临床免疫测定技术（各论）

凝集试验 Widal reaction Weil-felix reaction Wright test: 布鲁菌病 交叉配血试验

Widal reaction （试管内凝集反应）取：（ 1 ： 10 ）

待检血清 3.0ml

生理盐水 3.0ml/ 管

释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640

待测血清的抗体效价（滴度）： 即出现“ ++” 凝集的最终血清稀释度

血型鉴定（玻片凝集反应）（直接）

+

抗 A 标准血清

+

抗 B 标准血清

待测 RBC

待测 RBC

A 型

B 型

乳胶凝集试验 ( 间接 )

带现象Zone phenomenon前带prezone后带postzone

1 ）正向间接凝集试验 ( 用抗原致敏载体 -- 检测 Ab) 2 ）反向间接凝集试验间接凝集— ( 用抗体致敏载体 ---- 检测 Ag ） 3 ）间接凝集抑制试验 4) 协同凝集试验 (SPA 抗体致敏 ------ 测抗原 )

反向间接血凝试验 ( 测 Ag)1/

2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/12

8

1/25

6

1/51

2

1/10

24

Pos

.

Neg

.

Titer

64

8

512

<2

32

128

32

4

Patient

1

2

3

4

5

6

7

8

抗球蛋白抗体试验 - commbs （抗RBC 不完全抗体）

A （间接法—游离）

B （直接法—结合）：

(In fluid phase )絮状沉淀试验：

Ag

Ab

环状沉淀试验

(In gel phase )single gel diffusion test

抗原浓度的标准曲线

操作：抗体混于凝胶中

抗原加入孔内

抗原自由扩散

测定沉淀环直径

在标准曲线上查找

相应抗原浓度

影响因素影响因素 ::

1. 抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关2. 抗体种类：兔抗血清优于马、羊3. 抗体稀释度：抗体浓度大沉淀环小4. 扩散时间：抗原含量高，扩散时间长5. 扩散温度： 4 ～ 37℃ 内温度与扩散速度

正相关6. 琼脂板厚度：与沉淀环反相关

double gel diffusion test

原理 :

将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成沉淀线。

琼脂双向扩散试验的应用 1. 检测未知抗原或抗体 2. 抗原性质分析 3. 抗体效价滴定 4. 抗原或抗体纯度鉴定

1. 检测未知抗原或抗体

A: 浓度 Ag 、 Ab 及扩散率近似；B ：浓度 Ag 、 Ab 近似，扩散率 Ag ＞ Ab ；C ：浓度 Ag 、 Ab 近似，扩散率 Ag ＜ AbD ：浓度 Ag ＞ Ab ，扩散率近似；E ：浓度 Ag ＞ Ab ，扩散率 Ag ＞ Ab ；F ：浓度 Ag ＜ Ab ，扩散率 Ag ＜ Ab ；

2. 抗原性质分析

3. 抗体效价滴定

4. 抗原或抗体纯度鉴定

免疫浊度试验免疫浊度试验 (( 略略 )) 免疫球蛋白的检测（简）免疫球蛋白的检测（简）

年龄 IgG IgA IgM

脐血 6.5～ 16.0 0.01～ 0.04 ＜ 0.251 月 2.5～ 9.0 0.02～ 0.5 0.20～ 0.82～ 9 月 2.0～ 9.0 0.04～ 0.8 0.25～ 1.010～ 12 月 2.9～ 10.7 0.15～ 0.9 0.35～ 1.51～ 5 岁 3.4～ 12.4 0.15～ 1.6 0.45～ 2.06～ 12 岁 6.5～ 16.0 0.35～ 2.5 0.50～ 2.512～ 60 岁 6.5～ 16.0 0.40～ 3.5 0.50～ 3.0

健康人血清 Ig 含量（ g/L ）

免疫固定电泳（测M蛋白）

CH50(complement hemolysis 50%).

原理：组分和功能完整的补体系统能使抗体致敏的羊红细胞（ SRBC ）发生溶血反应。在一定范围内， SRBC 溶血程度与补体总活性成正相关。以溶血百分率作纵坐标，相应的血清量为横坐标绘图，在一个适当的、稳定的反应体系中，溶血程度与补体剂量依赖呈一个 S 形曲线

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4

(ml )1: 500豚鼠血清

(%)

溶血

率

Enzyme linked immunosorbent assay （ ELISA ） 原理（ Principle ）：将抗原或抗体结合到某固相载体表面，保持其免疫活性，测定时 ,把被测 sample 和 conjugate按不同的步骤与固相载体上的 immunosorbent 反应。用洗涤的方法使与固相载体上形成的 immunocomplex 与其他物质分开，再加入酶反应 substrate ，经酶的催化作用后 substrate变为有色产物。产物的量与标本中被检物的量直接相关。

ELISA 操作的基本步骤： 标本的收集、运送和保存 试剂准备 加样 温育 洗板 显色 比色 结果判断 结果报告及解释

1 、标本的收集、运送和保存

ELISA 检测分析用标本— 血清（浆） 特殊项目用： 唾液、脑脊液、尿液、粪便等 ELISA 检测分析的对象— 病原体抗原 / 抗体 Tumor mark、 hormone 、 cytokine et a

l采集、运送与保存的注意点： 采集时间、运送条件、暂存点温度

可能影响测定结果的标本因素一、内源性（标本内） 类风湿因子（ rheumatoid factor ） 补体（ complement ） 异嗜性抗体（ heterophilic antibody ） 治疗或诊断用鼠抗体（抗鼠抗体） 自身抗体或溶菌酶等二、外源性（操作） 溶血、反复冻融 细菌污染 储存时间过长 标本凝固不全

对策： 1 、稀释标本 2 、改变选用的酶标抗体 3 、预封闭（变性 IgG ） 4 、加入某些还原剂 5 、血清标本的补体灭活（ 56℃30min ） 6 、选择包被或标记抗体～如 F(ab)2 片段 7 、用理化方法解离自身抗体 8 、标本中添加 Cu2+ 离子或卵白蛋白 等等

2 、试剂准备

1 、实验开始前，将试剂盒从冰箱取出置室温放置 20min以上启用，谓平衡（ balance ）目的： 1 ）保证反应温度的一致性 2 ）去湿化，保证试剂浓度 2 、稀释液的质量和特殊试剂配制的要求

3 、加样 原则：量准 操作规范 量准—移液枪的状态与正确使用 操作规范— ①正确使用加样器

3 、加样 操作规范— ②掌握操作要领 吸头与加样器上吸头套密闭 吸头进入液体的深度要适宜 放送液体注意角度（ 10 ～ 40°） 位置（下 1/3 ） 速度（不宜太快） ③关注加样器的状态

4 、温育（ incubation ） 温育是 ELISA 检测反应中可能影响其检测结果的最为关键的一个因素。

液相的待测抗原 / 抗体与固相的抗体 / 抗原反应需要一定的温度与时间，以保证结合反应充分。

温育所需要的时间与反应温度成反比。 温育温度： 37℃ 、室温、 43℃ 和 2 ～ 8℃避免“边缘效应”。

5 、洗板（washing ）通过洗涤将特异性结合与固相的抗原或抗体与反应

温育过程中可能非特异吸附及游离的成分分离，完成固相免疫检测程序保证测定的特异性。

洗涤液 :0.05% tween-phosphate-buffer saline pH7.4

吐温 -20(山梨醇 -20)

一种非离子去垢剂

含亲水 /疏水基团

在洗涤中的作用是通过其疏水基团与被动吸附于固相载体上蛋白的疏水键相互作用以削弱之；同时通过其亲水基团结合液相中水分子的作用，促使非特异的蛋白质吸脱。

吐温 -20 的浓度（≤ 2% ）洗涤用量与次数～

例：选择 4条 8 孔的已包被抗原（ HBsAg ） ELISA 板条每 2条分别加同一份弱阳性和阴性样本然后按试剂盒的操作说明加 conjugate 、温育洗涤： 1排 4 孔洗 1次 4排 4 孔洗 4次 2排 4 孔洗 2次 …………… 3排 4 孔洗 3次 8排 4 孔洗 8次加底物，显色，比色～评判原则 - 阳性 /阴性值保持最大不变的次数

6 、显色 (Color is appeared)

添加酶特异性底物 (HRP- TMB/OPD)保证底物溶液的有效性 (无色、避光、显色 ) 反应温度（ 37℃ 、室温） 反应时间（ 25 ～ 30min ） 终止反应（酸溶液 -2mol/L sulfate acid ） 及时比色

7 、比色 (By the plate reader) 加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀 测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适 比较好的酶标仪可选择单波长或双波长比色测定 所谓双波长比色，即在敏感波长（此时对所显色 具最大光吸收）如 450 nm 和非敏感波长（所测得

的光吸收为微孔板上的划痕、污迹以及指纹等所 致），最后从仪器得到的读数为在敏感波长测得 的吸光度与非敏感波长测得的吸光度之差。

8 、结果判断 临床 ELISA 检测的结果报告形式— 定性（阴 /阳） 定量（量值）

ELISA 定性测定的“阴性”和“阳性”的判断依据是

试剂盒所确定的阳性判断值（ cut-off）。 ELISA 定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定出的剂量反应曲线（标准曲线）。

cut-off的建立 ( 略 ) S/CO≥1 时判为阳性 S/N或 P/N≥2.1阳性为

“灰区”（例 -HBsAg ）

9 、结果报告及解释

结果报告根据测定性质，定性 --阴性 /阳性 定量 --具体数值 结果解释结合所测项目的相关知识（临床意义），考虑各种可能影响的因素～

（关注测定操作中的各环节，尤其是加样、温育和洗涤）

例举：临床可能出现的问题及原因现象： 1 、相同的标本两次测定的结果不一致原因：加样 / 试剂量不准，板孔间有差异 加样过快，孔间发生污染 加错样本 加样 / 试剂时，落在非包被区 不同批号的试剂混用 温育、洗涤及反应时间不一致 孔内污染杂物 酶标仪滤光片不正确 血清分离不充分，纤维蛋白原或血细胞入孔

现象： 2 、弱阳性质控样本检测不出原因：温育时间或温度不够，显色反应时间过短， 配置缓冲液（洗涤液）的蒸馏水有问题现象： 3 、阳性对照不显色原因：漏加酶结合物 洗涤液配置？（含有酶抑制物 -NaN3 ） 漏加显色剂，错加（将终止液误为显色液）现象： 4 、全部孔都有显色原因：洗涤不够 显色液变质 底物或洗涤液被酶污染

临床 ELISA 测定的常用模式

一、双抗体夹心检测抗原二、竞争法检测抗原三、间接法检测抗体 四、竞争法检测抗体五、固相捕获法检测抗体六、双抗原夹心检测抗体七、 ABS- ELISA 及其他

一、双抗体夹心检测抗原例： ELISA 双抗体夹心法定性检测乙型肝炎表面抗原原理：

Ab＋ Ag＋ Ab* Ab Ag Ab* ＋ Ab Ag ＋ Ag Ab* ＋ Ab* Ag Ab* a b c d

Ab ＋ Ag Ab Ag （ b复合物） (1)

Ab Ag＋ Ab* Ab Ag Ab* （ a复合物） (2)

HooK‘S 效应（钩状效应）

评价： 被检测的抗原具有两个以上抗原决定族（全抗原） 标本中 RF会充当抗原分子（干扰） 一步法简便、快捷；存潜在缺陷 (hook's effect) 其他 - 判断时 OD值落在“灰色区”？ 假阴性？（ hook's effect /变异） 假阳性 ?

二、竞争法检测抗原 例 :T3 、T4等激素或地高辛、茶碱等药物浓度检测

评价： 结合于固相的酶标记抗原量与被测抗原量呈反比 检测对象为小分子蛋白（半抗原） 检测中需获得酶标记的小分子半抗原（制备难） 运用于仪器的自动化检测～

三、间接法检测抗体例 :ELISA 间接法检测各类病原体特异性抗体（ IgG ）

评价： 通用性大。只要更换固相抗原，同一种酶标记体 体（ IgG/IgA 、 M ）可用以各种与抗原相应的抗

体检 测。 标本高浓度时易受非特异 IgG 的干扰（稀释） 易受其他因素的影响（包被抗原的纯度）

四、竞争法检测抗体 抗体的检测一般不选用竞争法。当已知抗原难以纯化或

抗原 / 抗体的结合特异性不稳定时～

实例 -ELISA竞争法检测乙型肝炎病毒核心抗体 （基因工程表达的 HBcAg ）

固相板（包被 HBcAg ） + 待测标本 + 酶标记抗 -HBc —— 待测标本中抗 - HBc /酶标记抗 -HBc — （竞争）—固相板（包被 HBcAg ） |

酶标记抗 -HBc 与固相板（包被 HBcAg ）随 待测标本中抗 -HBc 的浓度增加 而 减少

五、固相捕获法检测抗体

间接 ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG型抗体，若用

抗人 IgM 作为二抗，使用时需进行标本的预处理～

目前临床检测抗体 IgM 时多采用捕获法 标本检测时要求稀释（除干扰）

六、双抗原夹心检测抗体例 :ELISA 双抗原夹心法定性检测抗 HBs原理：利用针对抗体不同位点的双抗原，将其中一 种（纯化）抗原直接包被，而将另一种抗原 进行酶标记，用于检测相应抗体～。 （一步 /二步法）注意：抗 HBs为中和抗体（≥ 10U/L ； ≥ 100U/L ） 待检标本使用防腐剂应避免 NaN3

疑示假阳性—— 中和试验 标本无需稀释可避免非特异性 IgG干扰，灵敏 度提高

七、 ABS- ELISA 及其他 ABS-ELISA: (avidin biotin- system) 的略语

ABS ，指亲和素生物素系统。其他 ELISA ：酶联免疫荧光测定 斑点 -ELISA 酶联免疫化学发光测定 酶联免疫电转移印迹法

室内质量控制（ internal quality control ， IQC ）

室间质量控制（ external quality control ， EQC ）

质量保证（ quality assurance ， QA ）

谢 谢