2d Determinacion de Proteinas

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Determinación deproteínasA. Ley de Lamber y BeerB. Curva patrónC. Método UV: Abs 280nmD. Métodos colorimétricos:Biuret, Lowry, bradford, BCA.Comparación de métodos



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Cuantificación de Proteínas

Determinar la concentración de proteínas enuna muestra biológica es una técnica de rutinabásica cuando se aborda un esquema de

purificación de una proteína concreta, cuandose quiere conocer la actividad específica de unapreparación enzimática, para el diagnóstico deenfermedades, así como para otros muchospropósitos.



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Cuantificación de Proteínas

Existen diferentes métodos para lacuantificación de proteínas. Muchos de estosmétodos se basan en:

a) la propiedad intrínseca de las proteínas para

absorber luz en el UV,b) para la formación de derivados químicos, oc) la capacidad que tienen las proteínas de

unir ciertos colorantes.



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Ley de Lambert - Beer

Relaciona la absorción de luz con

las propiedades del materialatravesado.

http://es.wikipedia.org/wiki/Absorci%C3%B3n_%28radiaci%C3%B3n_electromagn%C3%A9tica%29


http://es.wikipedia.org/wiki/Luz

http://es.wikipedia.org/wiki/Luz





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LEY DE LAMBERT Y BEER

La ley explica que hay una relaciónexponencial entre la transmisión de luz através de una sustancia y la concentración dela sustancia, así como también entre la

transmisión y la longitud del cuerpo que la luzatraviesa. Si conocemos l y A, la concentración de la

sustancia puede ser deducida a partir de lacantidad de luz transmitida.

A = ·c·lε

Donde:A = absorbencia = Coeficiente de extinción molar. l = longitud de la celda.



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COEFICIENTE DE EXTINCIÓN MOLAR

Es una medida de la cantidad de luzabsorbida por unidad de concentración.

Un compuesto con un alto valor decoeficiente de extinción molar es muyeficiente en la absorción de luz de la longitudde onda adecuada y, por lo tanto, puededetectarse por medidas de absorción cuando

se encuentra en disolución aconcentraciones muy BAJAS.



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Métodos para determinar proteínas

Intervalo del UVTodas la proteínas pueden ser detectadas, sin

embargo solo ciertos residuos de aminoácidosson los que se leen en la región del UV.

Por reacciones colorimétricas:Enlaces peptídicos o ciertos aminoácidos

reaccionan y los productos coloridos son los quese cuantifican



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PROTEÍNAS y la absorción enla región UV Las bandas de absorción más significativas se

encuentra en el ultravioleta cercano, en elintervalo de longitud de onda entre 230 y 300nm.

Concretamente absorben en este rango lascadenas laterales de los aminoácidos

aromáticos, la histidina y la cistina. La cistina presenta una banda centrada a

250 nm, n-->s* ( max ~ 300 M-1.cm-1), pero

apenas se puede considerar, ya que es muydébil y el porcentaje relativo de puentesdisulfuro es muy pequeño en una proteína.



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PROTEÍNAS

Los aromáticos absorben de 260-290 nm. Lafenilalanina. Es el menos importante cuantitativamente,aunque muestra un espectro complejo con múltiples bandasdiferenciadas en torno a 250-260 nm. Presenta tambiénbandas de mayor energía que solapan con el espectro delenlace peptídico en 215 y 180 nm. Sin embargo como noabsorbe por encima de 280 nm su contribución al espectroen la zona del ultravioleta cercano de proteínas suele serpequeña.

La tirosina presenta un máximo a 275 nm conun hombro a 285 nm. La banda se desplaza a mayores

longitudes de onda cuando se produce la desprotonación delOH del anillo aromático.

El triptófano agrupa al menos tres bandas diferentes.bajoel espectro centrado a 280 nm. También presenta bandasen la zona del UV lejano.



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calcular la concentración de proteínas:método UV

Se usará la ecuación de Lambert y Beer. El coeficiente de extinción molar de la

Albumina de Suero Bovino (BSA) que es 43824 M-1 cm-1 o bien usando el coeficiente

dado en porcentaje que es de 6.6 para unasolución de BSA al 1% (10 mg/mL)

La fórmula para determinar la concentraciónde la muestra.



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Desarrollo experimentalDeterminación de proteínas por elmétodo Abs 280 nm.

1. Descongelar sólo las alícuotas de lasfracciones de proteína destinadas para esteprotocolo y que fueron recolectadas durantela purificación de la lactato deshidrogenasa.

2. Mantener las fracciones en un recipiente conhielo durante todo el experimento.

3. Colocar las fracciones en cuvetas demetacrilato grado UV.

4. Leer la absorbancia las fracciones quete indique tú profesor a la longitud de280 nm.



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Calcular la concentración de proteínascon la fórmula y llenar la tabla

Tubo Absorbancia Concentración (µg/µL)

F0

F1

F2

F3

F4

FPA

FPB

NO SE NECESITA HACERCURVA PATRÓN



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Pero para los métodos colorimétricosse necesita una: Curva Patrón

Es un marco de referencia que se construyede cantidades conocidas de una sustancia (porejemplo la albúmina sérica bovina) que seutiliza para determinar la cantidad de proteínaspresente en una muestra incógnita.

En determinaciones colorimétricas, se cumpleuna relación proporcional entre la magnitud ointensidad de color que da una reacción y lacantidad del reactivo que la provoca.

La intensidad de color se mide con un

espectrofotómetro o colorímetro en función delas concentraciones crecientes de la sustanciase obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidadde proteína, mayor cantidad de producto dereacción y por lo tanto, mayor intensidad decolor.



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BLANCO

La absorbancia de una solución es la resultante de laabsorbancia del soluto cuya concentración se deseaconocer y la de otros componentes del sistema(solventes, reactivos) que absorben también a esalongitud de onda.

Se debe descartar la absorbancia de lasinterferencias, para ello es necesario hacer siempreuna muestra que contenga todas los componentes delsistema menos aquel que se desea medir. Esta

muestra se llama blanco y la absorbancia de éstedebe restarse a las muestras problema y a lospatrones, o bien, con el blanco se calibra elinstrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% detransmitancia.



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CURVA PATRÓN



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BIURET

Se basa en la formación de un complejocoloreado entre el Cu2+ y los grupos NH delos enlaces peptídicos en medio básico.

1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente

proporcional a la cantidad de proteínas(enlaces peptídicos) y la reacción es bastanteespecífica, de manera que pocas sustancias

interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo

se recomienda para la cuantificación deproteínas en preparados muy concentrados

(por ejemplo en suero).



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Reacción de Biuret

La reacción debe sunombre al biuret, unamolécula formada apartir de dos de urea

(H2N-CO-NH-CO-NH2),que es la más sencillaque da positiva estareacción, común atodos los compuestosque tengan dos o másenlaces peptídicosconsecutivos en susmoléculas.



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Biuret

La presencia de proteínas en una mezcla sepuede determinar mediante la reacción delBiuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4en solución acuosa alcalina (gracias a la

presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un

compuesto de color violeta, debido a laformación de un complejo de coordinación

entre los iones Cu2+ y los pares de electronesno compartidos del nitrógeno que forma partede los enlaces peptídicos.



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LOWRY

ESTE PROCEDIMIENTO INVOLUCRA LAFORMACIÓN DE UN COMPEJO COBRE -PROTEÍNA EN SOLUCIÓN ALCALINA.

ESTE COMPLEJO REDUCE AL REACTIVO

FOSFOMOLIBDICO- FOSFOTUNGSTATO LO QUEPRODUCE UNA INTENSA COLORACIÓN AZUL.



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Este método consta de dos etapas:

Primera reacción Biuret. Los iones Cu2+,en medio alcalino, se unen a las proteínasformando complejos con los átomos denitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos

complejos Cu2+-proteína tienen un color azulclaro. Además, provocan el desdoblamientode la estructura tridimensional de la proteína,exponiéndose los residuos de tirosina que vana participar en la segunda etapa de lareacción. El Cu2+ se mantiene en soluciónalcalina en forma de su complejo con tartrato.

Segunda reacción reactivo de Folin-Ciocalteau. La reducción, también en medio

básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los



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Este método se basa en la reacción de Biuret, donde losenlaces peptídicos reaccionan con el Cu2+ encondiciones alcalinas produciendo Cu+, después sereduce el reactivo de Folin por las proteínas tratadas concobre a azul heteropolimolibdeno. El color se desarrollaen la segunda reacción (con el fosfomolibdotungstato) y

es primeramente debida a los aminoácidos tirosina,triptófano, y en menor grado por cisteína, cistina e

BIBLIOGRAFÍA

O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275(1951)



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BRADFORD

v Se basa en la unión de un colorante, ComassieBlue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas.

v El colorante, en solución ácida, existe en dos formasuna azul y otra naranja.

v Las proteínas se unen a la forma azul para formarun complejo proteína-colorante con un coeficientede extinción mayor que el colorante libre.

v Este método es sensible (1-15 g), simple, rápido,μ

barato y pocas sustancias interfieren en su

determinación.v Entre las sustancias que interfieren están losdetergentes y las soluciones básicas.



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Bradford

El ensayo de Bradford es un ensayocolorimético para la medición de proteínatotal en una solución dada.

Involucra la unión de un colorante elCoomassie ® Brilliant Blue a las proteínas enun medio ácido y su conmitante cambio deabsorbancia de 465 a 595 nm.

Debido a que el reactivo causa la

precipitación de la proteína con el tiempo, lalinearidad de la reacción se encuentracomprometida. Las mediciones hay queconcluirlas rápidamente.

http://biz.yahoo.com/ic/41/41791.html

http://biz.yahoo.com/ic/41/41791.html



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Diferentes

El azul de Coomassie se uneaproximadamente estequiométrica, entoncesel método de detección tanto en solucióncomo en PAGE-SDS, gel u otras matrices es el

método preferido, cuando las concentracionesde proteínas se deben determinar pordensitometría.



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Cambio de absorbancia del coomasieblue

Los aminoácidos queson reconocidos porel colorante sonarginina,fenilalanina,

triptofano y prolina. El azul de Coomasie

libre se detecta a470 nm mientrasque la forma unida a

proteínas a 595 nm.Lo anterior debido aque el Coomassie seunepreferencialmente alos aa mencionadosy cambio de un



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El azul de coomasie y los aminoácidosque reconoce



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BCA

v El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capazde formar un complejo púrpura intenso con iones Cu1+en medio alcalino.

v Este reactivo forma la base de un método analítico capazde monitorizar el ión cuproso producido en una reacción

entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacciónde Biuret).v La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona

un método para la cuantificación de proteínas que essencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una grantolerancia a compuestos que afectan a otros métodos.

OH-Proteína + Cu2+ Cu1+

Cu1+ + BCA complejo púrpura BCA- Cu1+

C d i d



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Cuadro comparativo desensibilidad de las técnicas decuantificación de Proteínas



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