Studiul morfologiei bacteriene Coloratia simpla Coloratia Gram

Examinarile bacteriologice urmaresc: -evidentierea -identificarea bacteriilor din produse patologice. Dintre metodele folosite in acest scop,

studiul caracterelor morfologice este o etapa foarte importanta.

n Morfologia bacteriana se refera la forma, dimensiunile si asezarea bacteriilor.

n Microscopia optica permite evidentierea

formei si a dimensiunilor bacteriilor. n Microscopia electronica permite

cunoasterea structurii bacteriilor.

n Bacteriile avind dimensiuni de ordinul µm, nu pot fi vazute cu ochiul liber, de aceea examinarea lor se efectueaza cu ajutorul microscopului.

Anthoni van Leeuwenhoek (1632-1723) a fost primul care a studiat bacterii si alte microorganisme la microscop

n 

n Examenul microscopic se executa : -  direct din produsele patologice (examen

microscopic direct) -  din culturi pure.

n Preparatele microscopice sint de 2 feluri: - preparat nativ-cu germeni vii - frotiu / preparat colorat- cu germeni

omoriti

Examenul microscopic da indicatii asupra: 1. prezentei microorganismelor in preparat 2. proprietatilor morfotinctoriale: - forma (bacili, coci, spirili) - marimea - mobilitatea ( in preparatul nativ ) - existenta eventuala a formatiunilor neobligatorii ( cili, capsula, spori)

- asezarea in frotiu ( lant, ciorchine, diplo-, tetrade, etc) - proprietatile tinctoriale ( colorabilitatea )

Examenul microscopic - direct din produsele patologice -permite in unele infectii stabilirea diagnosticului ( gonococ, bacil tuberculos, stafilococ ) - constituie o etapa esentiala in identificarea bacteriana.

n Forme fundamentale bacteriene n COCII n Au in general diametrul de 1µ n Prezinta forma rotunda doar unele

bacterii:stafilococi, micrococi . n Majoritatea bacteriilor au forma ovoida. n Dispozitia bacteriilor rezulta in urma

diviziunii lor, putand ramane in urma diviziunii asociate fie pe verticala fie pe orizontala

n  Cocii pot prezenta dispozitia in: n  I.diplo:diplococi n  Ex:Pneumococii :coci ovoizi cu aspect de flacara de

lumanare n  Neisserii:coci cu aspect reniform n  II.lanturi: n  Streptococi:coci, diviziune ordonata pe orizontala n  Tetrade:Micrococi:4 coci reuniti n  Octade:Sarcina:8 coci reuniti n  Gramezi:Stafilococi :aglomerari neordonate de coci cu

aspect de ciorchine de strugure(staphylos=ciorchine),acestia putand avea si dizpozitie de diplococi sau de lanturi scurte

n BACILII n  Sunt bacterii de forma cilindrica de bastonas n  Dispozitia in frotiu:

izolati:Enterobacterii :bacilul coli n  Diplobacili: Bacilul carbunos n  Streptobacili:reprezentantii genului

Bacillus:Bacilul carbunos n  Bacili uniti la capete: Mycobacterium tuberculosis (aspect de majuscule

X,Y,W) Corynebacterium diphteriae(aspect de litere

chinezesti) Bacili uniti in palisade:Bacilii pseudodifterici

n COCOBACILII n Sunt bacili scurti si subtiri Ex: Haemophilus Bordetella Brucella

n FORME SPIRALATE n 1.Bacili incurbati: n Vibrionul holeric – bacil incurbat,mobil, cu

aspect de virgula n Helicobacter:mai multi bacili incurbati uniti

la capete – produc gastrita ,ulcer duodenal n 2.Bacterii spiralate n Spirochete : bacterii spiralate, lungi,

mobile prin aparata locomotor n Ex:Treponema pallidum

Dichotomous keys

Examenul microscopic - direct din produsele patologice -permite in unele infectii stabilirea diagnosticului ( gonococ, bacil tuberculos, stafilococ ) - constituie o etapa esentiala in identificarea bacteriana.

Preparatul nativ ( cu germeni vii )

Ex. microscopic al preparatului nativ reprezinta examinarea directa intre lama si lamela :

-a unei suspensii de germeni vii

intr-o picatura de ser fiziologic, sau mediu de cultura lichid

-a produsului patologic (singe, sediment urinar, lcr).

Examinarea prep. nativ -are implicatii restrinse -nu da informatii asupra tuturor

proprietatilor morfologice ale bacteriilor Este obligatorie completarea lui cu examinarea preparatului colorat.

Examenul microscopic al unui preparat colorat (frotiu)

n Proprietatile morfotinctoriale ale bacteriilor pot fi studiate mai detailat pe preparate fixate si colorate, cu germeni omoriti .

n  Mai rar se folosesc coloratii vitale, spre ex. in reactia de umflare a capsulei .

Timpii de executie a preparatului colorat

Timpi pregatitori: 1. - etalarea = intinderea frotiului 2.- uscarea 3.- fixarea ( procedee fizice : prin incalzire procede chimice: cu alcool

metilic, etilic, alcool -eter, acid acetic )

Fixarea Scopul fixarii este multiplu: - microorganismele sint omorite=preparat

neinfectios -  preparatul adera mai bine de lama - prin omorirea microorganismelor se mareste

permeabilitatea peretelui celular si se produc modificari ale citoplasmei, care cresc afinitatea fata de coloranti = detalii fine de strucura

Coloratia

n Procedeu fizico-chimic complex, in care colorantii se combina cu constituenti celulari, facindu-i vizibili la microscop.

n Colorantul se absoarbe, apoi se dizolva si difuzeaza in continutul celular , unde are loc formarea unei combinatii stabile.

n  Colorarea se executa de obicei prin acoperirea suprafetei frotiului fixat cu colorant, care se lasa sa actioneze un timp limitat, la cald sau la rece.

Tipuri de coloratii

Coloratia simpla- se executa cu un singur colorant Coloratia combinata-care se realizeaza prin

actiunea succesiva sau simultana a mai multor coloranti, fiecare colorant actionind independent si fixindu-se pe anumite elemente

Coloratii speciale- pentru formatiuni morfologice

celulare si extracelulare: corpusculi, cili, spori, capsula

Coloratia simpla

n  - frotiul fixat n  - se acopera complet cu un singur

colorant: albastru de metilen sau fuxina, timp de 1-2 min.

n  se spala cu apa si se usuca n  in coloratia cu albastru de metilen toate

elementele se coloreaza in albastru n  in coloratia cu fuxina, toate elementele se

coloreaza in rosu

Coloratia simpla

Permite stabilirea unor proprietati morfotinctoriale ca:

-forma si marimea microorganismelor -existenta unor elemente celulare Este utila in diagnosticul prin examenul

microscopic direct din produsul patologic in: - gonoree -meningita cerebrospinala epidemica

Coloratii combinate: coloratia Gram

-larg utilizata in microbiologie -deosebeste germenii gram pozitivi

de cei gram negativi -orienteaza cercetarea in directia

identificarii lor.

Hans Christian Gram (medic danez)

Coloratia Gram

Tehnica de colorare 1. Frotiul fixat este acoperit cu violet de gentiana : 1-2

min. (Se spală cu apă de la robinet ). 2. Se acopera cu o solutie de lugol pentru mordansare, 2

min. (Se spală cu apă). 3. Decolorare cu alcool-acetona timp de 20 sec, pina nu se

mai dizolva colorant. (Se spală cu apă). 4.Se recoloreaza cu fuxina diluata/ safranina , 2 min.( Se

spala cu apa ) Se usuca frotiul si se examineaza cu imersie.

Germenii gram + -rezista la decolorare -isi mentin culoarea albastru violet initiala

Germenii gram – -se decoloreaza si se recoloreaza in rosu cu

fuxina/safranina.

Coloratia Gram stanga:bacterii gram + dreapta:bacterii gram-

colorate-violet colorate-rosu

n Diferenta de comportament in coloratia Gram se explica prin structura si compozitia chimica diferita a peretelui celular la bacteriile gram+ si gram -.

n Peretele celular la bacteriile Gram pozitive n  Este gros de 15-50 nm ,dar are structura mai

simpla n  Este format din pana la 40 de straturi suprapuse

de peptidoglican dar si acizi teichoici atasati de peptidoglican

n  Acizii teichoici au rol in aderarea bacteriilor de celule epiteliale ale mucoaselor si sunt antigene de suprafata ale bacteriilor gram pozitive, inducand anticorpi specifici de specie (anticorpii pemit identificarea bacteriilor ,diagnosticul indirect al bolilor infectioase si protectie fata de reinfectia cu bacteria respectiva)

Peretele celular la bacteriile Gram negative

n Este subtire dar are o structura mai complexa

n Compozitie chimica:peptidoglican in proportie redusa ,glucide,lipide, proteine in cantitate mare

n Este multistratificat:detine peptidoglica,strat lipoproteic ,membrana externa , lipopolizaharid(LPS)

n  Lipopolizaharidul – este format dintr-o componenta lipidica- lipidul A si o componenta polizaharidica si lanturi oligozaharidice la exterior

n  Lipidul A este endotoxina la bacteriile Gram negative

n  Este responsabila de toxicitate , de fenomene toxice care apar in infectiile cu bacterii Gram negative:febra,diaree, greturi varsaturi,scaderea tensiunii arteriale

n  Lanturile oligozaharidice laterale – proemina la suprafata bacteriei ca spini si sunt in numar mare

n  Reprezinta Antigenul O responsabil de specificitatea bacteriilor Gram negative

Christian Gram recognized two different types of bacteria based on reaction to certain staining procedure.

Coloratia Gram permite constituirea urmatoarelor grupe de bacterii:

-  COCI GRAM+ : -  Streptococi -  Stafilococi Pneumococi -  COCI GRAM - : -  Meningococ -  Gonococ -  BACILI GRAM+ : -  Bacillus antracis ( bacilul carbunos), -  Corynebacterium diphteriae ( bacilul

difteric) Clostridium botulinum ( bacilul botulinic) Clostridium tetani ( bacilul tetanic)

n  BACILI GRAM - : - E. Coli ( bacilul coli ) - Klebsiella -Pseudomonas ( bacilul piocianic) -Salmonella typhi ( bacilul tific ) n  COCOBACILI GRAM - : - Haemophilus influenzae - Bordetella pertusis - Brucela

Coci Gram +, dispusi in gramezi

COCI GRAM+ STAPHYLOCOCCUS AUREUS(coci,asezare in gramezi,ciorchine de strugure)

COCI GRAM + STREPTOCOCCUS PNEUMONIE

coci lanceolati , in diplo , capsula unica pentru ambii coci

Coci Gram+, dispusi in lanturi(streptoccocus pyogenes))

Bacili Gram – E.Coli (bacil cu capete rotunjite)

Cocobacili gram- Haemophilus infuenzae

Bacili gram- (diplobacili) Klebsiella

Frotiu lcr colorat Gram bacilul carbunos gram+,bacili cu capetele taiate

drept

n Bacil carbunos-prezenta endosporilor n Baci gram+

Trusa comerciala pt coloratia Gram 1.Violet de gentiana 2.Solutie de lugol 3.Alcool-acetona 4.Fuxina diluata/safranina