LAPORAN TETAPPRAKTIKUM BIOKIMIA

I. NOMOR PERCOBAAN: VIII. NAMA PERCOBAAN :KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS ASAM AMINOIII. TUJUAN PERCOBAAN : 1. Mengetahui cara pemisahan asam amino dengan KLT2. Mengetahui harga Rf asam aminoIV. LANDASAN TEORI :Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran dalam berbagai wujud, baik cair, padat maupun gas. Cara ini dipakai jika campuran tidak dapat di pisahkan dengan cara lain. Dasar kromatografi adalah perbedaan daya serap suatu zat dengan zat lainnya. Jika campuran komponen campuran (misalnya A,B dan C) dialirkan dengan suatu pelarut melalui padatan tertentu, maka A, B dan C akan bergerak dengan kecepatan berbeda, karena daya serap padatan itu terhadap komponen tidak sama. Cairan atau pelarut yang membawa komponen bergerak disebut eluen atau fase gerak, sedangkan padatan yang menyerap komponen disebut adsorpen atau fase tetap. Syarat eluen harus dapat melarutkan semua komponendan dapat mengalir, maka berupa cairan atau gas. Eluen dapat berupa Zat murni atau campuran, misalnya ter murni atau alcohol 50%.Komponen paling kuat diserap oleh adsorben akan mengalir paling lambat (yaitu A) dan sebaliknya yang diserap paling rendah akan mengalir paling cepat (yaitu B), sedangkan daya serap terhadap C berada diantara A dan B. Semakinlama proses mengalir semakin jauh jarak antara komponen dan semakin sempurna pemisahan, tetapi diperlukan tabung yang panjang serta eluen dan adsorben yang banyak.Komponen dapat dipisahkan dari komponen lain dengan mendorong adsorben keluar dan dipotong berdasarkan komponennya. Tiap potongan dimasukan ke dalam pelarut dan disring untuk memisahkan adsorben, dan larutan akan mengandung satu komponen. Komponen dapat dipisahkan dari pelarut dengan teknik detilasi atau rekristalisasi.Berdasrkan jenis eluen dan adsorbennya, kromatografo dapat dibadi menjadi empat cara, yaitun kromatografi kolom, kertas,lempeng tipis, dan gas.Kromatografi kolom adalah kromatografi yang adsorbennya di masukan ke dalam tabung (pipa) kaca. Adsorben tersebut berupa padatan dalam bentuk tepung, contohnya alumina, setelah pemisahan masing-masing komponen kromatografi terdapat di daerah tertentu dalm tabung.Kromatografi kertas adalah jenis kromatografi yang menggunakan kertas sebagai adsorbennya dan zat cair sebagai eluennya. Teknik pemisahan, campuran komponen diteteskan pada kertas (yang dipakai adlah kertas kromatografi) dengan pipet kecil, misalkan pada dua titik p dan q tidak terbenam kertas digantungkan supaya stabil dan di biarkan agar eluan naik perlahan sambil membawa komponen yang terdapt pada p dan q tadi. Akhirnya akan terlihat komponen terpisah satu sama lain, karena perbedaan daya serapnya pada kertas.Kromatografi lempeng tipis (KLT) menggunakan lempeng tipis (seperti kaca atau lempengan logam) yang di lumuri padatan sebagai adsorben dan dikeringkan. Setelah itu lempengan ditetesi campurab yang akan dipisahkan dan dimasukan ke dalam bejana yang berisi eluen, seperti pada kromatogrfi kertas.Kromatogrfi gas adalah kromatogrfi yang mengunakan gas sebagai eluennya, sedangkan komponen di dalam alat akan diubah menjadi gas dan mengalir bersama eluen. Kecepatan mengalir komponen akan berbedadan mengakibatkan terpisahnya komponen yang satu dengan yang lain.Dalam teknik kromatografi, sampel yang merupakan campuran dari bebagai macam komponen di tempatkan dalam situasi dinamis dalam system yang terdiri dari fase diam dan fase gerak. Semua pemisahan pada kromatografi tergantung pada gerakan relatif dari masing-masing komponen diantara kedua fase tersebut. Senyawa atau komponen yang tertahan (terhambat) lebih lemah oleh fase diam akan bergerak lebih cepat dari pada komponen yang tertahan lebih kuat. Perbedaab gerakan antara komponene yang satu dengan yang lain disebabkan olehn perbedaan dalam adsorben, partisi, kelarutan atau penguapan diantara dua fase. Jika perbedaan-perbedaan ini cukup besar maka akan terjadi ppemisahan secara sempurna. Oleh karena itu dalam kromatogrfi pemilihan terhadap fase gerak maupun fase diam perlu dilakukan dengan sedemikian rupa sehingga semua komponen bias bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda agarv dapat terjadi proses pemisahan.Salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai peralatan yang paling dasar adalah kromatografi lapis tipis preperatif, walaupun dapat memisahkan dalam jumlah gram, sebagian besar pemakaian dalam jumlah milligram, KLTP bersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka, masih di jumpai dalm sebagian besar publikasi mengenai isolasi bahan alam, terutama dalam laboratorium yang tidak dilengkapi dengan cara pemisahan modern. Akan tetapi seperti yang akan diterangkan kemidian, terdapat banyak masal pada KLTP.Pada KLTP dapat di buat sebdiri atau dapat di beli dengan sudah berlapis penyerap. Keuntungan membuat pelat sendiri adalah ketebalan dan susunan lapisan dapat kita atur sendiri. Jadi, perak nitrat, senyawa dapar, dsb dapat dicampur dengan penjerap.KLTP klasik mempunya beberapa kekurangan, kekuranga yang utama adalah pengambilan senyawa dari pelat yang dilanjutkan dengan pengekstrksian dari penyarap. Jika senyawa beracun harus dikerok dari pelat dapt menimbulkan masalah yang serius. Kekurangan yang lainnya adalah jangka waktu yang diperlukan untuk pemisahan dan adanya pencemar dan sisa dari pelat sendiri setelah pengeksterksian pita yang mengandung senyawa yang dipisahkan dengan pelarut. Untuk mengatasi beberapa masalah tersebut, beberapa pendekatan yang melibatkan kromatografi setrifugal telah di coba, pada perinspnya kromatografi sentrifugal adalah kromatografi klasik dengan aliran fase gerak yang dipercepa toleh gaya sentrifugal.KLTP telah menjadi cara pilihan yang cepat untuk memisahkan campuran yang mengandung sekitar 100 mg cuplikan. Daya pisah lebih jelek dari pada daya pisah KLTP tetapi kondisi kerja sederhana dan pemisahan cepat.Keuntungan utamanya jika dibandingkan dengan KLTP adalah bahwa pengelusian hasil pemisahan tidak perlu mengerok lapisan. Perbaikan lebih lanjut sedang dan akan dilakukan tetapi hendaknya hal itu tidak mengubah kesederhanaan cara ini. Cara penumpulan pengelusi dapat di tingkatkan dan pemakaian KLT akan lebih luas jika banyaknya penyerap yang disapukan pada pelat.Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu tehnik yang sederhana dan banyak digunakan. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi penyerap untuk lapisan tipis dan kering bentuk silika gel, alomina, selulosa dan polianida. Untuk menotolkan larutan cuplikan pada lempeng kaca, pada dasarnya dgunakan mikro pipet/ pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam larutan pengulsi di dalam wadah yang tertutup (Chamber) (Rudi, 2010)Pemisahan campuran dengan cara kromatografi didasarkan pada perbedaan kecepatan merambat antara partikel-partikel zat yang bercampur pada medium tertentu. Dalam kehidupan sehari-hari pemisahan secara kromatografi dapat kita temui pada rembesan air pada dinding yang menghasilkan garis-garis dengan jarak ternentu.

Kromatografi adalah Suatu metoda untuk separasi yang menyangkut komponen suatu contoh di mana komponen dibagi-bagikan antara dua tahap, salah satu yang mana adalah keperluan selagi gerak yang lain . Di dalam gas chromatography adalah gas mengangsur suatu cairan atau tahap keperluan padat. Di dalam cairan chromatography adalah campuran cairan pindah gerakkan melalui cairan yang lain , suatu padat, atau suatu 'gel' agar. Mekanisme separasi komponen mungkin adalah adsorpsi, daya larut diferensial, ion-exchange, penyebaran/perembesan, atau mekanisme lain (David. 2001)Penentuan jumlah komponen senyawa dapat dideteksi dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan menggunakan plat KLT yang sudah siap pakai. Terjadinya pemisahan komponen-komponen pada KLT dengan Rf tertentu dapat dijadikan sebagai panduan untuk memisahkan komponen kimia tersebut dengan menggunakan kolom kromatografi dan sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel dan eluen yang digunakan berdasarkan basil yang diperoleh dari KLT dan akan lebih baik kalau kepolaraan eluen pada kolom kromatografi sedikit dibawah kepolaran eluen pada KLT (Lenny, 2006)Pada hakekatnya KLT merupakan metoda kromatografi cair yang melibatkan dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa geraknya berupa campuran pelarut pengembang dan fasa diamnya dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap (kromatografi cair-padat) atau berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair (kromatografi cair-cair). Fasa diam pada KLT sering disebut penyerap walaupun berfungsi sebagai penyangga untuk zat cair di dalam sistem kromatografi cair-cair. Hampir segala macam serbuk dapat dipakai sebagai penyerap pada KLT, contohnya silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida), kiselgur (tanah diatomae) dan selulosa. Silika gel merupakan penyerap paling banyak dipakai dalam KLT (Iskandar, 2007)

Perhitungan nilai RfPengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing. Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.Pengukuran berlangsung sebagai berikut:

Nilai Rfuntuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

IV. ALAT DAN BAHAN 1. alat :a. pelat kromatografib. selembar kacac. penggiling d. beker gelase. pengaduk magnetikf. gelas ukurg. pipet tetesh. penyemproti. penggarisj. pensil

2. Bahan a. silika gelb. pelarut etanolc. larutan ninhidrind. larutan Kuprinitrate. larutan asam amino (tirosin, fenilalanin, glisin)f. aquades

V. PROSEDUR PERCOBAAN Pembuatan lapis tipis. Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbag 25 gram Silica gel G dan aduk ini dengan 50 ml air dengan pengaduk magnetik sampai homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat Stahl atau alat buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu. Biarkan lapis tipis ini ditempatnya kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh dipindah tempatnya dan dibiarkan kering diudara selama semalam.Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa. Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5 2,0 ug dalam 0,5 ul, diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1 cm dari tepi bawah. Jika banyak macam zat yang akan diselidiki maka ini dapat diteteskan sejajar dengan jarak kira-kira 1 cm antara dua zat dan kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi. Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati seklai supaya permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada plat yang akan ditaruh (ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik dengan ujung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubang-lubang yang kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda.Sebelum eluaen dijalankan maka tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering.Ruang Kromatografi. Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan eluaen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya terendam sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi dengan kertas saring yang dibasahi dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi mudah dan cepat dijenuhi dengan uap eluen.Cara melakukan elusi. Plat-plat yang telah ditetesi asam amino dan yang telah kering, dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Disini yang dipakai adalah kromatografi mendaki. Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah berjalan sekitar 10 cm. Pada batas ini semulad diberi tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat diambil dan dikeringkan pada suhu kamar.Cara perwarnaan. (a) dengan hati-hati disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apababila fase gerakj yang dipakai bersifat alkali.Kemudian plat dikeringkan pada 60oC selama 30 menit atau 110oC selama 1`0 menit. Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose.(b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka plat kemudian disemprotkan dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab metrial). Maka akan terjadi ikatan komplek Cu-ninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam bebas. Maka sesudah disemprot, plat harus dikenakan uap amonia. Juga plat tidak boleh terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. walau disosiasi ini reversibel. Di atas pH 9 disosiasi tersebut bersifta irreversibel.

VI. HASIL PENGAMATAN

Asam aminoPanjang (cm)Warna

AlaninArgininAsparagin2,22,62,4Merah UnguOrange

VIII. REAKSI KIMIA

IX. ANALISA DATAMenghitung harga Rf, yaitu perbandingan antara jarak yang ditempuh asam amino dengan jarak yang ditempauh pelarut dari awal hingga garis akhir.Asam aminoPanjang (cm)Warna

AlaninArgininAsparagin2,22,62,4Merah UnguOrange

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

1. Pada Alanin, Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Rf = 2. Pada Arginin Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Rf =

3. Pada Aparagin Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Rf =

X. PEMBAHASANKromatografi lapis tipis adalah pemisahan zat berdasarkan kepolarannya, prinsipnya ada dua yakni partisi dan absorbsi. Pada percobaan ini, tehnik kromatografi lapis tipis yang digunakan adalah suatu plat tipis (aluminium) yang berfungsinya untuk tempat berjalannya adsorbens sehingga proses migrasi analit oleh solventnya bisa berjalan. Hal ini Inilah yang membedakan antara kromatografi kertas dengan kromatografi lapis tipis. Dimana Kromatografi Lapis Tipis menggunakan plat tipis sedangkan pada Kromatografi Kertas menggunakan kertas (lapisan selulosa) sehingga proses elusinya lebih lama (kira kira 10 20 menit lebih lama dari KLT). Perbedaan lainnya dari kedua kromatografi tersebut adalah pembentukan noda pada adsorbensnya dimana pada Kromatografi Lapis tipis noda yang dihasilkan lebih tajam dibandingkan noda yang nampak dalam Kromatografi Kertas. Hal ini disebabkan pada Kromatografi Kertas penyusun dari adsorbens berupa selulosa yang dapat mengikat air, sehingga ketika dielusi dengan suatu pelarut atau fase gerak maka noda yang dihasilkan mengalami penyebaran akibat terdapatnya gugus OH dalam adsorbens yang masih tertingal dalam fase diamnya sehingga penampakan nodanya terlihat lebih pudar dan bentuk nodanya tidak bulat. Sedangkan dalam Kromatografi Lapis Tipis adsorbens yang digunakan berupa silika gel (SiO2) yang tidak mengikat molekul air, sehingga noda yang tercipta lebih terfokus dan tajam. Pembuatan lapisan silika gel pada plat kaca, harus secara hati-hati dan juga harus menggunakan plat kaca yang benar-benar bersih dan terbebas dari lemak. Kemudian, siilika gel yang telah dibuat pada plat kaca terlebih dahulu dikeringkan baru bisa digunakan. Pada penetesan asam amino perlu dilakukan secara hati-hati agar lapis tipis silika gelnya tidak rusak. Penetesan asam amino yang kami lakukan dengan jarak 4 cm dari tepi bawah bila lembar kaca diletakkan ke dalam ruang kromatografi. Eluen yang akan dijalankan diukur sepanjang 10 cm. Setelah dilakukan penetesan asam amino maka eluen siap dijalankan. Eluen pun berjalan tergantung dengan lapis silikan gel yang dibuat. Bila lapisan silika gel yang kita buat terlalu tebal maka eluen pun akan berjalan lambat, dan juga sebaliknya. Oleh karena itu, pembuatan lapisan silikanya diusahakan setipis mungkin dan merata. Dan bila sudah sampai 10 cm, maka eluen yang berjalan dihentikan. Kemudian dikeringkan.Untuk melihat bercak noda dari jarak asam amino dapat disemprotkan dengan larutan ninhidrin agar terbentuk warna. Di sini, ninhidrin berfungsi untuk melacak jalannya asam amino dengan menimbulkan warna ungu pada asam amino. Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione) adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanyagugusamina.Apabila pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi berwarna ungu.Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol. Selain itu, warna yang terbentuk tidaklah stabil. Maka perlu adanya penyemprotan larutan lagi dengan larutan Kuprinitrat. Sehingga terbentuklah noda yang berwarna ungu. Hal ini terjadi karena terbentuknya Cu-ninhidrin. Bagus tidak hasilnya sangat dipengaruhi oleh tebal atau tipisnya silika gel yang dibuat. Dari hasil percobaan didapatlah jarak asam amino Pada percobaan ini, didapatkan nilai Rf yang berbeda-beda dari tiap analit. Pada penentuan nilai Rf asam amino, secara berturut-turut nilai Rf dari alanin, arginin dan asparagin adalah 0,22 , 0,26 , dan 0,24.

XI. KESIMPULAN 1. Suatu plat tipis (aluminium) berfungsi sebagai tempat berjalannya adsorbens sehingga proses migrasi analit oleh solventnya bisa berjalan.2. Kromatografi Lapis tipis menggunakan adsorben berupa silica gel, dimana silica gel tidak dapat mengikat molekul air, sehingga noda yang tercipta lebih terfokus dak tajam. Berbeda dengan kromatografi kertas yang adsorbennya berupa selulosa yang dapat mengikat air, sehingga ketika dielusi dengan suatu pelarut atau fase gerak maka noda yang dihasilkan mengalami penyebaran akibat terdapatnya gugus OH dalam adsorbens yang masih tertingal dalam fase diamnya sehingga penampakan nodanya terlihat lebih pudar dan bentuk nodanya tidak bulat3. Pengidentifikasian asam amino dengan melihat noda atau bintik yang dihasilkan, sehingga kita dapat menghitung Rf dari asam amino dengan cara membandingkan jarak yang ditempuh oleh asam amino dengan jarak yang ditempuh oleh eluen pada plat.4. Untuk memberikan warna pada noda atau bintik yang dihasilkan kita dapat menggunakan larutan ninhidrin dan larutan kuprinitrat sebagai penstabil warnanya. 5. Nilai Rf asam amino, secara berturut-turut nilai Rf dari alanin, arginin dan asparagin adalah 0,22 , 0,26 , dan 0,24.XII. DAFTAR PUSTAKA

Lehninger.1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga.Muhammad, Fauzan. (2012,Desember 24). Laporan Praktikum Kromatografi Lapis Tipis. Dipetik Mei 15, 2013, dari Blogspot: http://moslem-chemist.blogspot.com/2012/12/laporan-praktikum-kromatografi-lapis.htmlPoedjiadi, Anna.1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI-Press.Raharjo. (2011,April 01). Kromatografi Lapis Tipis. Dipetik Mei 15, 2013, dari Blogspot: http://alipart.blogspot.com/2011/04/kromatografi-lapis-tipis.html

XIII. GAMBAR ALAT

Pipet tetes Beaker Gelas

Gelas Ukur Erlenmeyer

Corong pemisah

JAWABAN PERTANYAAN 1. Menganalisa secara kualitatif dengan cara kromatografi lapis tipis satu dimensi. Suatu larutan asam amino yang bersedia. Dan hitung berapa harga Rfnya?Jawab :25 gram silica gel dalam 50 ml air diaduk sampai homogen, kemudian dituangkan ke atas lempeng kaca yang telah diukur pinggir kanannya 2 cm dan ditempeli dengan plester. Setelah itu larutan silica gel dituangkan dan diratakan. Diamkan selama semalam. Setelah kering silica gel tersebut dikur dari bawah sepanjang 2,5 cm dan diberikan tanda atau garis. Pada garis itu ditotolkan dengan asam amnio, masing-masing adalah alanini, tripthofan, dan arginin. Lalu masukkan plat tersebut ke dalam ruang kromatografi yang telah diisi dengan eluen (etanol 95%). Stelah itu dikeringkan. Kemudian disemprotkan engan ninhidrin dan dikeringkan kemabli selama 30 menit. Kemudian disemprotkan kembali dengan kuprinitrat. Setelah itu diukur jarak asam amino tersebut adalah sebagai berikut serta harga Rf nya :Dari hasil pengamatan diketahui jarak yang ditempuh oleh pelarut untuk plat adalah 10 cm. sedangkan untuk asam amino adalah :

Harga Rf = Maka :4. Pada Alanin, Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Rf = 5. Pada Arginin Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Rf =

6. Pada Aparagin Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Rf =

2. Tuliskan reaksi antara ninhidrin dengan asam amino!

3. Sebutkan factor-faktor yang mempengaruhi Rf pada KLT?Jawab :Kepolaran senyawa, jenis pelarut, jarak penetesan, dan fasa diam (adsorbennya).

4. Terangkan bagaimana orang melakukan analisa kuantitatif suatu zat tertentu dengan cara kromatografi lapis tipis?Jawab :Dengan menyemprotkan lempeng dengan asam sulfat 50% atau 25% dalam eetanol kemudian dipanaskan sehingga semua bahan organic akan terbakar dan tampak sebagai noda-noda coklat.Mengamati lempeng dengansinar UV sehingga noda-noda yang menyerap sinar UV atau sebaliknya dengan memancarkannya. Bahan sample ditotolkan pada salah satu sudut lempeng sebagai suatu titik dan pemisahahn dilakukan setelah lmepeng kering. Kemudian dipisahkan lagi dengan satu system solven yang lain dengan arah tegak lurus dari arah semula.

5. Terangkan bagaimana cara melakukan kromatografi lapis tipis dua dimensi dan bilakah orang terpaksa melakukan cara itu?Jawab:Dengan mengamati kepekatan warna yang diperoleh. Untuk cara ini, sample diteteskan dipojok kanan bawah dari plat TLC yang berukuran 20 x 20 cm, kira-kira 2 cm dari tepi kanan dan dari bawah. Setelah pengembangan pertama selesai, plat dikeringkan. Untuk mencegah terjadinya kerusakan senyawa yang dipisahkan selama pengeringan sebaiknya dilakukan dengan aliran gas N2. setelah dikeringkan, plat dikembangkan dengan menggunakan system pelarut yang kedua dengan memutar arah plat 90o. menggunakan cara ini mendapatkan hasil pengembangan yang lebih baik dengan penggunaan dua macam system pelarut, dan apabila pengembangan satu dimensi mendapatkan hasil yang kurang sempurna.