Guía Para La Utilización de Muestras Biológicas

7/25/2019 Gua Para La Utilizacin de Muestras Biolgicas

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para lautilizacin

de muestras

biolgicas enInvestigacin

Biomdica

GUA PRCTICA


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I. PANORAMA GENERAL1. Estado de la cuestin sobre investigacin biomdica con muestras biolgicas2. Marco tico y jurdico general


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I. Panorama general

1. ESTADO DE LA CUESTIN

SOBRE INVESTIGACIN BIOMDICACON MUESTRAS BIOLGICAS

Cada vez ms, y en especial a partir de los enormes avances de la Genmica, Pro-

temica y Transcriptmica, disponer de muestras humanas debidamente registradas y

almacenadas se ha convertido en una imperiosa necesidad para la investigacin bio-

mdica.

Cul es la situacin real con la que nos enfrentamos en Espaa actualmente con

respecto a la obtencin, el almacenamiento y la cesin de muestras para estudios bio-

mdicos? El Instituto Roche realiz una encuesta como trabajo previo al desarrollo de

esta gua para detectar cul era la prctica habitual en los diferentes centros espao-

les. De esta encuesta, a pesar de lo reducido del muestreo, se pueden obtener algu-

nas conclusiones bastante fiables. Sobre esta base se repasarn las condiciones de

los biobancos en Espaa.

A saber, ms del 80% de los biobancos de muestras humanas existentes se ubi-

can en hospitales y, dentro de ellos, un 40% aproximadamente corresponden a co-

lecciones de Anatoma Patolgica, el otro 40% al almacenaje de muestras para es-

tudios genticos, y el 20% restante son colecciones vinculadas a departamentos

de investigacin.

Naturalmente, las colecciones vinculadas a Anatoma Patolgica almacenan teji-

dos y, en menor medida, ADN/ARN, mientras que en los biobancos la proporcin se

invierte. Curiosamente, en pocos casos se almacenan clulas, incluidos los precur-

sores hematopoyticos, algo que seguramente variar rpidamente en los prximos

aos gracias al inters creciente por la terapia celular y la Medicina Regenerativa.

Un punto relevante es que los biobancos almacenan muchas ms muestras de las

que sirven, lo que indica que en gran medida una de las principales tareas de un bio-

banco y que marca su nivel de excelencia, consistente en el intercambio de sus mues-

tras para la investigacin, no se est cumpliendo.

Es importante detenerse en este aspecto porque lo que diferencia a un biobanco de

una coleccin inerte es que el primero intercambia con otras instituciones cientficas

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el material que posee, que debe aumentar y mejorar constantemente, y el segundo se

limita a ser un reservorio de muestras.

Con referencia a la recepcin/cesin de muestras, se debe sealar tambin que to-

dava un porcentaje importante de usuarios utiliza sus propios medios para el transpor-

te de las mismas, algo que demuestra la falta de controles y de rigor en el traslado. En

este mismo sentido, pero an ms grave, se encuentra el hecho de que alrededor del

60% de las instituciones no requiere ningn certificado de transporte para mandar o

recibir muestras, aspecto clave para su correcta preservacin y que est ampliamente

legislado en otros pases.

Cuatro elementos que informan sobre las condiciones de un biobanco son la estan-

darizacin de los protocolos que utiliza, la forma en la que codifica e identifica las mues-

tras, el rigor con el que utiliza los consentimientos informados y la cualificacin de su

personal. Se revisar a continuacin qu aporta la encuesta sobre estos aspectos.

En general, los distintos biobancos analizados poseen una variedad importante

tanto de mtodos de congelacin como de recipientes para su realizacin, incluso

un porcentaje importante utiliza sistemas de congelacin programables. Lo mismo

puede decirse de la disponibilidad de arcones y contenedores para el mantenimien-

to de las muestras. La variedad es mayor respecto de la forma de almacenar las

muestras, la disponibilidad de contenedores para el traslado o las medidas de se-

guridad de los arcones (por ejemplo, no todos disponen de alarma de aporte de CO 2

y pocos utilizan alarmas remotas por cable o telefnicas, red SAI, o bien vigilantes

de seguridad).

Aunque un porcentaje alto de los biobancos y colecciones tiene programas de con-

trol de calidad, ms de un tercio de los centros de investigacin carece de ellos y slo

alrededor del 60% de los distintos tipos de establecimientos que almacenan muestras

humanas tienen intencin de obtener una certificacin de calidad.

En este mismo sentido, un porcentaje notable de colecciones posean mtodos de

identificacin manual y no todos los establecimientos disponen de aplicacin inform-

tica para el control de los datos, ni de la funcin de adjudicacin del lugar de la mues-tra en el arcn o de comunicacin con otros bancos, ni de conexin a programas de

gestin clnica.

Es preocupante que aproximadamente un tercio de los bancos no posean consenti-

mientos informados que autoricen la obtencin y el almacenamiento de las muestras.

Slo en los bancos vinculados a pruebas genticas este porcentaje disminuye consi-

derablemente. An peor es que, incluso existiendo tales consentimientos informados,

no siempre ni mucho menos se utilizan. Por el contrario, es tranquilizador que las

muestras almacenadas en los centros de investigacin son en un 100% anonimizadas.

Tambin inquieta la escasa dedicacin prestada por los responsables de los bancosa los mismos. El director o el jefe tcnico no dedican en exclusividad ms del 10-20%

de su tiempo a las tareas vinculadas al banco. Este hecho refleja el escaso inters que

GUA PRCTICA PARA LA UTILIZACIN DE MUESTRAS BIOLGICAS

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muestran los centros/hospitales por estos establecimientos a los que vinculan bsica-

mente con la investigacin y, por ello, en los centros de investigacin la dedicacin se

duplica. Por otra parte, parece importante la necesidad de aumentar la formacin del

personal que trabaja en el banco, salvo en el caso nuevamente de los centros de in-

vestigacin.

Se cierra este repaso comentando otros dos aspectos acerca de la realidad de los

biobancos en Espaa. Incluso en los centros de investigacin, la actividad vinculada

con los bancos medida en forma de publicaciones o patentes no es muy alta. Tampo-

co parecen estar muchos bancos particularmente interesados en fomentar la donacin

de muestras o en la obtencin de otras nuevas, aspecto clave para el buen funciona-

miento del banco como antes se mencionaba.

Es evidente que, aunque los biobancos son elementos cuya importancia para la in-

vestigacin biomdica se reconoce cada da ms, necesitan todava un impulso an

mayor. Es fundamental modernizar sus instalaciones, especialmente sus sistemas de

alarma y de control, mejorando los controles de calidad y la preparacin de sus tcni-

cos, adems de aumentar el tiempo de dedicacin que prestan estos ltimos a los ban-

cos. Su colaboracin con otros biobancos o su funcionamiento en red es capital para

la expansin de estos establecimientos. Y todo ello requiere un sistema de acredita-

cin que defina qu es y qu no es un biobanco, y que seale las competencias de

aquellos que realmente lo sean frente a otros que no constituyan ms que meras co-

lecciones.

No es fcil definir un biobanco. Se puede aventurar una definicin que, al menos, en-

cierre muchos de los elementos esenciales que aqu se han sealado. Se podra definir

un biobanco como un establecimiento pblico o privado, sin nimo de lucro, que aco-

ge una coleccin de muestras biolgicas organizada como una unidad tcnica con cri-

terios de calidad, orden y destino con fines diagnsticos o de investigacin biomdica.

En esta definicin se enfatizan tres aspectos que han de presidir la vida del biobanco:

gratuidad, ordenacin cientfica de las muestras y un procedimiento tcnico de calidad

que asegure la idoneidad de la obtencin y del mantenimiento de las mismas.

2. MARCO TICO Y JURDICO GENERALUna muestra biolgica humana es una parte del cuerpo humano separada del mis-

mo que alberga cidos nucleicos y que contiene la dotacin gentica caracterstica de

una persona. Sus caractersticas son: 1) es una parte del cuerpo; 2) est separada del

mismo; 3) alberga la dotacin gentica caracterstica de una persona. La muestra bio-

lgica es, pues, un soporte de datos y una parte del cuerpo.

Los datos que potencialmente se pueden obtener de las muestras presentan unas

caractersticas especficas que los hacen diferentes de los datos de salud en gene-

ral. As pues, pueden ofrecer informacin sobre predisposiciones a enfermedades in-cluso en personas asintomticas e incidir sobre las personas asintomticas, a veces,

inesperadamente; son constantes a lo largo de toda la vida e incluso se pueden ob-

Panorama general

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tener tras el fallecimiento. Por otra parte, se heredan, lo cual significa que se com-

parten al menos potencialmente con la familia biolgica y se pueden transmitir a

la descendencia. Tanto la familia biolgica como la pareja con la que se piensa tener

descendencia pueden mostrar inters en conocer esta informacin, lo que podra im-

plicar un conflicto de intereses o condicionar las decisiones del sujeto del que se ob-

tienen.

Lo cierto es que este material es una herramienta fundamental en la investigacin bio-

mdica que se puede obtener con una extraccin (bien con una primera finalidad cl-

nica, bien con una finalidad exclusiva de donacin para la investigacin) o recurriendo

a muestras histricas, es decir, a las que ya estn almacenadas.

En efecto, este material se viene recogiendo y almacenando en los laboratorios y hos-

pitales con fines de donacin, terapia, diagnstico e investigacin. Algunas de estas

colecciones han sido objeto de regulacin jurdica con el objetivo fundamental de ga-

rantizar la proteccin de la salud humana.

Todo el proceso de utilizacin de estas muestras, su obtencin, conservacin y ce-

sin, tiene implicaciones para los derechos de los sujetos y plantea cuestiones a las

que el ordenamiento jurdico debe dar respuesta.

No existe, por el momento, en el ordenamiento jurdico espaol ninguna legislacin

especfica que regule la utilizacin de muestras humanas con fines de investigacin

biomdica. No obstante, s se ha regulado la utilizacin de partes del cuerpo separa-

das del mismo con finalidades teraputicas, reproductivas y de trasplante. Esta norma-

tiva est experimentando un proceso de actualizacin a partir de la adecuacin a las

recientes directivas europeas.

Valgan como ejemplos:

El Real Decreto 411/1996, de 1 de marzo, por el que se regulan las actividades re-

lativas a la utilizacin de tejidos humanos.

El Real Decreto 413/1996, de 1 de marzo, por el que se establecen los requisitos

tcnicos y funcionales precisos para la autorizacin y la homologacin de los cen-tros y servicios sanitarios relacionados con las tcnicas de reproduccin humana

asistida.

El Real Decreto 2070/1999, de 30 de diciembre, que regula la obtencin y la utili-

zacin clnica de rganos humanos para la donacin y el trasplante.

El Real Decreto 1088/2005, de 16 de septiembre, por el que se establecen los re-

quisitos tcnicos y condiciones mnimas de la hemodonacin y de los centros y ser-

vicios de transfusin.

El Real Decreto 223/2004, de 6 de febrero, por el que se regulan los ensayos clni-

cos con medicamentos.

El Real Decreto 65/2006, de 30 de enero, por el que se establecen requisitos para

la importacin y exportacin de muestras biolgicas. La Orden SCO/393/2006, de 8 de febrero, por la que se establece la organizacin

y funcionamiento del Banco Nacional de Lneas Celulares.


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La Directiva 2004/23/CE, de 31 de marzo de 2004, relativa al establecimiento de

normas de calidad y de seguridad para la donacin, la obtencin, la evaluacin,

el procesamiento, la preservacin, el almacenamiento y la distribucin de clulas

y tejidos humanos, cuya transposicin representar la modificacin de algunas

de las normas anteriores y la introduccin de otras nuevas.

No obstante, el Gobierno de la Nacin ha anunciado la prxima remisin a las Cor-

tes Generales del Proyecto de Ley de Investigacin Biomdica, donde entre otras

materias se abordar de forma especfica el rgimen de los anlisis genticos, las

muestras biolgicas y los biobancos.

En todas estas normas se exige el respeto a los derechos de los sujetos y, en con-

creto, a su integridad fsica y a la proteccin de sus datos de carcter personal.

A partir de esta situacin, la identificacin de las prescripciones jurdicas que de-

ben guiar a los investigadores que utilicen en sus investigaciones muestras biolgi-

cas exige un doble ejercicio: por una parte, la aplicacin por analoga en determina-

dos aspectos de las normas especficas citadas sobre la util izacin de partes del

cuerpo con otras finalidades; y por otra parte, la proyeccin de normas ms genera-

les hacia esta materia concreta.

Estas normas generales son las que se refieren al marco de los derechos de los pa-

cientes y usuarios del sistema de salud: la Ley 14/1986, de 25 de abril, General de Sa-

nidad, el Convenio de Derechos Humanos y Biomedicina del Consejo de Europa (que

entr en vigor en Espaa el 1 de enero del ao 2000); y la Ley 41/2002, de 14 de no-

viembre, bsica reguladora de la autonoma del paciente y de los derechos y obliga-

ciones en materia de informacin y documentacin clnica (as como las normativas au-

tonmicas correspondientes). A stas se ha de unir la legislacin sobre proteccin de

datos que contempla un rgimen especfico para el tratamiento de los datos de salud

(Ley Orgnica 15/1999, de 13 de diciembre, de Proteccin de Datos, de Carcter Per-

sonal y Normativa de Desarrollo).

Adems, desde los organismos internacionales se viene trabajando en los ltimos

aos en la redaccin de documentos de distinta naturaleza sobre esta cuestin,que son una gua muy valiosa para la interpretacin del marco normativo existente.

Cabe destacar la Declaracin Universal sobre los Datos Genticos Humanos de la

UNESCO, de 16 de octubre de 2003, y la Recomendacin (2006) 4 del Consejo de

Europa, sobre investigacin con material biolgico de origen humano, de 15 de mar-

zo de 2006, que ser la base para un futuro protocolo al Convenio de Derechos

Humanos y Biomedicina.

Por lo que se refiere a la regulacin en otros pases, son pocos los europeos con una

normativa especfica sobre la utilizacin de muestras biolgicas y biobancos para la in-

vestigacin cientfica (Islandia, Noruega y Dinamarca cuentan con leyes de 2002, 2003

y 2004, respectivamente; en Francia se tratan algunas cuestiones en la ley de 2004 re-lativa a la Biotica). Previsiblemente, esta tendencia hacia la regulacin se consolidar

a la vista del inters por este asunto, que se plasma en que algunos comits naciona-

Panorama general

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les de tica lo han tratado en extensos informes: Reino Unido (Human tissue and bio-

logical samples for use in research, 2001), Alemania (Biobanken, 2004), Francia (Pro-

blmes thiques poss par les collections de matriel biologique et les donnes din-

formation associes: biobanques, biothques), e Irlanda (Human Biological Material. Re-

commendations for collection, use and storage in research, 2005).


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para lautilizacin

de muestras

biolgicas enInvestigacin

Biomdica

GUA PRCTICA


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II. EL PROCESO DE UTILIZACIN DE LA MUESTRA1. Origen

2. Obtencin2.1. Procedimientos tcnicos para la obtencin de las muestras biolgicas de origen humano2.1.A. Tumores y tejidos sanos2.1.B. Clulas2.1.C. Fluidos

2.2. El respeto de los derechos de los pacientes en la obtencin de las muestras2.3. La gratuidad de la donacin

3. Preparacin de las muestras3.1. Procedimientos tcnicos para la preparacin de las muestras

3.1.A. Tejidos y tumores3.1.B. ADN y ARN3.1.C. Clulas3.1.D. Fluidos

3.2. El respeto de los derechos del paciente relativos al uso de las muestras

4. Conservacin4.1. Procedimientos tcnicos para la conservacin de las muestras

4.1.A. Tejidos y rganos4.1.B. ADN y ARN4.1.C. Clulas4.1.D. Fluidos

4.2. El respeto de los derechos de los pacientes durante la conservacinde las muestras

4.2.A. Diferenciacin entre muestras segn su relacincon un sujeto identificado o identificable

4.2.B. Confidencialidad

4.2.C. Derecho a no saber4.2.D. Derechos de acceso y rectificacin4.2.E. Periodo de conservacin


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5. Circulacin

5.1. Aspectos tcnicos del transporte de muestras biolgicas5.1.A. Legislacin aplicable

5.1.B. Envo de muestras5.1.C. Identificacin

5.1.D. Clasificacin de las muestras para el envo5.1.E. Empaquetado

5.1.F. Etiquetado

5.1.G. Documentacin para el envo de mercancas peligrosas5.1.H. Aspectos particulares para cada tipo de muestra

5.2. La regulacin jurdica de la importacin y la exportacin de muestras5.2.A. Entrada

5.2.B. Salida5.3. Cautelas sobre el tratamiento de datos de carcter personal en la transferenciainternacional de muestras biolgicas identificadas o identificables

6. Cesin de muestras para otros investigadores6.1. Usos de las muestras para investigacin6.2. Gestin de las peticiones de material6.3. Aplicacin de los principios de proteccin de datos de carcter personal

en la cesin de las muestras

7. Procesamiento. Implicaciones jurdicas del uso de la muestra8. Prcticas de seguridad

8.1. Condiciones de trabajo8.2. Proteccin de las muestras

8.3. Tratamiento de residuos8.3.A. Segn el tipo de residuo8.4. Listado de medidas preventivas

9. Explotacin de los resultados de la investigacin9.1. La relacin con el paciente9.2. El marco jurdico aplicable9.3. Se puede patentar un producto derivado de una muestra biolgica?9.4. La cuestin del consentimiento como posible requisito de patentabilidad9.5. La propiedad de la patente del producto derivado de la muestra:

la distribucin de beneficios econmicos9.6. La comercializacin de las muestras

10. Recomendaciones para la estructuracin y funcionamiento de un biobanco


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II. El proceso de utilizacinde la muestra

1. ORIGENLa determinacin del tipo de muestras que se precisan en la investigacin es un

primer paso fundamental para que el proceso de utilizacin posterior sea gil y ra-cional.

Si se considera que los biobancos deberan ser, de forma ideal, los establecimien-tos ms idneos para almacenar y distribuir las muestras biolgicas obtenidas con fi-nes de investigacin, sus caractersticas tcnicas ms idneas seran las siguientes:

1) En primer lugar, conviene definir el tipo de banco que puede ser independiente oestar asociado con otros bancos; en el segundo caso, cada banco est asociado a unared, con lo que sus procedimientos estarn regulados por los procedimientos consen-suados por la red.

2) En segundo lugar, conviene fijar los criterios de seleccin de las muestras: es re-comendable que cada banco establezca, con antelacin y basndose en sus objetivos,los criterios de seleccin de las muestras que tengan inters para su archivo entre aque-llas en las que:

- Exista material sobrante de estudios diagnsticos.- Se cuente con consentimiento informado expreso del paciente.

- El tiempo transcurrido entre la extraccin y la conservacin se ajuste a los estn-dares de calidad de cada tipo de muestra.

Estos criterios tpicamente se relacionan con el inters y la finalidad del banco o delos grupos que utilizan o que se prev que utilizarn las muestras almacenadas. Aun-que el criterio empleado puede ser en principio almacenar todas las muestras que,cumpliendo los criterios anteriores, lleguen al banco, hay que considerar que el man-tenimiento de un archivo con escasa utilizacin supone un coste variable que, depen-diendo de los formatos en los que se archiven las muestras, puede suponer unasobrecarga econmica importante para la institucin.

En el caso de decidir almacenar indiscriminadamente todas las muestras, habr cier-tamente que contar con una gran capacidad de almacenamiento. Por otro lado, los cri-terios empleados para que una muestra sea seleccionada para su archivo en el banco

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deben ser difundidos de forma clara a todos los que participan en su procesamientodesde la obtencin de la muestra hasta el final del procedimiento. Conviene resear laconveniencia, siempre que sea posible, de archivar muestras patolgicas (por ejemplo,tejido tumoral) y su contrapartida normal, imprescindible para muchos estudios. Cuan-do esto ltimo no sea posible, puede plantearse la toma de muestras de clulas de lamucosa bucal del paciente con una torunda y que se laven en un medio adecuado parasu posterior almacenamiento.

En resumen, conviene decidir cuanto antes cul ser el objetivo de cada banco y estodeterminar el criterio de seleccin de material:

Coleccin indiscriminada de muestras. Coleccin restringida a ciertos tipos de muestras. Coleccin de series limitadas de casos (ensayos clnicos). Coleccin de patologas concretas: cardiovasculares, neurodegenerativas, cncer, etc.

Cuando se pretenda un almacenamiento restringido de determinadas patologas parainvestigacin, sera recomendable considerar entre ellas aquellos tipos por los que exis-ta un conocido inters en la institucin.

2. OBTENCIN

A continuacin se estudian, en primer lugar, los procedimientos tcnicos para la ob-tencin de muestras en funcin de que se trate de tejidos, clulas o fluidos; en segun-do lugar, se describen los criterios que se deben respetar en relacin con los derechosde los sujetos fuente en esta fase.

2.1. Procedimientos tcnicos para la obtencin de las muestrasbiolgicas de origen humano

2.1.A. Tumores y tejidos sanos

A.1. Rapidez y forma de obtencin

La calidad de las muestras depende en gran medida de la rapidez y de la forma de ob-tencin, as como del procesamiento y del tipo de transporte hasta llegar al banco de te-jidos. Adems, debido a la enorme variabilidad biolgica, algunos tipos de tejidos y detumores pueden necesitar un tratamiento individualizado. Estas variables son especial-mente importantes cuando se pretende la extraccin y el posterior uso del ARN. Por ello,es recomendable un inmediato traslado de las muestras, en especial las obtenidas porprocedimientos quirrgicos, punciones y biopsias, desde el lugar de obtencin hasta elservicio en el que se van a realizar los estudios diagnsticos (por ejemplo, Anatoma Pa-tolgica o Hematologa) donde se efectuar la toma de la parte de la muestra exceden-

te del diagnstico para su archivo en el banco de tejidos. Esto requiere la coordinacincon el personal que realizar el traslado de las muestras. El envo de las mismas, una vezobtenidas, se debe hacer preferentemente en condiciones de esterilidad y en fresco.


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A.2. Tiempos desde la extraccin a la conservacin

Se debe establecer un mximo de tiempo desde la extraccin quirrgica hasta la con-gelacin a partir del cual el material se rechazar. Este tiempo puede variar con el tipo detejido y el objetivo para el cual se ha obtenido (extraccin de ARN, ADN, protenas, histo-loga, etc.). Como regla general, toda muestra que haya tardado ms de dos horas en esteproceso y que haya estado a temperatura ambiente debe ser descartada. En el caso deextraer ARN, el estndar de calidad se sita en un tiempo menor de 30 minutos. Estostiempos varan con el tipo y el tamao del tejido. La entrada de la muestra en la base dedatos debera recoger el tiempo transcurrido desde su extraccin hasta su congelacin.

A.3. Requisitos de la toma de muestras

La toma de muestras para el archivo en el banco de tejidos debe cumplir los siguien-tes requisitos:

1) No puede interferir ni con el diagnstico histopatolgico, citomorfolgico, fenot-pico o molecular del caso, ni con el uso para otro tipo de fines primordiales para el pa-ciente, como la evaluacin de los parmetros pronsticos; en otras palabras, slo sepodr utilizar para el archivo el material excedente del utilizado para los fines anterior-mente citados.

2) Con el objetivo de asegurar lo recogido en el punto anterior, la toma de la muestrapara el banco de tejidos la realizar una persona cuya capacitacin lo garantice.

3) La toma se realizar garantizando la calidad del procedimiento para asegurar suutilidad futura.

En principio, y con el objetivo de que las muestras almacenadas puedan ser estu-diadas mediante todos los mtodos diagnsticos y de investigacin que estn dispo-nibles o que se pudieran aplicar previsiblemente, stas se deberan recoger y mani-pular en condiciones de esterilidad y, aunque esto sea deseable, con frecuencia no sepuede garantizar, lo que no debe impedir que se tomen las mayores precauciones para

evitar la contaminacin del tejido de inters. En este apartado se har referencia es-pecfica a las recomendaciones para los diferentes tipos de muestras, segn su pro-cedencia, siempre y cuando existan aspectos especiales que se deban resolver.

2.1.B. Clulas

Si se trata de clulas, se pueden diferenciar dos tipos de muestras segn su ori-gen: clulas ex vivo y lneas celulares derivadas de ellas.

Aunque las clulas ex vivo son, generalmente, ms difciles de obtener que las l-neas celulares, en muchos casos son la nica opcin, por ejemplo, cuando no se

dispone de una lnea establecida que mimetice las condiciones celulares del orga-nismo o su estado fisiolgico, o siempre que se pretenda su utilizacin con finesdiagnsticos.

El proceso de utilizacin de la muestra

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Tambin, en el caso de estudios sobre patologas, la fuente de la muestra es gene-ralmente ex vivo, si bien de muchos tipos celulares, principalmente tumores, de dondese pueden derivar lneas celulares.

En cualquier caso, cuando sea posible y el tipo de ensayo lo permita, la facilidad demanejo y la reproductividad de los resultados aconsejan el empleo de lneas celulares,aunque siempre ser una situacin no exactamente igual a la condicin ex vivo.

De hecho, se han realizado importantes avances en la generacin de lneas celularespara investigacin y, actualmente, es un reto su utilizacin con fines teraputicos o re-generativos. De esta forma, se han obtenido lneas tumorales o procedentes de distin-tas patologas, lneas de clulas y tejidos sanos y, ms recientemente, lneas derivadasde clulas troncales embrionarias y adultas.

B.1. Aislamiento de clulas ex vivo

Un primer paso para la obtencin de clulas ex vivo consiste en obtener una suspen-sin de clulas individualizadas. En los casos en los que la muestra proceda de fluidoscorporales (sangre, orina, lquido peritoneal, etc.), las clulas se encuentran ya en sus-pensin y no es necesaria su preparacin.

B.1.1. Preparacin de suspensiones de tejidos slidos

1) Mtodos fsicos: determinados tipos celulares se encuentran dbilmente unidosal resto de las clulas presentes en los rganos, por ejemplo, las clulas linfoides. Enestos casos, es posible su liberacin y la recuperacin mediante la simple disgregacinmecnica del rgano en un medio o tampn adecuado, por ejemplo el medio de culti-vo RPMI 1640 + 5% de FCS. La disgregacin mecnica se puede realizar mediante lafragmentacin del tejido con pinzas o tijeras, y pasando los fragmentos repetidamen-te por una pipeta o aguja, o bien mediante el empleo de un homogeneizador.

2) Mtodos enzimticos: en muchos casos, la presencia en el tejido de uniones ce-lulares (tejidos epiteliales) o de una matriz extracelular (tejidos conectivos) hace nece-

saria una digestin enzimtica para liberar las clulas. Las enzimas utilizadas son: co-lagenasa, tripsina, elastasa, hialuronidasa, papana, ADNasa. En lneas generales, elprocedimiento a seguir consiste en:

- Fragmentacin del tejido en piezas pequeas.- Lavado de los fragmentos en el tampn o un medio adecuado.- Digestin con la mezcla de enzimas elegida en el medio adecuado.- Disgregacin del tejido mediante pipeteo o pasndolo a travs de una jeringa.- Filtrado de la suspensin.- Lavado de las clulas.- Recuento y estimacin de la viabilidad celular.

En este tipo de procedimientos, es necesario optimizar las concentraciones de enzi-mas y el tiempo de digestin, teniendo en cuenta que muchos preparados comercia-les varan de lote a lote. La eleccin de la mezcla de enzimas adecuada depende del


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tipo de muestra y, para cada muestra en concreto, es importante remitirse como refe-rencia a mtodos previamente utilizados y que aseguran, por lo tanto, cierta reprodu-cibilidad.

Por su parte, la eleccin del tampn o del medio de digestin debe ser compatiblecon las diferentes actividades de la mezcla enzimtica.

Como consideracin general, es primordial tener en cuenta que los preparados en-zimticos comerciales presentan diferentes actividades y grados de toxicidad. Es im-portante, por consiguiente, evaluar el rendimiento y la viabilidad de las clulas obte-nidas, por ejemplo, mediante la tincin con azul tripn y el recuento en un hemoci-tmetro.

La suspensin resultante debe quedar lo ms libre posible de clulas muertas, res-tos celulares y restos de tejido sin digerir. Es una buena medida la incorporacin de laADNasa en la digestin, ya que el ADN liberado densifica el medio, entorpeciendo elprocesamiento y disminuyendo su rendimiento. No deben omitirse, por consiguiente,los pasos de filtrado y lavado de la suspensin celular obtenida.

La suspensin resultante debe mantenerse en fro y procesarse para lo que sea me-nester (anlisis, almacenamiento, fijacin o aislamiento celular) lo ms rpidamenteposible.

B.1.2. Aislamiento de tipos celulares

Una vez obtenida la suspensin celular del tejido, existen diferentes aproximacionespara aislar o enriquecer las clulas de inters.

En primer lugar, se debe decidir la pureza del tipo celular concreto que se necesitapara la finalidad perseguida. Es necesario, igualmente, evaluar la relevancia en la mues-tra final de otros tipos celulares no deseados y presentes en el tejido inicial, que pue-den quedar como contaminantes y alterar o entorpecer los objetivos. Por ejemplo,para un determinado estudio que parte de una suspensin que contiene clulas de tipo

A, B y C, podra ser importante que la suspensin final contuviera clulas A pero nun-ca B, aunque la presencia de clulas C sea indiferente.

En funcin de las necesidades concretas se debe decidir, por consiguiente, qumtodo proporciona un mayor rendimiento con respecto a las clulas de inters y ala pureza requerida, resultando discriminatorio para las clulas no deseadas. En estesentido, es importante realizar estudios previos (anlisis histolgico, citometra deflujo, etc.) que orienten sobre la frecuencia en la muestra de las clulas de intersfrente a las clulas no deseadas, lo que permitira una mejor relacin pureza-rendi-miento.

En funcin de estos criterios, se puede optar por diferentes tcnicas que em-plean como parmetro diferencial distintas propiedades de las clulas objeto del ais-lamiento:


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1) Mtodos fsicos (centrifugaciones): cuando las diferentes clulas de la mues-tra tienen claras diferencias de densidad, la centrifugacin en gradiente de densi-dad es muy til para su aislamiento. No obstante, es difcil pensar que se puedaobtener una poblacin celular pura por esta tcnica, pero puede resultar muy tilpara eliminar de la muestra algunas clulas no deseadas (como los eritrocitos enlas muestras de sangre) o para preenriquecer la suspensin en las clulas de inte-rs, por ejemplo, como ocurre en el enriquecimiento en clulas dendrticas a partirdel bazo.

2) Parmetros fisiolgicos: en muchas ocasiones, es posible discriminar diferen-tes tipos de clulas en funcin de sus propiedades fisiolgicas, como son la adhe-rencia al sustrato o las condiciones de crecimiento en el cultivo. Mediante la incuba-cin de la suspensin celular en plstico u otras superficies, se pueden separar lasclulas adherentes de las no adherentes o las clulas con distinto grado de adhesin.Existen numerosos ejemplos de esta aplicacin, entre ellos:

- La separacin de clulas T de los ganglios linfticos en la columna de nailon.- La separacin de macrfagos y de clulas dendrticas de los rganos linfoides.

Tambin es factible separar las clulas epiteliales de los fibroblastos, en un cultivoprimario, mediante la digestin suave con proteasas (por ejemplo, tripsina). Por otraparte, en numerosas ocasiones se puede enriquecer una muestra en un tipo celularconcreto mediante el cultivo primario en condiciones que favorezcan su crecimiento osupervivencia frente al resto. Por ejemplo, para cultivos de clulas tumorales o tronca-les un procedimiento habitual consiste en cultivar un explante o una suspensin celu-lar total bajo determinadas condiciones en las que las clulas tumorales o las tronca-les acaban siendo seleccionadas en el cultivo gracias a su mayor capacidad de super-vivencia y proliferacin.

3) Utilizacin de la expresin diferencial de molculas superficiales (tcnicas deinmunomarcaje): actualmente, estas tcnicas suelen ofrecer el mayor grado de pure-za de la muestra y permiten la exclusin de tipos celulares muy concretos. Implican ladiscriminacin de las clulas en funcin de la expresin diferencial de las molculas su-perficiales, principalmente las protenas de membrana, que se pueden detectar con

ayuda de un reactivo especfico normalmente un anticuerpo, y tambin las lectinasy otras molculas. Los dos procedimientos principales son:- El empleo de anticuerpos o reactivos conjugados con sustancias fluorescentes que

son analizadas en un citmetro separador que permite la separacin de las clulasen funcin de este anlisis.

- El empleo de anticuerpos unidos a partculas magnticas que son retenidas en uncampo magntico.

Si bien las dos aproximaciones son similares, existen diferencias entre ambas queconviene remarcar. Por su naturaleza, el citmetro separador permite un anlisis mul-tiparamtrico al poder analizar diferentes fluorescencias y, por lo tanto, confiere la po-

sibilidad de combinar diferentes marcadores y definir la poblacin deseada con unagran especificidad, mientras que con un procedimiento de retencin en el campo mag-ntico solamente se puede distinguir marcado frente a no marcado y, por consiguien-


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te, las posibilidades de definir la poblacin deseada son ms restringidas. En general,las clulas sufren ms en el citmetro separador y, en consecuencia, pueden resultarms daadas o alteradas para posteriores anlisis.

En ambos casos, es importante asegurarse de que la expresin de los marcadoresutilizados sea verdaderamente diferencial entre las clulas deseadas y las no desea-das. A este respecto, hay que testar la especificidad y eficacia de los anticuerpos so-bre clulas frescas, evalundose previamente la muestra y el marcaje por citometra deflujo para determinar tanto la calidad del marcaje como lo discriminatorio que resulta yla frecuencia de clulas deseadas existente en la muestra.

Se debe tener en cuenta que las clulas obtenidas tienen unidos el anticuerpo o an-ticuerpos con los que se han marcado, por lo que siempre que sea posible es preferi-ble utilizar una seleccin negativa, es decir, marcar las poblaciones no deseadas y de-jar libre la fraccin no marcada. Esto, sin embargo, no es posible en muchas ocasio-nes, por lo que se debe considerar cul ser el efecto de la presencia del anticuerpoutilizado en la muestra final. Por ejemplo, muchos anticuerpos activarn en la clula lasmolculas a las que se han unido, lo que puede interferir en ensayos funcionales, etc.Existe tambin la posibilidad de liberar el anticuerpo unido, pero los mtodos necesa-rios para ello implican una mayor manipulacin y, por lo tanto, un mayor riesgo de es-tropear la muestra.

Independientemente del mtodo utilizado, una vez recuperadas las clulas, se ha deevaluar el rendimiento y la pureza obtenidos en el aislamiento.

4) Aislamiento de clulas observadas al microscopio (microdiseccin por lser):determinados estudios de Genmica o Protemica se pueden llevar a cabo en la ac-tualidad con mnimas cantidades de material. Con respecto a las muestras estudiadaspor microscopia, la microdiseccin mediante lser permite sealar la clula o clulasde inters directamente en la seccin observada y recortarla/s con ayuda de un l-ser, as como extraerla/s de la muestra para su anlisis posterior.

B.2. Lneas celulares

Como ya se ha indicado, la obtencin de lneas celulares de distinto origen constitu-ye una fuente importante de clulas con fines de investigacin. Aparte de su directageneracin, las lneas celulares se pueden obtener de colecciones; entre las ms com-pletas se encuentran:American Type Culture Collection (ATCC), National Cell CultureCenterdel NIH o European Collection of Cell Cultures (ECACC). Tambin se puedenobtener mediante la cesin de otro laboratorio, siendo sta una prctica habitual entreinvestigadores.

2.1.C. Fluidos

Los procesos que se realizan en los laboratorios deben garantizar la calidad de losresultados. Se sabe que las fases en las que se divide todo proceso analtico son tres:la preanaltica (hasta que la muestra llega a los analizadores o lugares de trabajo), la


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analtica (proceso de realizacin de la determinacin) y la postanaltica (desde el mo-mento en el que se tiene el resultado hasta que llega al mdico).

En estudios realizados por diversos autores sobre los errores en los resultados de loslaboratorios, que se sitan en un 0,81% de las determinaciones, se ha constatado queproceden en un 70-80% de la fase preanaltica, en un 6-13% de la fase analtica y enun 12-18% de la fase postanaltica. Al analizar las causas ms frecuentes de los erro-res de la fase preanaltica se ha observado que dos de las pruebas que presentan unporcentaje ms alto de problemas son los estudios de coagulacin y la velocidad desedimentacin globular (VSG).

Es necesario garantizar una adecuada calidad de la fase preanaltica, que va des-de la solicitud del anlisis hasta la recepcin en el laboratorio. Las dems fases ca-recern de sentido si no se hace correctamente la primera. En ella intervienen mu-chos mecanismos, organizaciones y personas que hacen difcil el control total de estafase.

Los laboratorios clnicos utilizan sistemas de transporte de muestras dado que tie-nen centros de extraccin perifricos o dado que envan algunas determinaciones aotros laboratorios. Dicho transporte debe regirse por una normativa tcnica muy bienestablecida con el fin de garantizar la estabilidad de las propiedades biolgicas de lasmuestras. Todas las organizaciones y personas que intervengan en el transporte demuestras biolgicas deben estar formadas y autorizadas segn el material que debantransportar.

Los fluidos o lquidos orgnicos ms habituales que se estudian en los laborato-rios son:

Sangre total: plasma y suero. Lquido pleural. Lquido pericrdico. Lquido asctico. Lquido cefalorraqudeo.

Lquido sinovial.Cada uno de estos lquidos posee un sistema peculiar de obtencin que requiere ha-

bilidad y que debe ser realizado por mdicos entrenados para ello, pues su incorrectarealizacin puede poner en peligro la vida de los pacientes.

Respecto de las muestras de sangre perifrica (SP) y aspirados de mdula sea (MO):

Las muestras de SP y/o aspirados de MO se deben recoger en tubos estriles quecontengan el anticoagulante suficiente y adecuado para permitir la posterior reali-zacin de los estudios de investigacin necesarios.

Es de inters para muchos tipos de investigacin biomdica que el biobanco reco-ja, adems del tejido especfico patolgico de un paciente, plasma y clulas san-guneas del mismo.


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Puede interesar la recogida de muestras de diferentes lquidos, incluidos orina, lqui-do cefalorraqudeo (LCR), lquido pleural, peritoneal o sinovial, e incluso de lavadosbroncoalveolares.

C.1. Rapidez y forma de obtencin

Conviene tener en cuenta, en el caso del estudio de parmetros bioqumicos de mues-tras sanguneas, que la extraccin del espcimen se debe realizar preferiblemente trasun periodo de al menos ocho horas de ayuno, en reposo y, como mnimo, una hora des-pus del ejercicio fsico. Las muestras lipmicas, que acontecen tras la ingesta, pue-den alterar diversas magnitudes. El estrs, el ejercicio y el tabaco influyen en numero-sas magnitudes de la hemostasia. Por este motivo, se debe procurar que la obtencinde muestras en las que se vayan a medir las magnitudes de la hemostasia se efecteen condiciones basales.

Es indispensable, asimismo, evitar las malas extracciones, para lo que se harn siem-pre a partir de una puncin limpia. La extraccin se puede efectuar mediante un tubode vaco, o bien mediante una jeringa con o sin palomilla. Es admisible una brevecompresin con torniquete. Tiempos de constriccin de un minuto seguidos de libera-cin del torniquete no tienen consecuencias sobre las concentraciones de los compo-nentes del suero y los factores de coagulacin del plasma. Cuando se usan mltiplestubos de recoleccin para obtener las muestras de sangre venosa, el tubo destinado alos exmenes de la coagulacin debera ser el segundo o preferiblemente el tercer tubo,a fin de minimizar la contaminacin con tromboplastina tisular liberada a raz de la pun-cin venosa. Cuando se obtiene una muestra de sangre, es imperativo poner atencinen asegurar la mezcla completa de la sangre con el anticoagulante; se inclinar suave-mente el tubo varias veces y se evitar as la formacin de espuma. No deben trans-currir ms de dos minutos entre el comienzo de la estasis venosa y la mezcla de la san-gre con el anticoagulante.

No se realizarn extracciones a travs de vas heparinizadas o catteres. Si no hu-biera ms remedio que utilizarlas, la cnula debe enjuagarse con una solucin salinaisotnica en una cantidad proporcional al volumen del catter. Se recomienda desechar

una cantidad de sangre equivalente a dos veces el volumen del catter. Habitualmen-te, los 5-10 mL primeros de sangre se debern desechar antes de la recoleccin delespcimen de sangre. La contaminacin de la muestra con heparina es uno de los ar-tefactos frecuentemente acontecidos en la prctica diaria.

La contaminacin de las muestras de laboratorio por soluciones de infusin intrave-nosa es la forma de interferencia preanaltica ms comn y frecuentemente ms rele-vante en los pacientes ingresados.

El tubo que ha de utilizarse para obtener plasma es el de citrato trisdico (0,105 mol/L)(3,2%). Se trata del anticoagulante estndar para la recoleccin de las muestras des-

tinadas a la realizacin de exmenes globales de coagulacin. Existen tubos con dis-tintas concentraciones de este anticoagulante que conducen a resultados diferentes.Se recomienda el uso de la concentracin al 3,2% de 0,105 mol/L. Se prefiere citrato


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tamponado a un pH de 5,5, ya que el pH de la mezcla (plasma y citrato) se aproximams al fisiolgico que el del no tamponado.

En los exmenes de coagulacin, tales como el tiempo de protrombina (TP) y el tiem-po de tromboplastina parcial (TTPA), el pH de la mezcla de reaccin se debera mante-ner preferentemente dentro de un intervalo de pH entre 7,10 y 7,35. La relacin nomi-nal de volumen de citrato y sangre es de 1:9. Si esta relacin se incrementa, es decir,si se recolecta menos sangre, la concentracin efectiva de anticoagulante aumenta.Esto se traduce en un aumento del valor del TTPA, especialmente si la relacin baja de1:7. Por el contrario, se precisa una correccin de la relacin anticoagulante/sangre enlos casos de poliglobulia cuando el hematocrito del paciente excede del 55%. En es-tos casos, los valores del TP y del TTPA se ven afectados debido a una reduccin delcompartimiento plasmtico por un aumento en el volumen de los eritrocitos, lo que con-duce a un exceso de citrato en el plasma. Este exceso de citrato prolonga el procesode coagulacin por insuficiencia de calcio. Una relacin de 1:10 puede ser la adecua-da en los casos de poliglobulia.

En la prctica diaria esta correccin de la proporcin citrato/sangre no suele ser muyoperativa, y, de no hacerse, en el informe analtico se har constar la posible interferen-cia de resultados en relacin con la poliglobulia.

Para la obtencin de los lquidos biolgicos se deben efectuar las siguientes punciones:

Lquido pleural: puncin pleural. Lquido pericrdico: puncin cardiaca. Lquido asctico: puncin peritoneal. Lquido cefalorraqudeo: puncin lumbar. Lquido sinovial: puncin articular.

Todas las punciones sern realizadas por personas entrenadas y en las mximas con-diciones de asepsia posibles.

C.2. Tratamientos individualizados

La sangre destinada a medir la concentracin de productos de degradacin de la fi-brina (PDF) en el plasma se debera recolectar en una mezcla que contuviese 10 U detrombina y 1.835 U de inhibidor tripsina de soja por mililitro de sangre. La trombinaconvierte el fibringeno residual en fibrina, ya que de otra manera se obtendra unaconcentracin de productos de degradacin de la fibrina falsamente elevada. La gene-racin de PDFin vitro, despus de la recoleccin de sangre, se impide, bien por el in-hibidor tripsina de soja, bien por la aprotinina, que tambin inhibe la enzima plasminageneradora de productos de degradacin de la fibrina. Por el contrario, la medicin dela concentracin del dmero D, que refleja la accin de la fibrinolisis, se puede realizarutilizando plasma citratado.

Se ha apreciado que, con fines de monitorizar el tratamiento con heparina no frac-cionada, el mejor anticoagulante es el citrato asociado a teofilina, adenosina, dipirida-


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mol (mezcla CTAD), puesto que previene la prdida de la heparina contenida en la mues-tra clnica, merced a una mayor estabilizacin plaquetaria, limitando la liberacin delfactor 4 plaquetario, que se observa cuando slo se utiliza el citrato. No obstante, laSociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia (ISTH) no recomienda por el mo-mento la implantacin generalizada de esta nueva mezcla en el laboratorio de coagu-lacin, por sus efectos sobre la razn normalizada internacional (INR), utilizada en lamonitorizacin del tratamiento anticoagulante oral.

C.3. Tiempos desde la extraccin a la conservacin

La conservacin de los especmenes en el tubo primario puede ser a temperatu-ra ambiente (20-25 C) y en condiciones de refrigeracin (4-6 C). En la Tabla I seselan las temperaturas aconsejables para cada magnitud. Las condiciones de esta-bilidad de algunas magnitudes biolgicas en espcimen y muestra han sido sorpren-dentes, muestran una aparente mayor estabilidad de la que se les vena adscri-biendo. En la Tabla II se especifican los datos de estas magnitudes. Parece claro queestos estudios en muchos casos son de valor limitado, bien sea por el nmero demuestras incluidas, bien sea por su limitacin a un tipo concreto de instrumentos.Por otro lado, se conoce cmo la estabilidad de una determinada magnitud no esigual en una muestra normal que en una patolgica.

Finalmente, no hay que olvidar que un mismo espcimen y muestra se puedenutilizar para realizar determinaciones de magnitudes di ferentes. Por esta razn,habr que asumir la menor estabil idad de las magnitudes que se vayan a analizar.Por todo ello, parece recomendable asumir las especificaciones sealadas en laTabla I.

2.2. El respeto de los derechos de los pacientes en la obtencinde las muestras

La utilizacin de material biolgico humano est condicionada por las tcnicas ne-cesarias para obtenerlo y por la voluntad del sujeto para acceder a su utilizacin cien-tfica. Las tcnicas para la obtencin de material biolgico pueden ser muy banales (re-

cogida de pelo, exudado, descamacin mucosa, o incluso muestras de sangre perif-rica), o bien suponer un riesgo a veces elevado para el paciente, como en el caso debiopsias o muestras intraoperatorias.

Cuando los procedimientos que se utilizan para obtener las muestras son los mismosque se llevan a cabo por razones diagnsticas o teraputicas, la informacin sobre ries-gos y el consentimiento para esos procedimientos son los mismos que deben atenderseen el caso de la intervencin diagnstica o teraputica. En estos casos, slo sera nece-sario un consentimiento especfico en relacin con el destino posterior de las muestras.

Cuando el nico objetivo de estos procedimientos es la obtencin de muestras para

la investigacin, entonces, adems del consentimiento para la extraccin y la utiliza-cin de las muestras, es imprescindible la informacin detallada y el conocimiento delas molestias y riesgos asociados a estas prcticas.


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TAB

LA

I.Condicionespreanalticasptimasparamagnitudeshemosttica

s

I.HEM

OSTASIAPRIMARIA

Magnitud

Prepa

racin

Tuboprimario

Transporte

yconservacin

Muestra

Mto

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Conservacin

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muestra

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1.

Recu

entoplaquetarioyfrotis

Rep.

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20-25C(

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Guía Para La Utilización de Muestras Biológicas