弥漫性大 B 细胞淋巴瘤中 PI3K/AKT 信

号通路抑制对肿瘤细胞生长及化疗敏感

性影响的体内外研究

于宝华，周晓燕，施达仁复旦大学附属肿瘤医院病理科

研究背景 弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（ DLBCL ）

– 最常见的 NHL

– 异质性的肿瘤

Institutional cases of FUCH (2006~2007, total case number 789)

• PI3K/AKT/mTOR 信号通路

乳腺癌、

卵巢癌、

DLBCL?

体外研究Western Blot 法 DLBCL 细胞株中 AKT 活化状态

用 LY294002 分别作用于 3 株细胞

LY294002 、 DOX 、两者联合及序贯

作用于细胞株

观察 pAKT 水平的改变及细胞生物学行为的改变

检测干扰后细胞凋亡等的变化

研究内容

体内研究

腹腔注射不同剂量 LY294002 和对照

观察不同浓度 LY294002 对肿瘤生长的抑制作用；

Western blot 方法检测 pAKT 和 AKT 蛋白表达

用 LY8 细胞株建立皮下移植瘤裸鼠模型

腹腔注射 LY294002 、 DOX 、LY294002+DOX

同前观察不同用药组肿瘤生长的

抑制情况

材料与方法• 细胞及动物

– 人 DLBCL 来源的 LY1 、 LY8 、 LY10 细胞株

– BALB/c 裸鼠

• 统计分析

—— 采用 SPSS11.5 软件进行统计学分析。

多样本计量资料比较：单因素方差分析。

结 果 - 体外 10 ％ FBS Serum-Free

Ly1 ly8 ly10 ly1 ly8 ly10 pAKT （ ser47

3） AKT

GAPDH

Western blotting 显示 DLBCL 细胞株 ly1 、 ly8 和 ly10 中 Akt 和 pAkt 状态 DMSO 10 20 30 50 100 DMSO 10 20 30 50 100 DMSO 10 20 30 50 100μΜ

pAKT (ser473)

a b c

不同浓度 LY294002作用 1h 对 DLBCL细胞株中 pAkt的抑制作用

AKT

GAPDH

三株细胞在 LY294002 作用 48h 后细胞周期分布变化及 不同时间点 S 期抑制作用分析

结 果 - 体外

LY294002 、 Doxo 、 Doxo+ LY294002 及两者序贯使用后流式细胞分析不同时间三株细胞中凋亡细胞比例变化分析

1 ．皮下移植瘤模型的建立

D14 左右（ D10-20 ）：接种部位皮下有肿瘤长出。

截至传至第 9 代时共移植裸鼠 124 只，成瘤率约 91.1% 。

细胞株接种

D21 左右：见有肿瘤长出，约 5×6mm ，扁平质软

D34 ：肿瘤长至10×10mm

无菌套管针法

鼠间种植

结 果 - 建模

2 ．移植瘤生长特点

A 、 B 、 C 分别为第 8 代裸鼠接种后第 19 、 26 、 34 天。

第 8 代移植瘤生长曲线

第 1 代至第 8 代生长曲线均类似

8第 代移植瘤生长曲线

0

1000

2000

3000

4000

5000

14 16 19 21 23 26 28 30

( )移植后 天

(mm3

)移

植瘤

体积

结 果 - 建模

3 ．大体观察

第 8 代荷瘤鼠接种后 28 天

肿瘤直径约 2cm ；切面示灰白灰红，鱼肉状，质地软，可见坏死。

结 果 - 建模

LY294002 对皮下移植瘤生长的影响• 动物分组与干预

30 只荷瘤鼠（ 200-400mm3 ）随机分为 3 组： 对照组、低剂量 LY294002 组（ 0.1mg/kg ）、高剂量 LY294002 组

（ 0.5 mg/kg ） 每天给药，共连续 10 天。

• 实验观察 – 移植瘤体积（体积＝ 1/2ab2 ）：每周 3 次– 质量抑瘤率和体积抑瘤率– IHC 检测 Ki67 表达； 细胞增殖指数（ PI ）：运用 Motic Images Advanced 3.2 软件对

Ki67 的阳性范围进行分析– 蛋白质提取， Western Blot 检测 pAKT 表达

1 ． LY294002 对肿瘤生长的影响

结 果 - 抑瘤

移植瘤在用药起始第 6 天时几乎消失。

2.1 生长曲线

D3 D6 D8 D11 D13

高剂量组

明显（ p=0.03

8 ）（ p=0.00

4 ）（ p=0.00

5 ）（ p=0.01

6 ）

最显著（ p<0.00

1 ）低剂量

组生长减缓

（ p>0.05 ）临界差异（ p=0.07

6 ）

结 果 - 抑瘤

• 体积抑瘤率和质量抑瘤率

体积抑瘤率： 17.40% 50.14%

p=0.076 p<0.001

质量抑瘤率： 8.67% 45.83%

p>0.05 p=0.004

结 果 - 抑瘤

2.2 LY294002 对 AKT 活化的影响

总 AKT 表达水平：基本一致 ;

pAKT 表达水平：高剂量组和低剂量组与对照组相比均显

著降低，高剂量组尤为显著。

结 果 - 抑瘤

2.3 LY294002 作用后肿瘤形态学改变

各处理组给药后 HE 形态学表现 （ ×400 ）

对照组 低剂量组 高剂量组

结 果 - 抑瘤

2.4 LY294002 对细胞增殖活性的影响

移植瘤组织中 Ki67 阳性范围比较

结 果 - 抑瘤

LY294002 与 DOX 联合对移植瘤生长的影响

• 动物分组与干预

40 只荷瘤鼠（ 200-400mm3 ），随机分为 4 组：

单用 LY294002 （ 0.5mg/kg ）组、单用 DOX （ 5.0 mg/kg ）组、

LY294002 （ 0.5mg/kg ）与 DOX （ 5.0 mg/kg ）联合用药组、对照组

LY294002: 腹腔注射 ; 每日给药 , 连续 10 天 ;

DOX: 尾静脉注射 ; 处理起始第 1 天和第 3 天给药。

• 实验观察（同前）。

1 ．不同处理组荷瘤鼠的生长曲线– LY294002+DOX 联合组： D3 即显示出对肿瘤生长的明

显抑制效果（ p=0.046 ），总体呈时间依赖性。– 单用 LY294002 组（ p=0.02 ）和单用 DOX 组

（ p=0.003 ） :D6开始显示出对肿瘤生长的抑制效果。

结 果 - 联合

Control LY294002 DOX LY294002+DOX

体积抑瘤率 17.3% 35.5% 65.5%

p值 <0.001 0.002 0.045

control LY294002 DOX LY294002+DOX

质量抑瘤率 24.7% 45.3% 65.5%

p值 <0.001 0.001 0.057

体积抑瘤率和质量抑瘤率

结 果 - 联合

2 ．肿瘤形态学的改变

LY294002对照

DOX LY+DOX

结 果 - 联合

3. 细胞增殖活性的影响

移植瘤组织中 Ki67 阳性范围比较

LY294002对照

DOX LY+DOX

结 果 - 联合

3 ．细胞增殖活性的影响

LY294002+DOX 组 Ki67 阳性率显著低于任一药物单用组。

结 果 - 联合

总 结

• 3 株 DLBCL 细胞株均有 pAKT 表达， PI3K 特异性抑制剂 LY294002 能快速有效地抑制 DLBCL 细胞中 AKT 磷酸化水平，表明 AKT 的组成性活化可能在 DLBCL 发生发展中起重要作用。

• 体外研究显示， LY294002 虽然不能诱导细胞凋亡，但LY294002 预处理后使用阿霉素的方案显著提高了肿瘤细胞对阿霉素诱导凋亡的敏感性。

• 体内研究显示， LY294002 联合 DOX 组荷瘤鼠较早地出现了对肿瘤生长的明显抑制，肿瘤体积抑瘤率和质量抑瘤率均显著优于任一药物单用组。

• 因此， PI3K 抑制剂 LY294002 可能是一潜在具有较好的DLBCL 化疗增敏作用的分子靶向药物。

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