的比例增殖细胞占总周期细胞的比例G0/G1G0/G1期细胞期细胞DNADNA含量变异系数含量变异系数CVCV

DNA Analysis

300

DNA Analysis

225

unts

150

Co

75

0

0 200 400 600 800 1000

PI Fluorescence22NN 44NN

PI Fluorescence

DNA Analysis

300

y

DNA i d 1 21DNA i d 1 21 2

25

A l id kA l id k

DNA index 1.21DNA index 1.21

unts

150

Aneuploid peakAneuploid peak

Co

75

0

0 200 400 600 800 1000

PI Fluorescence

DNADNA诊断肿瘤病标准诊断肿瘤病标准(( ))((Klein et al)Klein et al)

1.1.出现非整倍体细胞峰，出现非整倍体细胞峰， DI>1.1DI>1.1或或DI15%

33 无明显的异倍体 但无明显的异倍体 但G0/1G0/1的的CV>10%CV>10%3.3.无明显的异倍体，但无明显的异倍体，但G0/1G0/1的的CV>10%CV>10%，，

SS期在期在10% 10% --15%15%

4.4.S+G2/GS+G2/G1/0 1/0 >20%>20%

DNADNA的倍体和的倍体和DNADNA指数的关系指数的关系

DNA倍体 DNA指数(DI) 意义(染色体数)正二倍体 (2 Di l id) 1 00 46条染色体正二倍体 (2n, Diploid) 1.00 46条染色体亚二倍体 (Haploid) 0.50 23条染色体四倍体 (Teraploid) 2 00 92条染色体四倍体 (Teraploid) 2.00 92条染色体低倍体 (Hypoploid) 46条染色体高倍体 ( ype p o d) 1.0 6条染色体

DIDI样品样品GG0/10/1细胞峰均道值细胞峰均道值

DIDI==正常二倍体标准细胞正常二倍体标准细胞GG0/10/1期细胞均道值期细胞均道值

DNADNA分析的临床意义分析的临床意义

DNADNA倍体分析：倍体分析：辅助诊断辅助诊断//早期诊断肿瘤早期诊断肿瘤//

结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高些肿瘤的治愈率和生存率 尤其对 些细胞抽吸些肿瘤的治愈率和生存率 尤其对 些细胞抽吸一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸

物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。要。要。要。

监测疗效监测疗效

判断预后判断预后判断预后判断预后

细胞DNA分析的临床意义胞 分析的临床意义

DNA非整倍体的出现是癌前病变发生癌变的一个重要指标。癌前病变是指有癌变潜能的病变。指标。癌前病变是指有癌变潜能的病变。

临床上所谓的癌前病变所包括的实际上是一大组生物学行为迥异的病变, 其中的一小部分有潜在的癌变可能,而大部分完全是良性病变.依靠病理形态分析,可根据分级将其区分,但易受病理医师的经验限制,会可根据分级将其区分,但易受病理医师的经验限制,会得出截然不同的结论。用FCM分析细胞DNA含量,可提供较确切,可靠的信息。DNA的非整倍体出现与癌变率供较确切,可靠的信息。DNA的非整倍体出现与癌变率和癌前病变增生程度有关, 是癌前病变发生癌变的一个重要指标个重要指标

DNA 非整倍体出现是监别良性与恶性肿瘤的特异性指标:特异性指标:

良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非整倍体细胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞,实体瘤以超二倍体或多倍居多。实体恶胞,实体瘤以超二倍体或多倍居多。实体恶性肿瘤的非整倍体出现率>70%, 淋巴瘤和白血病以亚二倍体居多,出现率达50%。交界性血病以亚二倍体居多,出现率达50%。交界性肿瘤形态学介于良恶性之间,难于监别。如果交界性肿瘤出现异倍体即已具有恶性特果交界性肿瘤出现异倍体即已具有恶性特征, 尽管病理形态学尚不能证实,也应视为恶性。

观察病情演变

探讨化疗药物的作用机制和疗效分析。

判断预后判断预后

非整倍体的肿瘤 恶性程度高，复发率高，

转移率预后差。 近二倍体和二倍体肿瘤 : 预后好。 但少数肿瘤的DNA分析对预后无判断价值。S期细胞比例评估肿瘤恶性程度和预后有意义,S期细胞比例评估肿瘤恶性程度和预后有意义,高S期肿瘤一般比低S 期对化疗敏感。

异倍体癌前病例病变结果

组织类别 异倍体(例数) 癌变例数 组织学分级

1 2 3

鼻咽 13 7 0 1 6

口腔 7 4 0 0 4口腔 7 4 0 0 4

胃 10 3 0 0 3

宫内膜 9 6 0 1 5

宫颈 6 2 0 0 2

总计 45 22 2 20

各类癌前病变组织学分级与DNA倍体关系(1)

组织类别 不典型增 例数 DNA倍体(例数)

生分级 二倍体 异倍体生分级 二倍体 异倍体

鼻咽粘膜 1 11 11 0

2 28 23 5

3 13 5 83 13 5 8

口腔粘膜 1 10 10 0

2 6 6 0

3 19 12 7

各类癌前病变组织学分级与DNA倍体关系(2)

组织类别 不典型增 例数 DNA倍体(例数)

生分级 二倍体 异倍体

胃粘膜 1 18 18 0胃粘膜 1 18 18 0

2 14 13 1

3 14 6 8

宫内膜 1 10 10 0

2 14 13 1

3 16 8 83 16 8 8

宫颈粘膜 1 9 9 0

2 16 12 4

3 5 3 2

淋巴瘤组织学分级与DNA倍体及

S期细胞关系

Histology DNA Analysis S 期比值(%)Low -grade Diploid 1~5Intermediate-grade Frequently Aneuploid 5 ~15High-grade Frequently Diploid >15

脱落细胞的脱落细胞的DNADNA分析分析

尿液尿液

脱落细胞的脱落细胞的DNADNA分析分析

●● 尿液尿液

●● 宫颈分泌物宫颈分泌物

●● 胸腹水胸腹水

肺泡灌洗液肺泡灌洗液●● 肺泡灌洗液肺泡灌洗液

●● 各种刺激液各种刺激液●● 各种刺激液各种刺激液

外周血小板粘附分子与肿瘤转移外周血小板粘附分子与肿瘤转移

近十年来研究证实，肿瘤的转移复发与癌栓存在与否具有很密切的关系。转移往往包含有肿瘤—血小板—白细胞组成的癌栓形包含有肿瘤 血小板 白细胞组成的癌栓形成和它们与远处器官内皮细胞的相互作用。在肿瘤转移和癌栓形成过程中，癌细胞需经在肿瘤转移和癌栓形成过程中，癌细胞需经过脱落、粘附、运输和种植等重要步骤，细胞粘附为关键步骤之一，涉及选择素胞粘附为关键步骤之一，涉及选择素(Selectin)、整合蛋白、钙粘素(Cadherin)等多种粘附分子。等多种粘附分子。

血小板介导的肿瘤细胞捕获可能涉及两个不同的机制：

①肿瘤细胞或肿瘤细胞释放的因子诱导血小板的活化和聚集，

在血小板聚集过程中导致肿瘤细胞的被动捕获；

②通过血小板和肿瘤细胞之间的特异性粘附反应。

其共同作用使肿瘤细胞间接完成血小板特异的成功粘附。其共同作用使肿瘤细胞间接完成血小板特异的成功粘附。国内外研究表明，肿瘤患者尤其是中晚期肿瘤患者血小板粘附分子的表达和释放增加，处于激活状态；血管内皮损伤、血小板与肿瘤细胞相互作用及作用时释放的生物活性物质是血小板与肿瘤细胞相互作用及作用时释放的生物活性物质是血小板激活和释放的主要原因；血小板可增强肿瘤细胞与内皮细胞、内皮下细胞外基质的粘附，对肿瘤细胞血行转移的皮细胞、内皮下细胞外基质的粘附，对肿瘤细胞血行转移的所有中间步骤都有促进作用，并直接参与肿瘤细胞的转移过程。

FCM检测外周循环血液中的肿瘤细胞检测外周循环 液中的肿瘤细胞

近年来大量研究指出，实体肿瘤患者的外周血中存在癌细胞。这些循环的癌油细胞可能是导致肿瘤广泛在癌细胞。这些循环的癌油细胞可能是导致肿瘤广泛播散的重要原因，随访观察揭示，血循环中癌细胞阳性患者的生存期较短、预后显著较癌细胞阴性患者差。性患者的生存期较短、预后显著较癌细胞阴性患者差。因此，检测血循环中的癌细胞不仅有助于正确的临床分期和疗效判断，而且对及时的抗转移治疗和改善患分期和疗效判断，而且对及时的抗转移治疗和改善患者预后也具有重要的应用价值。血循环中癌细胞的含量甚微，因而要求检测方法的敏感性高(通常要从105量甚微，因而要求检测方法的敏感性高(通常要从10白细胞中检测到一个癌细胞)和特异性好。此外，最好能为临床提供定量的分析报告，如每升血中癌细跑的数量。迄今为止，能同时满足上述要求的检测方法尚不多见

应用流式细胞仪分析技术，以白细胞共同抗原CD45、上皮细胞标志细胞角蛋白同抗原CD45、上皮细胞标志细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)和肿瘤特异性单抗进行多色标记，是一种检测外周血肿癌细胞的定多色标记，是一种检测外周血肿癌细胞的定量分析的方法。

肿瘤基因表达产物的检测肿瘤基因表达产物的检测肿瘤基因表达产物的检测肿瘤基因表达产物的检测

恶性肿瘤是一种多基因异常疾病。由于恶性肿瘤是一种多基因异常疾病。由于恶性肿瘤是 种多基因异常疾病。由于恶性肿瘤是 种多基因异常疾病。由于原癌基因的激活或抑癌基因的突变、失活原癌基因的激活或抑癌基因的突变、失活或缺失 导致某些细胞分化不良和增殖失或缺失 导致某些细胞分化不良和增殖失或缺失，导致某些细胞分化不良和增殖失或缺失，导致某些细胞分化不良和增殖失控而形成肿瘤。控而形成肿瘤。

FCMFCM利用抗癌基因表达产物的单克窿抗利用抗癌基因表达产物的单克窿抗FCMFCM利用抗癌基因表达产物的单克窿抗利用抗癌基因表达产物的单克窿抗体对癌基因的表达蛋白进行检测，从分子体对癌基因的表达蛋白进行检测，从分子水平推动了恶性肿瘤的发生机制的研究进水平推动了恶性肿瘤的发生机制的研究进水平推动了恶性肿瘤的发生机制的研究进水平推动了恶性肿瘤的发生机制的研究进程程

肿瘤基因表达产物的检测肿瘤基因表达产物的检测肿瘤基因表达产物的检测肿瘤基因表达产物的检测

癌基 与抑癌基癌基 与抑癌基癌基因与抑癌基因：癌基因与抑癌基因：

mycmyc基因族（基因族（CC--myc, Nmyc, N--myc, Lmyc, L--mycmyc）：）：癌基因，高表癌基因，高表达促使转化细胞恶性繁殖进入肿瘤临床期达促使转化细胞恶性繁殖进入肿瘤临床期达促使转化细胞恶性繁殖进入肿瘤临床期达促使转化细胞恶性繁殖进入肿瘤临床期

rasras基因族（基因族（NN--ras, Kras, K--ras, Hras, H--rasras）：）：癌基因，编码蛋白癌基因，编码蛋白为为 P21P21，，在乳腺癌、胃癌中表现为在乳腺癌、胃癌中表现为P21P21蛋白过度表达蛋白过度表达为为 P21P21，，在乳腺癌、胃癌中表现为在乳腺癌、胃癌中表现为P21P21蛋白过度表达蛋白过度表达

P53P53：：抑癌基因，可抑制抑癌基因，可抑制rasras基因和基因和mycmyc基因协同作用引基因协同作用引起的细胞转化，许多恶性肿瘤都有起的细胞转化，许多恶性肿瘤都有P53P53基因的缺失或点突变基因的缺失或点突变

cc--erbB2erbB2基因：基因：又称又称neuneu基因，在癌细胞表面常有表达，基因，在癌细胞表面常有表达，表达产物为表达产物为HERHER--2/neu2/neu，，其过量表达与肿瘤的发生、复发转移其过量表达与肿瘤的发生、复发转移及预后不良有关及预后不良有关及预后不良有关及预后不良有关

HERHER--2/neu2/neu

cc--erbB2erbB2基因产物，高表达与肿瘤发生发展、基因产物，高表达与肿瘤发生发展、cc erbB2erbB2基因产物，高表达与肿瘤发生发展、基因产物，高表达与肿瘤发生发展、预后、治疗疗效高度相关预后、治疗疗效高度相关

HERHER--2/neu2/neu的过量表达常见于：卵巢癌、乳的过量表达常见于：卵巢癌、乳HERHER 2/neu2/neu的过量表达常见于：卵巢癌、乳的过量表达常见于：卵巢癌、乳腺癌、唾液腺腺癌、非小细胞肺癌、胃及肾腺癌、唾液腺腺癌、非小细胞肺癌、胃及肾脏腺癌、结肠癌脏腺癌、结肠癌

有有HERHER--2/neu2/neu表达常提示需要高剂量治疗，表达常提示需要高剂量治疗，可作为乳腺癌治疗监测指标可作为乳腺癌治疗监测指标

细胞荧光分子定量：定量评估癌细胞细胞荧光分子定量：定量评估癌细胞HERHER--2/neu2/neu的过量表达的过量表达// 的 量表的 量表

肿瘤治疗肿瘤治疗

多药耐药性多药耐药性MDRMDR 肿瘤细胞通过各种肿瘤细胞通过各种多药耐药性多药耐药性MDRMDR：：肿瘤细胞通过各种肿瘤细胞通过各种机制排除或抵御化疗药物的侵袭机制排除或抵御化疗药物的侵袭

肿瘤细胞表面肿瘤细胞表面PP--gpgp的表达：多药耐药性的表达：多药耐药性肿瘤细胞表面肿瘤细胞表面PP--gpgp的表达：多药耐药性的表达：多药耐药性是化疗失败的常见原因之一，是化疗失败的常见原因之一，PP--gpgp过量表过量表达的检测可以提供关于癌细胞化疗反应的达的检测可以提供关于癌细胞化疗反应的信息信息

化疗药物在细胞内的聚集和重新分配化疗药物在细胞内的聚集和重新分配

结合细胞结合细胞 分析分析 分析等多种分析等多种结合细胞结合细胞DNADNA分析、分析、MDRMDR分析等多种分析等多种方法，进行化疗与放疗的疗效观察方法，进行化疗与放疗的疗效观察

利用流式细胞术进行化疗机制的研究利用流式细胞术进行化疗机制的研究

细胞凋亡及凋亡调控基因

的流式细胞术检测

胞细胞凋亡的检测方法

形态学检测：

光镜或电镜下作Wright-Giemsa 、PAS可HE染色可观察到细胞凋亡的共同形态学可HE染色可观察到细胞凋亡的共同形态学特征，细胞体积缩小，染色质致密成斑块状，沿核膜收缩成新月体状，核体积减小，状，沿核膜收缩成新月体状，核体积减小，可裂解成一个或数个致密体，整个细胞可裂解成大小不一的凋亡小体。形态学观察裂解成大小不一的凋亡小体。形态学观察简便、直观、但难于定量。

DNA电泳

细胞凋亡更具有特征的是DNA变化，这种变化是细胞凋亡时细胞继续合成的核酸内切酶激活造成的，细胞凋亡时细胞继续合成的核酸内切酶激活造成的，正常人类DNA缠绕在一个个由组蛋白八聚体组成的核小体上，成串珠状相互连接。两个核小体之间的DNA小体上，成串珠状相互连接。两个核小体之间的DNA碱基对约185bP。核酸内切酶可在两核小体间切断DNA，形成185bp左右以及成倍数的几个核小体之间长短的 DNA片段。由于片段长短成倍数关系，在凝胶上电泳时形成了特征性的“阶梯(1ad—der)”，提示发生了细胞凋亡示发生了细胞凋亡

细胞凋亡的FCM检测细胞凋亡的FCM检测ApoApo 22··77TUNELTUNELTUNELTUNEL

bclbcl--22

PP5353

FasFas及及FasLFasL

AnnexinAnnexin ⅤⅤ

Caspase(Caspase(半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶))

细胞核内DNA断裂标记分析（ TUNEL 法，ISNT法）

细胞凋亡过程中细胞核内的DNA出现断裂，断裂点暴露出 DNA

分子的残端，用末端转移酶(TdT)或者缺口连接酶都可以标记上可以识别的化学物质。标记DAN断裂的3’ 羧基末端，常采用可以识别的化学物质。标记DAN断裂的3’—羧基末端，常采用由 DNA 聚 合 酶 I 催 化 的 原 位 缺 口 转 移 ( in situ nicktranslation， ISN)或用TdT介导的dUTP原位缺口末端标记translation， ISN)或用TdT介导的dUTP原位缺口末端标记( terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTPnick end labeling, TUNEL)技术。1SNT和 TUNEI法均可进行间接或直接标记，间接或直接标记，

直接法：标记物通常是生物素化脱氧三磷酸尿苷(biotin—直接法：标记物通常是生物素化脱氧三磷酸尿苷(biotindUTP)或地高辛Dig—dUTP等；

间接法：标记物常为异硫氰酸荧光素FITC dUTP。间接标记间接法：标记物常为异硫氰酸荧光素FITC—dUTP。间接标记还需链霉亲合素FITC或抗Dig—FITC，使标记反应倍增，其灵敏度较高，但比直接标记复杂。度较高，但比直接标记复杂。

Annexin Ⅴ 磷脂结合蛋白作为探针识别细胞膜表面磷脂酰丝氨酸

细胞凋亡早期，细胞表面发生化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸（PS）可以迁移到细胞外层表面。巨噬磷脂酰丝氨酸（PS）可以迁移到细胞外层表面。巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症反应。Annexin Ⅴ是一种Ca离子依赖的，对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜是否有PS，识别凋亡细胞，由于坏死细胞也可能在膜表面出现PS，故需要同时进行染料（PI）排斥实验，凋亡细胞膜完整，不能染色。实验，凋亡细胞膜完整，不能染色。

ß-TG不同时间（0、6、12、18、24h)诱导HL-60细胞凋亡（Annexin v)60细胞凋亡（Annexin v)

DNA 含量分析DNA 含量分析

凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强，使DNA分裂成一些小片段 这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外小片段，这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡细胞的 DNA含量相对减少，因此在DNA的直方图上出现一个位于 G1峰左侧的小峰（亚G1峰），称为AP峰。坏死及其它原因引起的细胞碎片则形成不规则的峰形，紧靠于Y轴右侧。FCM的DNA分析检测细胞凋亡存在一定的局限性。比如 机械处理的肿瘤标本常有许多碎片 在 DNA直方图上出如，机械处理的肿瘤标本常有许多碎片，在 DNA直方图上出现较宽的杂信号峰，使凋亡细胞被“淹没”其中，不少文献将G1峰前的所有信号均算为凋亡细胞，可能会过高计算凋亡细胞的数量；另外，多倍体肿瘤中的低倍体细胞和凋亡的细胞也无法鉴别，这样使所得结果的准确性受到很大的影响。由于亚G1峰是DNA断裂后胞浆内含量减少的结果，因此在评由于亚G1峰是DNA断裂后胞浆内含量减少的结果，因此在评价细胞早期凋亡时，该指标不够灵敏。

APO2.7

是一种分子量为38Kda的线粒体膜蛋白，仅表达在凋亡细胞的线粒体膜表面，仅表达在凋亡细胞的线粒体膜表面，2.7A6A3单抗能与之识别，是细胞凋亡的早期信号。用经Digitonin 透膜的细的早期信号。用经Digitonin 透膜的细胞与APO2.7的单抗反应后FCM检测，就可反应细胞凋亡的状态。可反应细胞凋亡的状态。

细胞凋亡调控基因表达产物的FCM检测细胞凋亡调控基因表达产物的FCM检测

细胞凋亡与细胞增殖、分化一样，也受着基因的调控。大量的实验研究证明，凋亡与细胞内多种信使调控。大量的实验研究证明，凋亡与细胞内多种信使及多种癌基因蛋白有关，凋亡的信息是通过一系列信息传导通路到细胞而启动细胞凋亡的，已知凋亡调控息传导通路到细胞而启动细胞凋亡的，已知凋亡调控基因可分为两大类：

1)诱导基因：如 C MYC、野生型 P53因、AP0 1或1)诱导基因：如 C—MYC、野生型 P53因、AP0—1或Fas基因等。

2)抑制基因：如bcl 2、bcl x、Cab l、突变的2)抑制基因：如bcl—2、bcl—x、Cab—l、突变的P53基因、ras基因等。

p53基因p53基因

是一个抑癌基因。分为是一个抑癌基因。分为

野生型(Wild—type)野生型(Wild type)

突变型(Mutatin type)，突变型(Mutatin type)，

野生型P53野生型P53

是一种诱导细胞凋亡的基因，可使细胞停止增殖，使 DNA受损细胞停止倍增，得以修复，如若修复失败，以凋亡方式使

损伤细胞死亡，故野生型 P53是细胞内的“分子警察”。当细胞受到某种药物或放疗作用后，造成细胞 DNA的损伤，受损细胞启动共济失调毛细血管扩张突变基因 (gene mutated损细胞启动共济失调毛细血管扩张突变基因 (gene mutatedin ataxia-telangiectasia， ATM)使 P53表达增加，引起细胞 Gl期阻滞以完成修复或进入凋亡以清除肿瘤细胞，野生型胞 Gl期阻滞以完成修复或进入凋亡以清除肿瘤细胞，野生型P53还可逆转变异细胞为正常细胞。因此是一个研究最深入的一个抗癌基因。已有学者提出并进行了基因治疗肿瘤，诱导细胞凋亡，对这方面的研究已进行了有意义的探索。在许多恶性胞凋亡，对这方面的研究已进行了有意义的探索。在许多恶性肿瘤中发现p53基因缺失和突变，并有突变P53蛋白表达增高。

突变型P53

不但抑制野生型P53诱导细胞凋亡的作用，还可以拮抗C—MYC基凋亡的作用，还可以拮抗C MYC基因引起凋亡。增强细胞的增殖活性，促发细胞癌变。促发细胞癌变。

bcl-2基因基因

bcl—2基因被发现是在淋巴瘤细胞第18号染色体断裂点t(14，18)附近，bcl-2基因蛋白染色体断裂点t(14，18)附近，bcl-2基因蛋白定位表达于线拉体膜上。研究证明，bcl—2基因蛋白表达，可以抑制细胞凋亡，故称其为“抗凋亡基因”。它的抗凋亡机制是因为“抗凋亡基因”。它的抗凋亡机制是因为bcl—2基因蛋白能够增强线粒体膜电位，抑制线粒体钙离于的释放，使核酸内切酶无法活化，线粒体钙离于的释放，使核酸内切酶无法活化，而具有抗凋亡作用。

有作者用FCM研究发现，bcl—2基因的表达，可以阻止各种化疗药物引发的白血病细胞的凋亡，可以阻止各种化疗药物引发的白血病细胞的凋亡，bcl—2蛋白表达的程度与白血病细胞的多抗药性有关，bcl 2基因拮抗化疗药物引起的凋亡和耐有关，bcl—2基因拮抗化疗药物引起的凋亡和耐药，主要是干扰了氧化自由基的产生。Bcl-2是bcl-2家属中的其中一员，此外还有bcl-xl 、bcl-2家属中的其中一员，此外还有bcl-xl 、bcl-xs 、bax、 bad、bag-1、 bak等，其中bax、bak、bad、bcl-xs是促凋亡基因，bcl-xl、bag-1bak、bad、bcl-xs是促凋亡基因，bcl-xl、bag-1是抑凋亡基因。

Fas/FasL

Fas 又 称 Apol 或 CD95，FasL(FasLigand，Fas配体)又称cD95L。目前的Ligand，Fas配体)又称cD95L。目前的研究认为， FasL是死亡因子， Fas则是它的受体，当一个细胞的FasL与另一细胞的Fas结合时，可以导致表达Fas的细胞的Fas结合时，可以导致表达Fas的细胞凋亡。

ras基因：ras基因：

是细胞凋亡的一个抑制基因，有研究认是细胞凋亡的一个抑制基因，有研究认为，它抑制细胞凋亡是通过ras蛋白产物的高表达来抑制细胞凋亡过程中的核酸内切酶的表达来抑制细胞凋亡过程中的核酸内切酶的活性。研究发现，ras蛋白的表达多在肿瘤发生的早期增高，认为ras癌基因在肿瘤的发生生的早期增高，认为ras癌基因在肿瘤的发生过程中最早被激活。还发现越恶性度高，生长快的肿瘤，ras基因蛋白表达增高。这也说长快的肿瘤，ras基因蛋白表达增高。这也说明ras基因具有抑制细胞凋亡，促进肿瘤生长之作用。之作用。

C-MYC基因：基因：

C—MYC基因是调控细胞增殖的主要基因，C—MYC本身是个转录因子，它与DNA结合，故此与细胞增殖本身是个转录因子，它与DNA结合，故此与细胞增殖分化及细胞癌变具有密切关系。 C—MYC基因是细胞癌变过程中早期表达的基因。但C—MYC高表达的同时癌变过程中早期表达的基因。但C—MYC高表达的同时又可诱导细胞凋亡的过程发生，故此有人将C—MYC基因列入细胞凋亡的诱导基因范畴。 C—MYC诱导凋亡因列入细胞凋亡的诱导基因范畴。 C MYC诱导凋亡的特点之一是需要生长因子的缺乏。已有作者研究证实，激发细胞增殖和诱导细胞凋亡的MYC基因具有相实，激发细胞增殖和诱导细胞凋亡的MYC基因具有相同的结构或功能域的重叠，因此，C—MYC基因对细胞凋亡常有双重作用。

((四四) ) FCMFCM在血栓与止血中的应用在血栓与止血中的应用

11..血小板糖蛋白血小板糖蛋白血小板质膜糖蛋白血小板质膜糖蛋白●● 血小板质膜糖蛋白血小板质膜糖蛋白GPGPⅠⅠaa ：：CDwCDw4949bb GPGPⅢⅢaa：： CDCD6161GPGPⅠⅠbb ：：CD42b GPCD42b GPⅣⅣ：： CD36CD36GPGPⅠⅠb b ：：CD42b GPCD42b GPⅣⅣ：： CD36CD36GPGPⅠⅠc c ：：CDw49f GPCDw49f GPⅨⅨ：： CD42aCD42aGPGPⅡⅡa a ：：CD29 GPCD29 GPⅡⅡbb：： CD41CD41GPGPⅡⅡa'a'：：CD31CD31

●● 血小板颗粒膜糖蛋白血小板颗粒膜糖蛋白颗粒颗粒 CDCD6262PP (GMP(GMP140140 PADGEM)PADGEM)αα颗粒：颗粒：CDCD6262PP (GMP(GMP140140、、PADGEM)PADGEM)

GMPGMP--3333TSPTSPTSPTSP

λλ颗粒：溶酶体完整膜糖蛋白颗粒：溶酶体完整膜糖蛋白 CDCD6363溶酶体相关膜糖蛋白溶酶体相关膜糖蛋白--11 LAMPLAMP--11溶酶体相关膜糖蛋白溶酶体相关膜糖蛋白--22 LAMPLAMP--22

血小板切面模式图血小板切面模式图

垂直切面垂直切面 赤道切面赤道切面

22..活化血小板检测活化血小板检测

CDCD6262PP CDCD6363●● CDCD6262PP，， CDCD6363

●● GPGPⅡⅡb/b/ⅢⅢa(CDa(CD4141//6161))(( ))

●● GPGPⅣⅣ(CD(CD3636))

●● GPGPⅨⅨ--IbIb (CD(CD4242aa//CDCD4242b)b)

●● ThrombospondinThrombospondin●● ThrombospondinThrombospondin

●● 血小板内钙离子血小板内钙离子

33..遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断33..遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断

●● 巨血小板综合症巨血小板综合症((BSS)BSS)

GPGP IbIb--ⅨⅨ(CD(CD4242aa//CDCD4242b)b)缺陷或缺乏缺陷或缺乏

血小板无力症血小板无力症((CT)CT)●● 血小板无力症血小板无力症((CT)CT)

GPGP ⅡⅡb/b/ⅢⅢa(CDa(CD4141//6161))缺陷或缺乏缺陷或缺乏ⅡⅡ //ⅢⅢ (C(C // ))缺陷或缺乏缺陷或缺乏

●● 贮存池疾病贮存池疾病

δδ--SPDSPD下降下降

活化血小板的概念活化血小板的概念

循环血液中处于静息状态的血小板受到生物或物理因子刺激后,使血小板胞浆内颗粒膜糖蛋白释放与质膜板胞浆内颗粒膜糖蛋白释放与质膜融合,血小板膜表面糖蛋白发生数量重排和构象变化而成为活化血小板重排和构象变化而成为活化血小板

活化血小板的功能

◆参与血栓形成与止血

◆参与炎症和免疫反应

◆参与肿瘤的转移

血小板活化标志物在缺血性脑血管疾病中研血小板活化标志物在缺血性脑血管疾病中研究：

1.脑缺血患者急性期血小板CD62p、CD63测定

2.缺血性脑血管患者CD62p、CD54、CD49d测定

3.缺血性脑血管患者CD62p、TSP、CD54测定3.缺血性脑血管患者CD62p、TSP、CD54测定

((五五) ) FCMFCM在骨髓和器官移植中的应用在骨髓和器官移植中的应用(( ))

●● 骨髓或脐血的祖干细胞细胞测定骨髓或脐血的祖干细胞细胞测定

CDCD3434++ CDCD3838--

CDCD3434++ CDCD3838++

CDCD3434-- CDCD3838++

●● 移植前配型移植前配型

HLAHLA--II类抗原的抗体类抗原的抗体((PRA)PRA)血管内皮细胞抗体血管内皮细胞抗体((VEA)VEA)

●● 移植后的免疫监测移植后的免疫监测

淋巴细胞及活化淋巴细胞亚群淋巴细胞及活化淋巴细胞亚群淋巴细胞及活化淋巴细胞亚群淋巴细胞及活化淋巴细胞亚群

粘附分子粘附分子

((六六)) FCMFCM在基础医学研究中的应用在基础医学研究中的应用((六六) ) FCMFCM在基础医学研究中的应用在基础医学研究中的应用

●● 造血祖干细胞扩增及保存造血祖干细胞扩增及保存

肿瘤的发生与发展肿瘤的发生与发展●● 肿瘤的发生与发展肿瘤的发生与发展

●● 药物治疗机理的研究药物治疗机理的研究●● 药物治疗机理的研究药物治疗机理的研究

●● 基础免疫学的研究基础免疫学的研究●● 基础免疫学的研究基础免疫学的研究