И.С. Мамедов, И.В. Золкина, В.С. Сухоруков

ФГУ «Московский НИИ педиатрии и детской хирургии»

Минздравсоцразвития

Основные типы нарушений обмена веществ, определяемые методом MS/MS

Нарушения обмена отдельных аминокислот

Нарушения обмена органических кислот

Нарушения окисления жирных кислот

В качестве основных маркеров заболеваний используютсяконцентрации аминокислот и ацилкарнитинов с различными заместителями

Нарушения обмена отдельных аминокислоти основные маркеры заболеваний

Аргининсукцинилацидемия ASA Повышение уровня цитруллина ≥ 100 μмоль/л

Цитруллинемия (CIT) Повышение уровня цитруллина ≥ 100 μмоль/л

Гомоцистеинемия (HCY) Повышение уровня метионина ≥ 140 μмоль/л

Синдром кленового сиропа лейциноз (MSUD)

Повышение уровня лейцина-изолейцина ≥ 460 μмоль/л

Фенилкетонурия (PKU) Повышение уровня фенилаланина ≥ 280μмоль/л

Тирозинемия Повышение уровня тирозина ≥ 500μмоль/л

Нарушения обмена органических кислот и основные маркеры заболеваний.

Метилмалоновая ацидемия (MMA) С3 пропионил ≥ 8μмоль/л

Дефицит бета-кетотиолазы (BKT) C5:1 Тиглил/триметилкротонил ≥ 1,0μмоль/л

Глутаровая ацидемия 1-го типа (GAI)

C5-DC глутарил ≥ 0,3μмоль/л

3-гидрокси-3-метилглутаровая ацидемия (HMG)

C5-OH гидроксиизовалерил ≥ 2,0μмоль/л

Изовалериановая ацидемия (IVA) C5 изовалерил ≥ 1,62μмоль/л

Дефицит 3-метилкротонил-СоА карбоксилазы

C5-OH гидроксиизовалерил ≥ 2,0μмоль/л

Множественный дефицит карбоксилаз (MCD)

С3 пропионил ≥ 8,0μмоль/л

Пропионовая ацидемия С3 пропионил ≥ 8,0μмоль/л

Дефект распознавания карнитина (CUD)

Свободный карнитин С0 ≤ 3.0 μмоль/л

Дефицит гидроксиацетил-СоА-дегидрогеназы длинных цепей(LCHADD)

C16-OH гидроксипальмитоил ≥ 0.19 μмоль/лC18-1OH гидроксиолеил ≥ 0.5 μмоль/л

Дефицит ацетил-СоА-дегидрогеназы средних цепей(MCADD)

C8 (октаноил) ≥ 1.0 μмоль/л C6 (гексаноил) ≥ 1.0 μмоль/л

Дефицит трифункционального протеина (TFPD)

C16-OH (гидроксипальмитоил) < 0.10 μмоль/л

Дефицит ацетил-СоА-дегидрогеназы очень длинных цепей (VLCADD)

C14:1 (тетрадеценоил) ≥ 1.5 μмоль/л C14 (тетрадеканоил) ≥ 0.92 μмоль/л

Нарушения обмена жирных кислот

Отбор образцов крови

Кровь собирается на стандартную карточку-фильтр (№903 Whatman), который применяют для скрининга новорожденных на ФКУ.

Кровь может быть как капиллярная (из пальца, пятки), так и венозная.

Необходимо хорошо пропитать выделенную область на фильтре!

На карточке-фильтре обязательно должно быть четко указаны ФИО, кем и откуда направлен пациент, дата рождения и телефон лечащего врача.

Образец высушивается 2-3 часа на воздухе. Желательно приложить выписку из истории болезни.

Этапы пробоподготовки

Экстракция

Упаривание

Дериватизация

Экстракция определяемых компонентов

Упаривание и дериватизация пробы

N+

H3C

CH3 OR'

O-

O

H3C

10% HCl

n-butanol

N+

H3C

CH3 OR'

OBu

O

H3C

10% HCl

n-butanol

H2N

R

OH

O

H2N

R

OBu

O

Дериватизация аминокислот и ацилкарнитинов

R’ = H или ацил

Bu = бутил

Bu = бутил

аминокислота

Карнитин или ацилкарнитин

QQQ Agilent

Схема ТМС

MS1 MS2Ячейка

соударений

Газ аргонГаз аргон

PrecursorPrecursorProductsProducts

N2 Inlet

RFIon Guide

Q1 Q2Collision Cell

Q3

Detector

Все ионы из источника

поступают в ловушку

•ионы вещества•ионы фона

Детектор

MS/MS во времени

MS/MS в пространстве

Электроннаяионизация(EI)

Химическаяионизация(CI)

ИАД (ЭС,ХИАД,ФИАД)API (ESI, APCI, APPI)

БомбардировкаБыстрыми атомами(FAB)

МЕТОДЫ ИОНИЗАЦИ

И

Жесткая ионизация, сильная фрагментация

Мягкая ионизация,низкая фрагментация

Преимущества метода тандемной масс-спектрометрии:

• повышенная диагностическая чувствительность и специфичность;

• получение структурной информации об изучаемых молекулах;

• высокая скорость анализа (42 вещества за 3 минуты)• высокая селективность анализа в сложных

многокомпонентных смесях• низкая себестоимость анализа

7x10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1.4

+ Scan (0.821-1.213 min, 54 scans) Scan_100.d

227.34860

260.27881

188.27059150.20258

126.19671487.50000

431.40167388.29999302.29999 344.29676

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500

Масс – спектр образца крови

7x10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

+ EIC(246.20000) Scan Scan_160.d

1 1

Counts vs. Acquisition Time (min)0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

Пример типичной хроматограммы биологического образца

Параметры метода анализа хроматограмм

Масс-спектр пробы с повышенным содержанием ацилкарнитинов

5x10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3

3.1

Abundance vs. Mass-to-Charge (m/z)30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210

+ MRM (0.472-0.920 min, 23 scans) (311.2 -> **) AC663_D9_r003.d

85.0

Масс-спектр пробы с повышенным содержанием аминокислот

5x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

3.2

3.4

3.6

3.8

4

4.2

Abundance vs. Mass-to-Charge (m/z)30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210

+ MRM (0.202-0.576 min, 16 scans) (311.2 -> **) AS623_C4_r001.d

85.0

Обработка массива результатов анализа при помощи программного обеспечения MassHunter

Индивидуальный отчет, выдаваемый программой жидкостного хромато-масс-спектрометра

Сравнение фенилкетонурии и нормы

140 160 180 200 220 240 260 280m/z0

100

%

0

100

%

140 160 180 200 220 240 260 280m/z0

100

%

0

100

%

NormalNormal

PKUPKU

LeuLeu

d3-Leud3-Leu

d4-Alad4-AlaAlaAla

PhePhe

TyrTyr

MetMet

d3-Metd3-Met

d5-Phed5-Phe

d6-Tyrd6-Tyr

PhePhe

Увеличение пика фенилаланинаУвеличение пика фенилаланина

Сравнение нормы и дефицита среднецепочечного ацилкарнитина

MCAD DeficiencyMCAD Deficiency

225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500m/z0

100

%

0

100

%C3 carnitineC3 carnitine

C16 carnitineC16 carnitine

NormalNormal

C8 carnitineC8 carnitine

C10:1 carnitineC10:1 carnitine

C6 carnitineC6 carnitine

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение новых высокотехнологичных методов лабораторной диагностики

наследственных болезней метаболизма позволяет облегчить и ускорить трудный путь практического врача к правильному

диагнозу.